KR20100017511A

KR20100017511A - 카탈라아제 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20100017511A
Application number: KR1020097024976A
Authority: KR
Inventors: 요시히로 나카오; 유키코 고다마; 도모코 시모나가; 후미히코 오무라
Original assignee: 산토리 홀딩스 가부시키가이샤
Priority date: 2006-02-28
Filing date: 2006-12-22
Publication date: 2010-02-16
Also published as: EP1874808B1; AU2006340192B2; EP2206722B1; DK2206722T3; ATE497972T1; WO2007105350A2; US20090047380A1; WO2007105350A3; DK1874808T3; CN102174544A; EP1874808A2; EP2206722A1; JP2008529479A; DE602006020029D1; CN101029311A; AU2006340192A1; JP4478716B2; CA2607677A1; ATE544778T1; CN102174544B

Abstract

본 발명은 카탈라아제를 인코딩하는 유전자 및 이의 용도, 특히, 아황산염 생성 능력이 높은 양조 효모, 상기 효모로 제조된 알콜성 음료, 및 상기 음료의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 카탈라아제 Cta1p 를 인코딩하는 CTA1 유전자, 특별히 라거 양조 효모에 특이적인 비(非)-ScCTA1 유전자 또는 ScCTA1 유전자의 발현 수준을 증폭시킴으로써 생성물에서의 풍미의 안정성에 기여하는 아황산염을 생성하는 능력이 강화된 효모, 및 상기 효모를 이용한 알콜성 음료의 제조 방법에 관한 것이다.

양조 효모, 카탈라아제, 아황산염, 알콜성 음료

Description

카탈라아제 유전자 및 이의 용도 {CATALASE GENE AND USE THEREOF}

본 발명은 카탈라아제를 인코딩하는 유전자 및 이의 용도, 특히, 풍미가 뛰어난 알콜성 음료를 제조하는 양조 효모, 상기 효모로 제조된 알콜성 음료 및 상기 음료의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 양조 효모에서의 카탈라아제인 Cta1p 를 인코딩하는 CTA1 유전자, 특별히 라거 양조 효모에 특이적인 비(非)-ScCTA1 유전자 또는 ScCTA1 유전자의 발현 수준을 증폭시킴으로써 생성물에서의 풍미의 안정성에 기여하는 아황산염을 생성하는 능력이 강화된 효모, 및 상기 효모를 이용한 알콜성 음료의 제조 방법에 관한 것이다.

아황산염은 항산화 활성이 높은 화합물로 공지되어 왔으며, 따라서 식품, 음료, 약학 제품 등의 분야에서 널리 사용되어 왔다(예를 들어, 일본 특허 출원 공개공보 제 H06-040907 호 및 2000-093096 호). 알콜성 음료에서, 아황산염은 항산화제로 사용되어 왔다. 예를 들어, 아황산염은 장기간의 숙성을 필요로 하는 와인의 품질 유지에 중요한 역할을 하기 때문에, 잔류 농도 350 ppm (백만분율) 까지의 첨가는 일본의 보건복지노동부에 의해 허용된다. 나아가, 저장 수명 (품질 유지 기간) 은 맥주 양조에서 생성물 중의 아황산염 농도에 따라 다르다는 것이 또한 공지되어 있다. 따라서, 풍미 안정성 등의 관점에서 상기 화합물의 함량을 증가시키는 것이 매우 중요하다.

생성물에서의 아황산염 함량을 증가시키는 가장 손쉬운 방법은 아황산염을 첨가하는 것이다. 그러나, 아황산염을 식품 첨가제로 처리하면, 제품 개발 상의 제약 및 소비자의 식품 첨가제에 대한 부정적 이미지 등의 몇 가지 문제가 발생한다.

양조 공정 동안 발효주 내의 아황산염 함량을 증가시키는 방법으로는, (1) 공정 제어에 기초한 방법 및 (2) 효모 증식에 기초한 방법이 있다. 공정 제어에 기초한 방법에서는, 아황산염의 생성량이 초기 산소 공급량에 반비례하기 때문에, 아황산염의 생성량을 증가시키고 산화를 방지하기 위하여 산소 공급량을 감소시킨다.

한편, 효모 증식에 기초한 방법에서는 유전자 조작 기술이 이용된다. 효모는 그의 생물학적 활성에 필요한 황 함유 화합물들을 생합성한다. 아황산염은 황 함유 화합물의 생합성에서 중간체로서 생성된다. 따라서, 외부에서 아황산염을 첨가하지 않고 효모의 능력을 이용함으로써 생성물 중의 아황산염의 양을 증가시킬 수 있다.

MET3 및 MET14 는 배양 배지로부터 취한 황산염 이온으로부터 아황산염을 생합성하는데 연루된 단계들에 참여하는 환원효소들을 인코딩하는 유전자들이다. Korch 등은 상기 두 유전자의 발현 수준을 증가시킴으로써 효모의 아황산염 생성 능력을 증가시키고자 시도하였는데, MET14 가 더 효과적임을 발견하였다(C. Korch 등, Proc . Eur . Brew . Conv . Conger., Lisbon, 201-208, 1991). 또한, Hansen 등은 아황산염 이온 환원효소를 인코딩하는 MET10 유전자를 파괴하여 생성되는 아황산염의 환원을 방지함으로써 아황산염의 생성량을 증가시키고자 하였다(J. Hansen 등, Nature Biotech., 1587-1591, 1996). 한편, 그러나, 발효 지연 또는 바람직하지 않은 풍미 성분들인 아세트알데히드 및 1-프로판올의 증가가 또한 관찰된다.

나아가, Fujimura 등은 효모의 아황산염 이온 유출 펌프를 인코딩하는 SSU1 유전자들 중에서 라거 양조 효모에 유일한 비(非)-ScSSU1 유전자의 발현 수준을 증가시켜 효모 세포 밖으로의 아황산염의 배출을 증진시킴으로써 맥주에서의 아황산염 함량을 증가시키고자 하였다(Fujimura 등, Abstract of 2003 Annual Conference of the Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochem., 159, 2003).

상기 언급한 바와 같이, 생성물에서 아황산염을 증가시키는 가장 손쉬운 방법은 아황산염을 첨가하는 것이다. 그러나, 최근의 소비자들의 선호도, 즉 식품 첨가제 기피 및 천연 물질 선호의 관점에서 식품 첨가제의 사용을 최소화하는 것이 바람직하다. 따라서, 외부에서 아황산염을 첨가하지 않고 효모 자체의 생물학적 활성을 사용함에 의해 풍미 안정성에 효과적인 수준의 아황산염 함량을 달성하는 것이 바람직하다. 그러나, 상기 기재한 바와 같은 공정 제어에 기초한 방법은 산소 부족으로 인해 효모의 성장 속도가 저하되어 발효 지연 및 품질 손실이 발생할 수 있기 때문에, 실용적이지 않을 수 있다.

나아가, 유전자 조작 기술을 사용하여 효모를 증식시킴에 있어서, 모균주의 10 배 이상의 아황산염 함량을 달성하였다는 것을 언급하는 보고가 있다(J. Hansen 등, Nature Biotech., 1587-1591, 1996). 그러나, 발효 지연 및 아세트알데히드 및 1-프로판올과 같은 바람직하지 않은 풍미 성분의 증가와 같은 문제점이 존재한다. 따라서, 실제 사용을 위해서는 상기 효모로는 문제가 있다. 따라서, 발효 속도 및 생성물의 품질을 손상시키지 않으면서 충분한 양의 아황산염을 생성할 수 있는 효모를 증식시키는 방법에 대한 필요성이 존재해 왔다.

상기 기재한 문제들을 해결하기 위해서, 본 발명자들이 예의 연구한 결과, 라거 양조 효모로부터 카탈라아제를 인코딩하는 유전자를 동정 및 분리하는데 성공하였다. 나아가, 상기 수득한 유전자가 형질전환되어 발현된 효모를 제조하여 아황산염의 생성 증가를 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 라거 양조 효모에 존재하는 카탈라아제 유전자, 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질, 상기 유전자의 발현이 제어되는 형질전환된 효모, 상기 유전자의 발현이 제어되는 효모를 이용함으로써 생성물 중의 아황산염의 생성량을 제어하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 하기 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터, 상기 벡터가 도입된 형질전환된 효모, 상기 형질전환된 효모를 사용함에 의한 알콜성 음료의 제조 방법 등을 제공한다.

(1) 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(a) 서열번호:1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열번호:2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(c) 카탈라아제 활성을 가지며 서열번호:2 의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(d) 카탈라아제 활성을 가지며 서열번호:2 의 아미노산 서열과의 일치성이 60% 이상인 아미노산 서열을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(e) 엄격한 조건하에서 서열번호:1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며, 카탈라아제 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및

(f) 엄격한 조건하에서 서열번호:2 의 아미노산 서열의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 카탈라아제 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.

(2) 상기 (1) 에 있어서, 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(g) 서열번호: 2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하거나, 또는 서열번호: 2 의 아미노산 서열 중 1 내지 10 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 이때 상기 단백질은 카탈라아제 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드;

(h) 서열번호: 2 의 아미노산 서열과의 일치성이 90% 이상이며 카탈라아제 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(i) 서열번호: 1 에 혼성화하거나 또는 고도의 엄격한 조건하에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화하며, 카탈라아제 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.

(3) 상기 (1) 에 있어서, 서열번호: 1 로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.

(4) 상기 (1) 에 있어서, 서열번호: 2 로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.

(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, DNA 인 폴리뉴클레오티드.

(6) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드로 인코딩되는 단백질.

(7) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터.

(7a) 상기 (7) 에 있어서, 하기 구성요소들이 포함된 발현 카세트를 포함한 벡터:

(x) 효모 세포에서 전사될 수 있는 프로모터;

(y) 상기 프로모터에 센스 또는 안티센스 방향으로 연결된 상기 (1) 내지 (5) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나; 및

(z) 전사 종결 및 RNA 분자의 폴리아데닐화에 대하여 효모에서 기능할 수 있는 신호.

(8) 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터:

(j) 서열번호: 4 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하거나, 또는 서열번호: 4 의 아미노산 서열에서 1 내지 10 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 이 때 상기 단백질은 카탈라아제 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드;

(k) 서열번호: 4 의 아미노산 서열과의 일치성이 90% 이상이며 카탈라아제 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(l) 서열번호: 3 에 혼성화하거나 또는 고도의 엄격한 조건하에서 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화하며, 카탈라아제 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.

(9) 상기 (7) 또는 (8) 의 벡터가 도입된 효모.

(10) 상기 (9) 에 있어서, 아황산염 생성 능력이 강화된 효모.

(11) 상기 (10) 에 있어서, 상기 (6) 의 단백질의 발현 수준을 증가시킴에 의해 아황산염 생성 능력이 강화된 효모.

(12) 상기 (9) 내지 (11) 중 어느 하나의 효모를 배양하는 것을 포함하는 알콜성 음료의 제조 방법.

(13) 상기 (12) 에 있어서, 양조된 알콜성 음료가 맥아 음료인 알콜성 음료의 제조 방법.

(14) 상기 (12) 에 있어서, 양조된 알콜성 음료가 와인인 알콜성 음료의 제조 방법.

(15) 상기 (12) 내지 (14) 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 알콜성 음료.

(16) 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가지며 카탈라아제 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 설계된 프라이머 또는 탐침자 (probe) 를 사용하는 것을 포함하는, 시험 효모의 아황산염 생성 능력 평가 방법.

(16a) 상기 (16) 에 기재된 방법을 사용함으로써 강화된 아황산염 생성 능력을 가진 효모를 선별하는 방법.

(16b) 상기 (16a) 에 기재된 방법으로 선별된 효모를 사용함에 의한 알콜성 음료 (예를 들어, 맥주) 의 제조 방법.

(17) 하기를 포함하는 시험 효모의 아황산염 생성 능력 평가 방법: 시험 효모를 배양함; 및 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가지며 카탈라아제 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함.

(17a) 상기 (17) 에 기재된 방법에 의해 시험 효모를 평가하고 카탈라아제 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준이 높은 효모를 선별하는 것을 포함하는, 아황산염 생성 능력이 높은 효모를 선별하는 방법.

(17b) 상기 (17a) 에 기재된 방법으로 선별된 효모를 사용함에 의한 알콜성 음료 (예를 들어, 맥주) 의 제조 방법.

(18) 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 시험 효모를 배양함; (6) 에 따른 단백질을 정량하거나 또는 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가지며 카탈라아제 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 표적 아황산염 생성 능력에 따른 상기 단백질 양 또는 상기 유전자 발현 수준을 갖는 시험 효모를 선별함.

(19) 상기 (18) 에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가지며 카탈라아제 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 참조 효모에서보다 상기 유전자가 더 많이 발현된 시험 효모를 선별함.

(20) 상기 (18) 에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 상기 (6) 에 따른 단백질을 정량함; 및 참조 효모에서보다 상기 단백질의 양이 더 많은 시험 효모를 선별함.

(21) 하기를 포함하는 알콜성 음료의 제조 방법: 상기 (9) 내지 (11) 중 어느 하나에 따른 효모 또는 상기 (18) 내지 (20) 중 어느 하나에 따른 방법으로 선별된 효모를 이용하여 알콜성 음료의 제조를 위한 발효를 수행함; 및 아황산염 농도를 조절함.

본 발명의 알콜성 음료의 제조 방법에 따르면, 생성물 중의 항산화 활성을 가진 아황산염의 함량을 증가시켜, 풍미의 안정성이 뛰어나고 저장 수명이 더 긴 알콜성 음료가 제조될 수 있도록 할 수 있다.

발명의 실시를 위한 최선의 양식

본 발명자들은 일본 특허 출원 공개공보 제 2004-283169 호에 개시된 방법에 따라 맵핑된 라거 양조 효모 게놈 정보에 기초한 라거 양조 효모에 유일한 카탈라아제 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 비(非)-ScCTA1 유전자를 분리 및 동정하였다. 상기 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 1 로 표시된다. 나아가, 상기 유전자로 인코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 2 로 표시된다. 또한, 본 발명자들은 라거 양조 효모에 유일한 카탈라아제 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 ScCTA1 유전자를 분리 및 동정하였다. 상기 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 3 으로 표시된다. 나아가, 상기 유전자로 인코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 4 로 표시된다.

1. 본 발명의 폴리뉴클레오티드

먼저, 본 발명은 (a) 서열번호:1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 서열번호:2 또는 서열번호: 4 의 아미노산 서열의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 일 수 있다.

본 발명의 표적 폴리뉴클레오티드는 라거 양조 효모에서 유래한 카탈라아제 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 한정되지 않으며, 상기 단백질에 대한 등가의 기능을 갖는 단백질들을 인코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드들도 이에 포함될 수 있다. 등가의 기능을 가진 단백질로서는, 예를 들어, (c) 카탈라아제 활성을 가지며 서열번호: 2 또는 서열번호: 4 의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 가진 단백질이 있다.

이러한 단백질에는, 카탈라아제 활성을 가지며 서열번호: 2 또는 서열번호: 4 의 아미노산 서열에서, 예를 들어, 1 내지 100, 1 내지 90, 1 내지 80, 1 내지 70, 1 내지 60, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 39, 1 내지 38, 1 내지 37, 1 내지 36, 1 내지 35, 1 내지 34, 1 내지 33, 1 내지 32, 1 내지 31, 1 내지 30, 1 내지 29, 1 내지 28, 1 내지 27, 1 내지 26, 1 내지 25, 1 내지 24, 1 내지 23, 1 내지 22, 1 내지 21, 1 내지 20, 1 내지 19, 1 내지 18, 1 내지 17, 1 내지 16, 1 내지 15, 1 내지 14, 1 내지 13, 1 내지 12, 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6 (1 내지 수 개의 아미노산), 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1 개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열 로 이루어진 단백질이 포함된다. 일반적으로, 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가의 수는 더 적은 것이 바람직하다. 또한, 이러한 단백질에는, (d) 카탈라아제 활성을 가지며 서열번호: 2 또는 서열번호: 4 의 아미노산 서열과의 일치성이 약 60% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상인 아미노산 서열을 가진 단백질이 포함된다. 일반적으로, 백분율 동일성은 더 높은 것이 바람직하다.

상기 카탈라아제 활성은, 예를 들어 문헌 [Osorio 등, Archives of Microbiology, 181(3), 231-236 (2004)] 의 방법에 의해 평가할 수 있다.

나아가, 본 발명은 또한 (e) 엄격한 조건하에서 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 카탈라아제 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및 (f) 엄격한 조건하에서 서열번호: 2 또는 서열번호: 4 의 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 카탈라아제 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드를 염두에 둔다.

여기서, "엄격한 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드"란 서열번호:1 또 는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호:2 또는 서열번호: 4 의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 탐침자로서 사용하여 콜로니 혼성화 기술, 플라크 혼성화 기술, 서던 (southern) 혼성화 기술 등에 의해 수득된, DNA 등의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 상기 혼성화 방법은, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning 제 3 판, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997] 등에 기재된 방법일 수 있다.

본원에 사용된 "엄격한 조건"이라는 용어는 낮은 엄격성 조건, 중간 엄격성 조건 또는 높은 엄격성 조건 중 임의일 수 있다. "낮은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 32℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "중간 엄격성 조건"은, 예를 들어, 42℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "높은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 50℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. 이들 조건하에서, 상동성이 더 높은, DNA 등의 폴리뉴클레오티드는 더욱 높은 온도에서 효율적으로 수득될 것으로 예상되지만, 혼성화 엄격성에는 온도, 탐침자 농도, 탐침자 길이, 이온 세기, 시간, 염 농도 및 기타를 비롯하여 복수의 요인들이 연루되므로, 당업자는 유사한 엄격성을 구현하기 위해 이들 요인들을 적절히 선택할 수 있다.

혼성화를 위해 시판중인 키트를 사용하는 경우에는, 예를 들어, Alkphos Direct Labeling Reagents (Amersham Pharmacia) 를 사용할 수 있다. 이 경우, 첨부된 프로토콜에 따라, 표지된 탐침자와 함께 하룻밤 인큐베이션한 후, 막을 0.1% (w/v) SDS 가 함유된 55℃ 의 1차 세정 완충액으로 세정하여, 혼성화된, DNA 등의 폴리뉴클레오티드를 검출한다.

혼성화될 수 있는 기타 폴리뉴클레오티드에는, 기본 매개변수를 사용한 FASTA 및 BLAST 와 같은 상동성 검색 소프트웨어로 산출한 바, 서열번호:2 또는 서열번호: 4 의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 일치성이 약 60% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상인 폴리뉴클레오티드가 포함된다.

아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열들 간의 일치성은 Karlin 및 Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST 를 사용하여 결정할 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990; Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90: 5873, 1993). BLAST 알고리즘에 기초한 BLASTN 및 BLASTX 로 불리는 프로그램들이 개발되었다(Altschul SF 등, J. Mol. Biol. 215: 403, 1990). 뉴클레오티드 서열을 BLASTN 을 사용하여 서열분석하는 경우, 매개변수들은, 예를 들어, 스코어 = 100 및 단어 길이 = 12 이다. 아미노산 서열을 BLASTX 로 서열분석하는 경우, 매개변수들은, 예를 들어, 스코어 = 50 및 단어 길이 = 3 이다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램에 대한 기본 매개변수가 이용된다.

2. 본 발명의 단백질

본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (l) 중 어느 하나에 의해 인코딩되는 단백질을 제공한다. 본 발명의 바람직한 단백질은 서열번호:2 또는 서열번호: 4 의 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 포함하며, 카탈라아제 활성을 갖는다.

이러한 단백질에는, 카탈라아제 활성을 가지며 서열번호: 2 또는 서열번호: 4 의 아미노산 서열에서 상기 언급한 수의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 가진 것들이 포함된다. 또한, 이러한 단백질에는, 카탈라아제 활성을 가지며 서열번호: 2 또는 서열번호: 4 의 아미노산 서열에 대하여 상기 기재한 바와 같은 상동성을 갖는 것들이 포함된다.

이러한 단백질은, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning 제 3 판, Current Protocols in Molecular Biology, Nuc. Acids. Res., 10: 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6409 (1982), Gene 34: 315 (1985), Nuc. Acids. Res., 13: 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1985)] 에 기재된, 위치지정 돌연변이를 이용하여 수득할 수 있다.

본 발명의 단백질의 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가는 상기 동일 아미노산 서열 중 임의의 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 것을 의미한다. 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가 중 2 개 이상의 유형이 동시에 일어날 수도 있다.

이하에, 상호 치환가능한 아미노산 잔기의 예를 열거한다. 동일한 그룹 내의 아미노산 잔기는 상호 치환가능하다. 이하 상기 그룹들을 제시한다.

그룹 A: 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, o-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌; 그룹 B: 아스파르트산, 글루탐산, 이소아스파르트산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산 (2-aminosuberic acid); 그룹 C: 아스파라긴, 글루타민; 그룹 D: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산; 그룹 E: 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린; 그룹 F: 세린, 트레오닌, 호모세린; 및 그룹 G: 페닐알라닌, 티로신.

본 발명의 단백질은 또한 Fmoc 방법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐 방법) 및 tBoc 방법 (t-부틸옥시카르보닐 방법) 과 같은 화학적 합성 방법으로 제조할 수도 있다. 또한, 예를 들어, Advanced ChemTech, PerkinElmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimazu Corp. 로부터 구매가능한 펩티드 합성기를 또한 화학적 합성에 사용할 수 있다.

3. 본 발명의 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 효모

이어서 본 발명은 상기 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 상기 (a) 내지 (l) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 (DNA) 중 어느 하나가 포함된 벡터에 관한 것이다. 일반적으로, 본 발명의 벡터는 하기가 성분으로서 포함된 발현 카세트를 포함한다: (x) 효모 세포에서 전사가능한 프로모터; (y) 상기 프로모터에 센스 또는 안티센스 방향으로 연결된 상기 (a) 내지 (l) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 (DNA); 및 (z) 전사 종결 및 RNA 분자의 폴리아데닐화에 관하여 상기 효모에서 기능하는 신호.

상기 효모에 도입되는 벡터는 다중복제(multicopy)형 (YEp 형), 단일복제형 (YCp 형), 또는 염색체 통합형 (YIp 형) 중 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, YEp24 (J. R. Broach 등, J. R. Broach 등, Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983) 는 YEp 형 벡터로 알려져 있고, YCp50 (M. D. Rose 등, Gene 60: 237, 1987) 는 YCp 형 벡터로 알려져 있으며, YIp5 (K. Struhl 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 1035, 1979) 는 YIp 형 벡터로 알려져 있고, 이들 모두 용이하게 입수가능하다.

효모에서 유전자 발현을 조정하는 프로모터/종결자는 이들이 양조 효모에서 기능하며, 발효액 중의 구성성분의 농도에 영향을 끼치지 않는 한 임의의 조합일 수 있다. 예를 들어, 글리세르알데히드류 3-포스페이트 탈수소효소 유전자 (TDH3) 의 프로모터, 또는 3-포스포글리세레이트 키나아제 유전자 (PGK1) 의 프로모터를 사용할 수 있다. 이들 유전자들은, 예를 들어, 문헌 [M. F. Tuite 등, EMBO J., 1, 603 (1982)] 에 상세히 기재된 바와 같이 사전에 클로닝된 것이며, 이들은 공지된 방법으로 용이하게 수득가능하다.

영양요구성 마커는 양조 효모에 대한 형질전환시 선별 마커로 사용될 수 없기 때문에, 예를 들어, 제네티신(geneticin)-저항성 유전자 (G418r), 구리-저항성 유전자 (CUP1) (Marin 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984) 또는 세룰레닌(cerulenin)-저항성 유전자 (fas2m, PDR4) (각각, Junji Inokoshi 등, Biochemistiy, 64, 660, 1992; 및 Hussain 등, Gene, 101 : 149, 1991) 가 사용될 수 있다.

상기 기재된 바와 같이 구축된 벡터를 숙주 효모에 도입한다. 숙주 효모의 예로서는, 양조하는데 사용될 수 있는 임의의 효모, 예를 들어, 맥주, 와인 및 사케 (sake) 용 양조 효모를 들 수 있다. 구체적으로, 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속(屬)과 같은 효모를 사용할 수 있다. 본 발명에 따르면, 라거 양조 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 파스토리아누스 (Saccharomyces pastorianus) W34/70 등, 사카로마이세스 칼스버겐시스 (Saccharomyces carlsbergensis) NCYC453 또는 NCYC456 등, 또는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953 또는 NBRC1954 등을 사용할 수 있다. 또한, 일본양조협회 (Brewing Society of Japan) 로부터의 와인 효모 #1, 3 및 4 와 같은 와인 효모, 및 일본양조협회로부터의 사케 효모 #7 및 9 와 같은 사케 효모를 또한 사용할 수 있으나 이들에 한정되지는 않는다. 본 발명에서는, 사카로마이세스 파스토리아누스와 같은 라거 양조 효모를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

효모 형질전환 방법은 일반적으로 사용되는 공지된 방법일 수 있다. 예를 들어, 사용될 수 있는 방법으로는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 전기천공 방법 (Meth. Enzym., 194: 182 (1990)), 스페로플라스트 (spheroplast) 방법 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929(1978)), 리튬 아세테이트 방법 (J. Bacteriology, 153: 163 (1983)), 및 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929 (1978), Methods in Yeast Genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual] 에 기재된 방법을 들 수 있다.

더욱 구체적으로, 숙주 효모를 표준 효모 영양 배지 (예컨대, YEPD 배지 (Genetic Engineering. Vol. 1, Plenum Press, New York, 117(1979)) 등) 에서 OD600 nm 가 1 내지 6 이 되도록 배양한다. 상기 배양 효모를 원심분리로 수집하고, 세정한 후, 약 1 내지 2 M 의 농도의 알칼리 금속 이온, 바람직하게는 리튬 이온으로 예비-처리한다. 상기 세포를 약 30℃에서 약 60 분간 방치되도록 한 후, 도입시킬 DNA (약 1 내지 20 ㎍) 와 함께 약 30℃에서 약 60 분간을 더 방치한다. 폴리에틸렌글리콜, 바람직하게는 약 4,000 달톤의 폴리에틸렌글리콜을 최종 농도가 약 20% 내지 50% 가 되도록 첨가한다. 약 30℃에서 약 30 분간 방치한 후, 상기 세포를 약 42℃에서 약 5 분간 가열한다. 바람직하게는, 상기 세포 현탁물을 표준 효모 영양 배지로 세정하고, 소정의 양의 새로운 표준 효모 영양 배지에 첨가한 후, 약 30℃에서 약 60 분간 방치한다. 그 후, 이를 항생물질 등이 선별 마커로서 함유된 표준 한천 배지에 시딩 (seeding) 하여 형질전환체를 수득한다.

다른 일반적인 클로닝 기술은, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning 제 3 판], 및 문헌 [Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)] 에서 찾아볼 수 있다.

4. 본 발명에 따른 알콜성 음료의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 알콜성 음료

상기 기재한 본 발명의 벡터를 표적 알콜성 생성물을 양조하기에 적당한 효모 내로 도입한다. 상기 효모를 사용하여 풍미의 안정성이 뛰어난 목적하는 알콜성 음료의 아황산염의 함량을 증가시킬 수 있다. 또한, 후술되는 본 발명의 효모 평가 방법으로 선별되는 효모를 또한 사용할 수 있다. 상기 표적 알콜성 음료에는, 예를 들어, 이들에 한정되지 않으나, 맥주, 맥주맛 음료와 같은 유탄산 (sparkling) 알콜 음료 (happoushu), 와인, 사케 등이 있다.

이들 알콜성 음료를 제조하기 위해서, 본 발명에 따라 수득된 양조 효모를 모 균주 (parent strain) 대신 사용하는 것을 제외하고는 공지의 기술을 사용할 수 있다. 물질, 제조 장비, 제조 관리 등이 종래의 것과 정확히 동일할 수 있으므로, 아황산염의 함량이 증가된 알콜성 음료의 제조 비용을 증가시킬 필요가 없다. 따라서, 본 발명에 따르면, 비용 증가 없이 기존의 설비를 사용하여 풍미의 안정성이 뛰어난 알콜성 음료를 제조할 수 있다.

5. 본 발명의 효모 평가 방법

본 발명은 서열번호:1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가지며 카탈라아제 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 설계된 프라이머 또는 탐침자를 사용하여 시험 효모의 아황산염 생성 능력을 평가하는 방법에 관한 것이다. 이러한 평가 방법을 위한 일반적인 기술은 공지되어 있으며, 예를 들어, WO01/040514, 일본 공개 특허 출원 제 8-205900 호 등에 기재되어 있다. 상기 평가 방법은 하기 기술된다.

먼저, 시험 효모의 게놈을 준비한다. 상기 준비를 위해, Hereford 방법 또는 포타슘 아세테이트 방법과 같은 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다(예컨대, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 130 (1990)). 카탈라아제 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열 (바람직하게는, ORF 서열) 에 기초하여 설계된 프라이머 또는 탐침자를 사용하여, 수득한 시험 효모 게놈에서 상기 유전자 또는 상기 유전자에 특이적인 서열의 존재 여부를 결정한다. 상기 프라이머 또는 탐침자는 공지의 기술에 따라 설계될 수 있다.

상기 유전자 또는 상기 특이적 서열의 검출은 공지의 기술을 이용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 상기 특이적 서열의 일부 또는 전부가 포함된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이 포함된 폴리뉴클레오티드를 하나의 프라이머로 사용하고, 상기 서열의 상류 또는 하류의 서열의 일부 또는 전부가 포함된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이 포함된 폴리뉴클레오티드를 또 다른 프라이머로 사용하여 PCR 방법으로 상기 효모의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 산물의 존재 여부 및 상기 증폭된 산물의 분자량을 결정한다. 프라이머에 사용된 폴리뉴클레오티드의 염기의 수는 일반적으로 10 염기쌍 (bp) 이상, 및 바람직하게는 15 내지 25 bp 이다. 일반적으로, 상기 프라이머들 사이의 염기의 수는 적당하게는 300 내지 2000 bp 이다.

PCR 의 반응 조건으로는 특별한 제한이 없으나, 예를 들어, 변성 온도는 90 내지 95 ℃, 어닐링 (annealing) 온도는 40 내지 60℃, 신장 온도는 60 내지 75℃, 및 사이클 횟수는 10 이상일 수 있다. 결과적으로 생성된 반응 산물은, 예를 들어, 아가로오스 겔을 이용한 전기영동으로 분리하여, 증폭된 산물의 분자량을 측정할 수 있다. 상기 방법은, 증폭된 산물의 분자량이 상기 특정 부분의 DNA 분자를 포함하는 크기인지의 여부로 결정되는 효모의 아황산염 생성 능력의 예측 및 평가를 가능하게 한다. 또한, 증폭된 산물의 뉴클레오티드 서열을 분석함으로써, 상기 능력을 더욱 정확히 예측 및/또는 평가할 수 있다.

나아가, 본 발명에서는, 시험 효모를 배양하여 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가지며 카탈라아제 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 상기 시험 효모의 아황산염 생성 능력을 평가한다. 카탈라아제 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함에 있어서, 상기 시험 효모를 배양한 후, 카탈라아제 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자로부터 생성된 mRNA 또는 단백질을 정량한다. mRNA 또는 단백질의 정량은 공지의 기술을 이용함으로써 실시될 수 있다. 예를 들어, mRNA 는 노던 (Northern) 혼성화 또는 정량적 RT-PCR 로 정량할 수 있고, 단백질은, 예를 들어, 웨스턴 블랏팅 (Western blotting) 으로 정량할 수 있다(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003). 나아가, 시험 효모의 발효 후에 수득된 발효액의 아황산염 농도를 측정함으로써 상기 시험 효모의 상기 동정된 유전자의 발현 수준을 추정할 수도 있다.

또한, 시험 효모를 배양하고, 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가지며, 카탈라아제 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수 준을 측정하여 표적 카탈라아제 활성에 따른 유전자 발현 수준을 가진 시험 효모를 선별함으로써, 목적하는 알콜성 음료를 양조하는데 유리한 효모를 선별한다. 또한, 참조 효모 및 시험 효모를 배양하여 각 효모에서의 상기 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교하여, 유리한 시험 효모를 선별할 수도 있다. 더욱 구체적으로, 예를 들어, 참조 효모 및 하나 이상의 시험 효모를 배양하고, 각 효모에서 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가지며 카탈라아제 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정한다. 참조 효모에서보다 유전자가 더 많이 발현되는 시험 효모를 선별함으로써, 알콜성 음료를 양조하는데 적당한 효모를 선별할 수 있다.

다르게는, 시험 효모를 배양하고, 카탈라아제 활성이 더 높은 효모를 선별함으로써, 목적하는 알콜성 음료를 양조하는데 적당한 효모를 선별할 수 있다.

이들 경우에, 시험 효모 또는 참조 효모는, 예를 들어, 본 발명의 벡터가 도입된 효모, 인공적으로 변이유발된 효모 또는 자연적으로 변이유발된 효모일 수 있다. 상기 카탈라아제 활성은, 예를 들어, 문헌 [Osorio 등, Archives of Microbiology, 181(3), 231-236 (2004)] 의 방법으로 평가할 수 있다. 돌연변이 처리는, 예를 들어, 자외선 조사 및 방사선 조사와 같은 물리적 방법, 및 EMS (에틸메탄 술포네이트) 및 N-메틸-N-니트로소구아니딘과 같은 약품으로의 처리와 관련된 화학적 방법을 비롯한 임의의 방법을 이용할 수 있다(예컨대, 하기 참조: Yasuji Oshima Ed., Biochemistry Experiments vol. 39, Yeast Molecular Genetic Experiments, pp. 67-75, JSSP).

또한, 참조 효모 또는 시험 효모로 사용된 효모의 예로서는, 양조에 사용될 수 있는 임의의 효모, 예를 들어, 맥주, 와인, 사케 등을 위한 양조 효모를 들 수 있다. 더욱 구체적으로, 사카로마이세스 속과 같은 효모를 사용할 수 있다(예컨대, S. 파스토리아누스, S. 세레비지애 및 S. 칼스버겐시스). 본 발명에 따르면, 라거 양조 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 파스토리아누스 W34/70; 사카로마이세스 칼스버겐시스 NCYC453 또는 NCYC456; 또는 사카로마이세스 세레비지애 NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953 또는 NBRC1954 를 사용할 수 있다. 또한, 사카로마이세스 세레비지애 NCYC90 와 같은 위스키 효모; 일본양조협회로부터의 와인 효모 #1, 3 및 4 와 같은 와인 효모; 및 일본양조협회로부터의 사케 효모 #7 및 9 와 같은 사케 효모를 또한 사용할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서, 사카로마이세스 파스토리아누스와 같은 라거 양조 효모를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 참조 효모 및 시험 효모는 상기 효모들로부터 임의 조합으로 선택될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 참조하여 더욱 상세히 기술할 것이다. 그러나, 본 발명은 후술되는 실시예에 제한되지 않는다.

실시예 1: 라거 양조 효모의 카탈라아제를 인코딩하는 유전자 (비(非)-ScCTA1) 의 클로닝

라거 양조 효모에 특이적인 카탈라아제를 인코딩하는 유전자 (비(非)-ScCTA1 유전자; 서열번호: 1) 는 일본 특허 출원 공개공보 제 2004-283169 호에 기재된 비 교 데이터베이스를 이용한 검색의 결과로서 발견되었다. 획득한 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여, 프라이머들인 비(非)-ScCTA1_for (서열번호: 5) 및 비(非)-ScCTA1_rv (서열번호: 6) 을 상기 유전자의 전장 (full-length) 을 증폭하도록 설계하였다. 게놈 서열분석 균주인 사카로마이세스 파스토리아누스 Weihenstephan 34/70 (간혹 "W34/79 균주"로 약기됨) 의 염색체 DNA 를 주형으로 사용하여 PCR 을 수행하여, 비(非)-ScCTA1 의 전장 유전자가 포함된 DNA 절편을 수득하였다.

이렇게 수득한 비(非)-ScCTA1 유전자 절편을 TA 클로닝에 의해 pCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen 사 제조) 내로 삽입하였다. 비(非)-ScCTA1 유전자의 뉴클레오티드 서열을 Sanger 방법 (F. Sanger, Science, 214: 1215, 1981) 으로 분석하여 뉴클레오티드 서열을 확인하였다.

실시예 2: 맥주 발효 동안의 비(非)- ScCTA1 유전자의 발현 분석

라거 양조 효모인 사카로마이세스 파스토리아누스 34/70 을 사용하여 맥주 발효 시험을 수행하고, 발효 동안 효모 세포로부터 추출한 mRNA 를 효모 DNA 마이크로어레이로 분석하였다.

맥아즙 (wort) 추출물 농도 12.69%

맥아즙 함량 70 L

맥아즙에 용해된 산소 농도 8.6 ppm

발효 온도 15 ℃

효모 주입율 (pitching rate) 12.8 x 10⁶ 개 세포/mL

상기 발효주를 시간에 따라 표본추출하고, 효모 성장의 양 (도 1) 및 겉보기 추출물 농도 (도 2) 의 시간에 따른 변화를 관찰하였다. 동시에, 효모 세포를 표본추출하여 mRNA 를 준비하고, 상기 준비된 mRNA 를 비오틴으로 표지하여 이를 맥주 효모 DNA 마이크로어레이에 혼성화하였다. GCOS; GeneChip Operating Software 1.0 (Affymetrix Co. 제조) 을 사용하여 신호를 검출하였다. 비(非)-ScCTA1 유전자의 발현 패턴은 도 3 에 나타나 있다. 그 결과, 일반적인 맥주 발효에서 비(非)-ScCTA1 유전자가 발현된 것이 확인되었다.

실시예 3: 비(非)- ScCTA1 유전자-고도 발현 균주의 제조

실시예 1 에 기재된 비(非)-ScCTA1/pCR2.1-TOPO 를 제한효소들인 SacI 및 NotI 으로 절단하여, 비(非)-ScCTA1 유전자가 포함된 DNA 절편을 제조하였다. 상기 절편을 제한효소들인 SacI 및 NotI 으로 처리된 pUP3GLP2 에 결찰하여, 비(非)-ScCTA1 고도 발현 벡터 pUP-비(非)ScCTA1 을 구축하였다. 상기 효모 발현 벡터 pUP3GLP2 는 상동 재조합 부위에 오로티딘-5-인산 탈탄산효소 유전자 URA3 을 가진 YIp 형 (염색체 통합형) 효모 발현 벡터이다. 상기 도입된 유전자를 글리세릴알데히드-3-인산 탈수소효소 유전자인 TDH3 의 프로모터 및 종결자에 의해 고도 발현시켰다. 효모용 선별 마커로서의 약물-저항성 유전자 YAP1 를 갈락토키나아제 GAL1 의 프로모터 및 종결자의 제어 하에 도입하여, 갈락토오스를 함유한 배양 배지에서 이의 발현을 유도하였다. 대장균 (E. coli) 용 선별 마커로서의 암피실린-저항성 유전자 Amp^r 를 또한 포함시켰다.

상기 방법으로 제조된 고도 발현 벡터를 사용하여, 사카로마이세스 파스토리아누스 Weihenstephaner 164 를 일본 특허 출원 공개공보 제 07-303475 호에 기재된 방법으로 형질전환시켰다. 1.0 mg/L 의 세룰레닌이 함유된 YPGal 플레이트 배지 (1% 효모 추출물, 2% 폴리펩톤, 2% 갈락토오스 및 2% 한천) 에서 세룰레닌-저항성 균주를 선별하였다.

실시예 4: 맥주 발효 동안 생성된 아황산염의 양의 분석

실시예 3 에서 수득한 비(非)-ScCTA1-고도 발현 균주 및 모 균주를 사용하여 하기 조건 하에서 발효 시험을 수행하였다.

맥아즙 추출물 농도 12.87%

맥아즙 함량 2 L

맥아즙에 용해된 산소 농도 대략 8 ppm

발효 온도 15 ℃, 항온

효모 주입율 맥아즙 2 L 당 젖은 효모 세포 10.5 g

상기 발효액을 시간에 따라 표본 추출하여 시간에 따른 세포 성장 (OD660) (도 4) 및 추출물 소비량 (도 5) 을 관찰하였다. 발효 완료 시 산성 조건 하에서의 증류 및 알칼리를 이용한 적정에 의해 아황산염을 과산화수소 수용액 내로 수집함으로써 아황산염 농도의 정량을 수행하였다(Revised BCOJ Beer Analysis Method, 일본양조협회).

도 6 에 나타난 바와 같이, 비(非)-ScCTA1-고도 발현 균주는 아황산염을 모 균주에서보다 대략 2.5 배 더 많이 생성하였다. 또한, 본 시험에서 세포 성장 및 추출물 소비량에 있어서는 모 균주 및 고도 발현 균주간에 유의미한 차이가 관찰되지 않았다.

실시예 5: 카탈라아제를 인코딩하는 유전자 ( ScCTA1 ) 의 클로닝

라거 양조 효모에 특이적인 카탈라아제를 인코딩하는 유전자 (ScCTA1 유전자; 서열번호: 3) 는 일본 특허 출원 공개공보 제 2004-283169 호에 기재된 비교 데이터베이스를 이용한 검색의 결과로서 발견되었다. 상기 획득한 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여, 프라이머들인 ScCTA1_for (서열번호: 7) 및 ScCTA1_rv (서열번호: 8) 를 상기 전장 유전자를 증폭하도록 각각 설계하였다. 게놈 서열분석 균주인 사카로마이세스 파스토리아누스 Weihenstephan 34/70 균주의 염색체 DNA 를 주형으로 사용하여 PCR 을 수행하여, ScCTA1 의 전장 유전자가 포함된 DNA 절편을 수득하였다.

이렇게 수득한 ScCTA1 유전자 절편을 TA 클로닝에 의해 pCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen 사 제조) 내로 삽입하였다. ScCTA1 유전자의 뉴클레오티드 서열을 Sanger 방법 (F. Sanger, Science, 214: 1215, 1981) 으로 분석하여 뉴클레오티드 서열을 확인하였다.

실시예 6: 맥주 발효 동안의 ScCTA1 유전자의 발현 분석

라거 양조 효모인 사카로마이세스 파스토리아누스 34/70 균주를 사용하여 맥주 발효 시험을 수행한 후, 발효 동안 효모 세포로부터 추출한 mRNA 를 효모 DNA 마이크로어레이로 분석하였다.

맥아즙 추출물 농도 12.69%

맥아즙 함량 70 L

맥아즙에 용해된 산소 농도 8.6 ppm

발효 온도 15 ℃

효모 주입율 12.8 x 10⁶ 개 세포/mL

상기 발효주를 시간에 따라 표본추출하고, 효모 성장의 양 (도 7) 및 겉보기 추출물 농도 (도 8) 의 시간에 따른 변화를 관찰하였다. 동시에, 효모 세포를 표본추출하여 mRNA 를 준비하고, 상기 준비된 mRNA 를 비오틴으로 표지하여 이를 맥주 효모 DNA 마이크로어레이에 혼성화하였다. GCOS; GeneChip Operating Software 1.0 (Affymetrix Co. 제조) 을 사용하여 신호를 검출하였다. ScCTA1 유전자의 발현 패턴은 도 9 에 나타나 있다. 그 결과, 일반적인 맥주 발효에서 ScCTA1 유전자가 발현된 것이 확인되었다.

실시예 7: ScCTA1 -고도 발현 균주의 제조

실시예 5 에 기재된 ScCTA1/pCR2.1-TOPO 를 제한효소들인 SacI 및 NotI 으로 절단하여, ScCTA1 유전자가 포함된 DNA 절편을 제조하였다. 상기 절편을 제한효소들인 SacI 및 NotI 으로 처리된 pUP3GLP2 에 결찰하여, ScCTA1 고도 발현 벡터 pUP-ScCTA1 을 구축하였다.

상기 방법으로 제조된 고도 발현 벡터를 사용하여, 사카로마이세스 파스토리 아누스 Weihenstephaner 164 균주를 일본 특허 출원 공개공보 제 H7-303475 호에 기재된 방법으로 형질전환시켰다. 1.0 mg/L 의 세룰레닌이 함유된 YPGal 플레이트 배지 (1% 효모 추출물, 2% 폴리펩톤, 2% 갈락토오스 및 2% 한천) 에서 세룰레닌-저항성 균주를 선별하였다.

실시예 8: 맥주 발효 동안 생성된 아황산염의 양 분석

실시예 7 에서 수득한 ScCTA1-고도 발현 균주 및 모 균주를 사용하여 하기 조건 하에서 발효 시험을 수행하였다.

맥아즙 추출물 농도 12.87%

맥아즙 함량 2 L

맥아즙에 용해된 산소 농도 대략 8 ppm

발효 온도 15 ℃, 항온

효모 주입율 맥아즙 2 L 당 젖은 효모 세포 10.5 g

상기 발효액을 시간에 따라 표본 추출하여 시간에 따른 세포 성장 (OD660) (도 10) 및 추출물 소비량 (도 11) 을 관찰하였다. 발효 완료 시 산성 조건 하에서의 증류 및 알칼리를 이용한 적정에 의해 아황산염을 과산화수소 수용액 내로 수집함으로써 아황산염 농도의 정량을 수행하였다(Revised BCOJ Beer Analysis Method, 일본양조협회).

도 12 에 나타난 바와 같이, ScCTA1-고도 발현 균주는 아황산염을 모 균주에서보다 대략 2.1 배 더 많이 생성하였다. 또한, 본 시험에서 세포 성장 및 추출물 소비량에 있어서는 모 균주 및 고도 발현 균주간에 유의미한 차이가 관찰되지 않았다.

산업상 이용 가능성

본 발명의 알콜성 음료의 제조 방법에 따르면, 생성물 내에서 항산화 효과를 갖는 아황산염의 양을 증가시킴으로 인해, 풍미 안정성이 뛰어나고 저장 수명이 더 긴 알콜성 음료를 제조할 수 있다.

도 1 은 맥주 발효 시험시의 시간에 따른 세포 성장을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내고, 세로축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.

도 2 는 맥주 발효 시험 시의 시간에 따른 추출물 소비량을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내고, 세로축은 겉보기 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.

도 3 은 맥주 발효 시험 시의 효모에서의 비(非)-ScCTA1 유전자의 발현 거동을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내고, 세로축은 검출된 신호의 휘도를 나타낸다.

도 4 는 비(非)-ScCTA1-고도 발현 균주를 사용한 맥주 발효 시험 시의 시간에 따른 세포 성장을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내고, 세로축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.

도 5 는 비(非)-ScCTA1-고도 발현 균주를 사용한 맥주 발효 시험 시의 시간에 따른 추출물 소비량을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내고, 세로축은 겉보기 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.

도 6 은 비(非)-ScCTA1-고도 발현 균주를 사용한 맥주 발효 시험 동안의 (발효 완료 시의) 발효액 중의 아황산염 농도를 나타낸다.

도 7 은 맥주 발효 시험 시의 시간에 따른 세포 성장을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내고, 세로축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.

도 8 은 맥주 발효 시험 시의 시간에 따른 추출물 소비량을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내고, 세로축은 겉보기 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.

도 9 는 맥주 발효 시험 시의 효모에서의 ScCTA1 유전자의 발현 거동을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내고, 세로축은 검출된 신호의 휘도를 나타낸다.

도 10 은 ScCTA1-고도 발현 균주를 사용한 맥주 발효 시험 시의 시간에 따른 세포 성장을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내고, 세로축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.

도 11 은 ScCTA1-고도 발현 균주를 사용한 맥주 발효 시험 시의 시간에 따른 추출물 소비량을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내고, 세로축은 겉보기 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.

도 12 는 ScCTA1-고도 발현 균주를 사용한 맥주 발효 시험 동안의 (발효 완료 시의) 발효액 중의 아황산염 농도를 나타낸다.

<110> Suntory Limited <120> Catalase gene and use thereof <130> G07-0108 <140> PCT/JP2006/326309 <141> 2006-12-22 <150> JP2006-53951 <151> 2006-02-28 <160> 8 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1542 <212> DNA <213> Saccharomyces sp. <400> 1 atgtcaggac aagaggagaa taaagtaaat tcttctgacg taagaaagga tagagttgtg 60 acgaactcta ctggtaatcc catcaatgag ccatttgtca cccagcgtgt tggggagcac 120 gggcctttgc ttttacaaga ttataaccta ctcgattctt tggcgcattt taacagggag 180 aatattcctc aaagaaatcc tcacgcccac ggttctgggg ccttcggtta ttttgaagtg 240 acagacgata ttacagatgt ttgtgggtct gccatgttta gcaagatcgg taagagaacg 300 aagtgtctga caagattctc cactgtgggt ggtgataaag gtagtgccga tactgttcgt 360 gacccaagag ggtttgcaac taaattctac acagaagaag gtaatttgga ttgggtctac 420 aacaatacac ctgtattttt tatcagggat ccttcgaaat tcccccattt tatccacacg 480 cagaagagaa acccgcaaac taatctaaga gacgctgata tgttttggga tttccttacg 540 actccagaga atcaagtggc catccatcaa gtcatgattc tcttttcaga ccgtggtact 600 cctgcgagct atcgtaacat gcacggatat tctggtcata cttataaatg gtcaagtaaa 660 aacggcgatt ggcgttatgt gcaagtccat attaaaacca atcaaggggt caagaatttg 720 actatagacg aagccactaa aatcgcaggg tccaacccag attactgcca aaaagacttg 780 tttgaatcta tccaaagcgg taactatcca tcgtggactg tttatattca aacaatgact 840 gaacaggagg ccaagaattt accattttcg gtctttgact tgaccaaggt atggcctcaa 900 aagcaattcc cattacgtcg tgtaggcaaa cttgttctga atgaaaatcc actgaatttc 960 ttcgcacaag tggaacaagc agcgtttgcc cctagtacta ctgtcccata ccaagaagcc 1020 agtgctgatc cggtgctaca agctcgatta ttttcttatg cagatgctca cagatacaga 1080 ctgggcccca atttccatca aatacccgtc aactgtccct atgcctccaa gttttttaac 1140 cctgccatca gagatggccc aatgaacgta aatggaaatt ttggttcaga acctacctat 1200 ttagccaacg acaaatcata ctcgtatatt cagcaagaaa gacctattca acaacatcaa 1260 gaagtatgga acggacccgc tatcccttac cactgggcaa catctccagg tgatgtcgat 1320 tatgttcaag ctaggaattt gtaccgcgtc ttagggaagc aacctggaca acaaaagaac 1380 ctagctcaca acatcggtat ccatgtagag ggcgcctgcc ctggaatcca gcaacgggtt 1440 tacgatatgt ttgcccgcgt agataaggga ctatctgatg cgatcaagaa agaagcagag 1500 gcaaaacacg ctgctgaact ttcaaataac tctaagtttt ga 1542 <210> 2 <211> 513 <212> PRT <213> Saccharomyces sp. <400> 2 Met Ser Gly Gln Glu Glu Asn Lys Val Asn Ser Ser Asp Val Arg Lys 1 5 10 15 Asp Arg Val Val Thr Asn Ser Thr Gly Asn Pro Ile Asn Glu Pro Phe 20 25 30 Val Thr Gln Arg Val Gly Glu His Gly Pro Leu Leu Leu Gln Asp Tyr 35 40 45 Asn Leu Leu Asp Ser Leu Ala His Phe Asn Arg Glu Asn Ile Pro Gln 50 55 60 Arg Asn Pro His Ala His Gly Ser Gly Ala Phe Gly Tyr Phe Glu Val 65 70 75 80 Thr Asp Asp Ile Thr Asp Val Cys Gly Ser Ala Met Phe Ser Lys Ile 85 90 95 Gly Lys Arg Thr Lys Cys Leu Thr Arg Phe Ser Thr Val Gly Gly Asp 100 105 110 Lys Gly Ser Ala Asp Thr Val Arg Asp Pro Arg Gly Phe Ala Thr Lys 115 120 125 Phe Tyr Thr Glu Glu Gly Asn Leu Asp Trp Val Tyr Asn Asn Thr Pro 130 135 140 Val Phe Phe Ile Arg Asp Pro Ser Lys Phe Pro His Phe Ile His Thr 145 150 155 160 Gln Lys Arg Asn Pro Gln Thr Asn Leu Arg Asp Ala Asp Met Phe Trp 165 170 175 Asp Phe Leu Thr Thr Pro Glu Asn Gln Val Ala Ile His Gln Val Met 180 185 190 Ile Leu Phe Ser Asp Arg Gly Thr Pro Ala Ser Tyr Arg Asn Met His 195 200 205 Gly Tyr Ser Gly His Thr Tyr Lys Trp Ser Ser Lys Asn Gly Asp Trp 210 215 220 Arg Tyr Val Gln Val His Ile Lys Thr Asn Gln Gly Val Lys Asn Leu 225 230 235 240 Thr Ile Asp Glu Ala Thr Lys Ile Ala Gly Ser Asn Pro Asp Tyr Cys 245 250 255 Gln Lys Asp Leu Phe Glu Ser Ile Gln Ser Gly Asn Tyr Pro Ser Trp 260 265 270 Thr Val Tyr Ile Gln Thr Met Thr Glu Gln Glu Ala Lys Asn Leu Pro 275 280 285 Phe Ser Val Phe Asp Leu Thr Lys Val Trp Pro Gln Lys Gln Phe Pro 290 295 300 Leu Arg Arg Val Gly Lys Leu Val Leu Asn Glu Asn Pro Leu Asn Phe 305 310 315 320 Phe Ala Gln Val Glu Gln Ala Ala Phe Ala Pro Ser Thr Thr Val Pro 325 330 335 Tyr Gln Glu Ala Ser Ala Asp Pro Val Leu Gln Ala Arg Leu Phe Ser 340 345 350 Tyr Ala Asp Ala His Arg Tyr Arg Leu Gly Pro Asn Phe His Gln Ile 355 360 365 Pro Val Asn Cys Pro Tyr Ala Ser Lys Phe Phe Asn Pro Ala Ile Arg 370 375 380 Asp Gly Pro Met Asn Val Asn Gly Asn Phe Gly Ser Glu Pro Thr Tyr 385 390 395 400 Leu Ala Asn Asp Lys Ser Tyr Ser Tyr Ile Gln Gln Glu Arg Pro Ile 405 410 415 Gln Gln His Gln Glu Val Trp Asn Gly Pro Ala Ile Pro Tyr His Trp 420 425 430 Ala Thr Ser Pro Gly Asp Val Asp Tyr Val Gln Ala Arg Asn Leu Tyr 435 440 445 Arg Val Leu Gly Lys Gln Pro Gly Gln Gln Lys Asn Leu Ala His Asn 450 455 460 Ile Gly Ile His Val Glu Gly Ala Cys Pro Gly Ile Gln Gln Arg Val 465 470 475 480 Tyr Asp Met Phe Ala Arg Val Asp Lys Gly Leu Ser Asp Ala Ile Lys 485 490 495 Lys Glu Ala Glu Ala Lys His Ala Ala Glu Leu Ser Asn Asn Ser Lys 500 505 510 Phe <210> 3 <211> 1548 <212> DNA <213> Saccharomyces sp. <400> 3 atgtcgaaat tgggacaaga aaaaaatgaa gtaaattcct ctgatgtaag agaggataga 60 gttgtgacaa actccactgg taatccaatc aatgaaccat ttgtcaccca acgtattgga 120 gaacatggcc ctttgctttt gcaagattat aacttaattg attctttggc tcatttcaac 180 agggaaaata ttcctcaaag gaatccacat gctcatggtt ctggtgcctt cggctatttt 240 gaagtaaccg atgacattac tgatatctgc gggtctgcta tgtttagtaa aattgggaaa 300 agaacgaaat gtctaacaag attttcgact gtgggtggtg ataaaggtag tgccgacacg 360 gttcgtgatc caagggggtt tgccaccaaa ttctacactg aagaaggtaa tttagattgg 420 gtctacaata atacaccggt attctttatc agagaccctt ccaagttccc tcactttatc 480 cacacacaga agagaaaccc acaaaccaac ctaagggatg ctgacatgtt ttgggatttc 540 ctcaccactc ctgaaaatca ggtggccatt catcaagtaa tgatcctttt ttcagaccgt 600 ggtacccctg ccaactaccg tagtatgcat ggttattctg gtcataccta taaatggtcc 660 aataaaaacg gagattggca ttatgtgcaa gttcatatca aaaccgatca aggaataaag 720 aatttgacca tagaagaggc taccaaaatt gcgggatcca atccagatta ctgccagcag 780 gatttatttg aggctattca gaatggaaac tatccttcct ggacagttta tattcaaaca 840 atgaccgaac gcgatgccaa aaaattacca ttttcagtct ttgatttgac taaagtatgg 900 cctcaggggc aattcccttt acggcgtgtg ggtaagattg ttttgaacga gaatccactg 960 aacttcttcg cacaggtgga acaagctgcc ttcgccccca gtaccacggt tccttaccaa 1020 gaagcaagcg ctgatccagt attacaggcc cgtttgtttt catatgcgga tgctcataga 1080 tacaggctag gtcctaactt ccatcaaata cccgtaaact gtccatatgc atctaaattt 1140 ttcaatcccg ctatcagaga tggaccgatg aatgttaacg gcaacttcgg ctcagaacct 1200 acatatttgg ccaatgataa atcgtacacg tatatccaac aggacagacc cattcaacaa 1260 caccaagagg tatggaatgg gccagctatc ccttatcatt gggcaacatc cccaggtgat 1320 gtagatttcg tgcaagcaag aaatctctat cgcgttttgg gtaaacaacc tggacagcaa 1380 aagaacttgg catataacat cggcattcat gtagaaggcg cctgtcctca aatacagcag 1440 cgcgtttatg atatgtttgc tcgtgttgat aagggactat ctgaggcaat taaaaaagta 1500 gctgaggcaa aacatgcttc tgagctttcg agtaactcca aattttga 1548 <210> 4 <211> 515 <212> PRT <213> Saccharomyces sp. <400> 4 Met Ser Lys Leu Gly Gln Glu Lys Asn Glu Val Asn Ser Ser Asp Val 1 5 10 15 Arg Glu Asp Arg Val Val Thr Asn Ser Thr Gly Asn Pro Ile Asn Glu 20 25 30 Pro Phe Val Thr Gln Arg Ile Gly Glu His Gly Pro Leu Leu Leu Gln 35 40 45 Asp Tyr Asn Leu Ile Asp Ser Leu Ala His Phe Asn Arg Glu Asn Ile 50 55 60 Pro Gln Arg Asn Pro His Ala His Gly Ser Gly Ala Phe Gly Tyr Phe 65 70 75 80 Glu Val Thr Asp Asp Ile Thr Asp Ile Cys Gly Ser Ala Met Phe Ser 85 90 95 Lys Ile Gly Lys Arg Thr Lys Cys Leu Thr Arg Phe Ser Thr Val Gly 100 105 110 Gly Asp Lys Gly Ser Ala Asp Thr Val Arg Asp Pro Arg Gly Phe Ala 115 120 125 Thr Lys Phe Tyr Thr Glu Glu Gly Asn Leu Asp Trp Val Tyr Asn Asn 130 135 140 Thr Pro Val Phe Phe Ile Arg Asp Pro Ser Lys Phe Pro His Phe Ile 145 150 155 160 His Thr Gln Lys Arg Asn Pro Gln Thr Asn Leu Arg Asp Ala Asp Met 165 170 175 Phe Trp Asp Phe Leu Thr Thr Pro Glu Asn Gln Val Ala Ile His Gln 180 185 190 Val Met Ile Leu Phe Ser Asp Arg Gly Thr Pro Ala Asn Tyr Arg Ser 195 200 205 Met His Gly Tyr Ser Gly His Thr Tyr Lys Trp Ser Asn Lys Asn Gly 210 215 220 Asp Trp His Tyr Val Gln Val His Ile Lys Thr Asp Gln Gly Ile Lys 225 230 235 240 Asn Leu Thr Ile Glu Glu Ala Thr Lys Ile Ala Gly Ser Asn Pro Asp 245 250 255 Tyr Cys Gln Gln Asp Leu Phe Glu Ala Ile Gln Asn Gly Asn Tyr Pro 260 265 270 Ser Trp Thr Val Tyr Ile Gln Thr Met Thr Glu Arg Asp Ala Lys Lys 275 280 285 Leu Pro Phe Ser Val Phe Asp Leu Thr Lys Val Trp Pro Gln Gly Gln 290 295 300 Phe Pro Leu Arg Arg Val Gly Lys Ile Val Leu Asn Glu Asn Pro Leu 305 310 315 320 Asn Phe Phe Ala Gln Val Glu Gln Ala Ala Phe Ala Pro Ser Thr Thr 325 330 335 Val Pro Tyr Gln Glu Ala Ser Ala Asp Pro Val Leu Gln Ala Arg Leu 340 345 350 Phe Ser Tyr Ala Asp Ala His Arg Tyr Arg Leu Gly Pro Asn Phe His 355 360 365 Gln Ile Pro Val Asn Cys Pro Tyr Ala Ser Lys Phe Phe Asn Pro Ala 370 375 380 Ile Arg Asp Gly Pro Met Asn Val Asn Gly Asn Phe Gly Ser Glu Pro 385 390 395 400 Thr Tyr Leu Ala Asn Asp Lys Ser Tyr Thr Tyr Ile Gln Gln Asp Arg 405 410 415 Pro Ile Gln Gln His Gln Glu Val Trp Asn Gly Pro Ala Ile Pro Tyr 420 425 430 His Trp Ala Thr Ser Pro Gly Asp Val Asp Phe Val Gln Ala Arg Asn 435 440 445 Leu Tyr Arg Val Leu Gly Lys Gln Pro Gly Gln Gln Lys Asn Leu Ala 450 455 460 Tyr Asn Ile Gly Ile His Val Glu Gly Ala Cys Pro Gln Ile Gln Gln 465 470 475 480 Arg Val Tyr Asp Met Phe Ala Arg Val Asp Lys Gly Leu Ser Glu Ala 485 490 495 Ile Lys Lys Val Ala Glu Ala Lys His Ala Ser Glu Leu Ser Ser Asn 500 505 510 Ser Lys Phe 515 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gagctcatgt caggacaaga g 21 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 gcggccgctg acttctttac ttc 23 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gagctcatgt cgaaattggg acaagaaaaa aatgaa 36 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 gcggccgctc aaaatttgga gttactcgaa agctcaga 38

Claims

하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터:

(a) 서열번호: 4 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하거나, 또는 서열번호: 4 의 아미노산 서열에서 1 내지 10 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 이 때 상기 단백질은 강화된 아황산염 생성 능력을 갖는 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열번호: 4 의 아미노산 서열과의 일치성이 90% 이상이며 강화된 아황산염 생성 능력을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(c) 서열번호: 3 에 혼성화하거나 또는 고도의 엄격한 조건하에서 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화하며, 강화된 아황산염 생성 능력을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항의 벡터가 도입된 효모.
제 2 항에 있어서, 아황산염 생성 능력이 강화된 효모.
제 2 항의 효모를 배양하는 것을 포함하는 알콜성 음료의 제조 방법.
제 4 항에 있어서, 양조된 알콜성 음료가 맥아 음료인 알콜성 음료의 제조 방법.
제 4 항에 있어서, 양조된 알콜성 음료가 와인인 알콜성 음료의 제조 방법.
제 4 항의 방법에 의해 제조된 알콜성 음료.
서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가지며 강화된 아황산염 생성 능력을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 설계된 프라이머 또는 탐침자 (probe) 를 사용하는 것을 포함하는, 시험 효모의 아황산염 생성 능력 평가 방법.
하기를 포함하는 시험 효모의 아황산염 생성 능력 평가 방법: 시험 효모를 배양함; 및 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가지며 강화된 아황산염 생성 능력을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함.
하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 시험 효모를 배양함; 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가지며 강화된 아황산염 생성 능력을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 표적 아황산염 생성 능력에 따른 상기 단백질 양 또는 상기 유전자 발현 수준을 갖는 시험 효모를 선별함.
제 10 항에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가지며 강화된 아황산염 생성 능력을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 참조 효모에서보다 상기 유전자가 더 많이 발현된 시험 효모를 선별함.
하기를 포함하는 알콜성 음료의 제조 방법: 제 2 항에 따른 효모를 이용하여 알콜성 음료의 제조를 위한 발효를 수행함; 및 아황산염 농도를 조절함.
하기를 포함하는 알콜성 음료의 제조 방법: 제 10 항에 따른 효모를 이용하여 알콜성 음료의 제조를 위한 발효를 수행함; 및 아황산염 농도를 조절함.