JP4478717B2 - カタラーゼ遺伝子及びその用途 - Google Patents
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Description
(a)配列番号:1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(c)配列番号:2のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつカタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(d)配列番号:2のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつカタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(e)配列番号:1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び
(f)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
(g)配列番号:2のアミノ酸配列又は配列番号:2のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつカタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(h) 配列番号:2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつカタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び
(i)配列番号:1の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号:1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
(4)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(5)DNAである、上記(1)〜(4)のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
(6)上記(1)〜(5)のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
(7a)以下の(x)〜(z)の構成要素を含む発現カセットを含む上記(7)に記載のベクター:
(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター;
(y)該プロモーターにセンス方向又はアンチセンス方向で結合した、上記(1)〜(5)のいずれかに記載のポリヌクレオチド;及び
(z)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
(8)以下の(j)〜(l)からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有するベクター:
(j)配列番号:4のアミノ酸配列又は配列番号:4のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつカタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(k) 配列番号:4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつカタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び
(l)配列番号:3の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号:3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
(10)亜硫酸生成能が向上した上記(9)に記載の酵母。
(11)上記(6)に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって亜硫酸生成能が増強された上記(10)に記載の酵母。
(12)上記(9)〜(11)のいずれかに記載の酵母を培養することを含む酒類の製造方法。
(13)醸造する酒類が麦芽飲料である上記(12)に記載の酒類の製造方法。
(14)醸造する酒類がワインである上記(12)に記載の酒類の製造方法。
(15)上記(12)〜(14)のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
(16a)上記(16)に記載の方法によって、亜硫酸生成能が増強された酵母を選別する方法。
(16b)上記(16a)に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類(例えば、ビール)を製造する方法。
(17) 被検酵母を培養し、配列番号:1又は配列番号:3の塩基配列を有するカタラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の亜硫酸生成能を評価する方法。
(17a)上記(17)に記載の方法で、被検酵母を評価し、カタラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量が高い酵母を選別する、亜硫酸生成能の高い酵母を選別する方法。
(17b)上記(17a)に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類(例えば、ビール)を製造する方法。
(19) 基準酵母および被検酵母を培養して配列番号:1又は配列番号:3の塩基配列を有するカタラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現である被検酵母を選択する、上記(18)に記載の酵母の選択方法。
(21)上記(9)〜(11)に記載の酵母および上記(18)〜(20)に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、亜硫酸濃度を制御することを特徴とする、酒類の製造方法。
まず、本発明は、(a)配列番号:1又は配列番号:3の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び(b)配列番号:2又は配列番号:4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドはDNAであってもRNAであってもよい。
本発明で対象とするポリヌクレオチドは、上記のビール酵母由来のカタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号:2又は配列番号:4のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつカタラーゼ活性を有するタンパク質を有するタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質としては、配列番号:2又は配列番号:4のアミノ酸配列において、例えば、1〜100個、1〜90個、1〜80個、1〜70個、1〜60個、1〜50個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個、1〜8個、1〜7個、1〜6個(1〜数個)、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつカタラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び/又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号:2又は配列番号:4のアミノ酸配列と約60%以上、約70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつカタラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
なお、カタラーゼ活性は、例えばOsorio et al., Archives of Microbiology, 181(3), 231-236 (2004) に記載の方法で評価することができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993)を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul SF, et al: J. Mol. Biol. 215: 403, 1990)。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメータは、例えばscore=100、wordlength=12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメータは、例えばscore=50、wordlength=3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(l)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号:2又は配列番号:4のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつカタラーゼ活性を有するタンパク質である。
このようなタンパク質としては、配列番号:2又は配列番号:4のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつカタラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号:2又は配列番号:4のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつカタラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン; B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸; C群:アスパラギン、グルタミン; D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸; E群:プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン; F群:セリン、スレオニン、ホモセリン; G群:フェニルアラニン、チロシン。
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(l)のいずれかに記載のポリヌクレオチド(DNA)を含有する。また、本発明のベクターは、通常、(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター;(y)該プロモーターにセンス方向又はアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(l)のいずれかに記載のポリヌクレオチド(DNA);及び(z)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。
酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター/ターミネーターとしては、醸造用酵母中で機能するとともに、もろみ中の成分に影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(TDH3)のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子(PGK1)のプロモーターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えばM. F. Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982) に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。
上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール,ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス(Saccharomyces)属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス(Saccharomyces pastorianus)W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地(例えばYEPD培地“Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117(1979)”等)で、OD600nmの値が1〜6となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約1〜2Mのアルカリ金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約30℃で、約60分間静置した後、導入するDNA(約1〜20μg)とともに約30℃で、約60分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約4,000ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約20%〜50%となるように加える。約30℃で、約30分間静置した後、この細胞を約42℃で約5分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約30℃で約60分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。
その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第3版」、“Methods in Yeast Genitics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)”等を参照することができる。
上述した本発明のベクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、その酵母を用いることによって所望の酒類でかつ亜硫酸含量が増加し、香味安定性に優れた酒類を製造することができる。また、下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母も同様に用いることができる。対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、ワイン、清酒などが挙げられる。
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、亜硫酸含量を増加させた酒類を製造するためのコストの増加はない。つまり、本発明によれば、香味安定性等に優れた酒類を、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。
本発明は、配列番号:1又は配列番号:3の塩基配列を有するカタラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母の亜硫酸生成能について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、WO01/040514号公報、特開平8−205900号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる(例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990))。得られたゲノムを対象にして、カタラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列(好ましくは、ORF配列)に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマー又はプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
遺伝子又は特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、PCR 法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、10bp以上であり、15〜25bpであることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、300 〜2000bpが適当である。
PCR 法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度:90〜95℃、アニーリング温度:40〜60℃、伸長温度:60〜75℃、サイクル数:10回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のDNA 分子を含む大きさかどうかによって、その酵母の亜硫酸生成能について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性能についてより正確に予測・評価することが可能である。
これらの場合、被検酵母又は基準酵母としては、例えば、上述した本発明のベクターを導入した酵母、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母などが使用され得る。カタラーゼ活性は、例えばOsorio et al., Archives of Microbiology, 181(3), 231-236 (2004) に記載の方法で評価することができる。突然変異処理は、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、EMS(エチルメタンスルホネート)、N-メチル-N-ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい(例えば大嶋泰治編著、生物化学実験法39 酵母分子遺伝学実験法、p67-75、学会出版センターなど参照)。
特開2004-283169に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母に特有のカタラーゼをコードする遺伝子、nonScCTT1を見出した(配列番号:1)。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーnonScCTT1_for(配列番号:5)/nonScCTT1_rv(配列番号:6)を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株(「W34/70株」と略記する場合がある。)の染色体DNAを鋳型としたPCRによってnonScCTT1の全長遺伝子を含むDNA断片を取得した。
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度 12.69%
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量(図1)、外観エキス濃度(図2)の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム(GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製)を用いて行った。nonScCTT1遺伝子の発現パターンを図3に示す。この結果より、通常のビール発酵においてnonScCTT1遺伝子が発現していることが確認できた。
実施例1に記載のnonScCTT1/pCR2.1-TOPOを制限酵素SacIおよびNotIで消化し、nonScCTT1遺伝子を含むDNA断片を調製した。これを制限酵素SacIおよびNotI処理したpUP3GLP2に連結させ、nonScCTT1高発現ベクターpUP-nonScCTT1を構築した。pUP3GLP2とは相同組換え部位としてオロチジン5リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子URA3を含むYIp型(染色体組み込み型)の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子TDH3のプロモーター/ターミネーターによって高発現される。酵母での選択マーカーとして、ガラクトキナーゼ遺伝子GAL1のプロモーター/ターミネーターの制御下に薬剤耐性遺伝子YAP1が組み込まれており、ガラクトースを含む培地で発現が誘導される。また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Amprを含んでいる。
親株ならびに実施例3で得られたnonScCTT1高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行った。
麦汁エキス濃度 12.78%
麦汁容量 2L
麦汁溶存酸素濃度 約8ppm
発酵温度 15℃一定
酵母投入量 10.5g湿酵母菌体/2L麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量(OD660)(図4)、エキス消費量(図5)の経時変化を調べた。発酵終了時における亜硫酸濃度の定量は、酸性下で蒸留により亜硫酸を過酸化水素水に捕集した後、アルカリで滴定することによって行った((財)日本醸造協会 改訂BCOJビール分析法)。
図6に示すとおり、nonScCTT1高発現株では親株の約2.1倍の亜硫酸を生成することが明らかとなった。またこのとき、親株と高発現株の間で、増殖速度およびエキス消費速度に有意な差はみられなかった。
特開2004-283169に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母特有のカタラーゼをコードする遺伝子、ScCTT1を見出した(配列番号:3)。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーScCTT1_for(配列番号:7)/ScCTT1_rv(配列番号:8)を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株の染色体DNAを鋳型としたPCRによってScCTT1の全長遺伝子を含むDNA断片を取得した。
上記のようにして得られたScCTT1遺伝子断片を、TAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター(インビトロジェン社製)に挿入した。ScCTT1遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度 12.69%
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量(図7)、外観エキス濃度(図8)の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム(GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製)を用いて行った。ScCTT1遺伝子の発現パターンを図9に示す。この結果より、通常のビール発酵においてScCTT1遺伝子が発現していることが確認できた。
実施例5に記載の方法によって得られたScCTT1/pCR2.1-TOPOを制限酵素SalIおよびNotIで消化し、ScCTT1遺伝子を含むDNA断片を調製した。これを制限酵素SalIおよびNotI処理したpUP3GLP2に連結させ、ScCTT1高発現ベクターpUP-ScCTT1を構築した。
親株ならびに実施例7に記載の方法によって得られたScCTT1高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行った。
麦汁エキス濃度 12.78%
麦汁容量 2L
麦汁溶存酸素濃度 約 8ppm
発酵温度 15℃一定
酵母投入量 10.5g湿酵母菌体/2L麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量(OD660)(図10)、エキス消費量(図11)の経時変化を調べた。発酵終了時における亜硫酸濃度の定量は、酸性下で蒸留により亜硫酸を過酸化水素水に捕集した後、アルカリで滴定することによって行った((財)日本醸造協会 改訂BCOJビール分析法)。図12に示すとおり、ScCTT1高発現株では親株の約1.7倍の亜硫酸を生成することが明らかとなった。またこのとき、親株と高発現株の間で、増殖速度およびエキス消費速度に有意な差はみられなかった。
Claims (20)
- 以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリヌクレオチド:
(a)配列番号:1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(c)配列番号:2のアミノ酸配列において、1〜15個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ亜硫酸生成能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び
(d) 配列番号:2のアミノ酸配列に対して97%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ亜硫酸生成能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 - 以下の(g)〜(h)からなる群から選択される請求項1に記載のポリヌクレオチド:
(g)配列番号:2のアミノ酸配列又は配列番号:2のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ亜硫酸生成能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び
(h) 配列番号:2のアミノ酸配列に対して98%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ亜硫酸生成能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 - 配列番号:1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- DNAである、請求項1〜4のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
- 請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
- 以下の(j)〜(l)からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有するベクターが導入され、亜硫酸生成能が増大した酵母:
(j)配列番号:2もしくは4のアミノ酸配列又は配列番号:4のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ亜硫酸生成能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(k) 配列番号:2もしくは4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ亜硫酸生成能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び
(l)配列番号:1もしくは3の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号:1もしくは3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ亜硫酸生成能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 - 請求項7に記載のベクターが導入された酵母。
- 亜硫酸生成能が増大した請求項9に記載の酵母。
- 請求項6に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、亜硫酸生産能が増強された請求項10に記載の酵母。
- 請求項9〜11のいずれかに記載の酵母を培養することを含む酒類の製造方法。
- 醸造する酒類が麦芽飲料である請求項12に記載の酒類の製造方法。
- 醸造する酒類がワインである請求項12に記載の酒類の製造方法。
- 配列番号:1又は配列番号:3の塩基配列を有する亜硫酸生成能を有するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母の亜硫酸生成能について評価する方法。
- 被検酵母を培養し、配列番号:1又は配列番号:3の塩基配列を有する亜硫酸生成能を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の亜硫酸生成能を評価する方法。
- 被検酵母を培養して請求項6に記載のタンパク質を定量、または配列番号:1もしくは配列番号:3の塩基配列を有する亜硫酸生成能を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定し、目的とする亜硫酸生成能に応じた前記タンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
- 基準酵母および被検酵母を培養して配列番号:1又は配列番号:3の塩基配列を有する亜硫酸生成能を有するタンパク質をコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現である被検酵母を選択する、請求項17に記載の酵母の選択方法
- 基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項6に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、請求項18に記載の酵母の選択方法。
- 請求項9〜11に記載の酵母および請求項17〜19に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、亜硫酸濃度を制御することを特徴とする、酒類の製造方法。
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