CN102191261A - 半胱氨酸合成酶基因及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及半胱氨酸合成酶基因及其用途，特别是涉及制造香味优异的酒类的酿造酵母、使用该酵母制造的酒类及其制造方法等。进一步具体地说，本发明涉及通过提高编码酿造酵母半胱氨酸合成酶Ygr012wp的基因YGR012W，特别是啤酒酵母中特征性的nonScYGR012W基因的表达量，提高产品香味的酵母及使用该酵母的酒类的制造方法等。

Description

半胱氨酸合成酶基因及其用途
本申请是申请日为2006年8月21日、申请号为200610121385.2、发明名称为“半胱氨酸合成酶基因及其用途”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及半胱氨酸合成酶基因及其用途，特别是涉及制造香味优异的酒类的酿造酵母、使用该酵母制造的酒类及其制造方法等。进一步具体地说，本发明涉及通过提高编码酿造酵母半胱氨酸合成酶Ygr012wp的基因YGR012W，特别是啤酒酵母中特征性的nonScYGR012W基因或ScYGR012W基因的表达量，提高产品香味的酵母及使用该酵母的酒类的制造方法等。
背景技术
市售的pilsner type淡色啤酒制造中使用的啤酒酵母具有在主发酵过程中生成硫化氢的特性。该硫化氢是造成啤酒品质上不受欢迎的嫩啤酒味的原因之一，将其降低到阈值以下的对策可为延长后发酵乃至贮酒期间。
为减少啤酒中的硫化氢，以往即有关于影响硫化氢生成的因子的研究(Jangaard，N.O.，Gress，H.S.and Coe，R.W.；Amer.Soc.Brew.Chem.Proc.，p46，1973；Kuroiwa，Y.and Hashimoto，N.；Brew.Dig.，45，44，1970；Hysert，D.W.and Morrison，N.M.；J.Amer.Soc.Brew.Chem.，34，25，1976)、使用突变法或细胞融合法进行生成硫化氢少的酵母的育种研究(Molzahm，S.W.；J.Amer.Soc.Brew.Chem.，35，54，1977)的报告。
这些方法均不只减少了酵母的硫化氢生成量，还影响了酵母的其他酿造特性(发酵速度、啤酒香味)，所以至今还未得到适合作为啤酒酿造用酵母的酵母。近年来也利用基因操作技术进行酿造用酵母的育种，特开平5-244955号公报中公开了导入编码胱硫醚β-合成酶的DNA片段的啤酒酵母可减少硫化氢的生成。但其减少程度轻微，转化株的硫化氢生成量仍为亲代株生成量的60％～80％左右。
酵母的物质代谢中，硫化氢是在从培养基中吸收的硫酸离子(SO4 2-)的还原过程中生成的。该代谢系统是蛋氨酸、半胱氨酸等含硫氨基酸的生物合成途径，且有关于各阶段的酶及其基因(MET17基因)的详细的报道(Tabor，H.and Tabor，C.W.(eds.)；Methods in Enzymology Vol.17B，Academic Press，London，1971；Jakoby，W.B.and Griffith，O.W.(eds.)；Methods in Enzymology Vol.143，AcademicPress，London，1987)。
O-乙酰高丝氨酸巯基酶是将硫原子从硫化氢转移到O-乙酰高丝氨酸(O-acetyl homoserine)的酶，由MET17基因编码。该酶还具有向O-乙酰丝氨酸转移硫原子的活性。有报道指出使来源于Saccharomyces cerevisiae X2180-1A的MET17基因进行组成性表达的啤酒酵母株中，硫化氢的生成量减少到了亲代株的2％左右(特开平7-303475号公报)。
半胱氨酸合成酶是将硫原子从硫化氢转移到O-乙酰-L-丝氨酸的酶。该基因在其他微生物中已被鉴定，但在Saccharomyces cerevisiae中还未被鉴定。
近年来，大量的基因组已被确定，根据确定的全碱基序列，通过基因的鉴定、与公知基因的比较，进行功能推测。还有，通过比较分析大量的生物基因组碱基序列中存在的基因，进行orthologue基因(2个生物种中存在的基因，在共有的祖先种中是同一的基因，现在的功能也同一时为各自的基因)的推断，通过微生物基因组的orthologue分析，推测编码Saccharomyces cerevisiae的半胱氨酸合成酶的基因是YGR012W(R.L.Tatusov.，M.Y.Galperin.，D.A.Natale.，E.V.Koonin.；Nucleoc.Acids.Research.，28，33，2000)。但是，本基因的功能未经实验确认，与硫化氢生成量的关系也不清楚。
发明内容
如上所述，为使产品中硫化氢生成量减少，获取了突变株，但其结果造成了未曾预期的发酵延迟和不受欢迎的香味成分的增加，所以作为实用性酵母还存在着问题。由此，非常期望有既不影响发酵速度、不损害产品品质，又能减少硫化氢生成量的酵母的育种方法。
本发明人为解决上述课题不断锐意研究的结果，从啤酒酵母中成功地鉴定、分离出了编码半胱氨酸合成酶的基因。还有，制备了将所得基因导入酵母并使其表达的转化酵母，确认了硫化氢生成量的减少，从而完成了本发明。
即，本发明涉及啤酒酵母中存在的新型半胱氨酸合成酶基因、该基因编码的蛋白质、调节了该基因表达的转化酵母、通过使用调节了该基因表达的酵母以控制产品中硫化氢生成量的方法等。具体地说，本发明提供如下所示的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、导入了该载体的转化酵母、使用该转化酵母的酒类的制造方法等。
(1)从以下(a)～(f)组成的组中选择的多核苷酸，其为：
(a)含有由序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸的多核苷酸；
(b)含有编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；
(c)含有编码由序列号：2的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列组成的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；
(d)含有编码具有与序列号：2的氨基酸序列有等于或大于60％同源性的氨基酸序列的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；
(e)含有与序列号：1中的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交，且编码具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；以及
(f)含有与编码序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交，且编码具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。
(2)上述(1)所述的多核苷酸，其从以下(g)～(i)组成的组中选择：
(g)含有编码由序列号：2的氨基酸序列、或序列号：2的氨基酸序列中1～10个氨基酸缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列组成的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；
(h)含有编码具有与序列号：2的氨基酸序列有等于或大于90％同源性的氨基酸序列的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；及
(i)含有与序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸、或序列号：1的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交，且编码具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。
(3)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸。
(4)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。
(5)上述(1)～(4)中任一项所述的多核苷酸，其是DNA。
(6)蛋白质，其由上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸编码。
(7)载体，其含有上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸。
(7a)上述(7)中所述的载体，其含有具有以下(x)～(z)的组成要素的表达框架：
(x)在酵母细胞内可转录的启动子；
(y)上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸，其与该启动子以正向或反向结合；以及
(z)与RNA分子的转录终止及多聚腺苷酸化有关的、在酵母中起作用的信号。
(8)载体，其含有从以下(j)～(l)组成的组中选择的多核苷酸：
(j)含有编码由序列号：6的氨基酸序列或序列号：6的氨基酸序列中1～10个氨基酸缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列组成的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；
(k)含有编码具有与序列号：6的氨基酸序列有等于或大于90％同源性的氨基酸序列的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；及
(l)含有与序列号：5的碱基序列组成的多核苷酸、或序列号：5的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交，且编码具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。
(9)酵母，其中导入了上述(7)或(8)中所述的载体。
(10)上述(9)中所述的酵母，其通过导入上述(7)或(8)中所述的载体降低硫化氢生成能力。
(11)上述(10)中所述的酵母，其通过使上述(6)中所述的蛋白质的表达量增加降低硫化氢生成能力。
(12)酒类的制造方法，其使用上述(9)～(11)中任一项所述的酵母。
(13)上述(12)中所述的酒类的制造方法，其酿造的酒类是麦芽饮料。
(14)上述(12)中所述的酒类的制造方法，其酿造的酒类是葡萄酒。
(15)酒类，其使用上述(12)～(14)中任一项所述的方法制造。
(16)评价方法，其为使用根据具有序列号：1或序列号：5的碱基序列的半胱氨酸合成酶基因碱基序列设计的引物或探针，评价被检酵母的硫化氢生成能力的方法。
(16a)根据上述(16)中所述的方法，选别硫化氢生成能力低的酵母的方法。
(16b)使用通过(16a)中所述的方法选别的酵母制造酒类(例如啤酒)的方法。
(17)评价方法，其为通过培养被检酵母，测定具有序列号：1或序列号：5的碱基序列的半胱氨酸合成酶基因的表达量，以评价被检酵母的硫化氢生成能力的方法。
(18)酵母的选择方法，其包括培养被检酵母，对上述(6)中所述的蛋白质定量或测定具有序列号：1或序列号：5的碱基序列的半胱氨酸合成酶基因的表达量，选择与目的硫化氢生成能力对应的前述蛋白质的量或前述基因表达量的被检酵母。
(18a)培养被检酵母，测定硫化氢生成能力或半胱氨酸合成酶活性，选择目的硫化氢生成能力或半胱氨酸合成酶活性的被检酵母的酵母的选择方法。
(19)上述(18)中所述的酵母的选择方法，其包括培养标准酵母及被检酵母，测定具有序列号：1或序列号：5的碱基序列的半胱氨酸合成酶基因在各酵母中的表达量，选择该基因比标准酵母高表达的被检酵母。
(20)上述(18)中所述的酵母的选择方法，其包括培养标准酵母及被检酵母，对各酵母中上述(6)中所述的蛋白质定量，选择该蛋白质的量比标准酵母多的被检酵母。即培养复数的酵母，对各酵母中上述(6)中所述的蛋白质定量，选择其中该蛋白质的量多的被检酵母。
(21)酒类的制造方法，其特征在于，使用上述(9)～(11)中所述的酵母及通过上述(18)～(20)中所述的方法选择的酵母中的任一种酵母，进行用于酒类制造的发酵，调节硫化氢的生成量。
附图说明
图1是啤酒试验酿造中酵母增殖量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660的值。
图2是啤酒试验酿造中浸出物消耗量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。
图3是啤酒试验酿造中酵母的nonScYGR012W基因表达变动的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示检测出的信号辉度。
图4是啤酒试验酿造中亲代株、nonScYGR012W高表达株酵母增殖量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660的值。
图5是啤酒试验酿造中亲代株、nonScYGR012W高表达株浸出物消耗量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。
图6是啤酒试验酿造中酵母增殖量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660的值。
图7是啤酒试验酿造中浸出物消耗量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。
图8是啤酒试验酿造中酵母的ScYGR012W基因表达变动的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示检测出的信号辉度。
图9是啤酒试验酿造中亲代株、ScYGR012W高表达株酵母增殖量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660时的值。
图10是啤酒试验酿造中亲代株、ScYGR012W高表达株浸出物消耗量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。
具体实施方式
本发明人认为，通过使酵母的半胱氨酸合成酶活性增大，可更高效地减少硫化氢。基于这个设想反复进行了研究，以用特开2004-283169中公开的方法解读的啤酒酵母基因组信息为基础，分离、鉴定了编码啤酒酵母特有的半胱氨酸合成酶的non-ScYGR012W基因。该碱基序列如序列号：1所示。由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列号：2所示。而且分离、鉴定了编码啤酒酵母的半胱氨酸合成酶的ScYGR012W基因。该碱基序列如序列号：5所示。由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列号：6所示。
1.本发明的多核苷酸
首先，本发明提供(a)含有由序列号：1或序列号：5的碱基序列组成的多核苷酸的多核苷酸；及(b)含有编码由序列号：2或序列号：6的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。多核苷酸可为DNA、也可为RNA。
作为本发明对象的多核苷酸，不只限于编码来自上述啤酒酵母的半胱氨酸合成酶基因的多核苷酸，还包含编码与该蛋白质具同等功能的蛋白质的其他多核苷酸。作为功能相同的蛋白质，例如，可例举为(c)由序列号：2或序列号：6的氨基酸序列中1个或多个的氨基酸缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列组成的、且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白质。
这种蛋白质，在序列号2或序列号：6的氨基酸序列中，例如，可为由1～100个、1～90个、1～80个、1～70个、1～60个、1～50个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个(1～数个)、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、1个的氨基酸残基缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列组成的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白质。且上述氨基酸残基缺失、取代、插入及/或付加的数量，一般优选较小的数量。这种蛋白质可例举为具有(d)与序列号：2或序列号：6的氨基酸序列有等于或大于约60％、等于或大于约70％、等于或大于71％、等于或大于72％、等于或大于73％、等于或大于74％、等于或大于75％、等于或大于76％、等于或大于77％、等于或大于78％、等于或大于79％、等于或大于80％、等于或大于81％、等于或大于82％、等于或大于83％、等于或大于84％、等于或大于85％、等于或大于86％、等于或大于87％、等于或大于88％、等于或大于89％、等于或大于90％、等于或大于91％、等于或大于92％、等于或大于93％、等于或大于94％、等于或大于95％、等于或大于96％、等于或大于97％、等于或大于98％、等于或大于99％、等于或大于99.1％、等于或大于99.2％、等于或大于99.3％、等于或大于99.4％、等于或大于99.5％、等于或大于99.6％、等于或大于99.7％、等于或大于99.8％、等于或大于99.9％同源性的氨基酸序列，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白质。上述同源性的数值一般越大越好。
半胱氨酸合成酶活性，例如可根据J.Biol.Chem.45：28187-28192(1994)中所述的方法来测定。
另外，本发明也包含(e)含有与序列号：1或序列号：5的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交，且编码具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有与编码由序列号：2或序列号：6的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。
此处的“在严格条件下杂交的多核苷酸”，是指以与序列号：1或序列号：5的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸、或编码序列号：2或序列号：6的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分为探针，通过使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southern杂交法等得到的多核苷酸(例如DNA)。作为杂交方法，例如可利用Molecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons 1987-1997等中所述的方法。
本说明书中所述的“严格条件”可为低严格条件、中严格条件、高严格条件中的任一种。“低严格条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件。“中严格条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件。“高严格条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。在上述条件中，越提高温度，越能期待高效地获得具有高同源性的多核苷酸(例如DNA)。影响杂交严格性的因素可为温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，本领域技术人员通过适宜选择这些因素，均可实现同样的严格条件。
另外，杂交中使用市售的试剂盒时，例如可使用Alkphos Direct Labelling Reagents(Amersham Pharmacia公司制)。此时，根据试剂盒中附带的说明方案，与标记了的探针进行一夜培养后，将膜在55℃的条件下，用含有0.1％(w/v)SDS的洗涤缓冲液1次洗涤，之后可检测杂交后的多核苷酸(例如DNA)。
此外可杂交的多核苷酸，通过FASTA、BLAST等同源性搜索软件，使用默认值(default)计算时，可为与编码序列号：2或序列号：6的氨基酸序列的多核苷酸有等于或大于约60％、等于或大于约70％、等于或大于71％、等于或大于72％、等于或大于73％、等于或大于74％、等于或大于75％、等于或大于76％、等于或大于77％、等于或大于78％、等于或大于79％、等于或大于80％、等于或大于81％、等于或大于82％、等于或大于83％、等于或大于84％、等于或大于85％、等于或大于86％、等于或大于87％、等于或大于88％、等于或大于89％、等于或大于90％、等于或大于91％、等于或大于92％、等于或大于93％、等于或大于94％、等于或大于95％、等于或大于96％、等于或大于97％、等于或大于98％、等于或大于99％、等于或大于99.1％、等于或大于99.2％、等于或大于99.3％、等于或大于99.4％、等于或大于99.5％、等于或大于99.6％、等于或大于99.7％、等于或大于99.8％、等于或大于99.9％同源性的多核苷酸。
另外，氨基酸序列、碱基序列的同源性，可使用根据Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873，1993)来决定。开发了基于BLAST算法、被称为BLASTN、BLASTX的程序(Altschul SF，et al：J.Mol.Biol.215：403，1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，参数例如为score＝100、wordlength＝12。还有，使用BLASTX分析氨基酸序列时，参数例如为score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认值(default)参数。
2.本发明的蛋白质
本发明也提供由上述多核苷酸(a)～(l)中任一个编码的蛋白质。本发明的优选蛋白质，是由序列号：2或序列号：6中的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列组成的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白质。
这种蛋白质，例如，可例举为由序列号2或序列号：6的氨基酸序列中上述数量的氨基酸残基缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列组成的、且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白质。还有，这种蛋白质，可例举为含有与序列号：2或序列号：6的氨基酸序列具有如上述同源性的氨基酸序列、且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白质。
这种蛋白质，可使用(《分子克隆》第3版)、《Current Protocols in Molecular Biology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等中所述的定点诱变法来获得。
本发明的蛋白质的氨基酸序列中等于或大于1个的氨基酸残基被缺失、取代、插入及/或添加，是指在同一序列中任意的，且1个或多个的氨基酸序列的位置上，有1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入及/或添加之意，缺失、取代、插入及添加中的2种或大于2种也可同时发生。
以下，举例表示可相互取代的氨基酸残基。同一组中包含的氨基酸残基可相互取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、邻-甲基丝氨酸(o-methylserine)、叔丁基甘氨酸(t-butyl glycine)、叔丁基丙氨酸(t-butyl alanine)、环己基丙氨酸(cyclohexyl alanine)；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸(isoglutamic acid)、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸(2-aminosuberic acid)；C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯丙氨酸、酪氨酸。
还有，本发明的蛋白质可通过Fmoc法(fluorenylmethoxycarbonyl)、tBoc法(t-Butyl Oxy Carbonyl)等的化学合成法来制造。也可利用Advanced Chem Tech公司制、珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司制、Farumashia公司制、Protein Technologies Instruments公司制、Synthecell-Vega公司制、Perceptive公司制、岛津制作所公司制等的肽合成仪进行化学合成。
3.本发明的载体及导入了该载体的转化酵母
其次，本发明提供含有上述多核苷酸的载体。本发明的载体，是涉及含有上述(a)～(l)中任一项所述的多核苷酸(DNA)的载体。本发明的载体通常如下构成，其含有(x)在酵母细胞内可转录的启动子；(y)与该启动子以正向或反向结合的、上述(a)～(l)中任一项所述的多核苷酸(DNA)；以及(z)含有与RNA分子的转录终止及多聚腺苷酸化有关的在酵母中起作用的信号作为构成因子的表达框架。本发明在后述的啤酒酿造中，使上述本发明的蛋白质高表达时，为促进上述(a)～(l)中任一项所述的多核苷酸(DNA)的表达，将这些多核苷酸针对该启动子正向导入。
导入酵母时使用的载体，可利用多拷贝型(YEp型)、单拷贝型(YCp型)、染色体整合型(YIp型)中的任一种。例如，YEp型载体中的YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，Academic Press，New York，83，1983)、YCp型载体中的YCp50(M.D.Rose et al.，gene，60，237，1987)、YIp型载体中的YIp5(K.Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035，1979)均已为人所知，且易获得。
用于调节酵母中基因表达的启动子/终止子，如能在酿造用酵母中起作用，同时又不受醪液中成分的影响，可任意组合。例如可利用3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子等。这些基因已被克隆，例如可通过M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中详细记载的已知方法很容易地获得。
因酿造用酵母不能利用营养缺陷型标记，所以，转化时使用的选择性标记可利用耐氨基糖苷类抗生素(geneticin)基因(G418r)、耐铜基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)、耐浅蓝菌素基因(fas2m，PDR4)(分别为：猪腰淳嗣等，生化学，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991)等。
如上所述构建的载体被导入宿主酵母。宿主酵母，可例举为可用于酿造的任意的酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体地说，虽可例举为酵母属(Saccharomyces)等的酵母，但在本发明中，可使用啤酒酵母例如Saccharomyces pastorianus W34/70等，Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、NCYC456等，Saccharomyces cerevisiae NBRC 1951、NBRC 1952、NBRC1953、NBRC1954等。而且，可使用威士忌酵母，例如Saccharomyces cerevisiae NCYC90等；还可使用例如协会葡萄酒用1号、协会葡萄酒用3号、协会葡萄酒用4号等的葡萄酒酵母；例如协会酵母、清酒用7号、清酒用9号等的清酒酵母，但不限于这些。本发明中，啤酒酵母例如可优选使用Saccharomyces pastorianus。
酵母的转化方法，可利用一般使用的公知的方法。例如，可使用电穿孔法“Meth.Enzym.，194，p182(1990)”、原生质球法(Spheroplast法)“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75p1929(1978)”、醋酸锂法“J.Bacteriology，153，p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75p 1929(1978)、Methods in yeast genetics，2000 Edition：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中所述的方法实施，但不限于这些。
更具体地说，将宿主酵母置于标准酵母营养培养基(例如YEPD培养基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等)中培养，使OD600nm时的值为1～6。将该培养酵母离心分离后收集、洗涤，用浓度约为1～2M的碱金属离子、优选锂离子进行预处理。将该细胞在约30℃条件、静置约60分钟后，与导入的DNA(约1～20μg)同时在约30℃条件、静置约60分钟。加入聚乙二醇，优选加入约4,000Dalton的聚乙二醇，使最终浓度约为20％～50％。在约30℃、静置约30分钟后，将该细胞在约42℃条件、加热处理约5分钟。优选将该细胞悬浮液用标准酵母营养培养基洗涤后，放入所定量的新鲜标准酵母营养培养基中，在约30℃、静置约60分钟。之后，移植到含有作为选择性标记使用的抗生素等的标准琼脂培养基中，获得转化体。
其他有关一般性的克隆技术，可参照(《分子克隆》第3版)、“Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor，NY)”等。
4.本发明的酒类制造方法及根据其制法获得的酒类
将上述本发明的载体导入适合酿造所需制造对象的酒类的酵母中，并可通过使用其酵母，制造所需要的、且减少了硫化氢含量、增加了香味的酒类。而且也可同样使用通过下述本发明的酵母评价方法选择的酵母。作为制造对象的酒类并不限于此，例如可例举为啤酒、发泡酒等的啤酒味饮料、葡萄酒、威士忌、清酒等。
制造上述酒类时，除使用本发明中所得到的酿造酵母代替亲代株以外，可利用公知的手法。因此，原料、制造设备、制造管理等可与以往完全相同，不会为制造减少硫化氢含量的酒类而增加成本。即根据本发明，可在使用已有设施、不增加成本的情况下，制造出香味优异的酒类。
5.本发明的酵母的评价方法
本发明涉及使用根据具有序列号：1或序列号：5的碱基序列的半胱氨酸合成酶基因碱基序列设计的引物或探针，评价被检酵母的硫化氢生成能力的方法。这种评价方法的一般手法为公知，例如WO 01/040514号公报、特开平8-205900号公报等的记载。以下，就该评价方法进行简单说明。
首先，制备被检酵母的基因组。制备方法可使用Hereford法、醋酸钾法等公知的任何方法[例如，Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，p130(1990)]。以所得到的基因组为对象，使用根据半胱氨酸合成酶基因的碱基序列(优选ORF序列)设计的引物或探针，测定被检酵母的基因组中是否存在其基因或其基因的特异性序列。引物或探针的设计可使用公知的手法进行。
基因或特异性序列的检测，可使用公知的手法进行。例如，将含有包含特异性序列的一部分或全部的多核苷酸或其碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸作为一个引物使用，另一个引物使用含有包含该序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或其碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸，通过PCR法扩增酵母的核酸，并测定扩增物的有无、扩增物分子量的大小等。用于引物的多核苷酸的碱基数通常为等于或大于10bp，优选为15～25bp。还有，夹在两引物间的碱基数，通常以300～2000bp为宜。
PCR法的反应条件无特别限定，例如，可使用变性温度：90～95℃、退火温度：40～60℃、延伸温度：60～75℃、循环数：等于或大于10次等的条件。所得到的反应生成物可使用琼脂糖凝胶等的电泳法等分离，测定扩增产物的分子量。根据该方法，通过扩增产物的分子量是否是含有特异部分的DNA分子的大小，来预测、评价其酵母的硫化氢生成能力。还有，通过分析扩增物的碱基序列，可进一步更正确地预测、评价上述性能。
本发明中，可通过培养被检酵母，测定具有序列号：1或序列号：5的碱基序列的半胱氨酸合成酶基因的表达量，评价被检酵母的硫化氢生成能力。另外，半胱氨酸合成酶基因的表达量的测定，可通过培养被检酵母，对半胱氨酸合成酶基因的产物mRNA或蛋白质定量来进行。mRNA或蛋白质的定量，可使用公知的手法。mRNA的定量例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR，蛋白质的定量例如可通过Western印迹法进行(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons 1994-2003)。
还有，通过培养被检酵母，测定具有序列号：1或序列号：5的碱基序列的半胱氨酸合成酶基因的表达量，选择与目的硫化氢生成能力相应的前述基因表达量的酵母，可选择适合酿造所需酒类的酵母。也可培养标准酵母及被检酵母，测定各酵母中前述基因的表达量，比较标准酵母和被检酵母的前述基因的表达量，以选择所需的酵母。具体地说，例如，可通过培养标准酵母及被检酵母，测定具有序列号：1或序列号：5的碱基序列的半胱氨酸合成酶基因的各酵母中的表达量，选择该基因比标准酵母高表达的被检酵母，来选择适合所需酒类酿造的酵母。
或者可通过培养被检酵母，选择硫化氢生成能力低的、或半胱氨酸合成酶活性高或低的酵母，以选择适合所需酒类酿造的被检酵母。
此时，作为被检酵母或标准酵母，例如可使用上述导入了本发明载体的酵母、抑制了上述本发明的多核苷酸(DNA)表达的酵母、实施了突变处理的酵母、自发突变的酵母等。硫化氢生成量，例如可通过Brauwissenschaft.31.1(1978)、Applied.Environm.Microbiol.66：4421-4426(2000)、J.Am.Soc.Brew.Chem.53：58-62(1995)中任一个所述的方法来测定。半胱氨酸合成酶活性，例如可通过J.Biol.Chem.45：28187-28192(1994)中所述的方法测定。突变处理，例如可使用紫外线照射、放射线照射等的物理方法，通过甲磺酸乙酯(EMS：Ethylmethanesulfonate)、N-甲基-N-亚硝基胍(N-methyl-N-nitrosoguanidine)等药剂处理的化学方法等的任何方法进行(例如，参照大岛泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、p 67-75、学会出版中心等)。
另外，可作为标准酵母、被检酵母使用的酵母，可例举为酿造时可使用的任意的酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体地说，可例举为酵母属(Saccharomyces)等的酵母，在本发明中，可使用啤酒酵母例如Saccharomyces pastorianus W34/70等，Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、NCYC456等，Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。而且还可使用例如协会葡萄酒用1号、协会葡萄酒用3号、协会葡萄酒用4号等的葡萄酒酵母；例如协会酵母、清酒用7号、清酒用9号等的清酒酵母，但不限于这些。本发明中，啤酒酵母例如可优选使用Saccharomyces pastorianus。标准酵母、被检酵母可从上述酵母中以任意组合选择。
实施例
以下，通过实施例详细叙述本发明，但本发明不局限于以下实施例。
实施例1：新型半胱氨酸合成酶基因(nonScYGR012W)的克隆
使用特开2004-283169中记载的比较数据库检索的结果，发现了啤酒酵母中特有的新型半胱氨酸合成酶基因nonScYGR012W(序列号：1)。以所得到的碱基序列信息为基础，设计用于扩增各自全长基因的引物nonScYGR012W_for(序列号：3)/nonScYGR012W_rv(序列号：4)，以基因组解读株Saccharomyces pastorianus Weihenstephaner 34/70株(有时简称为“W34/70株”)的染色体DNA为模板，通过PCR，获得了含有nonScYGR012W全长基因的DNA片段(约1.2kb)。
将如上所述得到的nonScYGR012W基因片段通过TA克隆插入到pCR2.1-TOPO载体(invitrogen公司制)。将nonScYGR012W基因的碱基序列用Sanger方法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)进行分析，以确认碱基序列。
实施例2：啤酒试验酿造中nonScYGR012W基因表达分析
使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株进行啤酒试验酿造，将从发酵中的啤酒酵母菌体中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微阵列检测。
对发酵液经时抽样，观察酵母增殖量(图1)、表观浸出物浓度(图2)的经时变化。且与此同时对酵母菌体抽样，对制备后的mRNA进行生物素标记，使其在啤酒酵母DNA微阵列杂交。信号检测使用GCOS；Gene Chip Operating Software 1.0(AFFYMETRIX公司制)进行。nonScYGR012W基因表达模式如图3所示。由此结果，可确认通常的啤酒发酵中nonScYGR012W基因进行了表达。
实施例3：nonScYGR012W基因高表达株的制备
将实施例1中所述的nonScYGR012W/pCR2.1-TOPO用限制性内切酶SacI及NotI酶切，制备了包含蛋白质编码区域全长的DNA片段。使该片段与用限制性内切酶SacI及NotI処理的pYCGPYNot连接，构建了nonScYGR012W高表达载体nonScYGR012W/pYCGPYNot。pYCGPYNot是YCp型的酵母表达载体，导入的基因通过丙酮酸激酶基因PYK1的启动子高表达。酵母中的选择性标记包含耐氨基糖苷类抗生素(geneticin)基因G418r、大肠杆菌中的选择性标记包含氨苄青霉素抗性基因Ampr。
使用由上述方法制备的高表达载体，用特开平07-303475中所述的方法转化Saccharomyces pastorianus Weihenstephaner 34/70株。用含有氨基糖苷类抗生素(geneticin)300mg/L的YPD平板培养基(1％酵母浸出物、2％多聚蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂)选择转化体。
实施例4：啤酒试验酿造中硫化氢生成量的解析
使用亲代株(W34/70株)及由实施例3得到的nonScYGR012W高表达株通过以下条件进行了发酵试验。
Figure BSA00000445773000171
对发酵醪液经时抽样，观察酵母增殖量(OD660)(图4)、浸出物消耗量的经时变化(图5)。对发酵终止时硫化氢的定量参考Takahashi等[Brauwissenschaft.31.1(1978)]的手法。测定含有预知浓度的硫化氢的试样，从检测出的硫化氢峰面积来制成硫化氢的校正曲线，用与标准试样的分析条件相同的条件测定发酵醪液，从检测出的硫化氢的面积与校正曲线的关系对硫化氢量进行定量(表1)。
表1.发酵终止时发酵醪液中的硫化氢量
  亲代株(W34/70株)   nonScYGR012W高表达株
  H2S(ppb)   22.1   3.3
如表1所示，发酵终止时硫化氢生成量相对于亲代株的22.1ppb，其nonScYGR012W高表达株为3.3ppb。由该结果可知，通过nonScYGR012W高表达，硫化氢的生成量约减少了85％。
实施例5：半胱氨酸合成酶基因(ScYGR012W)的克隆
使用特开2004-283169中记载的比较数据库检索的结果，发现了啤酒酵母中的半胱氨酸合成酶基因ScYGR012W(序列号：5)。以所得到的碱基序列信息为基础，设计用于扩增各自全长基因的引物ScYGR012W_for(序列号：7)/ScYGR012W_rv(序列号：8)，以基因组解读株Saccharomyces pastorianus Weihenstephaner 34/70株的染色体DNA为模板，通过PCR，获得了含有ScYGR012W全长基因的DNA片段(约1.2kb)。
将如上所述得到的ScYGR012W基因片段通过TA克隆插入到pCR2.1-TOPO载体(invitrogen公司制)。将ScYGR012W基因的碱基序列用Sanger方法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)进行分析，以确认碱基序列。
实施例6：啤酒试验酿造中ScYGR012W基因表达分析
使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株进行啤酒试验酿造，将从发酵中的啤酒酵母菌体中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微阵列检测。
Figure BSA00000445773000181
对发酵液经时抽样，观察酵母增殖量(图6)、表观浸出物浓度(图7)的经时变化。且与此同时对酵母菌体抽样，对制备后的mRNA进行生物素标记，使其在啤酒酵母DNA微阵列杂交。信号检测使用GCOS；Gene Chip Operating Software 1.0(AFFYMETRIX公司制)进行。ScYGR012W基因表达模式如图8所示。由该结果，可确认通常的啤酒发酵中ScYGR012W基因进行了表达。
实施例7：ScYGR012W基因高表达株的制备
将实施例5中所述的ScYGR012W/pCR2.1-TOPO用限制性内切酶SacI及NotI酶切，制备了包含蛋白质编码区域全长的DNA片段。使该片段与用限制性内切酶SacI及NotI処理的pYCGPYNot连接，构建了ScYGR012W高表达载体ScYGR012W/pYCGPYNot。pYCGPYNot是YCp型的酵母表达载体，导入的基因通过丙酮酸激酶基因PYK1的启动子高表达。酵母中的选择性标记包含耐氨基糖苷类抗生素(geneticin)基因G418r，大肠杆菌中的选择性标记包含氨苄青霉素抗性基因Ampr。
使用由上述方法制备的高表达载体，用特开平07-303475中所述的方法转化Saccharomyces pastorianus Weihenstephaner 34/70株。用含有氨基糖苷类抗生素(geneticin)300mg/L的YPD平板培养基(1％酵母浸出物、2％多聚蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂)选择转化体。
实施例8：啤酒试验酿造中硫化氢生成量的解析
使用亲代株(W34/70株)及由实施例7得到的ScYGR012W高表达株通过以下条件进行了发酵试验。
Figure BSA00000445773000191
对发酵醪液经时抽样，观察酵母增殖量(OD660)(图9)、浸出物消耗量的经时变化(图10)。对发酵终止时硫化氢的定量参考Takahashi等[Brauwissenschaft.31.1(1978)]的手法。测定含有预知浓度的硫化氢的试样，从检测出的硫化氢峰面积来制成硫化氢的校正曲线，用与标准试样的分析条件相同的条件测定发酵醪液，从检测出的硫化氢的面积与校正曲线的关系对硫化氢量进行定量(表2)。
表2.发酵终止时发酵醪液中的硫化氢量
  亲代株(W34/70株)   ScYGR012W高表达株
  H2S(ppb)   22.1   2.6
如表2所示，发酵终止时硫化氢生成量相对于亲代株的22.1ppb，其ScYGR012W高表达株为2.6ppb。由该结果可知，通过ScYGR012W高表达，硫化氢的生成量约减少了88％。
工业实用性
因根据使用本发明的酵母的酒类制造方法(本发明的酒类的制造方法)，可通过半胱氨酸合成酶迅速消耗硫化氢，所以啤酒酿造及产品中硫化氢的浓度可被抑制到很低的水平，从而制造出香味优异的酒类。
序列表
Figure 1
Figure ISA00000445773200021
Figure ISA00000445773200041
Figure ISA00000445773200051

Claims (5)

1.载体，其含有编码由序列号：6的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的载体，其含有由序列号：5的碱基序列组成的多核苷酸。
3.酵母，其中导入了权利要求1或2所述的载体。
4.如权利要求3所述的酵母，其通过导入权利要求1或2所述的载体降低硫化氢生成能力。
5.啤酒的制造方法，其使用权利要求3或4所述的酵母。
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