JP2009528020A - グリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子及びその用途 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
(a)配列番号:1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(c)配列番号:2のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(d)配列番号:2のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(e)配列番号:1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び
(f)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
(g)配列番号:2のアミノ酸配列又は配列番号:2のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(h) 配列番号:2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び
(i)配列番号:1の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号:1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
(4)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(5)DNAである、上記(1)〜(4)のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
(6)上記(1)〜(5)のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
(7a)以下の(x)〜(z)の構成要素を含む発現カセットを含む上記(7)に記載のベクター:
(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター;
(y)該プロモーターにセンス方向又はアンチセンス方向で結合した、上記(1)〜(5)のいずれかに記載のポリヌクレオチド;及び
(z)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
(7b)以下の(x)〜(z)の構成要素を含む発現カセットを含む上記(7)に記載のベクター:
(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター;
(y)該プロモーターにセンス方向で結合した、上記(1)〜(5)のいずれかに記載のポリヌクレオチド;及び
(z)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
(9)乾燥耐性が増大した上記(8)に記載の酵母(実用酵母)。ここで、「実用酵母」とは、醸造用酵母、パン酵母、産業用酵母など、実用的価値を有する酵母をいう。
(10)低温保存耐性が増大した上記(8)に記載の酵母。
(11)上記(6)に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、乾燥耐性が増強された上記(9)に記載の酵母。
(12)上記(6)に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、低温保存耐性が増強された上記(10)に記載の酵母。
(12a)醸造酵母である、上記(9)〜(12)のいずれかに記載の酵母。
(14)醸造する酒類が麦芽飲料である上記(13)に記載の酒類の製造方法。
(15)醸造する酒類がワインである上記(13)に記載の酒類の製造方法。
(16)上記(13)〜(15)のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
(17a)上記(17)に記載の方法によって、乾燥耐性および/または低温保存耐性が増強された酵母を選別する方法。
(17b)上記(17a)に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類(例えばビール、工業用アルコールなど)を製造する方法。
(17c)上記(17a)に記載の方法によって選別された酵母を用いて有用物質(例えば、タンパク質)を製造する方法。
(18)被検酵母を培養し、配列番号:1の塩基配列を有するグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の乾燥耐性および/または低温保存耐性を評価する方法。
(18a)上記(18)に記載の方法で、被検酵母を評価し、グリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の発現量が高い酵母を選別する、乾燥耐性および/または低温保存耐性の高い酵母を選別する方法。
(18b)上記(18a)に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類(例えば、ビール)を製造する方法。
(18c)上記(18a)に記載の方法によって選別された酵母を用いて有用物質(例えば、タンパク質)を製造する方法。
(20)基準酵母および被検酵母を培養して配列番号:1の塩基配列を有するグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現である被検酵母を選択する、上記(19)に記載の酵母の選択方法。
(21)基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における上記(6)に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、上記(19)に記載の酵母の選択方法。
まず、本発明は、(a)配列番号:1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド及び(b)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、DNAであってもRNAであってもよい。
本発明で対象とするポリヌクレオチドは、上記のビール酵母由来のグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号:2のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質としては、配列番号:2のアミノ酸配列において、例えば、1〜100個、1〜90個、1〜80個、1〜70個、1〜60個、1〜50個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個、1〜8個、1〜7個、1〜6個(1〜数個)、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び/又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号:2のアミノ酸配列と約60%以上、約70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
なお、グリコーゲン分岐酵素活性は、例えばMol Cell Biol. 1992 Jan;12(1):22-9.に記載の方法で評価することができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993)を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul SF, et al: J. Mol. Biol. 215: 403, 1990)。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメータは、例えばscore=100、wordlength=12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメータは、例えばscore=50、wordlength=3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(i)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号:2のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質である。
このようなタンパク質としては、配列番号:2のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号:2のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン; B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸; C群:アスパラギン、グルタミン; D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸; E群:プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン; F群:セリン、スレオニン、ホモセリン; G群:フェニルアラニン、チロシン。
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド(DNA)を含有する。また、本発明のベクターは、通常、(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター;(y)該プロモーターにセンス方向又はアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド(DNA);及び(z)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。なお、上記本発明のタンパク質を高発現させる場合は、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド(DNA)の発現を促進するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してセンス方向に導入するのが好ましい。
上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、任意の酵母(実用酵母)、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母やパン酵母、工業用アルコール生産酵母や有用タンパク質生産酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス(Saccharomyces)属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス(Saccharomyces pastorianus)W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等、パン酵母、例えばNBRC 0555、NBRC 1346、NBRC 2043等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地(例えばYEPD培地“Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117(1979)”等)で、OD600nmの値が1〜6となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約1〜2Mのアルカリ金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約30℃で、約60分間静置した後、導入するDNA(約1〜20μg)とともに約30℃で、約60分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約4,000ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約20%〜50%となるように加える。約30℃で、約30分間静置した後、この細胞を約42℃で約5分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約30℃で約60分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。 その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第3版」、“Methods in Yeast Genitics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)”等を参照することができる。
上述した本発明のベクターを酵母に導入することによって、乾燥耐性および/または低温保存耐性に優れた酵母を得ることができる。また、下記の本発明の酵母の評価方法によって選択することによっても乾燥耐性および/または低温保存耐性に優れた酵母を得ることができる。本発明で得られる酵母の使用対象としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、ワイン、ウイスキー、清酒などの酒類の醸造、パンの製造、工業用アルコール生産や有用タンパク質生産等の有用物質の製造等が挙げられる。
これらの生産を行う場合は、親株の代わりに本発明において得られた実用酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と同様のものを用いることができ、コストを増加させることなく実施することができる。
本発明は、配列番号:1の塩基配列を有するグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母の乾燥耐性および/または低温保存耐性について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、WO01/040514号公報、特開平8−205900号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる(例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990))。得られたゲノムを対象にして、グリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の塩基配列(好ましくは、ORF配列)に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子またはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマー又はプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
PCR 法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度:90〜95℃、アニーリング温度:40〜60℃、伸長温度:60〜75℃、サイクル数:10回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のDNA 分子を含む大きさかどうかによって、その酵母の乾燥耐性および/または低温保存耐性について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性質についてより正確に予測・評価することが可能である。
さらに、被検酵母を培養して、配列番号:1の塩基配列を有するグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の発現量を測定し、目的とするグリコーゲン合成能に応じた前記遺伝子発現量の酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。また、基準酵母および被検酵母を培養し、各酵母における前記遺伝子発現量を測定し、基準酵母と被検酵母の前記遺伝子発現量を比較して、所望の酵母を選択してもよい。具体的には、例えば、基準酵母および被検酵母を培養して配列番号:1の塩基配列を有するグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現である株を選択することによって、所望の酒類の醸造や有用物質生産に好適な酵母を選択することができる。
これらの場合、被検酵母又は基準酵母としては、例えば、上述した本発明のベクターを導入した酵母、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母などが使用され得る。グリコーゲン分岐酵素活性は、例えばMol Cell Biol. 1992 Jan;12(1):22-9.に記載の方法で評価することができる。突然変異処理は、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、EMS(エチルメタンスルホネート)、N-メチル-N-ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい(例えば大嶋泰治編著、生物化学実験法39 酵母分子遺伝学実験法、p67-75、学会出版センターなど参照)。
なお、基準酵母、被検酵母として使用され得る酵母としては、任意の酵母(実用酵母)、例えばビール,ワイン、清酒等の醸造用酵母やパン酵母、工業用アルコール生産酵母や有用タンパク質生産酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス(Saccharomyces)属等の酵母(例えば、サッカロマイセス パストリアヌス、サッカロマイセス セレビシエおよびサッカロマイセス カールスベルゲンシス)が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス(Saccharomyces pastorianus)W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等、パン酵母、例えばNBRC 0555、NBRC 1346、NBRC 2043等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。基準酵母、被検酵母は、上記酵母群から任意の組合せで選択してもよい。
特開2004-283169に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母のグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子、nonScGLC3を見出した(配列番号:1)。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーnonScGLC3_for(配列番号:3)/nonScGLC3_rv(配列番号:4)を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株(「W34/70株」と略記することがある。)の染色体DNAを鋳型としたPCRによってnonScGLC3の全長遺伝子を含むDNA断片を取得した。
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度 12.69%
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量(図1)、外観エキス濃度(図2)の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム(GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製)を用いて行った。nonScGLC3遺伝子の発現パターンを図3に示す。この結果より、通常のビール発酵においてnonScGLC3遺伝子が発現していることが確認できた。
実施例1に記載の方法によって得られるnonScGLC3/pCR2.1-TOPOを制限酵素SacIおよびNotIで消化し、nonScGLC3遺伝子を含むDNA断片を調製した。これを制限酵素SacIおよびNotI処理したpYCGPYNotに連結させ、nonScGLC3高発現ベクターnonScGLC3/pYCGPYNotを構築した。pYCGPYNot はYCp型の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子PYK1のプロモーターによって高発現される。酵母での選択マーカーとしてジェネチシン耐性遺伝子G418rを、また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Amprを含んでいる。
親株(AJL4004株)ならびに実施例3に記載の方法で得られたnonScGLC3高発現株の乾燥耐性を以下の方法で評価した。
1白金耳の酵母を10mL麦汁(100mg/Lのジェネチシンを含む)に植菌し、30℃で一晩振盪培養した。この前培養液をOD660=0.5となるように10mL麦汁(同上)に植菌して本培養を開始した。培養は2日間、酵母の増殖が定常期に達するまで行い、終了時の菌体濁度を測定してOD660=2となるように滅菌水に懸濁した。このように調整した懸濁液100(Lを1.5mLマイクロチューブにとり、減圧乾燥機(DNA110 SpeedVac(登録商標)、ThermoSavant社製)で1時間処理することにより菌体を乾固させた。
生菌率の測定は以下の方法で行った。上記で得られた乾燥菌体を50(Lの滅菌水に再懸濁し、50(Lの0.02%メチレンブルー溶液(pH4.5)を添加して、還元力を失い青く染色された菌体を死菌とした。次にこの懸濁液を顕微鏡下で観察し、細胞生死判別システム(DAセルカウンター、ヤマト科学株式会社製)を用いて生菌率を計測した。実験誤差を抑えるため、母数が2,000細胞以上となるようにカウントした。
図4に示すように、親株の生菌率が19.9%であったのに対し、高発現株の生菌率は30.2%となり、nonScGLC3高発現によって酵母の乾燥耐性が向上することが示された。
親株(AJL4004株)ならびに実施例3に記載の方法で得られたnonScGLC3高発現株の低温耐性を以下の方法で評価する。実施例4に記載の方法で培養し、OD660=2に調製した酵母懸濁液を2本のマイクロチューブにそれぞれ900(Lずつ分注し、一方には100(Lの滅菌水を、もう一方には100(Lの99.5%エタノールを添加(最終濃度10%)する。これを5℃で4週間保存した後、実施例4と同様の方法で生菌率を計測する。
Claims (22)
- 以下の(a)〜(f)からなる群から選択されるポリヌクレオチド:
(a)配列番号:1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(c)配列番号:2のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(d) 配列番号:2のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(e)配列番号:1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び
(f)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 - 以下の(g)〜(i)からなる群から選択される請求項1に記載のポリヌクレオチド:
(g)配列番号:2のアミノ酸配列又は配列番号:2のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(h) 配列番号:2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び
(i)配列番号:1の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号:1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 - 配列番号:1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- DNAである、請求項1〜4のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
- 請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
- 請求項7に記載のベクターが導入された酵母。
- 乾燥耐性が増大した請求項8に記載の酵母。
- 低温保存耐性が増大した請求項8に記載の酵母。
- 請求項6に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、乾燥耐性が増強された請求項9に記載の酵母。
- 請求項6に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、低温保存耐性が増強された請求項10に記載の酵母。
- 請求項8〜12のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
- 醸造する酒類が麦芽飲料である請求項13に記載の酒類の製造方法。
- 醸造する酒類がワインである請求項13に記載の酒類の製造方法。
- 請求項13〜15のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
- 配列番号:1の塩基配列を有するグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母の乾燥耐性および/または低温保存耐性について評価する方法。
- 被検酵母を培養し、配列番号:1の塩基配列を有するグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の乾燥耐性および/または低温保存耐性を評価する方法。
- 被検酵母を培養して請求項6に記載のタンパク質を定量、または配列番号:1の塩基配列を有するグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の発現量を測定し、目的とする乾燥耐性および/または低温保存耐性に応じた前記タンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
- 基準酵母および被検酵母を培養して配列番号:1の塩基配列を有するグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現である被検酵母を選択する、請求項19に記載の酵母の選択方法。
- 基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項6に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、請求項19に記載の酵母の選択方法。
- 請求項8〜12に記載の酵母および請求項19〜21に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いることを特徴とする、酒類の製造方法。
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