KR20100024508A

KR20100024508A - 시스테인 합성효소 유전자 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20100024508A
Application number: KR1020107001606A
Authority: KR
Inventors: 요시히로 나카오; 유키코 고다마; 도모코 시모나가
Original assignee: 산토리 홀딩스 가부시키가이샤
Priority date: 2005-08-22
Filing date: 2006-08-21
Publication date: 2010-03-05
Also published as: WO2007023973A1; US20090123599A1; KR20070122475A; AU2006282317A1; CA2602486A1; DK1869175T3; CN1920043B; AU2006282317B2; CN102191261A; CN1920043A; JP4460004B2; EP1869175A1; JP2008529477A; EP1869175B1

Abstract

본 발명은 조절된 황화수소-생성 능력을 가진 양조 효모, 조절된 황화수소 양을 가진 알콜 음료를 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 제품의 향을 증가시키는 황화수소-생성 능력이 양조 효모 시스테인 합성효소 Ygr012wp 를 암호화하는 YGR012W 유전자, 특히 라거 양조 효모에 특이적인 비-ScYGR012W 유전자의 발현 수준을 향상시킴으로써 조절되는 효모, 및 상기 효모를 이용해 알콜 음료를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

시스테인 합성효소 유전자 및 그의 용도 {CYSTEINE SYNTHASE GENE AND USE THEREOF}

본 발명은 시스테인 합성효소 유전자 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 탁월한 향의 알콜 음료를 제조하는 양조용 효모, 그러한 효모를 사용하여 제조된 알콜 음료, 및 그러한 알콜 음료의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 양조용 효모 내 시스테인 합성효소 YgrO12wp 의 유전암호를 지정하는 YGR012W 유전자, 특히 맥주 효모에 특이적인 비-ScYGR012W 유전자, 또는 ScYGR012W 유전자의 발현 수준을 증가시킴으로써 제품의 향을 향상시키는 효모, 및 그러한 효모를 사용하여 알콜 음료를 제조하는 방법에 관한 것이다.

시판의 필스너-형 (Pilsner-유형) 담채색 맥주의 제조에 사용되는 맥주 효모는 1 차 발효 단계 동안에 황화수소를 형성하는 성질을 가지고 있다. 이러한 황화수소는 맥주 품질에 바람직하지 못한 미숙성 맥주 향의 원인 중 하나이다. 이러한 향을 역치 수준 미만으로 감소시키기 위해, 2 차 발효 기간의 연장 또는 숙성 기간의 연장이 수행된다.

맥주 내 황화수소의 수준을 저하시키기 위해, 황화수소의 형성에 영향을 미치는 요소에 관한 연구 (Jangaard, N.O., Gress, H.S. and Coe, R. W.: Amer. Soc. Brew. Chem. Proc, p. 46 (1973) ; Kuroiwa, Y. and Hashimoto, N.: Brew. Dig., 45, 44 (1970) ; Hysert, D.W. and Morrison, N.M.: J. Amer. Soc. Brew. Chem., 34, 25 (1976)), 및 돌연변이 과정 또는 세포 융합 과정을 이용한 저 황화수소 생성 효모의 개발에 대한 연구 (Molzahm, S.W.: J. Amer. Soc. Brew. Chem., 35, 54 (1977)) 가 보고되어 왔다.

상기 모든 방법은 효모에 의해 생성되는 황화수소의 양을 감소시킬 뿐만 아니라, 효모의 기타 양조 특성 (발효 속도, 맥주 향) 에도 영향을 미친다. 따라서, 맥주 양조에 적합한 효모는 아직 개발되지 않았다. 최근, 유전자 조작 기술을 이용한 양조용 효모의 개발이 수행되고 있다. 일본 특허 출원 공개 제 H5-244955 호는, 시스타티오닌 β-합성효소를 암호화하는 DNA 절편이 삽입된 맥주 효모가 황화수소의 생성을 감소시킨다고 개시하였다. 그러나, 감소율이 작았다. 즉, 형질전환체에 의해 생성된 황화수소의 양은 모 계통에 의해 생성된 것의 약 60 내지 80% 였다.

효모 대사에서, 황화수소는 배지로부터 취해지는 황산염 이온 (SO₄ ^2-) 을 환원시키는 과정에서 생성된다. 이러한 대사 시스템은 메티오닌 및 시스테인과 같은 황-함유 아미노산의 생합성 경로이다. 상기 경로의 각 단계에 참여되는 효소 및 그의 유전자 (MET17 유전자) 에 대한 상세한 연구가 공개되어 있다 ([Tabor, H. and Tabor, C. W., eds., Methods in Enzymobgy, Vol. 17B (London: Academic Press, 1971)] ; 및 [Jakoby, W.B. and Griffith, O. W., eds., Methods in Enzymology, Vol. 143 (London: Academic Press, 1987)] 참조).

O-아세틸호모세린술프하이도렐레이스 (O-acetylhomoserinesulfhydorelae) 는 황 원자를 황화수소로부터 O-아세틸호모세린으로 옮기는 효소이고, MET17 유전자에 의해 암호화된다. 이 효소는 또한 황 원자를 O-아세틸세린으로 옮긴다. 사카로미세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) X2180-1A 로부터 MET17 유전자가 구성적으로 발현되는 맥주 효모 계통이 감소된 양의 황화수소를 생성하며, 그 수준은 모 계통에서의 수준의 약 2% 라는 것이 보고되어 있다 (일본 특허 출원 공개 제 H7-303475 호).

추가로, 시스테인 합성효소는 황 원자를 황화수소로부터 O-아세틸-L-세린으로 옮기는 효소이다. 효소의 유전자는 기타 미생물에서는 동정되었더라도, 사카로미세스 세레비시애에서는 동정되지 않았다.

최근, 수많은 게놈 서열이 결정되었다. 결정된 게놈 서열을 바탕으로, 유전자의 동정, 및 상기 유전자의 기능을 공지된 유전자와 비교한 추정을 수행하였다. 추가로, 비슷한 유전자 (즉, 2 가지 상이한 종의 유전자의 한 쌍, 여기서, 상기 유전자는 공유 조상의 동일한 유전자로부터 발생된 것이고, 유전자의 현재의 기능은 동일함) 를 개체의 수많은 게놈 서열에 존재하는 많은 유전자의 비교 분석에 의해 추정하였다. 사카로미세스 세레비시애 내 시스테인 합성효소를 암호화하는 유전자는 미생물 게놈의 유사 분석에 의해 YGR012W 인 것으로 추정된다 (R. L. Tatusov., M Y. Galperin., D. A Natale., E. V. Koonin.; Nucleoc. Acids. Research., 28, 33, 2000). 그러나, 상기 유전자의 기능은 실험적으로 확인되지 않았다. 또한, 상기 유전자가 황화수소의 생성량과 관계있는지 결정되지 않았다.

상기 언급된 바와 같이, 최종 생성물 내에서 생성되는 황화수소의 양을 저하시키기 위해, 변이체 계통이 개발하였다. 그 결과, 일부 경우에서 예상치못한 발효 지연 및 불쾌한 향 성분의 증가가 관찰되었고, 이는 상기 효모의 실용성에 있어서 문제가 된다. 따라서, 발효 속도나 생성물 품질을 손상시키지 않으면서, 황화수소를 거의 생성하지 않는 효모를 개발하는 방법에 관한 요구가 있었다.

본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위한 심도있는 연구를 수행하였고, 그 결과, 라거 (lager) 양조 효모로부터 시스테인 합성효소를 암호화하는 유전자를 동정 및 단리하는데 성공하였다.

더욱이, 수득된 유전자를 형질전환시키고 발현시킨 효모는 황화수소 생성량의 감소를 확인하도록 제조되었고, 그 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 라거 양조 효모에 존재하는 신규 시스테인 합성효소 유전자, 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질, 상기 유전자의 발현이 조절되는 형질전환 효모, 상기 유전자의 발현이 조절되는 효모를 사용하여 생성물 내 황화수소 생성량을 조절하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 하기 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 사용해 도입되는 형질전환 효모, 상기 형질전환 효모를 사용한 알콜 음료 제조 방법 등을 제공한다.

(1) 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 :

(a) SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ;

(b) SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ;

(c) 하나 이상의 아미노산이 소실, 치환, 삽입 및/또는 첨가된 SEQ ID NO:2 의 아마노산 서열로 이루어지고, 시스테인 합성효소 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ;

(d) SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열과 60% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열을 가지고, 시스테인 합성효소 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ;

(e) 엄격한 조건 하에 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고, 시스테인 합성효소 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ; 및

(f) 엄격한 조건 하에 SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고, 시스테인 합성효소 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.

(2) 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 (1) 의 폴리뉴클레오티드 :

(g) SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하거나, 또는 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (여기서, 그의 1 내지 10 개의 아미노산은 소실, 치환, 삽입 및/또는 첨가되고, 상기 단백질은 시스테인 합성효소 활성을 가짐) ;

(h) SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지고, 시스테인 합성효소 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 ; 및

(i) 엄격한 조건 하에 SEQ ID NO: 1 에 혼성화하거나, 또는 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화하고, 시스테인 합성효소 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.

(3) SEQ ID NO: 1 로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 (1) 의 폴리뉴클레오티드.

(4) SEQ ID NO: 2 로 이루어진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 (1) 의 폴리뉴클레오티드.

(5) 폴리뉴클레오티드가 DNA 인 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드.

(6) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 단백질.

(7) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.

(7a) 하기 성분을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 상기 (7) 의 벡터 :

(x) 효모 세포 내에서 전사될 수 있는 프로모터 ;

(y) 프로모터에 센스 또는 안티센스 방향으로 연결된 상기 (1) 내지 (5) 에서 기술된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 폴리뉴클레오티드 ; 및

(z) RNA 분자의 전사 종료 및 폴리아데닐화에 관해 효모 내에서 작용할 수 있는 신호.

(8) 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 :

(j) SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하거나, 또는 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 그의 1 내지 10 개의 아미노산은 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가되고, 상기 단백질은 시스테인 합성효소 활성을 가짐 ;

(k) SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 가지고, 시스테인 합성효소 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 ; 및

(l) 엄격한 조건 하에 SEQ ID NO: 5 에 혼성화하거나, 또는 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화하고, 시스테인 합성효소 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.

(9) 상기 (7) 또는 (8) 의 벡터가 삽입된 효모.

(10) 황화수소-생성 능력이 상기 (7) 또는 (8) 의 벡터를 도입합으로써 감소되는 상기 (9) 의 효모.

(11) 황화수소-생성 능력이 상기 (6) 의 단백질의 발현 수준을 증가시킴으로써 감소되는 상기 (10) 의 효모.

(12) 상기 (9) 내지 (11) 중 어느 하나의 효모를 사용하여 알콜 음료를 제조하는 방법.

(13) 양조주가 맥아 음료인, 상기 (12) 의 알콜 음료 제조 방법.

(14) 양조주가 와인인,상기 (12) 의 알콜 음료 제조 방법.

(15) 상기 (12) 내지 (14) 중 어느 하나의 방법에 의해 제조되는 알콜 음료.

(16) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 시스테인 합성효소 유전자의 뉴클레오티드 서열을 기준으로 디자인된 프라이머 또는 프로브를 사용하는 것을 포함하는, 테스트 효모를 그의 황화수소-생성 능력에 대해 평가하는 방법.

(16a) 상기 (16) 의 방법을 사용하여 낮은 황화수소-생성 능력을 가진 효모를 선별하는 방법.

(16b) 상기 (16a) 의 방법을 사용하여 선별된 효모를 사용하여 알콜 음료 (예를 들어, 맥주) 를 제조하는 방법.

(17) 테스트 효모를 배양하고 ; SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 시스테인 합성효소 유전자의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는, 테스트 효모를 그의 황화수소-생성 능력에 대해 평가하는 방법.

(17a) 상기 (17) 에서 기술된 방법에 의해 테스트 효모를 평가하고, 시스테인 합성효소 유전자의 높은 발현 수준을 갖는 효모를 선별하는 것을 포함하는, 낮은 황화수소-생성 능력을 가진 효모를 선별하는 방법.

(17b) 상기 (17a) 의 방법을 이용하여 선별된 효모를 사용하여 알콜 음료 (예를 들어, 맥주) 를 제조하는 방법.

(18) 테스트 효모를 배양하고 ; 상기 (6) 의 단백질을 정량화하거나 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 서열을 가진 시스테인 합성효소 유전자의 발현 수준을 측정하고 ; 황화수소를 생성하는 표적 능력에 따라 상기 단백질 양 또는 상기 유전자의 발현 수준을 갖는 테스트 효모를 선별하는 것을 포함하는, 효모 선별 방법.

(18a) 테스트 효모를 배양하고 ; 황화수소-생성 능력 또는 시스테인 합성효소 활성을 측정하고 ; 황화수소를 생성하는 표적 능력 또는 표적 시스테인 합성효소 활성을 갖는 테스트 효모를 선별하는 것을 포함하는 효모 선별 방법.

(19) 대조 효모 및 테스트 효모를 배양하고 ; 각 효모 내에서 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 시스테인 합성효소 유전자의 발현 수준을 측정하고 ; 대조 효모 내 것보다 더 높게 발현되는 유전자를 갖는 테스트 효모를 선별하는 것을 포함하는, 상기 (18) 의 효모 선별 방법.

(20) 대조 효모 및 테스트 효모를 배양하고 ; 각 효모 내 상기 (6) 의 단백질을 정량화하고 ; 대조 효모 내의 것보다 더 큰 양으로 상기 단백질을 갖는 테스트 효모를 선별하는 것을 포함하는, 상기 (18) 의 효모 선별 방법. 즉, 다수의 효모를 배양하고 ; 각 효모 내 상기 (6) 의 단백질을 정량화하고 ; 그로부터 단백질을 대량으로 갖는 테스트 효모를 선별하는 것을 포함하는, 상기 (18) 의 효모 선별 방법.

(21) (9) 내지 (11) 중 어느 하나에 따른 효모, 또는 (18) 내지 (20) 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 선별되는 효모를 사용하여 알콜 음료를 제조하기 위해 발효를 수행하고 ; 황화수소의 생성량을 조정하는 것을 포함하는, 알콜 음료 제조 방법.

맥주 발효 및 완제품 내 황화수소의 농도를 낮은 수준으로 유지함으로써 알콜 음료를 제조하는 본 발명의 방법은 훌륭한 향을 가진 알콜 음료를 제조하는데 사용될 수 있다. 시스테인 합성효소를 사용해 형질전환된 효모를 사용하여 알콜 음료를 제조하는 방법 (본 발명의 알콜 음료 제조 방법) 에 따르면, 황화수소는 시스테인 합성효소에 의해 재빨리 소비된다. 따라서, 황화수소의 농도가 맥주 발효 및 완제품 내에서 저하될 수 있어서, 훌륭한 향을 가진 알콜 음료가 제조될 수 있다.

도 1 은 맥주의 시험 양조 시 시간에 따른 세포 성장을 보여준다. 수평축은 발효 시간을 나타내는 한편, 수직축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.
도 2 는 맥주의 시험 양조 시 시간에 따른 추출물 소비를 보여준다. 수평축은 발효 시간을 나타내는 한편, 수직축은 외관상 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.
도 3 은 맥주의 시험 양조 시 효모 내 비-ScYGRO12W 유전자의 발현 거동을 보여준다. 수평축은 발효 시간을 나타내는 한편, 수직축은 검출된 신호의 세기를 나타낸다.
도 4 는 모 계통 및 비-ScYGR012W 고도 발현 계통을 사용한 맥주의 시험 양조 시 시간에 따른 세포 성장을 보여준다. 수평축은 발효 시간을 나타내는 한편, 수직축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.
도 5 는 모 계통 및 비-ScYGR012W 고도 발현 계통을 사용한 맥주의 시험 양조 시 시간에 따른 당 (sugar) 소비를 보여준다. 수평축은 발효 시간을 나타내는 한편, 수직축은 외견상 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.
도 6 은 맥주의 시험 양조 시 시간에 따른 세포 성장을 보여준다. 수평축은 발효 시간을 나타내는 한편, 수직축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.
도 7 은 맥주의 시험 양조 시 시간에 따른 추출물 소비를 보여준다. 수평축은 발효 시간을 나타내는 한편, 수직축은 외관상 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.
도 8 은 맥주의 시험 양조 시 효모 내 ScYGRO12W 유전자의 발현 거동을 보여준다. 수평축은 발효 시간을 나타내는 한편, 수직축은 검출된 신호의 세기를 나타낸다.
도 9 는 모 계통 및 ScYGR012W 고도 발현 계통을 사용한 맥주의 시험 양조 시 시간에 따른 세포 성장을 보여준다. 수평축은 발효 시간을 나타내는 한편, 수직축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.
도 10 은 모 계통 및 ScYGR012W 고도 발현 계통을 사용한 맥주의 시험 양조 시 시간에 따른 세포 성장을 보여준다. 수평축은 발효 시간을 나타내는 한편, 수직축은 외관상 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.

본 발명자들은 효모의 시스테인 합성효소 활성을 증가시킴으로써 황화수소를 효과적으로 저하시킬 수 있다고 생각하였다. 본 발명자들은 이 개념을 바탕으로 연구하였고, 그 결과, 일본 특허 출원 공개 제 2004-283169 호에서 개시된 방법에 따라 지도화된 라거 양조 효모 게놈 정보를 바탕으로 라거 양조 효모에 특이적인 시스테인 합성효소를 암호화하는 비-ScYGR012W 유전자를 단리 및 동정하였다. 상기 유전자의 뉴클레오티드 서열을 SEQ ID NO: 1 로 나타낸다. 또한, 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 2 로 나타낸다. 또한, 본 발명자들은 라거 양조 효모의 시스테인 합성효소를 암호화하는 ScYGRO12W 유전자를 단리 및 동정하였다. 상기 유전자의 뉴클레오티드 서열을 SEQ ID NO: 5 로 나타낸다. 추가로, 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 6 으로 나타낸다.

1. 본 발명의 폴리뉴클레오티드

우선, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ; 및

(b) SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 일 수 있다.

본 발명의 표적 폴리뉴클레오티드는 더 큰 양조 효모로부터 유도된 시스테인 합성효소 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 제한되지 않으며, 상기 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 다른 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 동등한 기능을 가진 단백질에는 예를 들어, (c) 그의 하나 이상의 아미노산이 소실, 치환, 삽입 및/또는 첨가되는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열의, 시스테인 합성효소 활성을 가진 단백질이 포함된다.

그러한 단백질은 예를 들어, 그의 1 내지 100, 1 내지 90, 1 내지 80, 1 내지 70, 1 내지 60, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 39, 1 내지 38, 1 내지 37, 1 내지 36, 1 내지 35, 1 내지 34, 1 내지 33, 1 내지 32, 1 내지 31, 1 내지 30, 1 내지 29, 1 내지 28, 1 내지 27, 1 내지 26, 1 내지 25, 1 내지 24, 1 내지 23, 1 내지 22, 1 내지 21, 1 내지 20, 1 내지 19, 1 내지 18, 1 내지 17, 1 내지 16, 1 내지 15, 1 내지 14, 1 내지 13, 1 내지 12, 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6 (1 내기 수 개의 아미노산), 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1 개의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입 및/또는 첨가되는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열로 이루어지고, 시스테인 합성효소 활성을 가진 단백질을 포함한다. 일반적으로, 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가의 수는 바람직하게는 더 작다. 또한, 그러한 단백질은 (d) SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지고, 시스테인 합성효소 활성을 가진 단백질을 포함한다. 일반적으로, % 동일성은 바람직하게는 더 높다.

시스테인 합성효소 활성은, 예를 들어, [J. Biol. Chem. 45: 28187-28192 (1994)] 에 기술된 바와 같이 Thomas 등의 방법에 의해 측정될 수 있다.

더욱이, 본 발명은 또한, (e) 엄격한 조건 하에 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고, 시스테인 합성효소 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ; 및 (f) 엄격한 조건 하에 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 6 의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고, 시스테인 합성효소 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본원에서, "엄격한 조건 하에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드" 는, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드, 또는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 전부 또는 일부를 프로브로서 사용하여, 콜로니 혼성화 기술, 플라크 혼성화 기술, 서던 혼성화 기술 등에 의해 수득된, DNA 와 같은 폴리뉴클레오티드를 말한다. 혼성화 방법은 예를 들어, [MOLECULAR CLONING 3rd Ed., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons 1987-1997] 에 기술된 방법일 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "엄격한 조건" 은 낮은 엄격한 조건, 중간 정도 엄격한 조건, 또는 높은 엄격한 조건 중 어느 하나일 수 있다. "낮은 엄격한 조건" 은 예를 들어, 32℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "중간 정도 엄격한 조건" 은 예를 들어, 42℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "높은 엄격한 조건" 은 예를 들어, 50℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. 상기 조건 하에서, 더 높은 상동성을 가진 DNA 와 같은 폴리뉴클레오티드는 더 높은 온도에서 효율적으로 수득될 것으로 예상되나, 온도, 프로브 농도, 프로브 길이, 이온 세기, 시간, 염 농도 및 기타를 포함하여 다수의 요소가 혼성화 엄격성에 관여하며, 당업자는 유사한 엄격성을 실현하기 위해 상기의 요소들을 적절하게 선택할 수 있다.

시판의 키트가 혼성화에 사용되는데, 예를 들어, Alkphos Direct Labeling Reagents (Amersham Pharmacia) 가 사용될 수 있다. 이 경우, 첨부된 프로토콜에 따라, 표지된 프로브를 밤새 인큐베이션시킨 후, 막을 0.1% (w/v) SDS 를 함유하는 1 차 세정 완충액으로 55℃ 에서 세정하여, 혼성화된 DNA 와 같은 폴리뉴클레오티드를 검출한다.

혼성화될 수 있는 다른 폴리뉴클레오티드는 디폴트 변수를 사용하여 FASTA 및 BLAST 와 같은 상동성 연구 소프트웨어에 의해 계산된 바와 같이, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 약 60% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성은 Karlin 및 Altschul에 의한 알고리즘 BLAST 를 사용하여 결정될 수 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873, 1993). BLAST 알고리즘을 바탕으로 한 BLASTN 및 BLASTX 라고 하는 프로그램을 개발하였다 (Altschul SF 등, J. Mol. Biol. 215: 403, 1990). 뉴클레오티드 서열이 BLASTN 을 사용하여 서열화되는 경우, 상기 변수는 예를 들어, 스코어 = 100 및 워드 길이 = 12 이다. 아미노산 서열이 BLASTX 를 사용하여 서열화되는 경우, 변수는 예를 들어, 스코어 = 50 및 워드 길이 = 3 이다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우, 상기 프로그램의 각각에 대한 디폴트 변수를 적용한다.

2. 본 발명의 단백질

본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (l) 중 임의의 것에 의해 암호화되는 단백질을 제공한다. 본 발명의 바람직한 단백질은 그의 하나 또는 다수의 아미노산이 소실, 치환, 삽입 및/또는 첨가되는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열을 포함하고, 시스테인 합성효소 활성을 가진다.

그러한 단백질은 상기 언급된 수의 그의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입 및/또는 첨가되는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열을 갖고, 시스테인 합성효소 활성을 가진 단백질을 포함한다. 또한, 그러한 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열과 상기 기술된 바와 같이 상동성을 가지고, 시스테인 합성효소 활성을 가진 단백질을 포함한다.

그러한 단백질은 예를 들어, [MOLECULAR CLONING 3rd Ed., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Nuc. Acids. Res., 10: 6487 (1982), Proc Natl. Acad. Sci. USA 19: 6409 (1982), Gene 34: 315 (1985), Nuc. Acids. Res., 13 : 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1985)] 에 기술된 위치-특이적 돌연변이를 적용하여 수득될 수 있다.

본 발명의 단백질의 아미노산 서열 내 하나 이상의 아미노산 잔기의 소실, 치환, 삽입 및/또는 첨가는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 동일한 아미노산 서열 내에서 임의의 하나 이상의 위치에서 소실, 치환, 삽입 및/또는 첨가되는 것을 의미한다. 2 가지 이상의 유형의 소실, 치환, 삽입 및/또는 첨가가 동시에 발생할 수 있다.

이후, 서로 치환가능한 아미노산 잔기의 예를 열거한다. 동일한 군 내의 아미노산 잔기는 서로 치환가능하다. 상기 군은 하기에 제공된다.

A 군 : 루신, 이소루신, 노르루신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, o-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌 ;

B 군 : 아스파르트산, 글루탐산, 이소아스파르트산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산 ;

C 군 : 아스파라긴, 글루타민 ;

D 군 : 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산 ;

E 군 : 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린 ;

F 군 : 세린, 트레오닌, 호모세린 ; 및

G 군 : 페닐알라닌, 티로신.

본 발명의 단백질은 또한 Fmoc 방법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐 방법) 및 tBoc 방법 (t-부틸옥시카르보닐 방법) 과 같은 화학 합성 방법에 의해 생성될 수 있다. 또한, 예를 들어, [Advanced ChemTech, PerkinElmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimazu Corp.] 로부터 시판되는 펩티드 합성제가 또한 화학 합성에 사용될 수 있다.

3. 본 발명의 벡터 및 상기 벡터를 사용해 변형된 효모

다음, 본 발명은 상기 기술된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 상기 (a) 내지 (l) 에서 기술된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA) 중 임의의 것을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 일반적으로, 본 발명의 벡터는 성분으로서, (x) 효모 세포 내에서 전사할 수 있는 프로모터 ; (y) 상기 프로모터에 센스 또는 안티센스 방향으로 연결된 상기 (a) 내지 (l) 중에서 기술된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA) ; 및 (z) 전사 종료 및 RNA 분자의 폴리아데닐화에 대해 효모 내에서 작용하는 신호를 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 본 발명에 따르면, 하기 기술된 알콜 음료 (예를 들어, 맥주) 의 양조 시, 상기 기술된 본 발명의 단백질을 고도로 발현시키기 위해, 상기 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 센스 방향으로 도입되어, 상기 (a) 내지 (i) 중에서 기술된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA) 의 발현을 촉진한다.

효모 내에 도입된 벡터는 다수복사 유형 (YEp 유형), 단일 복사 유형 (YCp 유형), 또는 염색체 통합 유형 (YIp 유형) 중 임의일 수 있다. 예를 들어, YEp24 (J. R. Broach 등, EXPERIMENTALMAMPULAΗON OF GENE EXPRESSION, Academic Press, New York, 83, 1983) 는 YEp 유형 벡터로서 알려져 있고, YCp50 (M. D. Rose 등, Gene 60: 237, 1987) 은 YCp 유형 벡터로서 알려져 있으며, YIp5 (K. Struhl 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 1035, 1979) 는 YIp 유형 벡터로서 알려져 있고, 이 모든 것은 쉽게 이용가능하다.

효모 내에서 유전자 발현을 조정하는 프로모터/종결자는 그것들이 양조 효모에서 작용하고, 발효 배양액 내 성분에 의해 영향을 받지 않는 한, 임의로 조합될 수 있다. 예를 들어, 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디하이드로게나제 유전자 (TDH3) 의 프로모터, 또는 3-포스포글리세레이트 키나아제 유전자 (PGKl) 의 프로모터가 사용될 수 있다. 이러한 유전자는 예를 들어, [M. F. Tuite 등, EMBO J., 1, 603 (1982)] 에서 상세히 기술된 바와 같이 이전에 클로닝되었고, 공지된 방법에 의해 쉽게 이용가능하다.

양조 효모에 대한 형질전환 시 영양요구성 마커가 선별 마커로서 사용될 수 없기 때문에, 예를 들어, 제네티신 (geneticin)-내성 유전자 (G418r), 구리-내성 유전자 (CUP1) (Marin 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984) 또는 셀룰레닌-내성 유전자 (fas2m, PDR4) (각각 [Junji Inokoshi 등, Biochemistry, 64, 660, 1992]; 및 [Hussain 등, Gene, 101: 149, 1991]) 가 사용될 수 있다.

상기 기술된 바와 같이 구축된 벡터를 숙주 효모 내로 도입한다. 숙주 효모의 예에는 양조에 사용될 수 있는 임의의 효모가 포함되는데, 예를 들어, 맥주, 와인 및 쉐이크용 양조 효모가 포함된다. 구체적으로는, 속 (屬) 사카로미세스와 같은 효모가 사용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 라거 양조 효모, 예를 들어, 사카로미세스 파스토리아누스 (Saccharomyces pastorianus) W34/70, 사카로미세스 카를스베르게니스 (Saccharomyces carlsbergensis) NCYC453 또는 NCYC456, 또는 사카로미세스 세레비시애 NBRC 1951, NBRC1952, NBRC1953 또는 NBRC1954 가 사용될 수 있다. 또한, 사카로미세스 세레비시애 NCYC90 과 같은 위스키 효모, 일본 양조 협회의 와인 효모 #1, 3 및 4 와 같은 와인 효모, 및 일본 양조 협회의 쉐이크 효모 #7 및 9 와 같은 쉐이크 효모를 사용할 수 있으며, 그에 제한은 없다. 본 발명에서, 사카로미세스 파스토리아누스와 같은 라거 양조 효모가 바람직하게 사용될 수 있다.

효모 형질전환 방법은 일반적으로 사용되는 공지 방법일 수 있다. 예를 들어, 사용될 수 있는 방법은 전기영동법 (Meth. Enzym., 194: 182 (1990)), 스페로플라스트 (spheroplast) 방법 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929(1978)), 리튬 아세테이트 방법 (J. Bacteriology, 153: 163 (1983)), 및 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929 (1978), METHODS IN YEAST GENETICS, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual] 에 기술된 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

더욱 구체적으로, 숙주 효모는 표준 효모 영양 배지 (예를 들어, YEPD 배지 (Genetic Engineering. Vol. 1, Plenum Press, New York, 117 (1979)) 등) 에서 배양되어, OD600 nm 가 1 내지 6 일 것이다. 이러한 배양 효모를 원심분리에 의해 수합하고, 세정하고, 약 1 내지 2 M 농도에서 알칼리 이온 금속 이온, 바람직하게는 리튬 이온으로 전-처리한다. 세포를 약 30℃ 에서 약 60 분 동안 그대로 놔둔 후에, 약 30℃ 에서 약 추가의 60 분 동안, 도입되는 DNA (약 1 내지 20 μg) 와 함께 그대로 둔다. 폴리에틸렌글리콜, 바람직하게는 약 4,000 달톤의폴리에틸렌글리콜을 약 20% 내지 50% 의 최종 농도가 되게 첨가한다. 약 30℃ 에서 약 30 분 동안 놔둔 후, 세포를 약 42℃ 에서 약 5 분 동안 가열한다. 바람직하게는, 상기 세포 현탁액을 표준 효모 영양 배지로 세정하고, 예정된 양의 신선한 표준 효모 영양 배지에 첨가하고, 약 30℃ 에서 약 60 분 동안 놔둔다. 그런 후, 선별 마커로서 항생제 등을 함유하는 표준 한천 배지에 세포를 심어, 형질전환체를 수득한다.

다른 일반적인 클로닝 기술을 예를 들어, [MOLECULAR CLONING 3rd Ed., and METHODS IN YEAST GENETICS, A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)] 에서 발견할 수 있다.

4. 본 발명에 따른 알콜 음료 제조 방법, 및 상기 방법에 의해 제조된 알콜 음료

상기 기술된 본 발명의 벡터는 표적 알콜 제품을 양조하기에 적합한 효모 내로 도입된다. 이러한 효모는 황화수소의 함량이 저하되었으면서 향은 향상된 목적하는 알콜 음료를 제조하는데 사용될 수 있다. 또한, 하기 기술된 본 발명의 효모 평가 방법에 의해 선별되는 효모가 또한 사용될 수 있다. 표적 알콜 음료에는 예를 들어, 맥주맛 음료와 같은 스파클링 음료 (해포우슈 (happoushu)), 와인, 위스키, 쉐이크 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

이러한 알콜 음료를 제조하기 위해, 본 발명에 따라 수득되는 양조 효모를 모 계통의 것 대신에 사용한다는 점을 제외하고는, 공지된 기술을 사용할 수 있다. 물질, 제조 장비, 제조 조절 등이 통상의 것과 정확히 동일할 수 있기 때문에, 황화수소의 함량이 저하된 알콜 음료를 제조하는 비용을 증가시킬 필요는 없다. 따라서, 본 발명에 따르면, 향이 향상된 알콜 음료는 비용 증가 없이 기존의 설비를 사용해 제조될 수 있다.

5. 본 발명의 효모 평가 방법

본 발명은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 시스테인 합성효소 유전자의 뉴클레오티드 서열을 바탕으로 디자인된 프라이머 또는 프로브를 사용하여 테스트 효모를 그의 황화수소-생성 능력에 대해 평가하는 방법에 관한 것이다. 그러한 평가 방법을 위한 일반적인 기술은 공지되어 있고, 예를 들어, WO01/040514, 일본 공개 특허 출원 제 8-205900 호 등에 기술되어 있다. 이러한 평가 방법은 하기 기술된다.

우선, 테스트 효모의 게놈을 제조한다. 이러한 제조를 위해, Hereford 방법 또는 칼륨 아세테이트 방법과 같은 임의의 공지된 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어, METHODS IN YEAST GENETICS, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 130 (1990)). 시스테인 합성효소 유전자의 뉴클레오티드 서열 (바람직하게는, ORF 서열) 을 바탕으로 디자인된 프라이머 또는 프로브를 사용하여, 유전자, 또는 유전자에 특이적인 서열의 존재를 수득된 테스트 효모 게놈에서 측정한다. 프라이머 또는 프로브를 공지된 기술에 따라 디자인할 수 있다.

유전자 또는 특이적인 서열의 검출을 공지된 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 특이적인 서열 일부 또는 전부를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 하나의 프라이머로서 사용하는 한편, 상기 서열의 상부 또는 하부 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 또다른 프라이머로서 사용하여, PCR 방법에 의해 효모의 핵산을 증폭시켜서, 증폭된 생성물의 존재 및 증폭된 생성물의 분자량을 측정한다. 프라이머에 사용되는 폴리뉴클레오티드의 염기 수는 일반적으로 10 개 이상의 염기쌍 (bp), 및 바람직하게는 15 내지 25 개 bp 이다. 일반적으로, 프라이머 사이의 염기 수는 적합하게는 300 내지 2000 bp 이다.

PCR 반응 조건은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, 90 내지 95℃ 의 변성 온도, 40 내지 6O℃ 의 어닐링 온도, 60 내지 75℃ 의 신장 온도 ; 및 10 회 이상의 순환 수를 포함할 수 있다. 생성 반응 생성물은 예를 들어, 아가로스 겔을 사용한 전기영동법에 의해 분리되어, 증폭된 생성물의 분자량을 측정할 수 있다. 이러한 방법은 증폭된 생성물의 분자량이 특정 부위의 DNA 분자를 함유하는 크기인지에 의해 결정되는 식으로, 황화수소를 생성하는 효모의 능력을 예견 및 평가할 수 있게 한다. 또한, 증폭된 생성물의 뉴클레오티드 서열을 분석함으로써, 상기 능력을 더욱 정확하게 예견 및/또는 평가할 수 있다.

더욱이, 본 발명에서, 테스트 효모를 배양하여, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 시스테인 합성효소 유전자의 발현 수준을 측정하고, 테스트 효모의 황화수소-생성 능력에 대해 상기 효모를 평가한다. 시스테인 합성효소 유전자의 발현 수준의 측정 시, 테스트 효모를 배양하고, 그런 다음 시스테인 합성효소 유전자 유래의 mRNA 또는 단백질을 정량화한다. mRNA 또는 단백질 정량화는 공지된 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 메신저 RNA (mRNA) 를 노던 혼성화 또는 정량 RT-PCR 에 의해 정량화할 수 있는 한편, 단백질은 예를 들어, 웨스턴 블로팅에 의해 정량화할 수 있다 (CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons 1994-2003).

더욱이, 테스트 효모를 배양하고, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 시스테인 합성효소 유전자의 발현 수준을 측정하여, 황화수소를 생성하는 표적 능력에 따른 유전자 발현 수준을 가진 테스트 효모를 선별함으로써, 목적하는 알콜 음료를 양조하는데 적합한 효모를 선별한다. 또한, 대조 효모 및 테스트 효모를 배양하여, 효모의 각각에 있는 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교함으로써, 적합한 테스트 효모를 선별할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 예를 들어, 대조 효모 및 하나 이상의 테스트 효모를 배양하고, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 시스테인 합성효소 유전자의 발현 수준을 각각의 효모에서 측정한다. 대조 효모에서의 것보다 더 높게 발현되는 유전자를 가진 테스트 효모를 선별함으로써, 목적하는 알콜 음료를 양조하는데 적합한 효모를 선별할 수 있다.

대안적으로, 테스트 효모를 배양하고, 더 낮은 황화수소-생성 능력 또는 더 높거나 더 낮은 시스테인 합성효소 활성을 가진 효모를 선별함으로써, 목적하는 알콜 음료의 양조에 적합한 효모를 선별한다.

이러한 경우, 테스트 효모 또는 대조 효모는 예를 들어, 본 발명의 벡터를 사용해 도입된 효모, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현이 조절된 효모, 인공 돌연변이된 효모, 또는 자연 돌연변이된 효모일 수 있다. 황화수소의 생성량은 예를 들어, [Brauwissenschaft. 31. 1 (197 r8)], [Applied. Environm. Microbiol. 66: 4421-4426 (2000)], 또는 [J. Am. Soc. Brew. Chem. 53: 58-62 (1995)] 에서 기술된 방법 중 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 시스테인 합성효소 활성은, 예를 들어, [J. Biol. Chem. 45: 28187-28192 (1994)] 에서 기술된 방법에 의해 측정될 수 있다. 돌연변이 처리는 예를 들어, 자외선 조사 및 방사선 조사와 같은 물리적 방법, 및 EMS (에틸메탄 술포네이트) 및 N-메틸-N-니트로소구아니딘과 같은 약물 처리와 관련된 화학적 방법을 포함한 임의의 방법을 적용할 수 있다 (예를 들어, [Yasuji Oshima Ed., BIOCHEMISTRY EXPERIMENTS vol. 39, Yeast Molecular Genetic Experiments, pp. 67-75, JSSP] 참조).

또한, 대조 효모 또는 테스트 효모로서 사용되는 효모의 예는 양조에 사용될 수 있는 임의의 효모, 예를 들어, 맥주, 와인, 쉐이크용 양조 효모를 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, 속 사카로미세스와 같은 효모를 사용할 수 있다 (예를 들어, S. 파스토리아누스, S. 세레비시애, 및 S. 카를스베르겐시스). 본 발명에 따르면, 라거 양조 효모, 예를 들어, 사카로미세스 파스토리아누스 W34/70 ; 사카로미세스 카를스베르겐시스 NCYC453 또는 NCYC456 ; 또는 사카로미세스 세레비시애 NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953 또는 NBRC1954 를 사용할 수 있다. 추가로, 일본 양조 협회의 와인 효모 #1, 3 및 4 와 같은 와인 효모 ; 및 일본 양조 협회의 쉐이크 효모 #7 및 9 와 같은 쉐이크 효모를 또한 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서, 사카로미세스 파스토리아누스와 같은 라거 양조 효모가 바람직하게는 사용될 수 있다. 대조 효모 및 테스트 효모를 임의로 조합하여 상기 효모로부터 선별할 수 있다.

이후, 본 발명은 작업 실시예를 참조로 더욱 상세히 기술될 것이다. 그러나, 본 발명은 하기 기술된 실시예에 제한되지 않는다.

실시예 1 : 신규 시스테인 합성효소 (비-ScYGR012W) 유전자의 클로닝

라거 양조 효모의 특정 신규 시스테인 합성효소 유전자 비-ScYGR012W (SEQ ID NO: 1) 를 일본 특허 출원 공개 제 2004-283169 호에서 기술된 비교 데이타베이스를 사용하는 연구의 결과로서 발견하였다. 획득된 뉴클레오티드 서열 정보를 바탕으로, 프라이머 비-ScYGR012W_for (SEQ ID NO: 3) 및 비-ScYGR012W_rv (SEQ ID NO: 4) 를 각각 전장 유전자를 증폭시키도록 디자인하였다. 게놈 서열화 계통인 사카로미세스 파스토리아누스 바이헨슈테판 (Weihenstephan) 34/70 계통 ("W34/70 계통" 라고도 함) 의 염색체 DNA 를 주형으로서 사용해 PCR 을 수행하여, 비-ScYGR012W 의 전장 유전자를 포함하는 DNA 절편 (약 1.2 kb) 을 수득하였다.

그렇게 해서 수득된 비-ScYGR012W 유전자 절편을 TA 클로닝에 의해 pCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen) 에 삽입하였다. 비-ScYGR012W 유전자의 뉴클레오티드 서열을 Sanger's 방법 (F. Sanger, Science, 214: 1215, 1981) 에 따라 분석하여, 뉴클레오티드 서열을 확인하였다.

실시예 2 : 맥주 발효 동안의 비-ScYGR012W 유전자의 발현 분석

라거 양조 효모인 사카로미세스 파스토리아누스 W34/70 계통을 사용하여 발효 테스트를 수행한 다음, 발효 동안에 효모 세포로부터 추출되는 mRNA 를 DNA 마이크로어레이에 의해 검출하였다.

맥아즙 추출물 농도 12.69%

맥아즙 함량 70 L

맥아즙 용존 산소 농도 8.6 ppm

발효 온도 15℃

효모 피칭률 12.8 x 10⁶ 세포/mL

발효된 액체의 샘플링을 시간에 따라 수행하였고, 효모 성장량 (도 1) 및 외관상 추출물 농도 (도 2) 의 시간에 따른 변화를 관찰하였다. 동시에, 효모 세포를 샘플링하여 mRNA 를 제조하고, 제조된 mRNA 를 비오틴으로 표지하고, 맥주 효모 DNA 마이크로어레이에 혼성화하였다. 신호를 GCOS ; GeneChip Operating Software 1.0 (Affymetrix Co. 에 의해 제조됨) 을 사용하여 검출하였다. 비-ScYGR012W 유전자의 발현 패턴을 도 3 에 나타내었다. 그 결과, 비-ScYGR012W 유전자가 일반적인 맥주 발효에서 발현된다는 것을 확인하였다.

실시예 3 : 비-ScYGR012W 유전자의 높은 발현

실시예 1 에서 기술된 비-ScYGR012W/pCR2.1-TOPO 를 제한 효소 SacI 및 NotI 을 사용해 분해하여, 단백질-암호화 영역의 전장을 함유하는 DNA 절편을 제조하였다. 이 절편을 제한 효소 SacI 및 NotI 로 처리한 pYCGPYNot 에 연결함으로써, 비-ScYGR012W 고도 발현 벡터 비-ScYGR012W/pYCGPYNot 를 구축하였다. pYCGPYNot 는 YCp-유형 효모 발현 벡터이다. 삽입된 유전자는 피루베이트 키나아제 유전자 PYK1 프로모터에 의해 고도로 발현된다. 제네티신-내성 유전자 G418^r 을 효모에서 선별 마커로서 포함하고, 앰피실린-내성 유전자 Amp^r 을 대장균 (Escherichia coli) 에서 선별 마커로서 포함하였다.

상기 방법에 의해 제조된 고도 발현 벡터를 사용하여, 사카로미세스 파스테우리아누스 바이헨슈테파너 (Weihenstephaner) 34/70 계통을 일본 특허 출원 공개 제 H7-303475 호에 기술된 방법에 의해 형질전환하였다. 형질전환체를 300 mg/L 의 제네티신을 함유하는 YPD 플레이트 배양물 (1% 효모 추출물, 2% 폴리펩톤, 2% 글루코스, 2% 한천) 에서 선별하였다.

실시예 4 : 맥주의 시험 양조에서 생성된 황화수소의 양 분석

모 계통 (W34/70 계통) 및 실시예 3 에서 수득된 비-ScYGR012W 고도 발현 계통을 사용하여 하기 조건 하에서 발효 테스트를 수행하였다.

맥아즙 추출물 농도 12%

맥아즙 함량 1 L

맥아즙 용존 산소 농도 약 8 ppm

발효 온도 15℃ (고정)

효모 피칭률 맥아즙 1 L 당 습식 효모 세포 5 g

발효 배양액을 시간에 걸쳐서 샘플링하고, 효모 성장률의 시간에 따른 변화 (OD660) (도 4 참조) 및 소비된 추출물의 양 (도 5 참조) 을 측정하였다.

발효 완료 시 황화수소의 정량적 측정을 Takahashi 등의 방법 (Brauwissenschaft 31, 1 (1978)) 을 바탕으로 수행하였다. 우선, 공지된 농도의 황화수소를 함유하는 샘플을 측정하고, 황화수소에 대한 표준 커브를 검출된 황화수소에 대한 피크 영역으로부터 만들었다. 황화수소의 양을, 표준 샘플을 분석하는데 사용된 것과 동일한 조건 하에 발효 배양액의 측정에서 검출된 황화수소에 대한 영역 및 표준 커브 사이의 관계로부터 측정하였다 (표 1).

발효 완료 시 발효 배양액 내 황화수소의 양
	모 계통 (W34/70 계통)	비-ScYGR012W 고도 발현 계통
H₂S (ppb)	22.1	3.3

발효 완료시 생성되었던 황화수소의 양은 표 1 에서 기술된 바와 같이 모 계통에 대해서는 22.1 ppb 인데 반해, 비-ScYGR012W 고도 발현 계통에 대해서는 3.3 ppb 였다. 상기 결과로부터, 황화수소 생성량이 비-ScYGR012W 유전자의 고도 발현에 의해 약 85% 감소된 것이 확실하였다.

실시예 5 : 시스테인 합성효소 (ScYGR012W) 유전자의 클로닝

라거 양조 효모의 시스테인 합성효소 유전자 ScYGR012W (SEQ ID NO: 5) 를 일본 특허 출원 공개 제 2004-283169 호에서 기술된 비교 데이타베이스를 사용한 연구의 결과로서 발견하였다. 뉴클레오티드 서열 정보를 바탕으로, 프라이머 ScYGR012W_for (SEQ ID NO: 7) 및 ScYGR012W_rv (SEQ ID NO: 8) 를 각각 전장 유전자를 증폭하도록 디자인하였다. 게놈 서열화 계통인 사카로미세스 파스토리아누스 바이헨슈테판 34/70 계통의 염색체 DNA 를 주형으로서 사용하여 PCR 을 수행하여, ScYGR012W 의 전장 유전자를 포함하는 DNA 절편 (약 1.2 kb) 을 수득하였다.

그렇게 해서 수득된 ScYGR012W 유전자 절편을 TA 클로닝에 의해 pCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen) 에 삽입하였다. ScYGRO 12W 유전자의 뉴클레오티드 서열을 Sanger's 방법 (F. Sanger, Science, 214: 1215, 1981) 에 따라 분석하여, 뉴클레오티드 서열을 확인하였다.

실시예 6 : 맥주 발효 동안의 ScYGR012W 유전자의 발현 분석

라거 양조 효모인 사카로미세스 파스토리아누스 W34/70 계통을 사용하여 발효 테스트를 수행한 다음, 발효 동안에 효모 세포로부터 추출된 mRNA 를 DNA 마이크로어레이에 의해 분석하였다.

맥아즙 추출물 농도 12.69%

맥아즙 함량 70 L

맥아즙 용존 산소 농도 8.6 ppm

발효 온도 15℃

효모 피칭률 12.8 x 10⁶ 세포/mL

발효된 액체의 샘플링을 시간에 따라 수행하였고, 효모 성장량의 시간에 따른 변화 (도 6) 및 외관상 추출물 농도 (도 7) 를 관찰하였다. 동시에, 효모 세포를 샘플링하여 mRNA 를 제조하고, 제조된 mRNA 를 비오틴으로 표지하고, 맥주 효모 DNA 마이크로어레이에 혼성화하였다. 신호를 GCOS ; GeneChip Operating Software 1.0 (Affymetrix Co. 에 의해 제조됨) 을 사용하여 검출하였다. ScYGR012W 유전자의 발현 패턴을 도 8 에 나타내었다. 그 결과, ScYGR012W 유전자가 일반적인 맥주 발효에서 발현된다는 것을 확인하였다.

실시예 7 : ScYGR012W 유전자의 높은 발현

실시예 5 에서 기술된 ScYGR012W/pCR2.1-TOPO 를 제한 효소 SacI 및 NotI 을 사용해 분해하여, 단백질-암호화 영역의 전장을 함유하는 DNA 절편을 제조하였다. 이 절편을 제한 효소 SacI 및 NotI 로 처리한 pYCGPYNot 에 연결함으로써, ScYGR012W 고도 발현 벡터 ScYGR012W/pYCGPYNot 를 구축하였다. pYCGPYNot 는 YCp-유형 효모 발현 벡터이다. 삽입된 유전자는 피루베이트 키나아제 유전자 PYK1 프로모터에 의해 고도로 발현된다. 제네티신-내성 유전자 G418^r 을 효모에서 선별 마커로서 포함하고, 앰피실린-내성 유전자 Amp^r 을 대장균 (Escherichia coli) 에서 선별 마커로서 포함하였다.

상기 방법에 의해 제조된 고도 발현 벡터를 사용하여, 사카로미세스 파스테우리아누스 바이헨슈테파너 34/70 계통을 일본 특허 출원 공개 제 H7-303475 호에 기술된 방법에 의해 형질전환하였다. 형질전환체를 300 mg/L 의 제네티신을 함유하는 YPD 플레이트 배양물 (1% 효모 추출물, 2% 폴리펩톤, 2% 글루코스, 2% 한천) 에서 선별하였다.

실시예 8 : 맥주의 시험 양조에서 생성된 황화수소의 양 분석

모 계통 (W34/70 계통) 및 실시예 7 에서 수득된 ScYGR012W 고도 발현 계통을 사용하여 하기 조건 하에서 발효 테스트를 수행하였다.

맥아즙 추출물 농도 12%

맥아즙 함량 1 L

맥아즙 용존 산소 농도 약 8 ppm

발효 온도 15℃ (고정)

효모 피칭률 워트 맥아즙 1 L 당 습식 효모 세포 5 g

발효 배양액을 시간에 걸쳐서 샘플링하고, 효모 성장률의 시간에 따른 변화 (OD660) (도 9 참조) 및 소비된 추출물의 양 (도 10 참조) 을 측정하였다.

발효 완료 시 황화수소의 정량적 측정을 Takahashi 등의 방법 (Brauwissenschaft 31, 1 (1978)) 을 바탕으로 수행하였다. 우선, 공지된 농도의 황화수소를 함유하는 샘플을 측정하고, 황화수소에 대한 표준 커브를 검출된 황화수소에 대한 피크 영역으로부터 만들었다. 황화수소의 양을, 표준 샘플을 분석하는데 사용된 것과 동일한 조건 하에 발효 배양액의 측정에서 검출된 황화수소에 대한 영역 및 표준 커브 사이의 관계로부터 측정하였다 (표 2).

발효 완료 시 발효 배양액 내 황화수소의 양
	모 계통 (W34/70 계통)	ScYGR012W 고도 발현 계통
H₂S (ppb)	22.1	2.6

발효 완료시 생성되었던 황화수소의 양은 표 2 에서 기술된 바와 같이 모 계통에 대해서는 22.1 ppb 인데 반해, ScYGR012W 고도 발현 계통에 대해서는 2.6 ppb 였다. 상기 결과로부터, 황화수소 생성량이 ScYGR012W 유전자의 고도 발현에 의해 약 88% 감소된 것이 확실하였다.

본 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로써 본원에 삽입된 2005 년 8 월 22 일 및 2006 년 2 월 23 일에 출원된 일본 특허 출원 번호 2005-240350 의 이점을 청구한다. 언급된 모든 기타 참조 또한 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 삽입된다.

<110> Suntory Limited <120> Cysteine synthase gene and use thereof <130> G07-0098 <140> PCT/JP2006/316785 <141> 2006-08-21 <150> JP2005-240350 <151> 2005-08-22 <150> JP2006-47554 <151> 2006-02-23 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1188 <212> DNA <213> Yeast <400> 1 atgtccagtt cacgagataa gaacgctttg tatttgcctt ggaacgaatg catttccatc 60 gcttccgtcc taatcggcgc atatgcatcg tataaatatt ataaactatg caaggcgcag 120 gatataccac gtccaaaaga tggtgtggag cagctaatag gaaacactcc cctggttcag 180 attagatccc tttccaaggc caccggagtt aacatttatg caaaattaga gttatgtaac 240 ccagcaggaa gtgctaaaga tagagtagca ttaaacataa taaagaccgc agaggaacga 300 ggtgagctaa tcagaggcga acctggttgg gtgttcgaag gaacaagcgg ttcaacaggc 360 atttctatag ccatggtctg taatgcacta ggatataggg cacacatttc tttacccgac 420 gacacatcgt tagaaaagtt ggcattacta gaaagtctcg gtgctacagt caataaggtt 480 aagcctgcca gtattgtcga tccaaatcaa tatgttaatg cagctaagaa agcatgcgat 540 gatttgagta aggaaggtaa tggagtaaag gcagtttttg ctgaccaatt tgaaaatgaa 600 gccaattgga gagtacacta tcaaaccacg ggtccagaaa ttgcccatca aatggaagga 660 aaaattgatg cgtttattgc tggctgtggt accggtggaa cgataactgg agtggccaaa 720 tatctaaagg aaagcgcaaa aattccgtgc catgtcgttc ttgcagatcc acaaggttca 780 ggcttttata ataggataaa ctacggcgtg atgtatgact atgtagaaaa agaaggtaca 840 agaaggaggc atcaggtgga tactattgta gaaggtatcg ggctaaacag gattactcaa 900 aatttccaca tgggcgaaga gtttatcgat gaatcgatac gtgtcaatga cactcaagct 960 atcagaatgg caaaatacct atcagtaaac gatgggttat tcgtaggaag tagtacagct 1020 ataaacgcag tagctgctgt tcaaatcgcg aaaagactcc ctcctggtgc caacattgta 1080 attattgcat gcgacagcgg atcaagacat ttaagtaaat tctggaaaga agctaaacaa 1140 atagagtatg acatatcgtt aaaggagata acaggtggca ttcgatga 1188 <210> 2 <211> 395 <212> PRT <213> Yeast <400> 2 Met Ser Ser Ser Arg Asp Lys Asn Ala Leu Tyr Leu Pro Trp Asn Glu 1 5 10 15 Cys Ile Ser Ile Ala Ser Val Leu Ile Gly Ala Tyr Ala Ser Tyr Lys 20 25 30 Tyr Tyr Lys Leu Cys Lys Ala Gln Asp Ile Pro Arg Pro Lys Asp Gly 35 40 45 Val Glu Gln Leu Ile Gly Asn Thr Pro Leu Val Gln Ile Arg Ser Leu 50 55 60 Ser Lys Ala Thr Gly Val Asn Ile Tyr Ala Lys Leu Glu Leu Cys Asn 65 70 75 80 Pro Ala Gly Ser Ala Lys Asp Arg Val Ala Leu Asn Ile Ile Lys Thr 85 90 95 Ala Glu Glu Arg Gly Glu Leu Ile Arg Gly Glu Pro Gly Trp Val Phe 100 105 110 Glu Gly Thr Ser Gly Ser Thr Gly Ile Ser Ile Ala Met Val Cys Asn 115 120 125 Ala Leu Gly Tyr Arg Ala His Ile Ser Leu Pro Asp Asp Thr Ser Leu 130 135 140 Glu Lys Leu Ala Leu Leu Glu Ser Leu Gly Ala Thr Val Asn Lys Val 145 150 155 160 Lys Pro Ala Ser Ile Val Asp Pro Asn Gln Tyr Val Asn Ala Ala Lys 165 170 175 Lys Ala Cys Asp Asp Leu Ser Lys Glu Gly Asn Gly Val Lys Ala Val 180 185 190 Phe Ala Asp Gln Phe Glu Asn Glu Ala Asn Trp Arg Val His Tyr Gln 195 200 205 Thr Thr Gly Pro Glu Ile Ala His Gln Met Glu Gly Lys Ile Asp Ala 210 215 220 Phe Ile Ala Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr Ile Thr Gly Val Ala Lys 225 230 235 240 Tyr Leu Lys Glu Ser Ala Lys Ile Pro Cys His Val Val Leu Ala Asp 245 250 255 Pro Gln Gly Ser Gly Phe Tyr Asn Arg Ile Asn Tyr Gly Val Met Tyr 260 265 270 Asp Tyr Val Glu Lys Glu Gly Thr Arg Arg Arg His Gln Val Asp Thr 275 280 285 Ile Val Glu Gly Ile Gly Leu Asn Arg Ile Thr Gln Asn Phe His Met 290 295 300 Gly Glu Glu Phe Ile Asp Glu Ser Ile Arg Val Asn Asp Thr Gln Ala 305 310 315 320 Ile Arg Met Ala Lys Tyr Leu Ser Val Asn Asp Gly Leu Phe Val Gly 325 330 335 Ser Ser Thr Ala Ile Asn Ala Val Ala Ala Val Gln Ile Ala Lys Arg 340 345 350 Leu Pro Pro Gly Ala Asn Ile Val Ile Ile Ala Cys Asp Ser Gly Ser 355 360 365 Arg His Leu Ser Lys Phe Trp Lys Glu Ala Lys Gln Ile Glu Tyr Asp 370 375 380 Ile Ser Leu Lys Glu Ile Thr Gly Gly Ile Arg 385 390 395 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gagctcatag cggccatgtc cagttcacga gataagaacg 40 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ggatcctatg cggccgcgga aaaactaaca aggaattcag aa 42 <210> 5 <211> 1182 <212> DNA <213> Yeast <400> 5 atgtcctgtt ctcaaaataa gacttctgtc agtctggcct ggcgtgaatg catatccatc 60 gcttccgtcc taattggcgc gtatgcatca tacagatact ataagttgtt caaaacacgc 120 gatattccac gtccaaaaga aggcattgaa gaactcatag gaaacactcc tctggttaag 180 atcagatctc ttaccaaggc tactggagtt aacatttacg ctaagttgga gttatgcaac 240 ccagcaggaa gtgctaagga tagagtggct ttaaacatca taaagacggc tgaggaatta 300 ggcgagctcg tcagaggtga acctggctgg gtatttgaag gaacaagtgg gtcgactggt 360 atctctatag cagtggtctg taatgcgttg ggttataggg cacacatttc tttgcccgat 420 gacacatcgc tagaaaaatt ggcattacta gaaagcctcg gtgctactgt taataaggtt 480 aagcccgcta gtattgtcga tccaaaccaa tacgtaaatg ccgccaaaaa ggcatgtaat 540 gaactaaaga agagtggtaa tggaataaga gcagtttttg ccgatcagtt cgaaaacgaa 600 gccaactgga aagtacatta ccagaccaca ggcccagaaa ttgcccatca aactaaggga 660 aatattgacg cattcattgc tggttgcggt actggtggca ccataactgg tgtggcaaaa 720 ttcttaaagg aaagagcaaa gataccttgc catgtcgttc tagcggatcc acaaggatct 780 ggcttttata atagagtcaa ctatggcgtg atgtatgact atgtagagaa ggaaggtact 840 agaagaaggc atcaagttga cactatcgta gaagggattg ggttaaacag aatcactcat 900 aattttcata tgggcgaaaa atttattgat gaatcaatac gagtcaacga taatcaagcc 960 attagaatgg caaaatacct atcggtaaac gacgggctat tcgtggggag tagtacagct 1020 attaatgcgg tagccgctat tcaggttgca aaaacgcttc ctcacggctc aaacattgtg 1080 attattgcat gcgacagcgg ttcaagacac ctaagtaaat tctggaaaga agctaaagaa 1140 atcgatcacg acgtatcatt agaagaagta ataaatatct aa 1182 <210> 6 <211> 393 <212> PRT <213> Yeast <400> 6 Met Ser Cys Ser Gln Asn Lys Thr Ser Val Ser Leu Ala Trp Arg Glu 1 5 10 15 Cys Ile Ser Ile Ala Ser Val Leu Ile Gly Ala Tyr Ala Ser Tyr Arg 20 25 30 Tyr Tyr Lys Leu Phe Lys Thr Arg Asp Ile Pro Arg Pro Lys Glu Gly 35 40 45 Ile Glu Glu Leu Ile Gly Asn Thr Pro Leu Val Lys Ile Arg Ser Leu 50 55 60 Thr Lys Ala Thr Gly Val Asn Ile Tyr Ala Lys Leu Glu Leu Cys Asn 65 70 75 80 Pro Ala Gly Ser Ala Lys Asp Arg Val Ala Leu Asn Ile Ile Lys Thr 85 90 95 Ala Glu Glu Leu Gly Glu Leu Val Arg Gly Glu Pro Gly Trp Val Phe 100 105 110 Glu Gly Thr Ser Gly Ser Thr Gly Ile Ser Ile Ala Val Val Cys Asn 115 120 125 Ala Leu Gly Tyr Arg Ala His Ile Ser Leu Pro Asp Asp Thr Ser Leu 130 135 140 Glu Lys Leu Ala Leu Leu Glu Ser Leu Gly Ala Thr Val Asn Lys Val 145 150 155 160 Lys Pro Ala Ser Ile Val Asp Pro Asn Gln Tyr Val Asn Ala Ala Lys 165 170 175 Lys Ala Cys Asn Glu Leu Lys Lys Ser Gly Asn Gly Ile Arg Ala Val 180 185 190 Phe Ala Asp Gln Phe Glu Asn Glu Ala Asn Trp Lys Val His Tyr Gln 195 200 205 Thr Thr Gly Pro Glu Ile Ala His Gln Thr Lys Gly Asn Ile Asp Ala 210 215 220 Phe Ile Ala Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr Ile Thr Gly Val Ala Lys 225 230 235 240 Phe Leu Lys Glu Arg Ala Lys Ile Pro Cys His Val Val Leu Ala Asp 245 250 255 Pro Gln Gly Ser Gly Phe Tyr Asn Arg Val Asn Tyr Gly Val Met Tyr 260 265 270 Asp Tyr Val Glu Lys Glu Gly Thr Arg Arg Arg His Gln Val Asp Thr 275 280 285 Ile Val Glu Gly Ile Gly Leu Asn Arg Ile Thr His Asn Phe His Met 290 295 300 Gly Glu Lys Phe Ile Asp Glu Ser Ile Arg Val Asn Asp Asn Gln Ala 305 310 315 320 Ile Arg Met Ala Lys Tyr Leu Ser Val Asn Asp Gly Leu Phe Val Gly 325 330 335 Ser Ser Thr Ala Ile Asn Ala Val Ala Ala Ile Gln Val Ala Lys Thr 340 345 350 Leu Pro His Gly Ser Asn Ile Val Ile Ile Ala Cys Asp Ser Gly Ser 355 360 365 Arg His Leu Ser Lys Phe Trp Lys Glu Ala Lys Glu Ile Asp His Asp 370 375 380 Val Ser Leu Glu Glu Val Ile Asn Ile 385 390 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gagctcatag cggccatgtc ctgttctcaa aataagactt 40 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ggatcctatg cggccgccca cggaaagtag caaaaaatgt ag 42

Claims

하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 효모의 황화수소-생성 능력을 감소시키기 위해 효모 내에 도입되는 벡터 :
(j) SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 ; 및
(l) SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 따른 벡터를 포함하는 효모.
제 2 항에 있어서, 황화수소-생성 능력이 제 1 항에 따른 벡터를 도입함으로써 감소되는 효모.
제 2 항에 따른 효모를 배양하는 것을 포함하는 알콜 음료 제조 방법.
제 4 항에 있어서, 양조되는 알콜 음료가 맥아 음료인 알콜 음료 제조 방법.
제 4 항에 있어서, 양조되는 알콜 음료가 와인인 알콜 음료 제조 방법.
제 4 항에 따른 방법에 의해 제조되는 알콜 음료.
SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 시스테인 합성효소 유전자의 뉴클레오티드 서열을 바탕으로 디자인된 프라이머 또는 프로브를 사용하는 것을 포함하는, 테스트 효모를 그의 황화수소-생성 능력에 대해 평가하는 방법.
테스트 효모를 배양하고 ; SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 시스테인 합성효소 유전자의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는, 테스트 효모를 그의 황화수소-생성 능력에 대해 평가하는 방법.
테스트 효모를 배양하고 ; SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 서열을 가진 시스테인 합성효소 유전자의 발현 수준을 측정하고 ; 황화수소를 생성하는 표적 능력에 따라 상기 단백질의 양 또는 상기 유전자의 발현 수준을 갖는 테스트 효모를 선별하는 것을 포함하는, 효모 선별 방법.
제 10 항에 있어서, 대조 효모 및 테스트 효모를 배양하고 ; 각 효모 내에서 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 시스테인 합성효소 유전자의 발현 수준을 측정하고 ; 대조 효모 내의 것보다 더 높게 발현되는 유전자를 갖는 테스트 효모를 선별하는 것을 포함하는, 효모 선별 방법.
제 2 항에 따른 효모, 또는 제 10 항에 따른 방법에 의해 선별되는 효모를 사용하여 알콜 음료를 제조하기 위해 발효를 수행하고 ; 황화수소의 생성량을 조정하는 것을 포함하는, 알콜 음료 제조 방법.