KR20080038447A

KR20080038447A - 저온 발효성 및/또는 저온 내성을 개선시키는 유전자 및 그 용도

Info

Publication number: KR20080038447A
Application number: KR1020087007617A
Authority: KR
Inventors: 요시히로 나카오; 유키코 고다마; 도모코 시모나가
Original assignee: 산또리 가부시키가이샤
Priority date: 2005-09-01
Filing date: 2006-08-31
Publication date: 2008-05-06
Also published as: CN101253266A; WO2007026956A1; AU2006285604A1; US20090175983A1; JPWO2007026956A1; CA2620877A1; EP1930431A1; EP1930431A4

Abstract

본 발명은, 저온 성능 (저온 발효성 및/또는 냉동 내성) 을 증강시키는 유전자 및 그 용도에 관한 것으로, 특히 저온 성능이 높은 양조 효모, 그 효모를 사용하여 제조한 주류, 그 제조 방법 등에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은, 양조 효모의 저온 성능을 증강시키는 DLT1p 를 코드하는 유전자 DLT1, 특히 맥주 효모에 특징적인 nonScDLT1 유전자의 발현량을 높임으로써 저온 성능을 향상시킨 효모, 당해 효모를 사용한 주류의 제조 방법 등에 관한 것이다.

Description

저온 발효성 및/또는 냉동 내성을 증강시키는 유전자 및 그 용도{GENE CAPABLE OF ENHANCING LOW TEMPERATURE FERMENTATION ABILITY AND/OR FREEZING STRESS RESISTANCE AND USE THEREOF}

본 발명은, 저온 발효성 및/또는 냉동 내성 (이하, 「저온 성능」이라고도 함) 을 증강시키는 유전자 및 그 용도에 관한 것으로, 특히, 저온 성능이 우수한 양조 효모, 그 효모를 사용하여 제조한 주류, 그 제조 방법 등에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은, 양조 효모의 저온 성능을 증강시키는 단백인 Dlt1p를 코드하는 유전자 DLT1, 특히 맥주 효모에 특징적인 nonScDLT1 유전자의 발현량을 높임으로써 저온 성능을 향상시킨 효모, 당해 효모를 사용한 주류의 제조 방법 등에 관한 것이다.

라거 맥주는 저온 (10 - 15℃) 에서 발효가 실시되고, 잡미가 없는 깔끔한 맛을 특징으로 한다. 라거 맥주의 제조에 사용되는 하면 발효 효모는 이 저온 발효성이 우수하지만, 저온 발효성에 관여하고 있는 유전자에 대해서는 밝혀져 있지 않다.

또, 동일하게 저온에서 발효가 실시되는 청주에서는, 에스테르류 등의 향기 성분 생성 효소의 활성 유지, 향기 성분 분해 효소의 활성 저하, 향기 성분 기질의 증가 등에 있어서 저온이 중요한 역할을 하고 있는 것이 알려져 있다.

일본 재공표특허공보 97/02444호에는, 발효능의 저온 감수성을 나타내는 변이를 상보하는 유전자의 발현에 의해 저온 발효능이 향상된 예가 보고되어 있다. 또, 저온 증식에 관여하는 유전자로서 LTG3 (DLT1) 이 보고되어 있다 (청주 효모의 연구 90 년대의 연구, 청주 효모·누룩 연구회편 p103 - 107, 2003).

한편, 빵 효모의 냉동 내성을 증강시키는 유전자로서 YLR023c 및 YMR126c (DLT1) 가 보고되어 있다 (일본 공개특허공보 평2003-144137호).

발명의 개시

상기 상황하에서, 저온에 있어서 향미가 우수한 주류를 제조하기 위해서, 저온 발효성이 우수한 효모가 요망되고 있다. 또, 효모를 냉동함으로써 장기간 안정적으로 보존할 수 있으면, 생산성 향상으로 이어지기 때문에, 냉동 내성이 우수한 효모도 요망되고 있다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 거듭한 결과, 맥주 효모로부터 공지된 단백질보다 유리한 효과를 나타내는 저온 성능을 증강시키는 단백질을 코드하는 유전자를 동정·단리하는 것에 성공하였다. 또, 얻어진 유전자를 효모에 도입하여 발현시킨 형질 전환 효모를 제작하고, 저온 성능이 증강되는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

즉 본 발명은, 맥주 효모에 특징적으로 존재하는 신규 저온 성능을 증강시키는 유전자, 그 유전자가 코드하는 단백질, 그 유전자의 발현이 조절된 형질 전환 효모, 그 유전자의 발현이 조절된 효모를 사용함에 따른 주류의 제조 방법 등에 관한 것이다. 본 발명은, 구체적으로는, 다음으로 나타내는 폴리뉴클레오티드, 그 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터, 그 벡터가 도입된 형질 전환 효모, 그 형질 전환 효모를 사용하는 주류의 제조 방법 등을 제공한다.

(1) 이하의 (a) ∼ (f) 로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드：

(a) 배열 번호：1 의 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드；

(b) 배열 번호：2 의 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드；

(c) 배열 번호：2 의 아미노산 배열에 있어서, 1 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 저온 성능을 증강시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드；

(d) 배열 번호：2 의 아미노산 배열에 대해 60％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 배열을 가지고, 또한 저온 성능을 증강시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드；

(e) 배열 번호：1 의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 저온 성능을 증강시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드；및

(f) 배열 번호：2 의 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 저온 성능을 증강시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.

(2) 이하의 (g) ∼ (i) 로 이루어지는 군에서 선택되는 (1) 에 기재된 폴리뉴클레오티드：

(g) 배열 번호：2 의 아미노산 배열 또는 배열 번호：2 의 아미노산 배열에 있어서, 1 ∼ 10 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 저온 성능을 증강시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드；

(h) 배열 번호：2 의 아미노산 배열에 대해 90％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 배열을 가지고, 또한 저온 성능을 증강시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드；및

(i) 배열 번호：1 의 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 또는 배열 번호：1 의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 하이 스트린젠트 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 저온 성능을 증강시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.

(3) 배열 번호：1 의 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 상기 (1) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(4) 배열 번호：2 의 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 상기 (1) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(5) DNA 인, 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(6) 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드에 코드되는 단백질.

(7) 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터.

(7a) 이하의 (x) ∼ (z) 의 구성 요소를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 상기 (7) 에 기재된 벡터：

(x) 효모 세포 내에서 전사 가능한 프로모터

(y) 그 프로모터에 센스 방향 또는 안티센스 방향으로 결합된, 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드；및

(z) RNA 분자의 전사 종결 및 폴리아데닐화에 관한 것으로, 효모에서 기능하는 시그널.

(8) 상기 (7) 에 기재된 벡터가 도입된 효모.

(9) 상기 (7) 에 기재된 벡터를 도입함으로써, 저온 성능이 증강된 상기 (8) 에 기재된 효모.

(10) 상기 (6) 에 기재된 단백질의 발현량을 증가시킴으로써 저온 성능이 증강된 상기 (9) 에 기재된 효모.

(11) 상기 (8) ∼ (10) 중 어느 하나에 기재된 효모를 사용한 주류의 제조 방법.

(12) 양조하는 주류가 맥아 음료인 상기 (11) 에 기재된 주류의 제조 방법.

(13) 양조하는 주류가 와인인 상기 (11) 에 기재된 주류의 제조 방법.

(14) 상기 (11) ∼ (13) 중 어느 하나에 기재된 방법으로 제조된 주류.

(15) 배열 번호：1 의 염기 배열을 갖는 저온 성능을 증강시키는 유전자의 염기 배열에 기초하여 설계한 프라이머 또는 프로브를 사용하여, 피검 효모의 저온 성능에 대해 평가하는 방법.

(15a) 상기 (15) 에 기재된 방법에 의해, 저온 성능이 높은 효모를 선별하는 방법.

(15b) 상기 (15a) 에 기재된 방법에 의해 선별된 효모를 사용하여 주류 (예를 들어, 맥주) 를 제조하는 방법.

(16) 피검 효모를 배양하여, 배열 번호：1 의 염기 배열을 갖는 저온 성능을 증강시키는 유전자의 발현량을 측정함으로써, 피검 효모의 저온 성능을 평가하는 방법.

(17) 피검 효모를 배양하여, 상기 (6) 에 기재된 단백질을 정량 또는 배열 번호：1 의 염기 배열을 갖는 저온 성능을 증강시키는 유전자의 발현량을 측정하여, 목적으로 하는 저온 성능에 따른 상기 단백질량 또는 상기 유전자 발현량의 피검 효모를 선택하는, 효모의 선택 방법.

(17a) 피검 효모를 배양하여, 저온 발효능 또는 저온 발효 활성 또는 냉동 내성을 측정하여, 목적으로 하는 저온 발효능 또는 저온 발효 활성 또는 냉동 내성의 피검 효모를 선택하는, 효모의 선택 방법.

(18) 기준 효모 및 피검 효모를 배양하여, 배열 번호：1 의 염기 배열을 갖는 저온 성능을 증강시키는 유전자의 각 효모에 있어서의 발현량을 측정하여, 기준 효모보다 그 유전자가 고발현인 피검 효모를 선택하는, 상기 (17) 에 기재된 효모의 선택 방법.

(19) 기준 효모 및 피검 효모를 배양하고 각 효모에 있어서의 상기 (6) 에 기재된 단백질을 정량하여, 기준 효모보다 그 단백질량이 많은 피검 효모를 선택하는, 상기 (17) 에 기재된 효모의 선택 방법. 즉, 복수의 효모를 배양하고 각 효모에 있어서의 상기 (6) 에 기재의 단백질을 정량하여, 그 중에서 그 단백질량이 많은 피검 효모를 선택하는, 상기 (17) 에 기재된 효모의 선택 방법.

(20) 상기 (8) ∼ (10) 에 기재된 효모 및 상기 (17) ∼ (19) 에 기재된 방법에 의해 선택된 효모 중 어느 하나의 효모를 사용하여 주류 제조를 위한 발효를 실시하고, 저온 성능을 증강시킨 것을 특징으로 하는, 주류의 제조 방법.

본 발명의 형질 전환 효모를 사용하는 주류의 제조법에 의하면, 저온 발효성이 향상되어, 저온 발효에 있어서의 발효 기간을 단축할 수 있다. 또, 본 발명에 의하면, 냉동 내성이 우수한 효모를 제공할 수도 있다.

또한, 본 명세서에 있어서, 「저온 성능」이란, 저온 발효능 및/또는 냉동 내성을 말한다.

도 1 은, 맥주 시험 양조에 있어서의 효모 증식량의 시간 경과적 변화를 나타내는 도면이다. 가로축은 발효 시간을, 세로축은 OD660 의 값을 나타내고 있 다.

도 2 는, 맥주 시험 양조에 있어서의 엑기스 소비량의 시간 경과적 변화를 나타내는 도면이다. 가로축은 발효 시간, 세로축은 외관 엑기스 농도 (w/w％) 를 나타내고 있다.

도 3 은, 맥주 시험 양조 중의 효모에 있어서의 nonScDLT1 유전자의 발현 거동을 나타내는 도면이다. 가로축은 발효 시간, 세로축은 검출된 시그널 휘도를 나타내고 있다.

도 4 는, 친주 (親株) 그리고 nonScDLT1 고발현주의 냉동 내성도를 나타내는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명자들은, 효모의 저온 성능을 증강시킴으로써, 더욱 효율적으로 저온에서의 발효를 실시하는 것이 가능하다고 생각하였다. 이와 같은 착상에 기초해 연구를 거듭하여, 일본 공개특허공보 2004-283169 에 개시된 방법으로 해독한 맥주 효모 게놈 정보를 기초로, 맥주 효모 특유의 저온 성능을 증강시키는 단백을 코드하는 non-ScDLT1 유전자를 단리·동정하였다. 이 염기 배열을 배열 번호：

1 에 나타낸다. 또 이 유전자에 의해 코드되는 단백질의 아미노산 배열을 배열 번호：2 에 나타낸다.

1. 본 발명의 폴리뉴클레오티드

먼저, 본 발명은, (a) 배열 번호：1 의 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드；및 (b) 배열 번호：2 의 아미노산 배열로 이 루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는, DNA 이어도 되고 RNA 이어도 된다.

본 발명에서 대상으로 하는 폴리뉴클레오티드는, 상기한 맥주 효모 유래의 저온 성능을 증강시키는 단백을 코드하는 폴리뉴클레오티드로 한정되는 것은 아니고, 이 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 다른 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 기능적으로 동등한 단백질로는, 예를 들어, (c) 배열 번호：2 의 아미노산 배열에 있어서, 1 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 저온 성능을 증강시키는 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다.

이와 같은 단백질로는, 배열 번호：2 의 아미노산 배열에 있어서, 예를 들어, 1 ∼ 100 개, 1 ∼ 90 개, 1 ∼ 80 개, 1 ∼ 70 개, 1 ∼ 60 개, 1 ∼ 50 개, 1 ∼ 40 개, 1 ∼ 39 개, 1 ∼ 38 개, 1 ∼ 37 개, 1 ∼ 36 개, 1 ∼ 35 개, 1 ∼ 34 개, 1 ∼ 33 개, 1 ∼ 32 개, 1 ∼ 31 개, 1 ∼ 30 개, 1 ∼ 29 개, 1 ∼ 28 개, 1 ∼ 27 개, 1 ∼ 26 개, 1 ∼ 25 개, 1 ∼ 24 개, 1 ∼ 23 개, 1 ∼ 22 개, 1 ∼ 21 개, 1 ∼ 20 개, 1 ∼ 19 개, 1 ∼ 18 개, 1 ∼ 17 개, 1 ∼ 16 개, 1 ∼ 15 개, 1 ∼ 14 개, 1 ∼ 13 개, 1 ∼ 12 개, 1 ∼ 11 개, 1 ∼ 10 개, 1 ∼ 9 개, 1 ∼ 8 개, 1 ∼ 7 개, 1 ∼ 6 개 (1 ∼ 수 개), 1 ∼ 5 개, 1 ∼ 4 개, 1 ∼ 3 개, 1 ∼ 2 개, 1 개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 저온 성능을 증강시키는 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 상기 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 수는, 일반적으로는 작을 수록 바람직하다. 또, 이와 같은 단백질로는, (d) 배열 번호：2 의 아미노산 배열과 약 60％ 이상, 약 70％ 이상, 71％ 이상, 72％ 이상, 73％ 이상, 74％ 이상, 75％ 이상, 76％ 이상, 77％ 이상, 78％ 이상, 79％ 이상, 80％ 이상, 81％ 이상, 82％ 이상, 83％ 이상, 84％ 이상, 85％ 이상, 86％ 이상, 87％ 이상, 88％ 이상, 89％ 이상, 90％ 이상, 91％ 이상, 92％ 이상, 93％ 이상, 94％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 99％ 이상, 99.1％ 이상, 99.2％ 이상, 99.3％ 이상, 99.4％ 이상, 99.5％ 이상, 99.6％ 이상, 99.7％ 이상, 99.8％ 이상, 99.9％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 배열을 가지고, 또한 저온 성능을 증강시키는 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 상기 상동성의 수치는 일반적으로 클수록 바람직하다.

또한, 저온 발효성은, 예를 들어 10℃ 내지 15℃ 에 있어서의 에탄올 생성량과 에탄올 생성 속도를 측정함으로써 평가할 수 있다. 동일한 온도에서 양조했을 경우에, 기준 효모 (예를 들어, 사카로미세스 세레비제 NBRC2002, AJL4002 등) 와 비교하여 에탄올 생성량 또는 에탄올 생성 속도가 증가되어 있으면, 「저온 발효성을 증강시키는 활성」이 있다고 판단한다. 그러한 증가율은, 바람직하게는 5％ 이상, 보다 바람직하게는 10％ 이상, 더욱 바람직하게는 15％ 이상, 특히 바람직하게는 20％ 이상이다. 냉동 내성은, 예를 들어, 본 명세서의 실시예 5 에 기재된 방법과 같이, 피검 효모를 함유하는 효모 현탁액으로 냉동하지 않는 것과, 그 피검 효모를 함유하는 효모 현탁액을 한번 냉동한 후, 해동한 것의 글루코오스 소비 속도 등을 비교함으로써 평가할 수 있다. 즉, 냉동 처리 후의 글루코오스 소비 속도의 저하가 적을수록, 냉동 내성이 높다는 것이 된다.

또, 본 발명은, (e) 배열 번호：1 의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 저온 성능을 증강시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드；및 (f) 배열 번호：2 의 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 저온 성능을 증강시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드도 포함한다.

여기서, 「스트린젠트 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드」란, 배열 번호：1 의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 배열 번호：2 의 아미노산 배열을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 프로브로 하여 콜로니 하이브리다이제이션법, 플라크 하이브리다이제이션법 또는 서던 하이브리다이제이션법 등을 사용함으로써 얻어지는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA) 를 말한다. 하이브리다이제이션 방법으로는, 예를 들어 Molecular Cloning 3rd Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987 - 1997 등에 기재되어 있는 방법을 이용할 수 있다.

본 명세서에서 말하는 「스트린젠트 조건」은, 저 스트린젠트 조건, 중 스트린젠트 조건 및 고 스트린젠트 조건 중 어느 것이어도 된다. 「저 스트린젠트 조건」은, 예를 들어, 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5％ SDS, 50％ 포름아미드, 32 ℃ 의 조건이다. 또, 「중 스트린젠트 조건」은, 예를 들어, 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5％ SDS, 50％ 포름아미드, 42℃ 의 조건이다. 「고 스트린젠트 조건」은, 예를 들어, 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5％ SDS, 50％ 포름아미드, 50℃ 의 조건이다. 이들의 조건에 있어서, 온도를 높일수록 높은 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA) 가 효율적으로 얻어지는 것을 기대할 수 있다. 단, 하이브리다이제이션의 스트린젠시에 영향을 미치는 요소로는 온도, 프로브 농도, 프로브의 길이, 이온 강도, 시간, 염 농도 등 복수의 요소가 생각되고, 당업자라면 이들 요소를 적절히 선택함으로써 동일한 스트린젠시를 실현할 수 있다.

또한, 하이브리다이제이션에 시판된 키트를 사용하는 경우에는, 예를 들어 Alkphos Direct Labelling Reagents (아머샴파마시아사 제조) 를 사용할 수 있다. 이 경우에는, 키트에 첨부된 프로토콜에 따라, 표지한 프로브와의 인큐베이션을 하룻밤 실시한 후, 멤브레인을 55℃ 의 조건하에서 0.1％ (w/v) SDS 를 함유하는 1 차 세정 버퍼로 세정 후, 하이브리다이즈한 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA) 를 검출할 수 있다.

이들 이외에 하이브리다이즈할 수 있는 폴리뉴클레오티드로는, FASTA, BLAST 등의 상동성 검색 소프트웨어에 의해, 디폴트의 파라미터를 사용하여 계산했을 때에, 배열 번호：2 의 아미노산 배열을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 약 60％ 이상, 약 70％ 이상, 71％ 이상, 72％ 이상, 73％ 이상, 74％ 이상, 75％ 이상, 76％ 이상, 77％ 이상, 78％ 이상, 79％ 이상, 80％ 이상, 81％ 이상, 82％ 이상, 83％ 이상, 84％ 이상, 85％ 이상, 86％ 이상, 87％ 이상, 88％ 이상, 89％ 이상, 90％ 이 상, 91％ 이상, 92％ 이상, 93％ 이상, 94％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 99％ 이상, 99.1％ 이상, 99.2％ 이상, 99.3％ 이상, 99.4％ 이상, 99.5％ 이상, 99.6％ 이상, 99.7％ 이상, 99.8％ 이상, 99.9％ 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.

또한, 아미노산 배열이나 염기 배열의 동일성은, 카린 및 알튈에 의한 알고리즘 BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990 ; Proc Natl Acad Sci USA 90：5873, 1993) 를 사용하여 결정할 수 있다. BLAST 의 알고리즘에 근거한 BLASTN 나 BLASTX 로 불리는 프로그램이 개발되어 있다 (Altschul SF, et al：J. Mol. Biol. 215：403, 1990). BLASTN 을 사용하여 염기 배열을 해석하는 경우에는, 파라미터는, 예를 들어 score = 100, wordlength = 12 로 한다. 또, BLASTX 를 사용하여 아미노산 배열을 해석하는 경우에는, 파라미터는, 예를 들어 score = 50, wordlength = 3 으로 한다. BLAST 와 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우에는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용한다.

2. 본 발명의 단백질

본 발명은, 상기 폴리뉴클레오티드 (a) ∼ (i) 중 어느 하나에 코드되는 단백질도 제공한다. 본 발명의 바람직한 단백질은, 배열 번호：2 의 아미노산 배열에 있어서, 1 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 저온 성능을 증강시키는 활성을 갖는 단백질이다. 이와 같은 단백질로는, 배열 번호：2 의 아미노산 배열에 있어서, 상기한 바와 같은 수의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루 어지고, 또한 저온 성능을 증강시키는 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 또, 이와 같은 단백질로는, 배열 번호：2 의 아미노산 배열과 상기한 바와 같은 상동성을 갖는 아미노산 배열을 가지고, 또한 저온 성능을 증강시키는 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 이와 같은 단백질은, 「모레큘러클로닝 제 3 판」, 「커런트·프로토콜즈·인·모레큘러·바이올로지」, “Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”, “Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”, “Gene, 34, 315 (1985)”, “Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”, “Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 사용하여, 취득할 수 있다.

본 발명의 단백질의 아미노산 배열에 있어서 1 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되었다는 것은, 동일 배열 중의 임의 또한 1 또는 복수의 아미노산 배열 중의 위치에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가가 있는 것을 의미하고, 결실, 치환, 삽입 및 부가 중 2 종 이상이 동시에 발생하여도 된다.

이하에, 서로 치환 가능한 아미노산 잔기의 예를 나타낸다. 동일군에 포함되는 아미노산 잔기는 서로 치환할 수 있다. A 군：류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, o-메틸세린, t-부틸 글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌；B 군：아스파르트산, 글루타민산, 이소 아스파르트산, 이소글루타민산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산；C 군：아스파라긴, 글루타민；D 군：리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산；E 군：프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린；F 군：세린, 트레오닌, 호모세린；G 군：페닐알라닌, 티로신.

또, 본 발명의 단백질은, Fmoc 법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc 법 (t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또, 어드벤스드 챔테크사 제조, 파킨엘머사 제조, 팔마시아사 제조, 프로테인 테크놀로지 인스트루먼트사 제조, 신더셀베가사 제조, 펄셉티브사 제조, 시마즈 제작소사 제조 등의 펩티드 합성기를 사용하여 화학 합성할 수도 있다.

3. 본 발명의 벡터 및 이것을 도입한 형질 전환 효모

다음으로, 본 발명은, 상기한 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는, 상기 (a) ∼ (i) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 (DNA) 를 함유한다. 또, 본 발명의 벡터는, 통상적으로, (x) 효모 세포 내에서 전사 가능한 프로모터；(y) 그 프로모터에 센스 방향 또는 안티센스 방향에서 결합된, 상기 (a) ∼ (i) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 (DNA)；및 (z) RNA 분자의 전사 종결 및 폴리아데닐화에 관한 것으로, 효모에서 기능하는 시그널을 구성 요소로서 포함하는 발현 카셋트를 포함하도록 구성된다.

효모에 도입할 때에 사용하는 벡터로는, 다카피형 (YEp 형), 단카피형 (YCp 형), 염색체 삽입형 (YIp 형) 중 어느 것이라도 이용할 수 있다. 예를 들어, YEp 형 벡터로는 YEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983), YCp 형 벡터로는 YCp50 (M. D. Rose et al., gene, 60, 237, 1987), YIp 형 벡터로는 YIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USP, 76, 1035, 1979) 가 알려져 있고, 용이하게 입수할 수 있다.

효모에서의 유전자 발현을 조절하기 위한 프로모터/터미네이터로는, 양조용 효모 중에서 기능함과 함께, 전국 중의 성분에 영향을 받지 않으면, 임의의 조합이어도 된다. 예를 들어, 글리세르알데히드 3 인산 데히드로게나아제 유전자 (TDH3) 의 프로모터, 3-포스포글리셀레이트키나아제 유전자 (PGK1) 의 프로모터 등을 이용할 수 있다. 이들의 유전자는 이미 클로닝되어 있고, 예를 들어 M. F. Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982) 에 상세하게 기재되어 있어, 공지된 방법에 의해 용이하게 입수할 수 있다.

형질 전환시에 사용하는 선택 마커로는, 양조용 효모인 경우에는 영양 요구성 마커를 이용할 수 없기 때문에, 제네티신 내성 유전자 (G418r), 구리 내성 유전자 (CUP1) (Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984), 셀레닌 내성 유전자 (fas2m, PDR4) (각각 이노코시 준지 등, 생화학, 64, 660, 1992 ; Hussain et et al., gene, 101, 149, 1991) 등을 이용할 수 있다.

상기와 같이 구축되는 벡터는, 숙주 효모에 도입된다. 숙주 효모로는, 양조용으로 사용할 수 있는 임의의 효모, 예를 들어 맥주, 와인, 청주 등의 양조용 효모 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 사카로미세스 (Saccharomyces) 속 등의 효모를 들 수 있지만, 본 발명에 있어서는, 맥주 효모, 예를 들어 사카로미세스 파스토리아누스 (Saccharomyces pastorianus) W34/70 등, 사카로미세스 칼스버겐시스 (Saccharomyces carlsbergensis) NCYC453, NCYC456 등, 사카로미세스 세레비제 (Saccharomyces cerevisiae) NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953, NBRC1954 등을 사용할 수 있다. 또한, 위스키 효모, 예를 들어 사카로미세스 세레비제 NCYC90 등, 와인 효모, 예를 들어 협회 포도주용 1 호, 동 3 호, 동 4 호 등, 청주 효모, 예를 들어 협회 효모 청주용 7 호, 동 9 호 등도 사용할 수 있으나, 이것으로 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서는, 맥주 효모, 예를 들어 사카로미세스 파스토리아누스가 바람직하고 사용된다.

효모의 형질 전환 방법으로는 일반적으로 사용되는 공지된 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 엘렉트로포레이션법“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”, 스페로프라스트법“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)”, 아세트산리튬법“J.Bacteriology, 153, p163 (1983)”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978), Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual 등에 기재된 방법으로 실시할 수 있으나, 이것으로 한정되지 않는다.

보다 구체적으로는, 숙주 효모를 표준 효모 영양 배양지 (예를 들어, YEPD 배양지“Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117 (1979)”등) 에서, OD600nm 의 값이 1 ∼ 6 이 되도록 배양한다. 이 배양 효모를 원심 분리하여 모으고, 세정하여, 농도 약 1 ∼ 2M 의 알칼리 금속 이온, 바람직하게는 리튬 이온으로 전처리한다. 이 세포를 약 30℃ 에서, 약 60 분간 정치한 후, 도입하는 DNA (약 1 ∼ 20μg) 와 함께 약 30℃ 에서, 약 60 분간 정치한다. 폴리에틸렌글리콜, 바람직하게는 약 4,000 달톤의 폴리에틸렌글리콜을, 최종 농도가 약 20％ ∼ 50％ 가 되도록 첨가한다. 약 30℃ 에서, 약 30 분간 정치한 후, 이 세포를 약 42℃ 에서 약 5 분간 가열 처리한다. 바람직하게는, 이 세포 현탁 액을 표준 효모 영양 배양지에서 세정하고, 소정량의 신선한 표준 효모 영양 배양지에 넣어, 약 30℃ 에서 약 60 분간 정치한다. 그 후, 선택 마커로서 사용하는 항생 물질 등을 포함하는 표준 한천 배지 상에 이식하여, 형질 전환체를 취득한다.

그 외, 일반적인 클로닝 기술에 관해서는, 「모레큘러클로닝 제 3 판」, “Methods in Yeast Genitics, A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)”등을 참조할 수 있다.

4. 본 발명의 주류의 제법 및 그 제법에 의해 얻어지는 주류

상기 서술한 본 발명의 벡터를 제조 대상이 되는 주류의 양조에 적절한 효모에 도입하고, 그 효모를 사용함으로써 저온에 있어서 단기간에 주류를 제조할 수 있다. 또, 하기의 본 발명의 효모의 평가 방법에 의해 선택된 효모도 동일하게 사용할 수 있다. 대상이 되는 주류로는, 이들로 한정되지 않지만, 예를 들어, 맥주, 발포주 등의 맥주맛 드링크, 와인, 위스키, 청주 등을 들 수 있다. 이들의 주류를 제조하는 경우에는, 친주 대신에 본 발명에 있어서 얻어진 양조 효모를 사용하는 것 이외에는 공지된 수법을 이용할 수 있다. 따라서, 원료, 제조 설비, 제조 관리 등은 종래법과 완전히 동일해도 되고, 발효 기간이 단축된 주류를 제조하기 위한 비용 증가는 없다. 즉, 본 발명에 의하면, 기존의 시설을 사용하여, 비용을 증가시키지 않고 제조할 수 있다.

5. 본 발명의 효모의 평가 방법

본 발명은, 배열 번호：1 의 염기 배열을 갖는 저온 성능을 증강시키는 유전자의 염기 배열에 기초하여 설계한 프라이머 또는 프로브를 사용하여, 피검 효모의 저온 성능에 대해 평가하는 방법에 관한 것이다. 이와 같은 평가 방법의 일반적인 수법은 공지되어 있으며, 예를 들어, WO01/040514호, 일본 공개특허공보 평 8-205900호 등에 기재되어 있다. 이하, 이 평가 방법에 대해 간단하게 설명한다.

먼저, 피검 효모의 게놈을 조제한다. 조제 방법은, Hereford 법이나 아세트산 칼륨법 등, 공지된 모든 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)). 얻어진 게놈을 대상으로 하고, 저온 성능을 증강시키는 유전자의 염기 배열 (바람직하게는, ORF 배열) 에 기초하여 설계한 프라이머 또는 프로브를 사용하여, 피검 효모의 게놈에 그 유전자 또는 그 유전자에 특이적인 배열의 존재 유무를 조사한다. 프라이머 또는 프로브의 설계는 공지된 수법을 사용하여 실시할 수 있다.

유전자 또는 특이적인 배열의 검출은, 공지된 수법을 사용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 특이적 배열의 일부 또는 전부를 함유하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 염기 배열에 대해 상보적인 염기 배열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 하나의 프라이머로서 사용하여, 다른 일방의 프라이머로서 이 배열보다 상류 또는 하류의 배열의 일부 또는 전부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 염기 배열에 대해 상보적인 염기 배열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여, PCR 법에 의해 효모의 핵산을 증폭시켜, 증폭물의 유무, 증폭물의 분자량 크기 등을 측정한다. 프라이머에 사용되는 폴리뉴클레오티드의 염 기수는, 통상적으로, 10bp 이상이고, 15 ∼ 25bp 인 것이 바람직하다. 또, 삽입하는 부분의 염 기수는, 통상적으로, 300 ∼ 2000bp 가 적당하다.

PCR 법의 반응 조건은, 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 변성 온도：90 ∼ 95℃, 어닐링 온도：40 ∼ 60℃, 신장 온도：60 ∼ 75℃, 사이클 수：10 회 이상 등의 조건을 사용할 수 있다. 얻어지는 반응 생성물은 아가로스겔 등을 사용한 전기 영동법 등에 의해 분리되어, 증폭산물의 분자량을 측정할 수 있다. 이 방법에 의해, 증폭산물의 분자량이 특이 부분의 DNA 분자를 포함하는 크기인지 아닌지에 따라, 그 효모의 저온 성능에 대해 예측·평가한다. 또, 증폭물의 염기 배열을 분석함으로써, 더욱 상기 성능에 대해 보다 정확하게 예측·평가할 수 있다.

또, 본 발명에 있어서는, 피검 효모를 배양하여, 배열 번호：1 의 염기 배열을 갖는 저온 성능을 증강시키는 유전자의 발현량을 측정함으로써, 피검 효모의 저온 성능을 평가할 수도 있다. 또한, 유전자의 발현량의 측정은, 피검 효모를 배양하여, 저온 성능을 증강시키는 유전자의 산물인 mRNA 또는 단백질을 정량함으로써 가능하다. mRNA 또는 단백질의 정량은, 공지된 수법을 사용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, mRNA 의 정량은 예를 들어 노던 하이브리다이제이션이나 정량적 RT－PCR 에 의해, 단백질의 정량은 예를 들어 웨스턴블로팅에 의해 실시할 수 있다 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003).

또한, 피검 효모를 배양하여, 배열 번호：1 의 염기 배열을 갖는 저온 성능을 증강시키는 유전자의 발현량을 측정하여, 목적으로 하는 저온 성능에 따른 상기 유전자 발현량의 효모를 선택함으로써, 원하는 주류의 양조에 바람직한 효모를 선택할 수 있다. 또, 기준 효모 및 피검 효모를 배양하고, 각 효모에 있어서의 상기 유전자 발현량을 측정하여, 기준 효모와 피검 효모의 상기 유전자 발현량을 비교하여, 원하는 효모를 선택해도 된다. 구체적으로는, 예를 들어, 기준 효모 및 피검 효모를 배양하여, 배열 번호：1 의 염기 배열을 갖는 저온 성능을 증강시키는 유전자의 각 효모에 있어서의 발현량을 측정하여, 기준 효모보다 그 유전자가 고발현인 피검 효모를 선택함으로써, 원하는 주류의 양조에 바람직한 효모를 선택할 수 있다.

또는, 피검 효모를 배양하여, 저온 성능이 우수한 효모를 선택함으로써, 원하는 주류의 양조에 바람직한 피검 효모를 선택할 수 있다.

이들의 경우, 피검 효모 또는 기준 효모로는, 예를 들어, 상기 서술한 본 발명의 벡터를 도입한 효모, 상기 서술한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현이 억제된 효모, 돌연변이 처리가 실시된 효모, 자연 변이된 효모 등이 사용될 수 있다. 저온 발효능은, 예를 들어, 예를 들어 10℃ 내지 15℃ 에 있어서의 에탄올 생성량과 에탄올 생성 속도를 측정함으로써 평가할 수 있다. 냉동 내성은, 예를 들어 실시예 5 에 기재된 방법에 의해 평가할 수 있다. 돌연변이 처리는, 예를 들어 자외선 조사나 방사선 조사 등의 물리적 방법, EMS (에틸메탄술포네이트), N-메틸-N-니트로소구아니딘 등의 약제 처리에 의한 화학적 방법 등, 어떠한 방법을 사용하여도 된다 (예를 들어, 오오시마 야스지 편저, 생물 화학 실험법 39 효모 분자 유전학 실험법, p67-75, 학회 출판 센터 등 참조).

또한, 기준 효모, 피검 효모로서 사용될 수 있는 효모로는, 양조용으로 사용할 수 있는 임의의 효모, 예를 들어 맥주, 와인, 청주 등의 양조용 효모 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 사카로미세스 (Saccharomyces) 속 등의 효모를 들 수 있는데, 본 발명에 있어서는, 맥주 효모, 예를 들어 사카로미세스 파스토리아누스 (Saccharomyces pastorianus) W34/70등, 사카로미세스 칼스버겐시스 (Saccharomyces carlsbergensis) NCYC453, NCYC456 등, 사카로미세스 세레비제 (Saccharomyces cerevisiae) NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953, NBRC1954 등을 사용할 수 있다. 또한, 와인 효모, 예를 들어 협회 포도주용 1 호, 동 3 호, 동 4 호 등, 청주 효모, 예를 들어 협회 효모 청주용 7 호, 동 9 호 등도 사용할 수 있지만, 이것으로 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서는, 맥주 효모, 예를 들어 사카로미세스 파스토리아누스가 바람직하게 사용된다. 기준 효모, 피검 효모는, 상기 효모로부터 임의의 조합으로 선택해도 된다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 기술하지만, 본 발명은 이하의 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1：신규 저온 발효성을 증강시키는 유전자 ( nonScDLT1 ) 의 클로닝

일본 공개특허공보 2004-283169 에 기재된 비교 데이타베이스를 사용하여 검색한 결과, 맥주 효모에 특유의 신규 저온 발효성을 증강시키는 유전자, nonScDLT1 를 발견하였다 (배열 번호：1). 얻어진 염기 배열 정보를 기초로, 각각 전체 길이 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 nonScDLT1_F (배열 번호：3)/nonScDLT1_R (배열 번호：4) 를 설계하고, 게놈 해독주 사카로미세스 파스토리아누스 바이헨스테판 34/70 주의 염색체 DNA 를 주형으로 한 PCR 에 의해 nonScDLT1 의 전체 길이 유전자를 포함하는 DNA 단편을 취득하였다.

상기와 같이 하여 얻어진 nonScDLT1 유전자 단편을, TA 클로닝에 의해 pCR2.1-TOPO 벡터 (인비트로젠사 제조) 에 삽입하였다. nonScDLT1 유전자의 염기 배열을 상거 방법 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) 으로 분석하여, 염기 배열을 확인하였다.

실시예 2：맥주 시양 중의 nonScDLT1 유전자 발현 해석

맥주 효모 사카로미세스 파스토리아누스 W34/70 주를 사용하여 맥주 시양을 실시하고, 발효 중인 맥주 효모 균체로부터 추출한 mRNA 를 맥주 효모 DNA 마이크로 어레이로 검출하였다.

보리즙 엑기스 농도 12.69％

보리즙 용량 70L

보리즙 용존 산소 농도 8.6ppm

발효 온도 15℃

효모 투입량 12.8×10⁶cells/mL

발효액을 경시적으로 샘플링하고, 효모 증식량 (도 1), 외관 엑기스 농도 (도 2) 의 시간 경과적 변화를 관찰하였다. 또 이것과 동시에 효모 균체를 샘플링하고, 조제한 mRNA 를 비오틴 라벨하여, 일본 공개특허공보 2004-283169 에 기재된 맥주 효모 DNA 마이크로 어레이에 하이브리다이즈시켰다. 시그널의 검출은 진 칩 오퍼레이팅 시스템 (GCOS ; GeneChip Operating Software 1.0, 아피메트릭스 사 제조) 을 사용하여 실시하였다. nonScDLT1 유전자의 발현 패턴을 도 3 에 나타낸다. 이 결과로부터, 통상적인 맥주 발효에 있어서 nonScDLT1 유전자가 발현되고 있는 것을 확인하였다.

실시예 3： nonScDLT1 고발현주의 제작

실시예 1 에 기재된 nonScDLT1/pCR2. 1-TOPO 를 제한 효소 SacI 및 NotI 소화하여, 단백질코드 영역 전체 길이를 포함하는 DNA 단편을 조제하였다. 이 단편을 제한 효소 SacI 및 NotI 처리한 pYCGPYNot 에 연결시켜, nonScDLT1 고발현 벡터 nonScDLT1/pYCGPYNot 을 구축하였다. pYCGPYNot 은 YCp 형의 효모 발현 벡터이고, 도입된 유전자는 피루브산키나아제 유전자 PYK1 의 프로모터에 의해 고발현된다. 효모에서의 선택 마커로서 제네티신 내성 유전자 G418^r 을, 또 대장균에서의 선택 마커로서 암피실린 내성 유전자 Amp^r 를 포함하고 있다.

상기 서술한 방법으로 제작한 고발현 벡터를 사용하여, 일본 공개특허공보 평07-303475 에 기재된 방법으로 AJL4004 주를 형질 전환하고, 제네티신 300mg/L 를 포함하는 YPD 평판 배양지 (1％ 효모 엑기스, 2％ 폴리펩톤, 2％ 글루코오스, 2％ 한천) 에서 형질 전환체를 선택하였다.

실시예 4：맥주 시험 양조에 있어서의 저온 발효성의 평가

친주 그리고 실시예 3 에서 얻어진 nonScDLT1 고발현주를 사용한 발효 시험을 이하의 조건으로 실시한다.

보리즙 엑기스 농도 12％

보리즙 용량 1L

보리즙 용존 산소 농도 약 8ppm

발효 온도 12℃ 일정

효모 투입량 5g 습효모 균체/L보리즙

발효 전극를 경시적으로 샘플링하고, 효모 증식량 (OD660), 엑기스 소비량, 유리 아미노태질소 (FAN) 의 시간 경과적 변화를 조사한다. 저온 발효성은, 10℃ 내지 15℃ 에 있어서의 에탄올 생성량과 에탄올 생성 속도를 측정함으로써 평가한다.

실시예 5：냉동 내성의 평가

친주 그리고 고발현주의 냉동 내성을 이하의 방법으로 평가하였다. 이하의 예에 있어서 사용한 배양지의 내용은 다음과 같다.

·YPD 배양지：이스트 엑기스 1％, 박토펩톤 2％ 및 글루코오스 2％ 를 함유하는 물로 이루어지는 배양지.

·YNB 배양지：이스트니트로겐베이스 0.67％, 카사미노산 0.4％, 우라실 20ppm 및 아데닌 40ppm 을 함유하는 물로 이루어지는 배양지.

제네티신 300mg/L 를 함유하는 YPD 배양지 10mL 에 일백금이의 균체를 식균 하고 30℃ 에서 하룻밤 진탕 배양하였다. 균체탁도 (OD660) 를 측정하고, OD660=2 상당의 균체를 회수한 후, 4％ 글루코오스, 5％ 에탄올 및 제네티신 300mg/L 를 함유하는 YPD 배양지 1mL 에 현탁하였다. 친주, 고발현주 각각에 대해 상기 효모 현탁액을 냉동용·비냉동용을 2 개씩 준비하였다. 비냉동용에는 바로 YNB 배양지 1mL 를 첨가하여 30℃ 에서 2 시간 진탕 배양하였다. 원심 분리로 배양 상청을 회수하여, 바이오 센서 BF-5 (오지 계측 기기 주식회사 제조) 로 글루코오스 농도를 측정하였다. 냉동용은, 예랭으로 하여 빙욕에 30 분 정치하고, -20℃ 의 냉동고에서 2 시간 동결시킨 후, 수욕에 8 분간 담궈 해동하였다. 거기에 YNB 배양지 1mL 를 첨가하여 30℃ 에서 2 시간 진탕 배양한 후, 비냉동용와 동일하게 글루코오스 농도를 측정하였다. 냉동 효모의 글루코오스 감소량을 A, 비냉동 효모의 글루코오스 감소량을 B 로 하고, A/B 의 값을 「냉동 내성도」로 하여, 냉동 내성의 평가를 실시하였다.

도 4 에 나타내는 바와 같이, 친주의 냉동 내성이 0.4 이었는데 반해, 고발현주에서는 0.7 이 되어, nonScDLT1 의 고발현에 의해 냉동 내성이 향상되는 것이 분명해졌다.

본 발명의 주류 제조법에 의하면, 효모의 저온 성능이 증대되기 때문에, 저온에 있어서도 단기간으로 주류를 제조하는 것이 가능해진다.

<110> Suntory Limited <120> Gene capable of improving low temperature fermentability and/or low temperature resistance, and use thereof <130> G07-0100 <140> PCT/JP2006/317699 <141> 2006-08-31 <150> JP2005-253250 <151> 2005-09-01 <160> 4 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1029 <212> DNA <213> yeast <400> 1 atgtctgggc tagcgaaact gaagtcgtgg ctgtataagg gttccctctt tatatcattg 60 atacttttga ttgggttttc agtagtattg cctatagatt ccattgcaca ggcttctaaa 120 tcagagaaca atgctttcaa cacatttatt gttgttggtg ccttagttgt ttttggtgtt 180 gtttgtatcg ttattattat tggaagagtg ctatttcaca aaagctgtct aaaggatatt 240 ccaagaagat atattccaat cacaccagct gatcttccgc atcttgcgag tcgagaagca 300 gtattgaaaa acatggaaag gtctaaggaa ttaactattc tgctaaaaaa accaaaggat 360 cctgttatcc atgatggact ggaacctcca aagcgatgtg attttccatc aaatgaaaaa 420 ttatttccag aatacctaaa ttatgctgat tgtataaaaa gtctaacgga tagattgaaa 480 taccatgggt tgtttctgaa caacctagat gttaggatga aactggagga cacttttgct 540 gatgtggtga attctcagtt tgttaaccgc aatactaaca aggttcaatt gcaaaaggct 600 aaagatttta ttgacttgta tgaaacgata agattttcag gcaaagatgt cacaagagac 660 caatttatac tgtttgttga gctgtgtctt tattttgggg aggtgtcact aacaagggat 720 acgtcatttg caaatttcca gaattttaaa tataatgcca gttcaaataa tggcggaaca 780 aatgaatcga aatattcaat aaaccggttc gatgaaaacg aatacgctca ggaagatatg 840 cattactttc ctgaaccgcc tacccatttg gttagagaga gtagcagaag cacagtggca 900 cggcatattt catctggtgg agatttacct aattctgaag agcatccttt agaagacgat 960 tctgattgta atgggcttaa tgacaaactt gcagaagttc acagttatag aagcgtaatt 1020 cgtcattaa 1029 <210> 2 <211> 342 <212> PRT <213> yeast <400> 2 Met Ser Gly Leu Ala Lys Leu Lys Ser Trp Leu Tyr Lys Gly Ser Leu 1 5 10 15 Phe Ile Ser Leu Ile Leu Leu Ile Gly Phe Ser Val Val Leu Pro Ile 20 25 30 Asp Ser Ile Ala Gln Ala Ser Lys Ser Glu Asn Asn Ala Phe Asn Thr 35 40 45 Phe Ile Val Val Gly Ala Leu Val Val Phe Gly Val Val Cys Ile Val 50 55 60 Ile Ile Ile Gly Arg Val Leu Phe His Lys Ser Cys Leu Lys Asp Ile 65 70 75 80 Pro Arg Arg Tyr Ile Pro Ile Thr Pro Ala Asp Leu Pro His Leu Ala 85 90 95 Ser Arg Glu Ala Val Leu Lys Asn Met Glu Arg Ser Lys Glu Leu Thr 100 105 110 Ile Leu Leu Lys Lys Pro Lys Asp Pro Val Ile His Asp Gly Leu Glu 115 120 125 Pro Pro Lys Arg Cys Asp Phe Pro Ser Asn Glu Lys Leu Phe Pro Glu 130 135 140 Tyr Leu Asn Tyr Ala Asp Cys Ile Lys Ser Leu Thr Asp Arg Leu Lys 145 150 155 160 Tyr His Gly Leu Phe Leu Asn Asn Leu Asp Val Arg Met Lys Leu Glu 165 170 175 Asp Thr Phe Ala Asp Val Val Asn Ser Gln Phe Val Asn Arg Asn Thr 180 185 190 Asn Lys Val Gln Leu Gln Lys Ala Lys Asp Phe Ile Asp Leu Tyr Glu 195 200 205 Thr Ile Arg Phe Ser Gly Lys Asp Val Thr Arg Asp Gln Phe Ile Leu 210 215 220 Phe Val Glu Leu Cys Leu Tyr Phe Gly Glu Val Ser Leu Thr Arg Asp 225 230 235 240 Thr Ser Phe Ala Asn Phe Gln Asn Phe Lys Tyr Asn Ala Ser Ser Asn 245 250 255 Asn Gly Gly Thr Asn Glu Ser Lys Tyr Ser Ile Asn Arg Phe Asp Glu 260 265 270 Asn Glu Tyr Ala Gln Glu Asp Met His Tyr Phe Pro Glu Pro Pro Thr 275 280 285 His Leu Val Arg Glu Ser Ser Arg Ser Thr Val Ala Arg His Ile Ser 290 295 300 Ser Gly Gly Asp Leu Pro Asn Ser Glu Glu His Pro Leu Glu Asp Asp 305 310 315 320 Ser Asp Cys Asn Gly Leu Asn Asp Lys Leu Ala Glu Val His Ser Tyr 325 330 335 Arg Ser Val Ile Arg His 340 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> primer <400> 3 gagctcatag cggccatgtc tgggctagcg aaactgaagt 40 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> primer <400> 4 ggatcctatg cggccgctat ttttaggatt atgattattc aa 42

Claims

이하의 (a) ∼ (f) 로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드：

(a) 배열 번호：1 의 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드；

(b) 배열 번호：2 의 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드；

(c) 배열 번호：2 의 아미노산 배열에 있어서, 1 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 저온 성능을 증강시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드；

(d) 배열 번호：2 의 아미노산 배열에 대해 60％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 배열을 가지고, 또한 저온 성능을 증강시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드；

(e) 배열 번호：1 의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 저온 성능을 증강시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드；및

(f) 배열 번호：2 의 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 저온 성능을 증강시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
이하의 (g) ∼ (i) 로 이루어지는 군에서 선택되는 제 1 항에 기재된 폴리뉴클레오티드：

(g) 배열 번호：2 의 아미노산 배열 또는 배열 번호：2 의 아미노산 배열에 있어서, 1 ∼ 10개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 저온 성능을 증강시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드；

(h) 배열 번호：2 의 아미노산 배열에 대해 90％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 배열을 가지고, 또한 저온 성능을 증강시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드；및

(i) 배열 번호：1 의 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 또는 배열 번호：1 의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 하이 스트린젠트 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 저온 성능을 증강시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서,

배열 번호：1 의 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서,

배열 번호：2 의 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,

DNA 인 폴리뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드에 코드되는 단백질.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터.
제 7 항에 기재된 벡터가 도입된 효모.
제 8 항에 있어서,

제 7 항에 기재된 벡터를 도입함으로써, 저온 성능이 향상된 효모.
제 9 항에 있어서,

제 6 항에 기재된 단백질의 발현량을 증가시킴으로써 저온 성능이 향상된 효모.
제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 효모를 사용한 주류의 제조 방법.
제 11 항에 있어서,

양조하는 주류가 맥아 음료인 주류의 제조 방법.
제 11 항에 있어서,

양조하는 주류가 와인인 주류의 제조 방법.
제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 주류.
배열 번호：1 의 염기 배열을 갖는 저온 성능을 증강시키는 유전자의 염기 배열에 기초하여 설계한 프라이머 또는 프로브를 사용하여, 피검 효모의 저온 성능 에 대해 평가하는 방법.
피검 효모를 배양하여, 배열 번호：1 의 염기 배열을 갖는 저온 성능을 증강시키는 유전자의 발현량을 측정함으로써, 피검 효모의 저온 성능을 평가하는 방법.
피검 효모를 배양하여, 제 6 항에 기재된 단백질을 정량 또는 배열 번호：1 의 염기 배열을 갖는 저온 성능을 증강시키는 유전자의 발현량을 측정하여, 목적으로 하는 저온 발효능에 따른 상기 단백질량 또는 상기 유전자 발현량의 피검 효모를 선택하는, 효모의 선택 방법.
제 17 항에 있어서,

기준 효모 및 피검 효모를 배양하여 배열 번호：1 의 염기 배열을 갖는 저온 성능을 증강시키는 유전자의 각 효모에 있어서의 발현량을 측정하여, 기준 효모보다 그 유전자가 고발현인 피검 효모를 선택하는, 효모의 선택 방법.
제 17 항에 있어서,

기준 효모 및 피검 효모를 배양하고 각 효모에 있어서의 제 6 항에 기재된 단백질을 정량하여, 기준 효모보다 그 단백질량이 많은 피검 효모를 선택하는, 효모의 선택 방법.
제 8 항 내지 제 10 항에 기재된 효모 및 제 17 항 내지 제 19 항에 기재된 방법에 의해 선택된 효모 중 어느 하나의 효모를 사용하여 주류 제조를 위한 발효를 실시하고, 저온 발효능을 증강시킨 것을 특징으로 하는, 주류의 제조 방법.