JPWO2007026956A1 - 低温発酵性及び／又は冷凍耐性を増強させる遺伝子及びその用途 - Google Patents
低温発酵性及び／又は冷凍耐性を増強させる遺伝子及びその用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2007026956A1 JPWO2007026956A1 JP2007533380A JP2007533380A JPWO2007026956A1 JP WO2007026956 A1 JPWO2007026956 A1 JP WO2007026956A1 JP 2007533380 A JP2007533380 A JP 2007533380A JP 2007533380 A JP2007533380 A JP 2007533380A JP WO2007026956 A1 JPWO2007026956 A1 JP WO2007026956A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- yeast
- polynucleotide
- low
- seq
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
- C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
- C12C11/00—Fermentation processes for beer
- C12C11/003—Fermentation of beerwort
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
- C12C12/00—Processes specially adapted for making special kinds of beer
- C12C12/002—Processes specially adapted for making special kinds of beer using special microorganisms
- C12C12/004—Genetically modified microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
- C12C12/00—Processes specially adapted for making special kinds of beer
- C12C12/002—Processes specially adapted for making special kinds of beer using special microorganisms
- C12C12/006—Yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
- C12G1/00—Preparation of wine or sparkling wine
- C12G1/02—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation
- C12G1/0203—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation by microbiological or enzymatic treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
- C12N1/185—Saccharomyces isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
- C12G2200/00—Special features
- C12G2200/11—Use of genetically modified microorganisms in the preparation of wine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/85—Saccharomyces
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Botany (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Distillation Of Fermentation Liquor, Processing Of Alcohols, Vinegar And Beer (AREA)
Abstract
本発明は、低温性能（低温発酵性及び／又は冷凍耐性）を増強させる遺伝子及びその用途に関し、特に、低温性能の高い醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母の低温性能を増強させるＤＬＴ１ｐをコードする遺伝子ＤＬＴ１、特にビール酵母に特徴的なｎｏｎＳｃＤＬＴ１遺伝子の発現量を高めることによって、低温性能を向上させた酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。
Description
本発明は、低温発酵性及び／又は冷凍耐性（以下、「低温性能」ともいう）を増強させる遺伝子及びその用途に関し、特に、低温性能に優れた醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母の低温性能を増強させるタンパクであるＤｌｔ１ｐをコードする遺伝子ＤＬＴ１特にビール酵母に特徴的なｎｏｎＳｃＤＬＴ１遺伝子の発現量を高めることによって、低温性能を向上させた酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。
ラガービールは低温（１０−１５℃）で発酵が行なわれ、雑味のないすっきりした味わいを特徴とする。ラガービールの製造に使用される下面発酵酵母はこの低温発酵性に優れているが、低温発酵性に関与している遺伝子については明らかになっていない。
また、同じく低温で発酵が行なわれる清酒では、エステル類などの香気成分生成酵素の活性維持、香気成分分解酵素の活性低下、香気成分基質の増加などにおいて低温が重要な役割を果たしていることが知られている。
再表９７／０２４４４号公報には、発酵能の低温感受性を示す変異を相補する遺伝子の発現により低温発酵能の向上した例が報告されている。また、低温増殖に関与する遺伝子としてＬＴＧ３（ＤＬＴ１）が報告されている（清酒酵母の研究 ９０年代の研究、清酒酵母・麹研究会編ｐ１０３−１０７、２００３）。
一方、パン酵母の冷凍耐性を増強させる遺伝子としてＹＬＲ０２３ｃおよびＹＭＲ１２６ｃ（ＤＬＴ１）が報告されている（特開平２００３−１４４１３７号公報）。
また、同じく低温で発酵が行なわれる清酒では、エステル類などの香気成分生成酵素の活性維持、香気成分分解酵素の活性低下、香気成分基質の増加などにおいて低温が重要な役割を果たしていることが知られている。
再表９７／０２４４４号公報には、発酵能の低温感受性を示す変異を相補する遺伝子の発現により低温発酵能の向上した例が報告されている。また、低温増殖に関与する遺伝子としてＬＴＧ３（ＤＬＴ１）が報告されている（清酒酵母の研究 ９０年代の研究、清酒酵母・麹研究会編ｐ１０３−１０７、２００３）。
一方、パン酵母の冷凍耐性を増強させる遺伝子としてＹＬＲ０２３ｃおよびＹＭＲ１２６ｃ（ＤＬＴ１）が報告されている（特開平２００３−１４４１３７号公報）。
上記状況下、低温において香味の優れた酒類を製造するために、低温発酵性において優れた酵母が望まれていた。また、酵母を冷凍することによって長期間安定に保存できれば、生産性の向上につながるため、冷凍耐性において優れた酵母も望まれていた。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母から既知のタンパク質より有利な効果を奏する低温性能を増強させるをコードする遺伝子を同定・単離することに成功した。また、得られた遺伝子を酵母に導入し発現させた形質転換酵母を作製し、低温性能が増強されることを確認して、本発明を完成した。
すなわち本発明は、ビール酵母に特徴的に存在する新規な低温性能を増強させる遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることによる酒類の製造方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターが導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。
（１）以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｆ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（２）以下の（ｇ）〜（ｉ）からなる群から選択される上記（１）に記載のポリヌクレオチド：
（ｇ）配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｉ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（３）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）ＤＮＡである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（７ａ）以下の（ｘ）〜（ｚ）の構成要素を含む発現カセットを含む上記（７）に記載のベクター：
（ｘ）酵母細胞内で転写可能なプロモーター
（ｙ）該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
（ｚ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
（８）上記（７）に記載のベクターが導入された酵母。
（９）上記（７）に記載のベクターを導入することによって、低温性能が増強された上記（８）に記載の酵母。
（１０）上記（６）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって低温性能が増強された上記（９）に記載の酵母。
（１１）上記（８）〜（１０）のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
（１２）醸造する酒類が麦芽飲料である上記（１１）に記載の酒類の製造方法。
（１３）醸造する酒類がワインである上記（１１）に記載の酒類の製造方法。
（１４）上記（１１）〜（１３）のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
（１５）配列番号：１の塩基配列を有する低温性能を増強させる遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の低温性能について評価する方法。
（１５ａ）上記（１５）に記載の方法によって、低温性能が高い酵母を選別する方法。
（１５ｂ）上記（１５ａ）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
（１６）被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有する低温性能を増強させる遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の低温性能を評価する方法。
（１７）被検酵母を培養して、上記（６）に記載のタンパク質を定量または配列番号：１の塩基配列を有する低温性能を増強させる遺伝子の発現量を測定し、目的とする低温性能に応じた前記タンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（１７ａ）被検酵母を培養して、低温発酵能もしくは低温発酵活性または冷凍耐性を測定し、目的とする低温発酵能もしくは低温発酵活性または冷凍耐性の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（１８）基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有する低温性能を増強させる遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現である被検酵母を選択する、上記（１７）に記載の酵母の選択方法。
（１９）基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における上記（６）に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、上記（１７）に記載の酵母の選択方法。即ち、複数の酵母を培養して各酵母における上記（６）に記載のタンパク質を定量し、その中で該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、上記（１７）に記載の酵母の選択方法。
（２０）上記（８）〜（１０）に記載の酵母および上記（１７）〜（１９）に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、低温性能を増強させたことを特徴とする、酒類の製造方法。
本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、低温発酵性が向上し、低温発酵における発酵期間の短縮が可能となる。また、本発明によれば、冷凍耐性の優れた酵母を提供することもできる。
なお、本明細書において、「低温性能」とは、低温発酵能及び／又は冷凍耐性のことをいう。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母から既知のタンパク質より有利な効果を奏する低温性能を増強させるをコードする遺伝子を同定・単離することに成功した。また、得られた遺伝子を酵母に導入し発現させた形質転換酵母を作製し、低温性能が増強されることを確認して、本発明を完成した。
すなわち本発明は、ビール酵母に特徴的に存在する新規な低温性能を増強させる遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることによる酒類の製造方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターが導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。
（１）以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｆ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（２）以下の（ｇ）〜（ｉ）からなる群から選択される上記（１）に記載のポリヌクレオチド：
（ｇ）配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｉ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（３）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）ＤＮＡである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（７ａ）以下の（ｘ）〜（ｚ）の構成要素を含む発現カセットを含む上記（７）に記載のベクター：
（ｘ）酵母細胞内で転写可能なプロモーター
（ｙ）該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
（ｚ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
（８）上記（７）に記載のベクターが導入された酵母。
（９）上記（７）に記載のベクターを導入することによって、低温性能が増強された上記（８）に記載の酵母。
（１０）上記（６）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって低温性能が増強された上記（９）に記載の酵母。
（１１）上記（８）〜（１０）のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
（１２）醸造する酒類が麦芽飲料である上記（１１）に記載の酒類の製造方法。
（１３）醸造する酒類がワインである上記（１１）に記載の酒類の製造方法。
（１４）上記（１１）〜（１３）のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
（１５）配列番号：１の塩基配列を有する低温性能を増強させる遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の低温性能について評価する方法。
（１５ａ）上記（１５）に記載の方法によって、低温性能が高い酵母を選別する方法。
（１５ｂ）上記（１５ａ）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
（１６）被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有する低温性能を増強させる遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の低温性能を評価する方法。
（１７）被検酵母を培養して、上記（６）に記載のタンパク質を定量または配列番号：１の塩基配列を有する低温性能を増強させる遺伝子の発現量を測定し、目的とする低温性能に応じた前記タンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（１７ａ）被検酵母を培養して、低温発酵能もしくは低温発酵活性または冷凍耐性を測定し、目的とする低温発酵能もしくは低温発酵活性または冷凍耐性の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（１８）基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有する低温性能を増強させる遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現である被検酵母を選択する、上記（１７）に記載の酵母の選択方法。
（１９）基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における上記（６）に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、上記（１７）に記載の酵母の選択方法。即ち、複数の酵母を培養して各酵母における上記（６）に記載のタンパク質を定量し、その中で該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、上記（１７）に記載の酵母の選択方法。
（２０）上記（８）〜（１０）に記載の酵母および上記（１７）〜（１９）に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、低温性能を増強させたことを特徴とする、酒類の製造方法。
本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、低温発酵性が向上し、低温発酵における発酵期間の短縮が可能となる。また、本発明によれば、冷凍耐性の優れた酵母を提供することもできる。
なお、本明細書において、「低温性能」とは、低温発酵能及び／又は冷凍耐性のことをいう。
図１は、ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はＯＤ６６０の値を示している。
図２は、ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（ｗ／ｗ％）を示している。
図３は、ビール試験醸造中の酵母におけるｎｏｎＳｃＤＬＴ１遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
図４は、親株ならびにｎｏｎＳｃＤＬＴ１高発現株の冷凍耐性度を示す図である。
図２は、ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（ｗ／ｗ％）を示している。
図３は、ビール試験醸造中の酵母におけるｎｏｎＳｃＤＬＴ１遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
図４は、親株ならびにｎｏｎＳｃＤＬＴ１高発現株の冷凍耐性度を示す図である。
本発明者らは、酵母の低温性能を増強させることによって、さらに効率よく低温での発酵を行なうことが可能であると考えた。このような着想に基づいて研究を重ね、特開２００４−２８３１６９に開示の方法で解読したビール酵母ゲノム情報を基に、ビール酵母特有の低温性能を増強させるタンパクをコードするｎｏｎ−ＳｃＤＬＴ１遺伝子を単離・同定した。この塩基配列を配列番号：１に示す。またこの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
１．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、（ａ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
本発明で対象とするポリヌクレオチドは、上記のビール酵母由来の低温性能を増強させるタンパクをコードするポリヌクレオチドに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、例えば、１〜１００個、１〜９０個、１〜８０個、１〜７０個、１〜６０個、１〜５０個、１〜４０個、１〜３９個、１〜３８個、１〜３７個、１〜３６個、１〜３５個、１〜３４個、１〜３３個、１〜３２個、１〜３１個、１〜３０個、１〜２９個、１〜２８個、１〜２７個、１〜２６個、１〜２５個、１〜２４個、１〜２３個、１〜２２個、１〜２１個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列と約６０％以上、約７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
なお、低温発酵性は、例えば１０℃から１５℃におけるエタノール生成量とエタノール生成速度を測定することによって評価することができる。同一温度で醸造した場合に、基準酵母（例えば、サッカロマイセス セレビシエ ＮＢＲＣ２００２、ＡＪＬ４００２など）と比較してエタノール生成量またはエタノール生成速度が増加していれば、「低温発酵性を増強させる活性」があると判断する。そのような増加率は、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、より好ましくは１５％以上、さらに好ましくは２０％以上である。冷凍耐性は、例えば、本明細書の実施例５に記載の方法のように、被検酵母を含む酵母懸濁液で冷凍しないものと、その被検酵母を含む酵母懸濁液を一度冷凍後、解凍したもののグルコース消費速度などを比較することによって評価することができる。すなわち、冷凍処理後のグルコース消費速度の低下が少ないほど、冷凍耐性が高いということになる。
また、本発明は、（ｅ）配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び（ｆ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）をいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ Ｅｄ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９８７−１９９７などに記載されている方法を利用することができる。
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を検出することができる。
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約６０％以上、約７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７２２６４−２２６８，１９９０；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ｅｔ ａｌ：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
２．本発明のタンパク質
本発明は、上記ポリヌクレオチド（ａ）〜（ｉ）のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質である。このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第３版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１０，６４８７（１９８２）”、“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）”、“Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）”、“Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１３，４４３１（１９８５）”、“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸； Ｃ群：アスパラギン、グルタミン； Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸； Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン； Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン； Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
また、本発明のタンパク質は、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
３．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記（ａ）〜（ｉ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を含有する。また、本発明のベクターは、通常、（ｘ）酵母細胞内で転写可能なプロモーター；（ｙ）該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記（ａ）〜（ｉ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）；及び（ｚ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（ＹＥｐ型）、単コピー型（ＹＣｐ型）、染色体組み込み型（ＹＩｐ型）のいずれもが利用可能である。例えば、ＹＥｐ型ベクターとしてはＹＥｐ２４（Ｊ．Ｒ．Ｂｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，８３，１９８３）、ＹＣｐ型ベクターとしてはＹＣｐ５０（Ｍ．Ｄ．Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，ｇｅｎｅ，６０，２３７，１９８７）、ＹＩｐ型ベクターとしてはＹＩｐ５（Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＰ，７６，１０３５，１９７９）が知られており、容易に入手することができる。
酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、醸造用酵母中で機能するとともに、もろみ中の成分に影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＴＤＨ３）のプロモーター、３−ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ１）のプロモーターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えばＭ．Ｆ．Ｔｕｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１，６０３（１９８２）に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Ｍａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，３３７ １９８４）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，ＰＤＲ４）（それぞれ猪腰淳嗣ら，生化学，６４，６６０，１９９２；Ｈｕｓｓａｉｎ ｅｔ ｅｔ ａｌ．，ｇｅｎｅ，１０１，１４９，１９９１）などが利用可能である。
上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）Ｗ３４／７０等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）ＮＣＹＣ４５３、ＮＣＹＣ４５６等、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ１９５１、ＮＢＲＣ１９５２、ＮＢＲＣ１９５３、ＮＢＲＣ１９５４等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエＮＣＹＣ９０等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用１号、同３号、同４号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用７号、同９号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法“Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１９４，ｐ１８２（１９９０）”、スフェロプラスト法“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５ ｐ１９２９（１９７８）”、酢酸リチウム法“Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，ｐ１６３（１９８３）”、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５ ｐ１９２９（１９７８）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００ Ｅｄｉｔｉｏｎ：Ａ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばＹＥＰＤ培地“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｖｏｌ．１，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１１７（１９７９）”等）で、ＯＤ６００ｎｍの値が１〜６となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約１〜２Ｍのアルカリ金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約３０℃で、約６０分間静置した後、導入するＤＮＡ（約１〜２０μｇ）とともに約３０℃で、約６０分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約４，０００ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約２０％〜５０％となるように加える。約３０℃で、約３０分間静置した後、この細胞を約４２℃で約５分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約３０℃で約６０分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。
その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第３版」、“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｉｔｉｃｓ、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）”等を参照することができる。
４．本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
上述した本発明のベクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、その酵母を用いることによって低温において短期間で酒類を製造することができる。また、下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母も同様に用いることができる。対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、発泡酒などのビールテイストドリンク、ワイン、ウイスキー、清酒などが挙げられる。
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、発酵期間の短縮された酒類を製造するためのコストの増加はない。つまり、本発明によれば、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。
５．本発明の酵母の評価方法
本発明は、配列番号：１の塩基配列を有する低温性能を増強させる遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の低温性能について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、ＷＯ０１／０４０５１４号公報、特開平８−２０５９００号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Ｈｅｒｅｆｏｒｄ法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｐ１３０（１９９０））。得られたゲノムを対象にして、低温性能を増強させる遺伝子の塩基配列（好ましくは、ＯＲＦ配列）に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマーまたはプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
遺伝子または特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、１０ｂｐ以上であり、１５〜２５ｂｐであることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、３００〜２０００ｂｐが適当である。
ＰＣＲ法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：９０〜９５℃、アニーリング温度：４０〜６０℃、伸長温度：６０〜７５℃、サイクル数：１０回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のＤＮＡ分子を含む大きさかどうかによって、その酵母の低温性能について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性能についてより正確に予測・評価することが可能である。
また、本発明においては、被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有する低温性能を増強させる遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の低温性能を評価することもできる。なお、遺伝子の発現量の測定は、被検酵母を培養し、低温性能を増強させる遺伝子の産物であるｍＲＮＡ又はタンパク質を定量することによって可能である。ｍＲＮＡ又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、ｍＲＮＡの定量は例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、タンパク質の定量は例えばウエスタンブロッティングによって行うことができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９４−２００３）。
さらに、被検酵母を培養して、配列番号：１の塩基配列を有する低温性能を増強させる遺伝子の発現量を測定し、目的とする低温性能に応じた前記遺伝子発現量の酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。また、基準酵母および被検酵母を培養し、各酵母における前記遺伝子発現量を測定し、基準酵母と被検酵母の前記遺伝子発現量を比較して、所望の酵母を選択してもよい。具体的には、例えば、基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有する低温性能を増強させる遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現である被検酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。
あるいは、被検酵母を培養して、低温性能の優れた酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な被検酵母を選択することができる。
これらの場合、被検酵母または基準酵母としては、例えば、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現が抑制された酵母、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母などが使用され得る。低温発酵能は、例えば、例えば１０℃から１５℃におけるエタノール生成量とエタノール生成速度を測定することによって評価することができる。冷凍耐性は、例えば、実施例５に記載の方法によって評価することができる。突然変異処理は、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい（例えば、大嶋泰治編著、生物化学実験法 ３９酵母分子遺伝学実験法、ｐ６７−７５、学会出版センターなど参照）。
なお、基準酵母、被検酵母として使用され得る酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）Ｗ３４／７０等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）ＮＣＹＣ４５３、ＮＣＹＣ４５６等、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ１９５１、ＮＢＲＣ１９５２、ＮＢＲＣ１９５３ＮＢＲＣ１９５４等が使用できる。さらにワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用１号、同３号、同４号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用７号、同９号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。基準酵母、被検酵母は、上記酵母から任意の組み合わせで選択しても良い。
１．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、（ａ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
本発明で対象とするポリヌクレオチドは、上記のビール酵母由来の低温性能を増強させるタンパクをコードするポリヌクレオチドに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、例えば、１〜１００個、１〜９０個、１〜８０個、１〜７０個、１〜６０個、１〜５０個、１〜４０個、１〜３９個、１〜３８個、１〜３７個、１〜３６個、１〜３５個、１〜３４個、１〜３３個、１〜３２個、１〜３１個、１〜３０個、１〜２９個、１〜２８個、１〜２７個、１〜２６個、１〜２５個、１〜２４個、１〜２３個、１〜２２個、１〜２１個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列と約６０％以上、約７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
なお、低温発酵性は、例えば１０℃から１５℃におけるエタノール生成量とエタノール生成速度を測定することによって評価することができる。同一温度で醸造した場合に、基準酵母（例えば、サッカロマイセス セレビシエ ＮＢＲＣ２００２、ＡＪＬ４００２など）と比較してエタノール生成量またはエタノール生成速度が増加していれば、「低温発酵性を増強させる活性」があると判断する。そのような増加率は、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、より好ましくは１５％以上、さらに好ましくは２０％以上である。冷凍耐性は、例えば、本明細書の実施例５に記載の方法のように、被検酵母を含む酵母懸濁液で冷凍しないものと、その被検酵母を含む酵母懸濁液を一度冷凍後、解凍したもののグルコース消費速度などを比較することによって評価することができる。すなわち、冷凍処理後のグルコース消費速度の低下が少ないほど、冷凍耐性が高いということになる。
また、本発明は、（ｅ）配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び（ｆ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）をいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ Ｅｄ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９８７−１９９７などに記載されている方法を利用することができる。
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を検出することができる。
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約６０％以上、約７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７２２６４−２２６８，１９９０；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ｅｔ ａｌ：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
２．本発明のタンパク質
本発明は、上記ポリヌクレオチド（ａ）〜（ｉ）のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質である。このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第３版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１０，６４８７（１９８２）”、“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）”、“Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）”、“Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１３，４４３１（１９８５）”、“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸； Ｃ群：アスパラギン、グルタミン； Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸； Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン； Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン； Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
また、本発明のタンパク質は、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
３．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記（ａ）〜（ｉ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を含有する。また、本発明のベクターは、通常、（ｘ）酵母細胞内で転写可能なプロモーター；（ｙ）該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記（ａ）〜（ｉ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）；及び（ｚ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（ＹＥｐ型）、単コピー型（ＹＣｐ型）、染色体組み込み型（ＹＩｐ型）のいずれもが利用可能である。例えば、ＹＥｐ型ベクターとしてはＹＥｐ２４（Ｊ．Ｒ．Ｂｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，８３，１９８３）、ＹＣｐ型ベクターとしてはＹＣｐ５０（Ｍ．Ｄ．Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，ｇｅｎｅ，６０，２３７，１９８７）、ＹＩｐ型ベクターとしてはＹＩｐ５（Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＰ，７６，１０３５，１９７９）が知られており、容易に入手することができる。
酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、醸造用酵母中で機能するとともに、もろみ中の成分に影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＴＤＨ３）のプロモーター、３−ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ１）のプロモーターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えばＭ．Ｆ．Ｔｕｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１，６０３（１９８２）に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Ｍａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，３３７ １９８４）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，ＰＤＲ４）（それぞれ猪腰淳嗣ら，生化学，６４，６６０，１９９２；Ｈｕｓｓａｉｎ ｅｔ ｅｔ ａｌ．，ｇｅｎｅ，１０１，１４９，１９９１）などが利用可能である。
上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）Ｗ３４／７０等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）ＮＣＹＣ４５３、ＮＣＹＣ４５６等、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ１９５１、ＮＢＲＣ１９５２、ＮＢＲＣ１９５３、ＮＢＲＣ１９５４等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエＮＣＹＣ９０等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用１号、同３号、同４号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用７号、同９号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法“Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１９４，ｐ１８２（１９９０）”、スフェロプラスト法“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５ ｐ１９２９（１９７８）”、酢酸リチウム法“Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，ｐ１６３（１９８３）”、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５ ｐ１９２９（１９７８）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００ Ｅｄｉｔｉｏｎ：Ａ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばＹＥＰＤ培地“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｖｏｌ．１，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１１７（１９７９）”等）で、ＯＤ６００ｎｍの値が１〜６となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約１〜２Ｍのアルカリ金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約３０℃で、約６０分間静置した後、導入するＤＮＡ（約１〜２０μｇ）とともに約３０℃で、約６０分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約４，０００ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約２０％〜５０％となるように加える。約３０℃で、約３０分間静置した後、この細胞を約４２℃で約５分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約３０℃で約６０分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。
その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第３版」、“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｉｔｉｃｓ、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）”等を参照することができる。
４．本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
上述した本発明のベクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、その酵母を用いることによって低温において短期間で酒類を製造することができる。また、下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母も同様に用いることができる。対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、発泡酒などのビールテイストドリンク、ワイン、ウイスキー、清酒などが挙げられる。
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、発酵期間の短縮された酒類を製造するためのコストの増加はない。つまり、本発明によれば、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。
５．本発明の酵母の評価方法
本発明は、配列番号：１の塩基配列を有する低温性能を増強させる遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の低温性能について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、ＷＯ０１／０４０５１４号公報、特開平８−２０５９００号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Ｈｅｒｅｆｏｒｄ法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｐ１３０（１９９０））。得られたゲノムを対象にして、低温性能を増強させる遺伝子の塩基配列（好ましくは、ＯＲＦ配列）に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマーまたはプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
遺伝子または特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、１０ｂｐ以上であり、１５〜２５ｂｐであることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、３００〜２０００ｂｐが適当である。
ＰＣＲ法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：９０〜９５℃、アニーリング温度：４０〜６０℃、伸長温度：６０〜７５℃、サイクル数：１０回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のＤＮＡ分子を含む大きさかどうかによって、その酵母の低温性能について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性能についてより正確に予測・評価することが可能である。
また、本発明においては、被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有する低温性能を増強させる遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の低温性能を評価することもできる。なお、遺伝子の発現量の測定は、被検酵母を培養し、低温性能を増強させる遺伝子の産物であるｍＲＮＡ又はタンパク質を定量することによって可能である。ｍＲＮＡ又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、ｍＲＮＡの定量は例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、タンパク質の定量は例えばウエスタンブロッティングによって行うことができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９４−２００３）。
さらに、被検酵母を培養して、配列番号：１の塩基配列を有する低温性能を増強させる遺伝子の発現量を測定し、目的とする低温性能に応じた前記遺伝子発現量の酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。また、基準酵母および被検酵母を培養し、各酵母における前記遺伝子発現量を測定し、基準酵母と被検酵母の前記遺伝子発現量を比較して、所望の酵母を選択してもよい。具体的には、例えば、基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有する低温性能を増強させる遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現である被検酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。
あるいは、被検酵母を培養して、低温性能の優れた酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な被検酵母を選択することができる。
これらの場合、被検酵母または基準酵母としては、例えば、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現が抑制された酵母、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母などが使用され得る。低温発酵能は、例えば、例えば１０℃から１５℃におけるエタノール生成量とエタノール生成速度を測定することによって評価することができる。冷凍耐性は、例えば、実施例５に記載の方法によって評価することができる。突然変異処理は、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい（例えば、大嶋泰治編著、生物化学実験法 ３９酵母分子遺伝学実験法、ｐ６７−７５、学会出版センターなど参照）。
なお、基準酵母、被検酵母として使用され得る酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）Ｗ３４／７０等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）ＮＣＹＣ４５３、ＮＣＹＣ４５６等、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ１９５１、ＮＢＲＣ１９５２、ＮＢＲＣ１９５３ＮＢＲＣ１９５４等が使用できる。さらにワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用１号、同３号、同４号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用７号、同９号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。基準酵母、被検酵母は、上記酵母から任意の組み合わせで選択しても良い。
以下、実施例によって本発明の詳細を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１：新規低温発酵性を増強させる遺伝子（ｎｏｎＳｃＤＬＴ１）のクローニング
特開２００４−２８３１６９に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母に特有の新規低温発酵性を増強させる遺伝子、ｎｏｎＳｃＤＬＴ１を見出した（配列番号：１）。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーｎｏｎＳｃＤＬＴ１＿Ｆ（配列番号：３）／ｎｏｎＳｃＤＬＴ１＿Ｒ（配列番号：４）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン３４／７０株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによってｎｏｎＳｃＤＬＴ１の全長遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。
上記のようにして得られたｎｏｎＳｃＤＬＴ１遺伝子断片を、ＴＡクローニングによってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。ｎｏｎＳｃＤＬＴ１遺伝子の塩基配列をサンガーの方法（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２１５，１９８１）で分析し、塩基配列を確認した。
実施例２：ビール試醸中のｎｏｎＳｃＤＬＴ１遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌス Ｗ３４／７０株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したｍＲＮＡをビール酵母ＤＮＡマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度 １２．６９％
麦汁容量 ７０Ｌ
麦汁溶存酸素濃度 ８．６ｐｐｍ
発酵温度 １５℃
酵母投入量 １２．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図１）、外観エキス濃度（図２）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したｍＲＮＡをビオチンラベルして、特開２００４−２８３１６９に記載のビール酵母ＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（ＧＣＯＳ；ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ １．０、アフィメトリクス社製）を用いて行った。ｎｏｎＳｃＤＬＴ１遺伝子の発現パターンを図３に示す。この結果より、通常のビール発酵においてｎｏｎＳｃＤＬＴ１遺伝子が発現していることを確認した。
実施例３：ｎｏｎＳｃＤＬＴ１高発現株の作製
実施例１に記載のｎｏｎＳｃＤＬＴ１／ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯを制限酵素ＳａｃＩおよびＮｏｔＩ消化し、タンパク質コード領域全長を含むＤＮＡ断片を調製した。この断片を制限酵素ＳａｃＩおよびＮｏｔＩ処理したｐＹＣＧＰＹＮｏｔに連結させ、ｎｏｎＳｃＤＬＴ１高発現ベクターｎｏｎＳｃＤＬＴ１／ｐＹＣＧＰＹＮｏｔを構築した。ｐＹＣＧＰＹＮｏｔはＹＣｐ型の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子ＰＹＫ１のプロモーターによって高発現される。酵母での選択マーカーとしてジェネチシン耐性遺伝子Ｇ４１８ｒを、また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Ａｍｐｒを含んでいる。
上述の方法で作製した高発現ベクターを用い、特開平０７−３０３４７５に記載された方法でＡＪＬ４００４株を形質転換して、ジェネチシン３００ｍｇ／Ｌを含むＹＰＤ平板培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース、２％寒天）で形質転換体を選択した。
実施例４：ビール試験醸造における低温発酵性の評価
親株ならびに実施例３で得られたｎｏｎＳｃＤＬＴ１高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行う。
麦汁エキス濃度 １２％
麦汁容量 １Ｌ
麦汁溶存酸素濃度 約８ｐｐｍ
発酵温度 １２℃一定
酵母投入量 ５ｇ湿酵母菌体／Ｌ麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（ＯＤ６６０）、エキス消費量、遊離アミノ態窒素（ＦＡＮ）の経時変化を調べる。低温発酵性は、１０℃から１５℃におけるエタノール生成量とエタノール生成速度を測定することによって評価する。
実施例５：冷凍耐性の評価
親株ならびに高発現株の冷凍耐性を以下の方法で評価した。以下の例において使用した培地の内容は次のとおりである。
・ＹＰＤ培地：イーストエキス１％、バクトペプトン２％および
グルコース２％を含む水よりなる培地。
・ＹＮＢ培地：イーストニトロゲンベース０．６７％、カザミノ酸０．４％、ウラ
シル２０ｐｐｍおよびアデニン４０ｐｐｍを含む水よりなる培地。
ジェネチシン３００ｍｇ／Ｌを含むＹＰＤ培地１０ｍＬに一白金耳の菌体を植菌し、３０℃で一晩振盪培養した。菌体濁度（ＯＤ６６０）を測定し、ＯＤ６６０＝２相当の菌体を回収した後、４％グルコース、５％エタノールおよびジェネチシン３００ｍｇ／Ｌを含むＹＰＤ培地１ｍＬに懸濁した。親株、高発現株それぞれについて上記酵母懸濁液を冷凍用・非冷凍用の２本ずつ準備した。非冷凍用には直ちにＹＮＢ培地１ｍＬを加え、３０℃で２時間振盪培養した。遠心分離で培養上清を回収し、バイオセンサＢＦ−５（王子計測機器株式会社製）でグルコース濃度を測定した。冷凍用は、予冷として氷浴に３０分静置し、−２０℃の冷凍庫で２時間凍結させた後、水浴に８分間漬けて解凍した。そこにＹＮＢ培地１ｍＬを加え、３０℃で２時間振盪培養した後、非冷凍用と同様にグルコース濃度を測定した。冷凍酵母のグルコース減少量をＡ、非冷凍酵母のグルコース減少量をＢとし、Ａ／Ｂの値を「冷凍耐性度」として、冷凍耐性の評価を行った。
図４に示す通り、親株の冷凍耐性が０．４だったのに対して高発現株では０．７となり、ｎｏｎＳｃＤＬＴ１の高発現によって冷凍耐性が向上することが明らかとなった。
実施例１：新規低温発酵性を増強させる遺伝子（ｎｏｎＳｃＤＬＴ１）のクローニング
特開２００４−２８３１６９に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母に特有の新規低温発酵性を増強させる遺伝子、ｎｏｎＳｃＤＬＴ１を見出した（配列番号：１）。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーｎｏｎＳｃＤＬＴ１＿Ｆ（配列番号：３）／ｎｏｎＳｃＤＬＴ１＿Ｒ（配列番号：４）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン３４／７０株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによってｎｏｎＳｃＤＬＴ１の全長遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。
上記のようにして得られたｎｏｎＳｃＤＬＴ１遺伝子断片を、ＴＡクローニングによってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。ｎｏｎＳｃＤＬＴ１遺伝子の塩基配列をサンガーの方法（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２１５，１９８１）で分析し、塩基配列を確認した。
実施例２：ビール試醸中のｎｏｎＳｃＤＬＴ１遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌス Ｗ３４／７０株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したｍＲＮＡをビール酵母ＤＮＡマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度 １２．６９％
麦汁容量 ７０Ｌ
麦汁溶存酸素濃度 ８．６ｐｐｍ
発酵温度 １５℃
酵母投入量 １２．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図１）、外観エキス濃度（図２）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したｍＲＮＡをビオチンラベルして、特開２００４−２８３１６９に記載のビール酵母ＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（ＧＣＯＳ；ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ １．０、アフィメトリクス社製）を用いて行った。ｎｏｎＳｃＤＬＴ１遺伝子の発現パターンを図３に示す。この結果より、通常のビール発酵においてｎｏｎＳｃＤＬＴ１遺伝子が発現していることを確認した。
実施例３：ｎｏｎＳｃＤＬＴ１高発現株の作製
実施例１に記載のｎｏｎＳｃＤＬＴ１／ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯを制限酵素ＳａｃＩおよびＮｏｔＩ消化し、タンパク質コード領域全長を含むＤＮＡ断片を調製した。この断片を制限酵素ＳａｃＩおよびＮｏｔＩ処理したｐＹＣＧＰＹＮｏｔに連結させ、ｎｏｎＳｃＤＬＴ１高発現ベクターｎｏｎＳｃＤＬＴ１／ｐＹＣＧＰＹＮｏｔを構築した。ｐＹＣＧＰＹＮｏｔはＹＣｐ型の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子ＰＹＫ１のプロモーターによって高発現される。酵母での選択マーカーとしてジェネチシン耐性遺伝子Ｇ４１８ｒを、また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Ａｍｐｒを含んでいる。
上述の方法で作製した高発現ベクターを用い、特開平０７−３０３４７５に記載された方法でＡＪＬ４００４株を形質転換して、ジェネチシン３００ｍｇ／Ｌを含むＹＰＤ平板培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース、２％寒天）で形質転換体を選択した。
実施例４：ビール試験醸造における低温発酵性の評価
親株ならびに実施例３で得られたｎｏｎＳｃＤＬＴ１高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行う。
麦汁エキス濃度 １２％
麦汁容量 １Ｌ
麦汁溶存酸素濃度 約８ｐｐｍ
発酵温度 １２℃一定
酵母投入量 ５ｇ湿酵母菌体／Ｌ麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（ＯＤ６６０）、エキス消費量、遊離アミノ態窒素（ＦＡＮ）の経時変化を調べる。低温発酵性は、１０℃から１５℃におけるエタノール生成量とエタノール生成速度を測定することによって評価する。
実施例５：冷凍耐性の評価
親株ならびに高発現株の冷凍耐性を以下の方法で評価した。以下の例において使用した培地の内容は次のとおりである。
・ＹＰＤ培地：イーストエキス１％、バクトペプトン２％および
グルコース２％を含む水よりなる培地。
・ＹＮＢ培地：イーストニトロゲンベース０．６７％、カザミノ酸０．４％、ウラ
シル２０ｐｐｍおよびアデニン４０ｐｐｍを含む水よりなる培地。
ジェネチシン３００ｍｇ／Ｌを含むＹＰＤ培地１０ｍＬに一白金耳の菌体を植菌し、３０℃で一晩振盪培養した。菌体濁度（ＯＤ６６０）を測定し、ＯＤ６６０＝２相当の菌体を回収した後、４％グルコース、５％エタノールおよびジェネチシン３００ｍｇ／Ｌを含むＹＰＤ培地１ｍＬに懸濁した。親株、高発現株それぞれについて上記酵母懸濁液を冷凍用・非冷凍用の２本ずつ準備した。非冷凍用には直ちにＹＮＢ培地１ｍＬを加え、３０℃で２時間振盪培養した。遠心分離で培養上清を回収し、バイオセンサＢＦ−５（王子計測機器株式会社製）でグルコース濃度を測定した。冷凍用は、予冷として氷浴に３０分静置し、−２０℃の冷凍庫で２時間凍結させた後、水浴に８分間漬けて解凍した。そこにＹＮＢ培地１ｍＬを加え、３０℃で２時間振盪培養した後、非冷凍用と同様にグルコース濃度を測定した。冷凍酵母のグルコース減少量をＡ、非冷凍酵母のグルコース減少量をＢとし、Ａ／Ｂの値を「冷凍耐性度」として、冷凍耐性の評価を行った。
図４に示す通り、親株の冷凍耐性が０．４だったのに対して高発現株では０．７となり、ｎｏｎＳｃＤＬＴ１の高発現によって冷凍耐性が向上することが明らかとなった。
本発明の酒類製造法によれば、酵母の低温性能が増大するため、低温においても短期間で酒類を製造することが可能となる。
［配列表］
［配列表］
Claims (20)
- 以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｆ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 - 以下の（ｇ）〜（ｉ）からなる群から選択される請求項１に記載のポリヌクレオチド：
（ｇ）配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｉ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ低温性能を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 - 配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
- ＤＮＡである、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
- 請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
- 請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
- 請求項７に記載のベクターが導入された酵母。
- 請求項７に記載のベクターを導入することによって、低温性能が向上した請求項８に記載の酵母。
- 請求項６に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって低温性能が向上した請求項９に記載の酵母。
- 請求項８〜１０のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
- 醸造する酒類が麦芽飲料である請求項１１に記載の酒類の製造方法。
- 醸造する酒類がワインである請求項１１に記載の酒類の製造方法。
- 請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
- 配列番号：１の塩基配列を有する低温性能を増強させる遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の低温性能について評価する方法。
- 被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有する低温性能を増強させる遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の低温性能を評価する方法。
- 被検酵母を培養して、請求項６に記載のタンパク質を定量または配列番号：１の塩基配列を有する低温性能を増強させる遺伝子の発現量を測定し、目的とする低温発酵能に応じた前記タンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
- 基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有する低温性能を増強させる遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現である被検酵母を選択する、請求項１７に記載の酵母の選択方法。
- 基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項６に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、請求項１７に記載の酵母の選択方法。
- 請求項８〜１０に記載の酵母および請求項１７〜１９に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、低温発酵能を増強させたことを特徴とする、酒類の製造方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005253250 | 2005-09-01 | ||
| JP2005253250 | 2005-09-01 | ||
| PCT/JP2006/317699 WO2007026956A1 (ja) | 2005-09-01 | 2006-08-31 | 低温発酵性及び／又は冷凍耐性を増強させる遺伝子及びその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2007026956A1 true JPWO2007026956A1 (ja) | 2009-03-12 |
Family
ID=37809032
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007533380A Pending JPWO2007026956A1 (ja) | 2005-09-01 | 2006-08-31 | 低温発酵性及び／又は冷凍耐性を増強させる遺伝子及びその用途 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20090175983A1 (ja) |
| EP (1) | EP1930431A4 (ja) |
| JP (1) | JPWO2007026956A1 (ja) |
| KR (1) | KR20080038447A (ja) |
| CN (1) | CN101253266A (ja) |
| AU (1) | AU2006285604A1 (ja) |
| CA (1) | CA2620877A1 (ja) |
| WO (1) | WO2007026956A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103275881B (zh) * | 2013-04-27 | 2015-01-28 | 天津科技大学 | 一种适合于冷冻面团发酵的耐冷冻活性干酵母 |
| JP7012952B2 (ja) * | 2017-08-16 | 2022-01-31 | 国立大学法人帯広畜産大学 | 冷凍耐性及び低温発酵性を備える製パン用交雑酵母 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000245458A (ja) * | 1999-02-25 | 2000-09-12 | Iwate Prefecture | ワイン酵母の交雑育種方法 |
| JP2003144137A (ja) * | 2001-11-15 | 2003-05-20 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 冷凍耐性パン酵母 |
| JP2004283169A (ja) * | 2003-03-04 | 2004-10-14 | Suntory Ltd | 醸造用酵母遺伝子のスクリーニング法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3514507B2 (ja) | 1994-05-13 | 2004-03-31 | サントリー株式会社 | 硫化水素生成が低減された酵母とこの酵母を用いたビール製造法 |
| JP4149007B2 (ja) | 1995-02-01 | 2008-09-10 | 麒麟麦酒株式会社 | 酵母の凝集性判定用ｄｎａ分子および凝集性判定方法 |
| DE19524188A1 (de) | 1995-07-03 | 1997-01-09 | Brueninghaus Hydromatik Gmbh | Hydrostatischer Antrieb mit synchronisiertem Direktdurchtrieb |
-
2006
- 2006-08-31 CN CNA2006800318836A patent/CN101253266A/zh active Pending
- 2006-08-31 CA CA002620877A patent/CA2620877A1/en not_active Abandoned
- 2006-08-31 AU AU2006285604A patent/AU2006285604A1/en not_active Abandoned
- 2006-08-31 JP JP2007533380A patent/JPWO2007026956A1/ja active Pending
- 2006-08-31 US US11/990,942 patent/US20090175983A1/en not_active Abandoned
- 2006-08-31 WO PCT/JP2006/317699 patent/WO2007026956A1/ja active Application Filing
- 2006-08-31 KR KR1020087007617A patent/KR20080038447A/ko not_active Application Discontinuation
- 2006-08-31 EP EP06797575A patent/EP1930431A4/en not_active Withdrawn
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000245458A (ja) * | 1999-02-25 | 2000-09-12 | Iwate Prefecture | ワイン酵母の交雑育種方法 |
| JP2003144137A (ja) * | 2001-11-15 | 2003-05-20 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 冷凍耐性パン酵母 |
| JP2004283169A (ja) * | 2003-03-04 | 2004-10-14 | Suntory Ltd | 醸造用酵母遺伝子のスクリーニング法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20090175983A1 (en) | 2009-07-09 |
| KR20080038447A (ko) | 2008-05-06 |
| WO2007026956A1 (ja) | 2007-03-08 |
| EP1930431A1 (en) | 2008-06-11 |
| CA2620877A1 (en) | 2007-03-08 |
| AU2006285604A1 (en) | 2007-03-08 |
| EP1930431A4 (en) | 2009-11-18 |
| CN101253266A (zh) | 2008-08-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5091867B2 (ja) | グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及びその用途 | |
| JP2009504131A (ja) | ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ遺伝子及びその用途 | |
| JP2008529479A (ja) | カタラーゼ遺伝子及びその用途 | |
| JP4460006B2 (ja) | 分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素遺伝子及びその用途 | |
| JP2009527216A (ja) | アシルＣｏＡ：エタノールＯ−アシルトランスフェラーゼ／エステラーゼ遺伝子及びその用途 | |
| JP2009060790A (ja) | 酵母に乾燥耐性および／または低温保存耐性を付与する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子及びその用途 | |
| JP4887367B2 (ja) | アルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子及びその用途 | |
| JP2009527218A (ja) | アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子及びその用途 | |
| JP2009528024A (ja) | マルターゼおよびマルトーストランスポーター遺伝子の転写誘導因子をコードする遺伝子及びその用途 | |
| JP4460007B2 (ja) | ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子及びその用途 | |
| JP2009528019A (ja) | トレハロース−６リン酸脱リン酸化酵素をコードする遺伝子及びその用途 | |
| JP4954203B2 (ja) | 細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子及びその用途 | |
| JPWO2007026956A1 (ja) | 低温発酵性及び／又は冷凍耐性を増強させる遺伝子及びその用途 | |
| JP4870089B2 (ja) | エステラーゼ遺伝子及びその用途 | |
| JP4460003B2 (ja) | 酵母の凝集性に関与するタンパク質をコードする遺伝子及びその用途 | |
| JP4478717B2 (ja) | カタラーゼ遺伝子及びその用途 | |
| JP4478718B2 (ja) | グリコーゲン合成開始因子をコードする遺伝子及びその用途 | |
| JP4460004B2 (ja) | システインシンターゼ遺伝子及びその用途 | |
| JP2009528020A (ja) | グリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子及びその用途 | |
| JPWO2007026958A1 (ja) | トリプトファントランスポーター遺伝子及びその用途 | |
| JP2008530977A (ja) | Ｏ−アセチルホモセリンサルフハイドリレース遺伝子及びその用途 | |
| JP2009528018A (ja) | トレハロース合成促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子及びその用途 | |
| JP2009506751A (ja) | グリセロールチャネル遺伝子及びその用途 | |
| JP2007053921A (ja) | αグルコシドトランスポーター遺伝子及びその用途 | |
| JP2009165353A (ja) | アミノ酸トランスポーター遺伝子及びその用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090225 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20090422 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110816 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20111220 |