CN102080091B - 过氧化氢酶基因及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及编码过氧化氢酶的基因及其用途，特别是涉及制造亚硫酸盐生成能力强的酿造酵母、使用该酵母制造制造酒精饮料的方法等。进一步具体地说，本发明涉及通过提高酿造酵母的编码过氧化氢酶Ctt1p的基因CTT1、特别是啤酒酵母中特征性的non-ScCTT1基因或ScCTT1基因的表达量，而使对产品香味稳定性起作用的亚硫酸盐的生成能力提高的酵母及使用该酵母的酒精饮料制造方法等。

Description

过氧化氢酶基因及其用途

本申请是于2007年1月26日提交的发明名称为“过氧化氢酶基因及其用途”，申请号为200710008185.0发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及编码过氧化氢酶的基因及其用途，特别是涉及制造香味优异的酒精饮料的酿造酵母、使用该酵母制造的酒精饮料及其制造方法等。进一步具体地说，本发明涉及通过提高酿造酵母的编码过氧化氢酶Ctt1p的基因CTT1、特别是啤酒酵母中特征性的nonScCTT1基因或ScCTT1基因的表达量，使对产品香味稳定化起作用的亚硫酸盐的生成能力提高的酵母及使用该酵母的酒精饮料的制造方法等。

背景技术

亚硫酸盐作为抗氧化作用强的化合物而为人所知，在食品、饮料、医药品等领域中作为抗氧化剂被广泛应用(例如日本特开平06-040907号公报、日本特开2000-093096号公报等)。在酒精饮料中，亚硫酸盐也被用作抗氧化剂，例如，对需长时间陈酿的葡萄酒的质量保证起重要作用，所以，日本国内厚生劳动省许可添加到残留浓度为350ppm以下。而且，在啤酒酿造产品中，保质期的变化依赖于产品中含有的亚硫酸盐浓度，所以提高此化合物的浓度，在香味稳定性等方面非常重要。

使产品中亚硫酸盐含量增大的最简单的方法是添加亚硫酸盐，但此时亚硫酸盐会被作为食品添加剂处理，这会带来商品开发受到限制以及消费者对食品添加剂存在的负面印象等方面的问题。

使酿造过程中发酵液中的亚硫酸盐浓度升高的方法，有1)通过过程控制的方法和2)通过酵母育种的方法。通过过程控制的方法，是指由于酿造中亚硫酸盐的生成与初期氧的供给量成反比，所以减少向发酵液中的氧供给量，不仅可增加亚硫酸盐的生成量，同时可抑制其氧化。

通过酵母育种的方法利用了基因操作技术。酵母可生物合成自身生命活动所需的含硫化合物，亚硫酸盐则作为生物合成含硫化合物的中间产物而生成。因此，利用酵母的此能力，不由外部添加亚硫酸盐，即可使产品中亚硫酸盐的量增加。MET3及MET14是编码如下还原酶的基因，其为参与从培养基中摄入的硫酸根离子生物合成亚硫酸盐过程的还原酶。C.Korch等进行了以下尝试，通过使此2个基因的表达量增加提高酵母的亚硫酸盐生成能力，并证明MET14更为有效(C.Korch et al.，Proc.Eur.Brew.Conv.Conger.，Lisbon，201-208，1991)。另外，J.Hansen等进行了以下尝试，通过破坏编码亚硫酸盐还原酶(sulfite ionreductase)的MET10基因，防止生成的亚硫酸盐还原，而使亚硫酸盐生成量增加(J.Hansen et al.，Nature Biotech.，1587-1591，1996)，但同时也出现了发酵延迟，以及不受欢迎的香味成分乙醛及1-丙醇的增加的问题。

而且，藤村等进行了以下尝试，通过提高编码酵母的亚硫酸根离子排出泵的SSU1基因中啤酒酵母中特有的nonScSSU1基因的表达量，促进菌体内生成的亚硫酸盐向菌体外排出，以增加啤酒中的亚硫酸盐浓度(藤村等，2003年度日本农艺化学会年次大会要旨集，159，2003。日语原名；藤村ら、2003年度日本農芸化学会年次大会要旨集、159、2003)。

发明内容

如上所述，使产品中亚硫酸盐含量增大的最简单的方法是添加亚硫酸盐，但近年来，消费者中对无添加、天然原料的愿望增强，并希望食品添加剂的使用为最低限。因此，利用酵母自身的生命活动，对不由外界添加亚硫酸盐即可达到对香味稳定性有效的亚硫酸盐浓度是行之有效的。但是，上述通过过程控制的方法由于供氧不足有时会降低酵母的增殖速度，引起发酵延迟及品质下降，所以不一定实用。

另外，有文献报道利用基因操作技术进行酵母育种，其结果达到了亲株的10倍以上的亚硫酸盐浓度(J.Hansen et al.，Nature Biotech.，1587-1591，1996)，但另一方面，也出现了发酵延迟，以及不受欢迎的香味成分乙醛及1-丙醇的增加等问题，所以实际应用的酵母还存在着问题。因此，希望能有既不影响发酵速度和产品质量，又能生产足量亚硫酸盐的酵母的育种方法。

本发明者为解决上述课题不断锐意研究的结果，从啤酒酵母中成功地鉴定、分离了编码过氧化氢酶的基因。且制备了将所得基因导入酵母并使其表达的转化酵母，确认了亚硫酸盐生成量的增加，从而完成了本发明。

本发明涉及啤酒酵母中存在的过氧化氢酶基因、该基因编码的蛋白质、该基因的表达得到调节的转化酵母、通过使用基因表达得到调节的酵母而控制产品中亚硫酸盐生成量的方法等。具体地说，本发明提供如下所示的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、导入了该载体的转化酵母、使用该转化酵母的酒精饮料的制造方法等。

(1)从以下(a)～(f)组成的群组中选择的多核苷酸：

(a)含有由序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸的多核苷酸；

(b)含有编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；

(c)含有编码由序列号：2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或增加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的、且具有过氧化氢酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；

(d)含有编码具有与序列号：2氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列、且具有过氧化氢酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；

(e)含有与序列号：1碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；以及

(f)含有与由编码序列号：2氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。

(2)上述(1)中所述的多核苷酸，其从以下(g)～(i)组成的群中选择：

(g)含有编码由序列号：2的氨基酸序列或序列号：2氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或增加了1～10个氨基酸的氨基酸序列组成的、且具有过氧化氢酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；

(h)含有编码具有与序列号：2氨基酸序列有90％或90％以上同一性的氨基酸序列、且具有过氧化氢酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；以及

(i)含有与由序列号：1碱基序列组成的多核苷酸或序列号：1碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交、且编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。

(3)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸。

(4)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。

(5)上述(1)～(4)中任一项所述的多核苷酸，其是DNA。

(6)蛋白质，其由上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸编码。

(7)载体，其含有上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸。

(7a)上述(7)中所述的载体，其含有具有以下(x)～(z)组成要素的表达盒：

(x)在酵母细胞内可转录的启动子；

(y)上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸，其与该启动子以正义方向或反义方向结合；以及

(z)与RNA分子的转录终止及多聚腺苷酸化有关的、在酵母中起作用的信号。

(8)载体，其含有从以下(j)～(l)组成的群中组选择的多核苷酸：

(j)含有编码由序列号：4的氨基酸序列或序列号：4氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或增加了1～10个氨基酸的氨基酸序列组成的、且具有过氧化氢酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；

(k)含有编码具有与序列号：4氨基酸序列有90％或90％以上同一性的氨基酸序列、且具有过氧化氢酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；以及

(l)含有与由序列号：3碱基序列组成的多核苷酸或序列号：3碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交、且编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。

(9)酵母，其中导入了上述(7)或(8)中所述的载体。

(10)上述(9)中所述的酵母，其亚硫酸盐的生成能力提高了。

(11)上述(10)中所述的酵母，其亚硫酸盐的生成能力是通过使上述(6)中所述的蛋白质的表达量增加而获得。

(12)酒精饮料的制造方法，其包括培养上述(9)～(11)中任一项所述的酵母。

(13)上述(12)中所述的酒精饮料的制造方法，其中所酿造的酒精饮料是麦芽饮料。

(14)上述(12)中所述的酒精饮料的制造方法，其中所酿造的酒精饮料是葡萄酒。

(15)酒精饮料，其由上述(12)～(14)中任一项所述的方法制造。

(16)一种评价被检酵母的亚硫酸盐生成能力的方法，其包括使用基于具有序列号：1或序列号：3的碱基序列、且编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的核苷酸序列而设计的引物或探针。

(16a)利用上述(16)中所述的方法，选择亚硫酸盐生成能力增强的酵母的方法。

(16b)利用上述(16a)所述的方法所选择的酵母制造酒精饮料(例如啤酒)的方法。

(17)评价被检酵母的亚硫酸盐生成能力的方法，其包括：培养被检酵母；以及测定具有序列号：1或序列号：3的碱基序列、且编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的基因的表达量。

(17a)亚硫酸盐生成能力高的酵母的选择方法，其包括：利用上述(17)中所述方法，评价被检酵母，并且选择编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的基因表达量高的酵母。

(17b)使用根据上述(17a)中所述方法选择的酵母制造酒精饮料(例如啤酒)的方法。

(18)酵母的选择方法，其包括：培养被检酵母，定量上述(6)中所述的蛋白质或测定具有序列号：1或序列号：3的碱基序列、且编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的基因的表达量，选择前述蛋白量或前述基因表达量与目标亚硫酸盐生成能力相应的被检酵母。

(19)上述(18)中所述的酵母的选择方法，其包括：培养标准酵母及被检酵母；测定具有序列号：1或序列号：3的碱基序列、且编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的基因在各酵母中的表达量；选择该基因表达量高于标准酵母的被检酵母。

(20)上述(18)中所述的酵母的选择方法，其包括：培养标准酵母及被检酵母；定量各酵母中上述(6)所述的蛋白质；选择该蛋白质含量高于标准酵母的被检酵母。

(21)酒精饮料的制造方法，其包括：使用上述(9)～(11)中任一所述的酵母或通过上述(18)～(20)中任一所述方法所选择的酵母，进行用于酒精饮料制造的发酵；调节亚硫酸盐的浓度。

使用本发明的酒精饮料的制造方法，可使产品中具有抗氧化作用的亚硫酸盐含量增大，因而可制造出香味稳定性优异、保质期更长的酒精饮料。

附图说明

图1是啤酒试验酿造中酵母增殖量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660值。

图2是啤酒试验酿造中浸出物消耗量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。

图3是啤酒试验酿造中酵母的non-ScCTT1基因表达变动的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示检测出的信号辉度。

图4是使用non-ScCTT1高表达株的啤酒试验酿造中酵母增殖量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660值。

图5是使用non-ScCTT1高表达株的啤酒试验酿造中浸出物消耗量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。

图6是表示使用non-ScCTT1高表达株的啤酒试验酿造在发酵结束时发酵液中亚硫酸盐浓度的示意图。

图7是啤酒试验酿造中酵母增殖量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660值。

图8是啤酒试验酿造中浸出物消耗量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。

图9是啤酒试验酿造中酵母的ScCTT1基因表达变动的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示检测出的信号辉度。

图10是使用ScCTT1高表达株的啤酒试验酿造中酵母增殖量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660值。

图11是使用ScCTT1高表达株的啤酒试验酿造中浸出物消耗量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。

图12是表示使用ScCTT1高表达株的啤酒试验酿造在发酵结束时发酵液中亚硫酸盐浓度的示意图。

具体实施方式

本发明者等以用日本特开2004-283169中公开的方法解读的啤酒酵母基因组信息为基础，分离、鉴定了啤酒酵母中特有的编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的non-ScCTT1基因。此碱基序列如序列号：1所示。由此基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列号：2所示。并且分离、鉴定了啤酒酵母中编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的ScCTT1基因。此碱基序列如序列号：3所示。由此基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列号：4所示。

1.本发明的多核苷酸

首先，本发明提供(a)含有由序列号：1或序列号：3的碱基序列组成的多核苷酸的多核苷酸；以及(b)含有编码由序列号：2或序列号：4的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA或RNA。

作为本发明对象的多核苷酸，不只限于来自上述啤酒酿造酵母的编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的多核苷酸，还包含编码与此蛋白质具同等功能的蛋白质的其他多核苷酸。作为功能相同的蛋白质，例如，可例举为(c)具有由序列号：2或序列号：4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或增加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的，且具有过氧化氢酶活性的蛋白质。

此种蛋白质，可为由序列号：2或序列号：4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或增加了例如1～100个、1～90个、1～80个、1～70个、1～60个、1～50个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个(1～数个)、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、或1个氨基酸残基的氨基酸序列组成的，且具有过氧化氢酶活性的蛋白质。上述氨基酸残基的缺失、取代、插入及/或增加的数量，一般优选较小的数量。次外，此种蛋白质可例举为(d)具有与序列号：2或序列号：4氨基酸序列有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、或99.9％以上同一性的氨基酸序列，且具有过氧化氢酶活性的蛋白质。上述同一性的数值一般越大越好。

过氧化氢酶活性，可根据例如Osorio et al.，Archives of Microbiology，181(3)，231-236(2004)中所述的方法评价。

另外，本发明也包含(e)含有与序列号：1或序列号：3碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有与编码由序列号：2或序列号：4氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。

此处的“在严谨条件下杂交的多核苷酸”，是指以序列号：1或序列号：3碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸的全部或一部分、或编码序列号：2或序列号：4氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分为探针，通过使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southern杂交法等得到的多核苷酸(例如DNA)。杂交方法，例如可利用Molecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons 1987-1997等中所述的方法。

本说明书中所述的“严谨条件”可为低严谨条件、中严谨条件、高严谨条件中的任一种。“低严谨条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件。“中严谨条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件。“高严谨条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。在上述条件中，越提高温度，越能期待高效地获得具有高同源性的多核苷酸(例如DNA)。影响杂交严谨性的因素可为温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，本领域技术人员通过适宜选择这些因素，可实现相似的严谨条件。

且杂交中使用市售的试剂盒时，例如，可使用Alkphos Direct LabellingReagents[Amersham Pharmacia公司制]。此时，根据试剂盒中附带的说明方案，与标记了的探针进行一夜培养后，将膜在55℃的条件下，用含有0.1％(w/v)SDS的第一次洗涤缓冲液洗涤，之后检测杂交后的多核苷酸(例如DNA)。

可杂交的其它多核苷酸包括，通过FASTA、BLAST等同源性搜索软件，使用默认参数(default parameter)计算时，与编码序列号：2或序列号：4氨基酸序列的多核苷酸具有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、或99.9％以上同一性的多核苷酸。

且氨基酸序列、碱基序列的同一性，可使用根据Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873，1993)确定。开发了基于BLAST算法、被称为BLASTN、BLASTX的程序(Altschul SF，et al：J.Mol.Biol.215：403，1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，参数例如为score＝100、word length＝12。使用BLASTX分析氨基酸序列时，参数例如为score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和GappedBLAST程序时，使用各程序的默认参数。

2.本发明的蛋白质

本发明也提供由上述多核苷酸(a)～(l)中任一个编码的蛋白质。本发明的优选蛋白质，包括由序列号：2或序列号：4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或增加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的、且具有过氧化氢酶活性的蛋白质。

此种蛋白质包括由序列号：2或序列号：4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或增加了上述数量的氨基酸残基的氨基酸序列组成的、且具有过氧化氢酶活性的蛋白质。且此种蛋白质也包括与序列号：2或序列号：4氨基酸序列具有如上所述同源性的氨基酸序列、且具有过氧化氢酶活性的蛋白质。

此种蛋白质，可使用《分子克隆》第3版、《Current Protocols in MolecularBiology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等中所述的定点诱变法获得。

本发明蛋白质的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或增加了1个或多个氨基酸残基，是指在同一氨基酸序列中任意1个或多个位置上，缺失、取代、插入及/或增加了1个或多个氨基酸残基之意，缺失、取代、插入及增加中的两种或两种以上也可同时发生。

以下，举例表示可相互取代的氨基酸残基。同一组中包含的氨基酸残基可相互取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基丝氨酸(o-methylserine)、叔丁基甘氨酸(t-butylglycine)、叔丁基丙氨酸(t-butyl alanine)、环己基丙氨酸(cyclohexyl alanine)；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸(isoglutamic acid)、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸(2-aminosuberic acid)；C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯丙氨酸、酪氨酸。

本发明的蛋白质可通过Fmoc法(fluorenylmethoxycarbonyl)、tBoc法(t-ButylOxy Carbonyl)等的化学合成法制造。也可利用Advanced Chem Tech公司制、珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司制、Pharmacia公司制、Protein TechnologyInstruments公司制、Synthecell-Vega公司制、PerSeptive公司制、岛津制作所公司制的肽合成仪等进行化学合成。

3.本发明的载体及导入了该载体的转化酵母

其次，本发明提供含有上述多核苷酸的载体。本发明的载体含有上述(a)～(l)中任一项所述的多核苷酸(DNA)。本发明的载体通常包括表达盒，该表达盒含有(x)在酵母细胞内可转录的启动子；(y)与该启动子以正义方向或反义方向结合的、上述(a)～(l)中任一项所述的多核苷酸(DNA)；以及(z)含有与RNA分子的转录终止及多聚腺苷酸化有关的、在酵母中起作用的信号。

导入酵母时使用的载体，可利用多拷贝型(YEp型)、单拷贝型(YCp型)、染色体整合型(YIp型)中的任一种。例如，YEp型载体的YEp24(J.R.Broachet al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，Academic Press，New York，83，1983)、YCp型载体的YCp50(M.D.Rose et al.，gene，60，237，1987)、YIp型载体的YIp5(K.Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035，1979)均已为人所知，且易获得。

用于调节酵母中基因表达的启动子/终止子，如能在酿造用酵母中起作用，同时对发酵液中成分没有影响，可任意组合。例如可利用3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子等。这些基因已被克隆，例如可通过M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中详细记载的已知方法很容易地获得。

因酿造用酵母不能利用营养缺陷型标记，所以，转化时使用的选择性标记可利用氨基糖苷类抗生素(Geneticin)抗性基因(G418^r)、铜抗性基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，3371984)、浅蓝菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(分别为猪腰淳嗣等，生化学，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991。日语原名；猪腰淳嗣ら，生化学，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991)等。

如上所述构建的载体被导入宿主酵母。宿主酵母为可用于酿造的任意酵母，例如可为啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体地说，可例举为酵母属(Saccharomyces)等的酵母。在本发明中，可使用的啤酒酵母例如可为Saccharomyces pastorianus W34/70，Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、NCYC456等，或Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953或NBRC1954等；。还可使用例如日本酿造协会葡萄酒用1号、3号、和4号等的葡萄酒酵母；以及例如清酒用酵母7号、和9号等的日本酿造协会清酒酵母，但不限于此。本发明中，优选使用的啤酒酵母例如为巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)。

酵母的转化方法，可利用一般可使用的公知的方法。例如，可使用电穿孔法“Meth.Enzym.，194，182(1990)”、原生质球法(Spheroplast法)“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，751929(1978)”、醋酸锂法“J.Bacteriology，153，p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75p1929(1978)、Methods in yeast genetics，2000Edition：ACold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中所述的方法实施，但不限于此。

更具体地说，将宿主酵母置于标准酵母营养培养基[例如YEPD培养基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等]中培养，使OD600nm值为1～6。将此培养酵母离心分离后收集、洗涤，用浓度约为1～2M的碱金属离子、优选锂离子进行预处理。将此细胞在约30℃条件、静置约60分钟后，与待导入的DNA(约1～20μg)同时在约30℃条件下静置约60分钟。加入聚乙二醇，优选加入约4,000道尔顿的聚乙二醇，使最终浓度约为20％～50％。在约30℃、静置约30分钟后，将此细胞在约42℃条件，加热处理约5分钟。优选将此细胞悬浮液用标准酵母营养培养基洗涤后，放入预定量的新鲜标准酵母营养培养基中，约30℃下静置约60分钟。之后，将其接种到含有作为选择性标记使用的抗生素或类似物质的标准琼脂培养基中，获得转化体。其他有关一般性的克隆技术可参照(《分子克隆》第3版)、“Methods in YeastGenetics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold SpringHarbor，NY)”等。

4.本发明的酒精饮料的制造方法及根据其制法获得的酒精饮料

将上述本发明的载体导入适合酿造所需酒精饮料的酵母中，并可通过使用其酵母，制造所需要的、且亚硫酸盐含量增加的、香味稳定性优异的酒精饮料。而且通过下述本发明的酵母评价方法选择的酵母也可同样使用。作为制造对象的酒精饮料并不限于此，例如可例举为啤酒、发泡饮料(happoushu)(例如啤酒味饮料)、葡萄酒、清酒等。

制造上述酒精饮料时，除使用本发明中所得到的酿造酵母代替亲株以外，可利用公知的方法。因此，原料、制造设备、制造管理等可与以往完全相同，不会因制造亚硫酸盐含量增加的酒精饮料而增加成本。即根据本发明，可在使用已有设备、不增加成本的情况下，制造香味稳定性等优异的酒精饮料。

5.本发明的酵母的评价方法

本发明涉及使用基于具有序列号：1或序列号：3的碱基序列、且编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的基因的碱基序列而设计的引物或探针，评价被检酵母的亚硫酸盐的生产能力的方法。此种评价方法的一般方法为公知方法，例如，如WO 01/040514、日本特开平8-205900号公报等中所记载。以下，就此评价方法进行简单说明。

首先，制备被检酵母的基因组。制备方法可使用Hereford法、醋酸钾法等公知的任何方法[例如，Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，p130(1990)]。以所得到的基因组为对象，使用基于编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的基因碱基序列(优选ORF序列)而设计的引物或探针，测定被检酵母的基因组中是否存在该基因或该基因的特异性序列。引物或探针的设计可使用公知的方法进行。

基因或特异性序列的检测可使用公知的方法进行。例如，将含有特异性序列的一部分或全部的多核苷酸或含有其碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸作为一个引物使用，另一个引物为含有此序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或含有其碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸，通过PCR法扩增酵母的核酸，并测定扩增物的有无、扩增物分子量的大小等。用于引物的多核苷酸的碱基数通常为10bp以上，优选为15～25bp。且夹在两引物间的碱基数，通常为300～2000bp较适当。

PCR法的反应条件无特别限定，例如，可使用变性温度：90～95℃、退火温度：40～60℃、延伸温度：60～75℃、循环数：10次以上等的条件。所得到的反应生成物可使用琼脂糖凝胶等的电泳法等分离，以测定扩增产物的分子量。根据此方法，通过扩增产物的分子量是否是含有特异部分的DNA分子的大小，来预测、评价其酵母的亚硫酸盐生产能力。且可通过分析扩增物的碱基序列，更进一步正确地预测、评价上述能力。

本发明中，可通过培养被检酵母，测定具有序列号：1或序列号：3的碱基序列、且编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的基因的表达量，评价被检酵母的亚硫酸盐生产能力。在测定编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的基因表达量时，可通过培养被检酵母，然后定量来自编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的基因的mRNA或蛋白质来进行。mRNA或蛋白质的定量，可使用公知的方法。mRNA的定量例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR，蛋白质的定量例如可通过Western印迹法进行(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons1994-2003)。而且，可通过测定被检酵母发酵后所得到的发酵液中的亚硫酸盐浓度，预测被检酵母中上述基因的表达量。

而且，可通过培养被检酵母，测定具有序列号：1或序列号：3的碱基序列、且编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的基因的表达量，选择前述基因表达量与目标过氧化氢酶活性相应的酵母，来选择适合酿造所需酒精饮料的酵母。也可培养标准酵母及被检酵母，测定各酵母中前述基因的表达量，比较标准酵母和被检酵母的前述基因的表达量，来选择所需的酵母。具体地说，例如可通过培养标准酵母及被检酵母，测定具有序列号：1或序列号：3的碱基序列、且编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的基因在各酵母中的表达量，选择该基因的表达高于标准酵母的被检酵母，来选择适合酿造所需酒精饮料的酵母。

或者，可通过培养被检酵母，选择过氧化氢酶活性较强的酵母，来选择适合酿造所需酒精饮料的酵母。

此时，被检酵母或标准酵母，例如为使用上述导入了本发明载体的酵母、实施了突变处理的酵母或自发突变的酵母等。过氧化氢酶活性，例如可用Osorioet al.，Archives of Microbiology，181(3)，231-236(2004)中所述的方法评价。突变处理，例如可使用紫外线照射、放射线照射等的物理方法，通过甲磺酸乙酯(EMS：Ethylmethanesulfonate)、N-甲基-N-亚硝基胍(N-methyl-N-nitrosoguanidine)等药剂处理的化学方法等的任何方法进行(例如，参照大岛泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、p67-75、学会出版中心。日语原名；大嶋泰治編著、生物化学実験法39酵母分子遺伝学実験法、p67-75、学会出版センタ一)。

作为标准酵母、被检酵母使用的酵母，可例举为酿造时可使用的任意酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体地说，可例举为酵母属(Saccharomyces)等的酵母[例如，巴斯德酵母(S.pastorianus)、S.cerevisiae、及S.carlsbergensis)，本发明中，可使用啤酒酵母例如Saccharomyces pastorianusW34/70，Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、或NCYC456，或Saccharomycescerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、或NBRC1954等。而且还可使用威士忌酵母，例如Saccharomyces cerevisiae NCYC90等；例如日本酿造协会葡萄酒用1号、3号、和4号等的葡萄酒酵母；例如日本酿造协会清酒用7号、和9号等的清酒酵母，但不限于此。本发明中，啤酒酵母例如可优选使用巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。标准酵母、被检酵母可从上述酵母群中以任意组合选择。

实施例

以下，通过实施例详细叙述本发明，但本发明不限于以下实施例。

实施例1：啤酒酿造酵母中编码过氧化氢酶的基因(nonScCTT1)的克隆

使用日本特开2004-283169号公报中记载的比较数据库检索的结果，发现了啤酒酵母中特有的编码过氧化氢酶的基因non-ScCTT1(序列号：1)。以所得到的碱基序列信息为基础，设计用于扩增各自全长基因的引物non-ScCTT1_for(序列号：5)和non-ScCTT1_rv(序列号：6)，以基因组解读株Saccharomycespastorianus Weihenstephan 34/70株(有时可简写为“W34/70株”)的染色体DNA为模板，通过PCR，获得了含有non-ScCTT1全长基因的DNA片段。

将如上所述获得的non-ScCTT1基因片段通过TA克隆插入到pCR2.1-TOPO载体[invitrogen公司制]。将non-ScCTT1基因的碱基序列用Sanger方法(F.Sanger，Science，214：1215，1981)进行分析，以确认碱基序列。

实施例2：啤酒试验酿造中non-ScCTT1基因表达的分析

使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株进行啤酒试验酿造，将从发酵中的啤酒酵母菌体中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微阵列检测。

麦芽汁浸出物浓度    12.69％

麦芽汁容量          70L

麦芽汁溶解氧浓度    8.6ppm

发酵温度            15℃

酵母投入量          12.8×10⁶细胞/mL

对发酵液经时取样，观察酵母增殖量(图1)、表观浸出物浓度(图2)的经时变化。与此同时对酵母菌体取样以制备mRNA，对制备后的mRNA进行生物素标记，使其在啤酒酵母DNA微阵列杂交。信号检测使用GeneChip OperatingSystem[GCOS；GeneChip Operating Software 1.0AFFYMETRIX公司制]进行。Non-ScCTT1基因的表达模式如图3所示。由此结果可确认，通常的啤酒发酵中，non-ScCTT1基因进行了表达。

实施例3：non-ScCTT1基因高表达株的制备

将实施例1中所述的non-ScCTT1/pCR2.1-TOPO用限制性内切酶SacI及NotI酶切，制备包含non-ScCTT1基因的DNA片段。使此片段与用限制性内切酶SacI及NotI处理的pUP3GLP2连接，构建了non-ScCTT1高表达载体pUP-nonScCTT1。pUP3GLP2是指同源重组位点含有乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因URA3的YIp型(染色体整合型)酵母表达载体，导入的基因通过3-磷酸甘油醛脱氢酶基因TDH3的启动子/终止子高表达。在半乳糖激酶基因GAL1的启动子/终止子的控制下，导入作为选择性标记的耐药性基因YAP1，由此在含有半乳糖的培养基中诱导表达。还包括作为大肠杆菌的选择性标记氨苄青霉素抗性基因Amp^r。

使用由上述方法制备的高表达载体，用日本特开平07-303475中所述的方法转化Saccharomyces pastorianus Weihenstephan 164株，用含有1.0mg/L浅蓝菌素的YPGa1平板培养基(1％酵母浸出物、2％多聚蛋白胨、2％半乳糖、2％琼脂)选择浅蓝菌素抗性菌株。

实施例4：啤酒试验酿造中亚硫酸盐生成量的解析

使用亲株及用实施例3中所述方法获得的non-ScCTT1高表达株，在以下条件下进行发酵试验。

麦芽汁浸出物浓度     12.78％

麦芽汁容量           2L

麦芽汁溶解氧浓度     约8ppm

发酵温度             15℃，恒定

酵母投入量           10.5g湿酵母菌体/2L麦芽汁

对发酵液经时取样，观察酵母增殖量(OD660)(图4)、浸出物消耗量(图5)的经时变化。对发酵终止时亚硫酸盐浓度的定量，是在酸性条件下，通过蒸馏将亚硫酸盐收集于过氧化氢水溶液中后，用碱滴定[(财)日本酿造协会修订的BCOJ啤酒分析法](日语原名；(財)日本醸造協会改訂BCOJ ビ一ル分析法)。

如图6所示，可判明non-ScCTT1高表达株生成了高于亲株约2.5倍的亚硫酸盐。且此时，亲株与高表达株之间在增殖速度及浸出物消耗速度上无显著差异。

实施例5：编码过氧化氢酶的基因(ScCTT1)的克隆

使用日本特开2004-283169中记载的比较数据库检索的结果，发现了啤酒酵母中特有的编码过氧化氢酶的基因ScCTT1(序列号：3)。以所得到的碱基序列信息为基础，设计用于扩增各自全长基因的引物ScCTT1_for(序列号：7)和ScCTT1_rv(序列号：8)，以基因组解读株Saccharomyces pastorianusWeihenstephan 34/70株的染色体DNA为模板，通过PCR，获得了含有ScCTT1全长基因的DNA片段。

将如上所述得到的ScCTT1基因片段通过TA克隆插入到pCR2.1-TOPO载体[invitrogen公司制]。将ScCTT1基因的碱基序列用Sanger方法(F.Sanger，Science，214：1215，1981)进行分析，以确认碱基序列。

实施例6：啤酒试验酿造中ScCTT1基因表达的分析

使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株进行啤酒试验酿造，将从发酵中的啤酒酵母菌体中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微阵列检测。

麦芽汁浸出物浓度    12.69％

麦芽汁容量          70L

麦芽汁溶解氧浓度    8.6ppm

发酵温度            15℃

酵母投入量          12.8×10⁶细胞/mL

对发酵液经时取样，观察酵母增殖量(图7)、表观浸出物浓度(图8)的经时变化。与此同时对酵母菌体取样，以制备mRNA，对制备后的mRNA进行生物素标记，使其在啤酒酵母DNA微阵列杂交。信号检测使用GeneChipOperating System[GCOS；GeneChip Operating Software 1.0AFFYMETRIX公司制]进行。ScCTT1基因的表达模式如图9所示。由此结果可确认，通常的啤酒发酵中，ScCTT1基因进行了表达。

实施例7：ScCTT1高表达株的制备

将实施例5中所述的ScCTT1/pCR2.1-TOPO用限制性内切酶SacI及NotI酶切，制备包含ScCTT1基因的DNA片段。使此片段与用限制性内切酶SacI及NotI处理的pUP3GLP2连接，构建了ScCTT1高表达载体pUP-ScCTT1。

使用由上述方法制备的高表达载体，用日本特开平07-303475中所述的方法转化Saccharomyces pastorianus Weihenstephan 164株，用含有1.0mg/L浅蓝菌素的YPGa1平板培养基(1％酵母浸出物、2％多聚蛋白胨、2％半乳糖、2％琼脂)选择浅蓝菌素抗性菌株。

实施例8：啤酒试验酿造中亚硫酸盐生成量的解析

使用亲株及用实施例7所述方法获得的ScCTT1高表达株，在以下条件进行发酵试验。

麦芽汁浸出物浓度    12.78％

麦芽汁容量          2L

麦芽汁溶解氧浓度    约8ppm

发酵温度            15℃(恒定)

酵母投入量10.5g湿酵母菌体/2L麦芽汁

对发酵液经时取样，观察酵母增殖量(OD660)(图10)、浸出物消耗量(图11)的经时变化。对发酵终止时亚硫酸盐浓度的定量，是在酸性条件下，通过蒸馏将亚硫酸盐收集于过氧化氢水溶液中后，用碱滴定[(财)日本酿造协会修订的BCOJ啤酒分析法](日语原名；(財)日本醸造協会改訂BCOJ ビ一ル分析法)。如图12所示，可判明ScCTT1高表达株生成了高于亲株约1.7倍的亚硫酸盐。且此时，亲株与高表达株之间在增殖速度及浸出物消耗速度上无显著差异。

根据本发明的酒精饮料的制造方法，可增大产品中具有抗氧化作用的亚硫酸盐的含量，制造出香味稳定性优异、保质期更长的酒精饮料。

Claims (12)

1.一种多核苷酸，其编码由序列号：4的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其由序列号：3的碱基序列组成。

3.如权利要求1所述的多核苷酸，其是DNA。

4.蛋白质，其由权利要求1-3任一项所述的多核苷酸编码。

5.载体，其含有权利要求1-3任一项所述的多核苷酸。

6.酵母，其中导入了权利要求5所述的载体。

7.酒精饮料的制造方法，其包括培养权利要求6所述的酵母。

8.如权利要求7所述的酒精饮料的制造方法，其中所酿造的酒精饮料是麦芽饮料。

9.如权利要求7所述的酒精饮料的制造方法，其中所酿造的酒精饮料是葡萄酒。

10.一种酵母的选择方法，其包括：培养标准酵母及被检酵母；测定由序列号：3的碱基序列组成的基因在所述标准酵母和所述被检酵母中的表达量；以及选择基因表达量高于标准酵母的被检酵母。

11.一种酵母的选择方法，其包括：培养标准酵母及被检酵母；定量所述标准酵母和所述被检酵母中权利要求4所述的蛋白质；以及选择所述蛋白质含量高于标准酵母的被检酵母。

12.一种酒精饮料的制造方法，其包括：使用权利要求6所述的酵母或通过权利要求10或11所述的方法选择的酵母，进行用于酒精饮料制造的发酵；以及调节亚硫酸盐的浓度。

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