CN101024838A - 编码乙酰乳酸合成酶的基因及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及乙酰乳酸合成酶基因及其用途，特别是涉及制造香味优异的酒精饮料的酿造酵母、使用该酵母制造的酒精饮料及其制造方法等。进一步具体地说，本发明涉及通过降低编码酿造酵母的乙酰乳酸合成酶Ilv2p的基因ILV2，特别是啤酒酵母中特征性的nonScILV2基因的表达量，使造成产品不良味道的VDK、特别是DA的生成能力降低的酵母及使用该酵母制造酒精饮料的方法等。

Description

编码乙酰乳酸合成酶的基因及其用途

技术领域

本发明涉及编码乙酰乳酸合成酶的基因及其用途，特别是涉及制造香味优异的酒精饮料的酿造酵母、使用该酵母制造的酒精饮料(alcoholicbeverages)及所述酒精饮料的制造方法等。更具体地说，本发明涉及通过抑制编码酿造酵母的乙酰乳酸合成酶的基因ILV2，特别是啤酒酵母中特征性的nonScILV2基因的表达量，从而使造成产品不良味道的连二酮类，特别是双乙酰的生产量降低的酵母及使用该酵母制造酒精饮料的方法。

背景技术

酒精饮料的呈味成份中，双乙酰(以下为DA)味是啤酒、清酒及葡萄酒等酿造的酒精饮料中具有代表性的不良味道之一。DA味(在啤酒中表现为馊饭味或黄油味，清酒中表现为使人想吐的味)是以DA为主的连二酮类(以下为VDK)在产品中以阈值以上浓度存在时所产生的，啤酒中的阈值为0.1ppm[Joumal of the Institute of Brewing，76，486(1970)]。

酒精饮料中的VDK大致分为DA和2，3-戊二酮(以下为PD)。DA和PD分别以缬氨酸及异亮氨酸生物合成体系的中间产物α-乙酰乳酸及α-乙酰羟基丁酸为前体物质，通过酵母不参与的非酶促反应而生成。

由以上可知，VDK(DA及PD)及其前体物质α-乙酰羟基酸类(α-乙酰乳酸及α-乙酰羟基丁酸)均可作为可带给产品DA味的物质，培养出能降低这些物质的酵母，不仅可使酒精饮料的生产质量控制容易进行，还可扩展新商品的开发。

DA味的控制方法，例如日本特开2001-204457公报中报道了清酒的制造方法，其通过米-麦芽-酵母的培养物来抑制DA生成，该培养基含有低浓度的作为α-乙酰羟基酸类前体物质的丙酮酸。乙酰乳酸合成酶是把丙酮酸或α-氧代丁酸分别转换为α-乙酰乳酸或α-乙酰羟基丁酸的酶，编码酵母的乙酰乳酸合成酶的基因有ILV2及ILV6。已知，ILV2编码活性亚基，而ILV6编码调控亚基。Journal of Basic Microbiology，28(3)，175-183(1988)中报道了如下结果，即通过对ILV2实行诱变、基因破坏，抑制了上述酶活性，从而降低前体物质(α-乙酰羟酸类)的合成，结果降低了DA的浓度。关于作为调控亚基的Ilv6p，例如在Biochemistry，38(16)，5222-31(1999)中对乙酰乳酸合成酶的活性进行了酶学上的分析，但尚不明确其对DA生成是否产生影响。

虽有如下报道，即在啤酒生产中，使用缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸营养缺陷型酵母可降低VDK生成量，但由于营养缺陷型菌株易产生生长迟缓、发酵延迟，所以未能达到实用化。日本特开2002-291465号公报中公开的方法是，获得对这些支链氨基酸的类似物具有敏感性的突变株，从中选拔DA累积较少的株。在Journal of American Society of Brewing Chemists，Proceeding，81-84(1987)中报道了调节来自实验室设计的基因工程酵母的ILV5基因的表达量。在European Brewery Convention，Proceedings of the 21st EBC congress，Madrid，553-560(1987)中同样报道了调节基因工程酵母的ILV3基因的表达量。此时ILV5基因编码的乙酰羟基酸还原异构酶的酶活性增加了5-7倍，VDK生成量减少到40％左右。

而ILV3基因编码的二羟酸脱水酶的酶活性虽增加了5-6倍，但VDK生成量无显著的减少。上述2个报道均使用了合成培养基，而对于实际啤酒酿造的影响未与分析。另外，Villa等在Journal of American Society of BrewingChemists，53：49-53(1995)中报道，通过ILV5基因、ILV3基因或者ILV5和ILV3的基因产物的质粒扩增，使VDK生成量与实际的啤酒酿造中的正常酿造酵母的相比，分别减少了70％、40％、60％。

Dulieu等在European Brewery Convention，Proceedings of the 26th EBCcongress，Maastricht，455-460(1997)中，虽提出了通过使用α-乙酰乳酸脱羧酶使DA的前体物质α-乙酰乳酸迅速转换成3-羟基-2-丁酮的方法，但由于α-乙酰乳酸脱羧酶仅能通过DNA重组技术制得，因此日本的税制上规定在发酵过程中的发酵液内不能添加该酶。日本特开平2-265488号公报及日本特开平7-171号公报均报道了使用编码α-乙酰乳酸脱羧酶的DNA链的基因工程酵母。

发明内容

基于上述情况，有必要开发一种方法来生产香味优异的酒精饮料，所述方法利用编码能减少VDK(连二酮)味，特别是DA味的蛋白质的基因以及该蛋白质来培育VDK生成量少的酵母菌来实现的。

本发明的发明人为解决上述课题进行了不断的研究，并从啤酒酵母中成功地鉴定、分离出了编码乙酰乳酸合成酶的基因。

本发明涉及啤酒酵母中特征性存在的新型乙酰乳酸合成酶基因、该基因编码的蛋白质、该基因表达受到调控的转化酵母、通过使用该基因表达受到调控的酵母控制产品中VDK浓度，特别是DA浓度的方法等。具体地说，本发明提供如下所示的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体或DNA片段、导入了该载体或DNA片段的转化酵母、使用该转化酵母制造酒精饮料的方法等。

(1)多核苷酸，其选自由以下(a)～(f)组成的群组：

(a)含有由序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸的多核苷酸；

(b)含有编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；

(c)含有编码由序列号：2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的，且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；

(d)含有编码具有与序列号：2的氨基酸序列有60％或60％以上同一性的氨基酸序列，且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；

(e)含有与序列号：1的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交且编码具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；以及

(f)含有与编码序列号：2氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸序列互补的多核苷酸在严格条件下杂交，且编码具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。

(2)上述(1)中所述的多核苷酸，其选自由以下(g)～(i)组成的群组：

(g)编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质或编码序列号：2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1～10个氨基酸的氨基酸序列组成的且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸；

(h)编码与序列号：2的氨基酸序列具有90％或90％以上同一性的氨基酸序列，且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸；以及

(i)与序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸或与序列号：1的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸在高严格条件下杂交，且编码具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸。

(3)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸。

(4)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。

(5)上述(1)～(4)中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA。

(6)多核苷酸，其选自由以下(j)～(m)组成的群组：

(j)编码具有与上述(5)中所述多核苷酸(DNA)的转录产物互补的碱基序列的RNA的多核苷酸；

(k)编码通过RNAi作用而抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表达的RNA的多核苷酸；

(1)编码具有特异性切割上述(5)中所述的多核苷酸(DNA)转录产物活性的RNA的多核苷酸；以及

(m)编码通过共抑制作用而抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表达的RNA的多核苷酸。

(7)蛋白质，其由上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸所编码。

(8)载体，其含有上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸。

(8a)上述(8)中所述的载体，其含有具有以下(x)～(z)组成要素的表达盒：

(x)在酵母细胞内可转录的启动子；

(y)上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸，其与该启动子以正义方向或反义方向结合；以及

(z)与RNA分子的转录终止及多聚腺苷酸化有关的、在酵母中起作用的信号。

(9)载体，其含有上述(6)中所述的多核苷酸。

(10)酵母，其中导入了上述(8)～(9)中任一项所述的载体。

(11)上述(10)中所述的酵母，其通过导入上述(8)～(9)中任一项所述的载体，降低总连二酮的生产能力或总双乙酰的生产能力。

(12)上述(11)中所述的酵母，其通过使上述(7)中所述的蛋白质的表达量减少，降低总连二酮的生产能力或总双乙酰的生产能力。

(13)酵母，其通过导入上述(8)～(9)中任一项所述的载体，或通过破坏与上述(5)中所述多核苷酸(DNA)有关的基因，抑制上述(5)中所述的多核苷酸(DNA)的表达。

(14)酒精饮料的制造方法，其包括培养上述(10)～(13)中任一项所述的酵母。

(15)上述(14)中所述的酒精饮料的制造方法，其中所酿造的酒精饮料是麦芽饮料。

(16)上述(14)中所述的酒精饮料的制造方法，其酿造的酒精饮料是葡萄酒。

(17)酒精饮料，其用上述(14)～(16)中任一项所述的方法制造。

(18)评价被检酵母的总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力的方法，其包括使用根据具有序列号：1碱基序列的乙酰乳酸合成酶基因的碱基序列而设计的引物或探针。

(18a)使用上述(18)中所述的方法，选择总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力低的酵母的方法。

(18b)使用通过上述(18a)中所述方法选择的酵母制造酒精饮料(例如啤酒)的方法。

(19)评价被检酵母的总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力的方法，其包括：培养被检酵母；以及测定具有序列号：1碱基序列的乙酰乳酸合成酶基因的表达量。

(19a)酵母的选择方法，其包括根据上述(19)中所述的方法评价被检酵母，选择乙酰乳酸合成酶基因的表达量低的酵母。

(19b)使用根据上述(19a)中所述的方法选择的酵母制造酒精饮料(例如啤酒)的方法。

(20)酵母的选择方法，其包括：培养被检酵母；对上述(7)中所述的蛋白质定量或测定具有序列号：1碱基序列的乙酰乳酸合成酶基因的表达量；以及根据目标总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力选择具有所述蛋白质生成量或所述基因表达量的被检酵母。

(21)上述(20)中所述的酵母的选择方法，其包括：培养标准酵母及被检酵母；测定具有序列号：1碱基序列的乙酰乳酸合成酶基因在各酵母中的表达量；以及选择该基因的表达量低于标准酵母的被检酵母。

(22)上述(20)中所述的酵母的选择方法，其包括：培养标准酵母及被检酵母；对各酵母中上述(7)中所述的蛋白质定量；以及选择该蛋白质的量比标准酵母少的被检酵母。即上述(20)中所述的酵母的选择方法，其包括：培养多个酵母；对各酵母中上述(7)中所述的蛋白质定量；以及选择其中该蛋白质的量较少的被检酵母。

(23)酒精饮料的制造方法，其包括：使用上述(10)～(13)中任一项所述的酵母或通过上述(20)～(22)中任一项所述的方法选择的酵母，进行用于酒精饮料制造的发酵；以及调节总连二酮的生产能力或总双乙酰的生产能力。

根据使用本发明所述的酒精饮料的制造方法，可降低产品中不良味道的连二酮类(VDK)[例如双乙酰(DA)、2，3-戊二酮(PD)等]或其前体物质(例如α-乙酰羟酸类等)，特别是双乙酰(DA)或其前体物质(例如α-乙酰乳酸等)的生产量，所以易于制造出香味优异的酒精饮料。

附图说明

图1是啤酒试验酿造中酵母生长经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示660nm处的光密度(OD660)。

图2是啤酒试验酿造中浸出物消耗量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。

图3是啤酒试验酿造中酵母的non-ScILV2基因表达变动的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示检测出的信号辉度。

图4是使用ILV2破坏株而进行的的nonScILV2补充试验的结果图。

a)是由于ILV2破坏形成缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸缺陷型的示意图。亲株用S.cerevisiae X2180-1A。所述菌株在SC(-Leu，Ile，Val)平板培养基、30℃下培养3日。

b)是通过将nonScILV2导入ILV2破坏株而形成非缺陷型的示意图。亲株用X2180-1A(ilv2：：nat1)。所述菌株在含有300mg/L的氨基糖苷类抗生素(Geneticin)的SC(-Leu，Ile，Val)平板培养基中，于30℃下培养3日。

具体实施方式

本发明人等以用日本特开2004-283169中公开的方法解读的啤酒酵母基因组信息为基础，分离、鉴定了啤酒酵母特有的编码乙酰乳酸合成酶的non-ScILV2基因。该基因的碱基序列如序列号：1所示。且由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列号：2所示。

本文中有时把VDK与其前体物质α乙酰羟酸总称为“总连二酮”。把DA与其前体物质α-乙酰乳酸总称为“总双乙酰”。

1.本发明的多核苷酸

首先，本发明提供：(a)含有由序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸的多核苷酸；以及(b)含有编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA也可以是RNA。

作为本发明对象的多核苷酸，不只限于来自上述啤酒酵母的编码乙酰乳酸合成酶的多核苷酸，还包含编码与此蛋白质具有同等功能的蛋白质的其他多核苷酸。同等功能的蛋白质包括，例如，(c)由序列号：2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1个或多个的氨基酸的氨基酸序列组成的，且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质。

此种蛋白质包括，由序列号：2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了例如1～100个、1～90个、1～80个、1～70个、1～60个、1～50个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个(1至数个)、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、1个氨基酸残基的氨基酸序列组成的，且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质。上述氨基酸残基的缺失、取代、插入及/或添加的数量，一般优选为较小的数量。此种蛋白质包括(d)具有与序列号：2的氨基酸序列有约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或者99.9％或以上的同一性的氨基酸序列，且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质。上述同一性的数值一般越大越好。

乙酰乳酸合成酶活性，例如可根据Pang等的方法[Biochemistry，38，5222-5231(1999)]测定。

另外，本发明也包含：(e)含有与序列号：1碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交，且编码具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有与编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交，且编码具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。

此处的“在严格条件下杂交的多核苷酸”，是指以序列号：1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸的全部或一部分、或编码序列号：2的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分为探针，通过使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southern杂交法等得到的多核苷酸(例如DNA)。杂交方法可以是，例如Molecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons 1987-1997等中所述的方法。

本文中所述的“严格条件”可为低严格条件、中严格条件、高严格条件中的任一种。“低严格条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件。“中严格条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件。“高严格条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。在上述条件中，温度越高，越能高效地获得具有较高同源性的多核苷酸(例如DNA)。影响杂交严格性的因素可为温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，本领域技术人员通过适宜选择这些因素，均可实现类似的严格条件。

杂交中使用市售的试剂盒时，例如，可使用Alkphos Direct LabellingReagents(Amersham Pharmacia公司制)。此时，根据试剂盒中附带的说明方案，与标记了的探针温育整夜后，将膜在55℃的条件下，用含有0.1％(w/v)SDS的首次洗涤缓冲液洗涤，之后检测杂交后的多核苷酸(例如DNA)。

其它可杂交的多核苷酸包括与编码序列号：2的氨基酸序列的多核苷酸有约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2或％以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上同一性的多核苷酸，上述同一性例如是通过FASTA、BLAST等同源性搜索软件，使用默认参数(default parameter)所计算得。

氨基酸序列或碱基序列的同一性，可使用根据Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873，1993)而确定。开发了基于BLAST算法、被称为BLASTN、BLASTX的程序(Altschul SF，et al：J.Mol.Biol.215：403，1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，参数例如为score＝100、wordlength＝12。使用BLASTX分析氨基酸序列时，参数例如为score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各程序的默认参数。

而且，本发明的多核苷酸包含(j)编码具有与上述(5)中所述多核苷酸(DNA)的转录产物互补的碱基序列的RNA的多核苷酸；(k)编码通过RNAi作用抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表达的RNA的多核苷酸；(1)编码具有特异性切割上述(5)中所述多核苷酸(DNA)转录产物活性的RNA的多核苷酸；以及(m)编码通过共抑制作用抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表达的RNA的多核苷酸。这些多核苷酸可被整合进载体，而且可在导入了该载体的转化细胞中抑制上述(a)～(i)的多核苷酸(DNA)的表达。因此，可优选用于适合抑制上述多核苷酸(DNA)表达的场合。

本文中，“编码具有与DNA转录产物互补的碱基序列的RNA的多核苷酸”，是指所谓的反义DNA。反义技术作为抑制特定的内源性基因表达的方法而公知，且在种种文献中均有记载[例如，参照平岛及井上：新生化学实验讲座2核酸IV基因的复制和表达(日本生化学会编，东京化学同人)pp.319-347，1993等][平島および井上：新生化学実験講座2核酸IV遺伝子の複製と発现(日本生化学会编，東京化学同人)pp.319-347，1993など]。反义DNA的序列是优选与内源性基因或其一部分互补的序列，但只要能有效抑制基因的表达，即使不完全互补也可以。被转录的RNA与靶基因的转录产物优选具有90％以上，更优选具有95％以上的互补性。反义DNA的长度至少为15个碱基或以上，优选100个碱基或以上，更优选500个碱基或以上。

本文中，“编码通过RNAi作用抑制DNA表达的RNA的多核苷酸”，是指用于通过RNA interference(RNAi)抑制内源性基因表达的多核苷酸。“RNAi”是指将具有与靶基因序列同一或类似的序列的双链RNA导入细胞内时，导入的外源基因及内源性靶基因的表达均被抑制的现象。此处使用的RNA，例如可为21～25碱基长度的、且可产生RNA干扰的双链RNA，例如，dsRNA(double strand RNA)、siRNA(small interfering RNA)或shRNA(shorthairpin RNA)。此种RNA可通过脂质体等的运输系统向所需位点局部运输，或使用产生上述双链RNA的载体使其局部表达。此种双链RNA(dsRNA、siRNA或shRNA)的制备方法、使用方法等已由许多文献公开(参照日本特表2002-516062；US2002/086356A；Nature Genetics，24(2)，180-183，2000 Feb.；Genesis，26(4)，240-244，2000 April；Nature，407：6802，319-20，2002 Sep.21；Genes & Dev.，Vol.16，(8)，948-958，2002 Apr.15；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，99(8)，5515-5520，2002 Apr.16；Science，296(5567)，550-553，2002 Apr.19；ProcNatl.Acad.Sci.USA，99：9，6047-6052，2002 Apr.30；Nature Biotechnology，Vol.20(5)，497-500，2002 May；Nature Biotechnology，Vol.20(5)，500-505，2002May；Nucleic Acids Res.，30：10，e46，2002 May 15等)。

本文中，“编码具有特异性切割DNA转录产物活性的RNA的多核苷酸”一般是指核酶。核酶是指具有催化活性的RNA分子，其通过切割靶DNA的转录产物，抑制该基因的功能。核酶的设计可参照各种公知文献(例如参照FEBS Lett.228：228，1988；FEBS Lett.239：285，1988；Nucl.Acids.Res.17：7059，1989；Nature 323：349，1986；Nucl.Acids.Res.19：6751，1991；ProteinEng 3：733，1990；Nucl.Acids Res.19：3875，1991；Nucl.Acids Res.19：5125，1991；Biochem Biophys Res Commun 186：1271，1992等)。“编码通过共抑制作用抑制DNA表达的RNA的多核苷酸”，是指通过“共抑制”，阻断靶DNA功能的核苷酸。

本文中，“共抑制”是指细胞中通过转化导入与内源性靶基因具有同一或类似序列的基因，而使导入的外源基因及内源靶基因的表达均被抑制的现象。具有共抑制作用的多核苷酸的设计，可参照种种公知文献(例如，参照SmythDR：Curr.Biol.7：R793，1997、Martienssen R：Curr.Biol.6：810，1996等)。

2.本发明的蛋白质

本发明也提供由上述多核苷酸(a)～(i)中任一个编码的蛋白质。本发明的优选蛋白质包括序列号：2中的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列，且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质。

此种蛋白质包括序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了如上所述数量的氨基酸残基的氨基酸序列，且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质。且此种蛋白质包括与序列号：2的氨基酸序列具有如上所述同源性的氨基酸序列、且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质。

此种蛋白质，可使用《分子克隆》第3版、《Current Protocols in MolecularBiology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等中所述的定点诱变法获得。

本发明的蛋白质氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1个或以上的氨基酸残基，是指在同一序列中任意的1个或多个氨基酸序列的位置上，缺失、取代、插入及/或添加了1个或多个氨基酸残基，2种或2种以上类型的缺失、取代、插入及添加也可同时发生。

以下，举例表示可相互取代的氨基酸残基。同一组中包含的氨基酸残基可相互取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基丝氨酸(o-methylserine)、叔丁基甘氨酸(t-butyl glycine)、叔丁基丙氨酸(t-butyl alanine)、环己基丙氨酸(cyclohexyl alanine)；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸(isoglutamic acid)、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸(2-aminosuberic acid)；C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯丙氨酸、酪氨酸。

本发明的蛋白质可通过Fmoc法(fluorenylmethoxycarbonyl)、tBoc法(t-Butyl Oxy Carbonyl)等的化学合成法制造。也可利用Advanced Chem Tech公司制、珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司制、Pharmacia公司制、ProteinTechnology Instruments公司制、Synthecell-Vega公司制、PerSeptive公司制、Shimazu公司制的肽合成仪进行化学合成。

3.本发明的载体及导入了该载体的转化酵母

其次，本发明提供含有上述多核苷酸的载体。本发明的载体含有上述(a)～(i)中所述的任一多核苷酸(例如DNA)。本发明的载体通常包括表达盒，该表达盒包括如下构成因子：(x)在酵母细胞内可转录的启动子；(v)与该启动子以正义方向或反义方向结合的、上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(例如DNA)；以及(z)含有与RNA分子的转录终止及多聚腺苷酸化有关的、在酵母中起作用的信号。在含有上述(i)～(m)中任一项所述的多核苷酸的载体中导入这些多核苷酸，使这些多核苷酸表达。本发明中，通过破坏上述靶基因(DNA)，可抑制上述DNA的表达或上述蛋白质的表达。基因的破坏，可通过对参与靶基因中基因产物表达的区域，例如向编码区域、启动子区域等添加或缺失单个或多个碱基，或使这些区域的全体缺失来进行。此种基因破坏的方法，可参照公知的文献[例如，参照Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，4951(1979)、Methods in Enzymology，101，202(1983)、日本特开平6-253826号公报等]。

导入酵母时使用的载体，可利用多拷贝型(YEp型)、单拷贝型(YCp型)、染色体整合型(YIp型)中的任一种。例如，YEp型载体的YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，Academic Press，New York，83，1983)、YCp型载体的YCp50(M.D.Rose et al.，gene，60，237，1987)、YIp型载体的YIp5(K.Stmhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035，1979)均为已知，且易获得。

用于调节酵母中基因表达的启动子/终止子可任意组合，前提是所述组合能在酿造用酵母中起作用，同时又不受发酵液中成分的影响，。例如可利用3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子等。这些基因已被克隆，例如在M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中有详细的记载，并且可通过已知方法很容易地获得。

因酿造用酵母不能利用营养缺陷型标记，所以，转化时使用的选择性标记例如可利用氨基糖苷类抗生素(Geneticin)抗性基因(G418^r)、铜抗性基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)、或浅蓝菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(分别见Junji Inokoshi et al.，Biochemistry，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991)。

如上所述构建的载体被导入宿主酵母。宿主酵母为可用于酿造的任意的酵母，例如可为啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体地说，可使用酵母属(Saccharomyces)等的酵母。在本发明中，可使用啤酒酵母，例如Saccharomyces pastorianus W34/70、Saccharomyces carlsbergensis NCYC453或NCYC456、或Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、或NBRC1954等。而且可使用威士忌酵母，例如Saccharomycescerevisiae NCYC90等；还可使用例如日本协会的葡萄酒用1号、3号、4号等的葡萄酒酵母以及例如日本协会的清酒用7号、和9号等的清酒酵母，但不限于此。本发明中，啤酒酵母例如可优选使用巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)。

酵母的转化方法，可利用一般可使用的公知的方法。例如，可使用电穿孔法(Meth.Enzymol.，194，p182(1990))、原生质球法(Spheroplast法)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978))、醋酸锂法(J.Bacteriology，153，p163(1983))、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)、Methods in yeastgenetics，2000 Edition：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中所述的方法实施，但不限于此。

更具体地说，将宿主酵母置于标准酵母营养培养基(例如YEPD培养基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等)中培养，使OD600nm值为1～6。将此培养酵母离心分离后收集、洗涤，用浓度约为1～2M的碱金属离子、优选锂离子进行预处理。将此细胞在约30℃条件下静置约60分钟后，与要导入的DNA(约1～20μg)同时在约30℃条件下再静置约60分钟。加入聚乙二醇，优选加入约4,000道尔顿的聚乙二醇，使最终浓度约为20％～50％。在约30℃下静置约30分钟后，将此细胞在约42℃条件下加热处理约5分钟。优选将此细胞悬浮液用标准酵母营养培养基洗涤后，放入所定量的新鲜标准酵母营养培养基中，并约30℃、静置约60分钟。之后，接种到含有作为选择性标记使用的抗生素或其类似物的标准琼脂培养基中，获得转化体。

其他有关一般性的克隆技术，可参照(《Molecular Cloning(分子克隆)》第3版)、“Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual(Cold Spring HarborLaboratory Press、Cold Spring Harbor，NY)”等。

4.本发明的酒精饮料制造方法及根据其制法获得的酒精饮料

将上述本发明的载体导入适合酿造所需酒精饮料产品的酵母中，并可通过使用该酵母制造所需要的且减少了VDK、特别是DA生成量的香味优异的酒精饮料。具体地说，可通过使用上述导入了本发明的载体的酵母，上述抑制了本发明的多核苷酸(DNA)表达的酵母或由下述本发明的酵母评价方法选择的酵母，进行用于酒精饮料制造的发酵，降低VDK生成量、特别是DA生成量，从而制造出所需要的且VDK含量、特别是DA含量降低了的酒精饮料。作为制造对象的酒精饮料包括但不限于例如啤酒、发泡酒(happoushu)等的啤酒味饮料、葡萄酒、威士忌、清酒等。

制造上述酒精饮料时，除使用本发明中所得到的酿造酵母来代替亲株以外，可利用公知的方法。由于原料、制造设备、生产质量控制等可与常规方法完全相同，所以不会因制造浓度降低了的VDK、特别是DA生成量的酒精饮料而增加成本。即根据本发明，可在使用已有设备、不减少成本的情况下，制造出香味优异的酒精饮料。

5.本发明的酵母的评价方法

本发明涉及使用根据具有序列号：1碱基序列的乙酰乳酸合成酶基因的碱基序列而设计的引物或探针，评价被检酵母的总VDK或总DA生产能力的方法。此种评价方法的一般方法为公知，例如，在WO 01/040514号公报、日本特开平8-205900号公报等中有记载。以下，就此评价方法进行简单说明。

首先，制备被检酵母的基因组。制备方法可使用Hereford法、醋酸钾法等公知的任何方法[例如，Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，p130(1990)]。使用根据乙酰乳酸合成酶基因的碱基序列(优选ORF序列)设计的引物或探针，测定被检酵母的基因组中是否存在其基因或其基因的特异性序列。引物或探针的设计可使用公知的方法进行。

基因或特异性序列的检测，可使用公知的方法进行。例如，将含有特异性序列的一部分或全部的多核苷酸或含有其碱基序列的互补碱基序列的一部分或全部多核苷酸作为一个引物使用，另一个引物使用含有此序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或含有其碱基序列的互补碱基序列的一部分或全部多核苷酸，通过PCR法扩增酵母的核酸，并测定扩增物的有无、扩增物分子量的大小等。用于引物的多核苷酸的碱基数通常为10bp或以上，优选为15～25bp。且夹在两引物间的碱基数，通常为300～2000bp较适当。

PCR法的反应条件无特别限定，例如，可使用变性温度：90～95℃、退火温度：40～60℃、延伸温度：60～75℃、循环数：10次或以上等的条件。所得到的反应生成物可使用琼脂糖凝胶等的电泳法等分离，测定扩增产物的分子量。根据此方法，通过扩增产物的分子量是否是含有特异部分的DNA分子的大小，来预测、评价其酵母的总连二酮(VDK)的生产能力或总双乙酰(DA)的生产能力。且通过分析扩增物的碱基序列，可更进一步准确地预测、评价上述性能。

本发明中，可通过培养被检酵母，测定具有序列号：1碱基序列的乙酰乳酸合成酶基因的表达量，评价被检酵母的总连二酮(VDK)生产能力或总双乙酰(DA)生产能力。此时，乙酰乳酸合成酶基因表达量的测定，可通过培养被检酵母，对乙酰乳酸合成酶基因的产物mRNA或蛋白质定量进行。mRNA或蛋白质的定量，可使用公知的方法。mRNA的定量例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR等，蛋白质的定量例如可通过Western印迹法进行(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons1994-2003)。

而且，可通过培养被检酵母，测定具有序列号：1碱基序列的乙酰乳酸合成酶基因的表达量，选择其基因表达量与总连二酮(VDK)的目标生产能力或总双乙酰(DA)的目标生产能力相应的酵母，借此来选择适合所需酒精饮料酿造的酵母。也可通过培养标准酵母(例如基因组解读株Saccharomycespastorianus Weihenstephan 34/70株)及被检酵母，测定并比较各酵母中基因的表达量，由此选择适宜的被检酵母。更具体而言，例如培养标准酵母和一种或多种被检酵母，测定具有序列号：1碱基序列的基因在各酵母中的表达量，选择该基因的表达低于标准酵母的被检酵母，借此来选择适合酒精饮料酿造的酵母。

或者，可通过培养被检酵母，选择总连二酮(VDK)生产能力或总双乙酰(DA)生产能力低的酵母，来选择适合所需酒精饮料酿造的被检酵母。

此时，被检酵母或标准酵母，例如可使用上述导入了本发明载体的酵母、上述抑制了本发明多核苷酸(DNA)表达的酵母、上述抑制了本发明的蛋白质表达的酵母、实施了突变处理的酵母、自发突变的酵母等。VDK或DA的生产能力，可使用公知的方法测定。例如，总连二酮量的定量可通过Drews etal.，Mon.fur Brau.，34，1966中所述的方法进行。总双乙酰量的定量，例如可通过J Agric Food Chem.50(13)：3647-53，2002中所述的方法进行。乙酰乳酸合成酶活性，可通过Pang等的方法[Biochemistry，38，5222-5231(1999)]测定。突变处理，例如可使用紫外线照射、放射线照射等的物理方法，通过EMS(Ethylmethanesulfonate)、N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine)等药剂处理的化学方法等的任何方法进行(例如，参照大岛泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、p67-75、学会出版中心等)(日语原文名称；大泰治编著、生物化学実験法39酵母分子遺伝学実験法、p67-75、学会出版センタ一など)。

可作为标准酵母、被检酵母使用的酵母，可例举为包括酿造时可使用的任意的酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体地说，可例举为酵母属(Saccharomyces)等的酵母[例如，巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)、Saccharomyces cerevisiae、及Saccharomyces carlsbergensis)]。在本发明中，可使用啤酒酵母例如Saccharomyces pastorianus W34/70等，Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、或NCYC456等，或Saccharomycescerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、或NBRC1954等。而且还可使用如下酵母：威士忌酵母，例如Saccharomyces cerevisiae NCYC90等；例如日本协会葡萄酒用1号、3号和4号等的葡萄酒酵母；例如日本协会清酒用7号和9号等的清酒酵母，但不限于此。本发明中，啤酒酵母例如可优选使用巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。标准酵母、被检酵母可从上述酵母中以任意组合选择。

实施例

以下，通过实施例详细叙述本发明，但本发明不限于以下实施例。

实施例1：新型乙酰乳酸合成酶基因(non-ScILV2)的克隆

使用日本特开2004-283169中记载的比较数据库的检索结果，发现了啤酒酵母中特有的新型乙酰乳酸合成酶基因non-ScILV2(序列号：1)。以所得到的碱基序列信息为基础，分别设计用于扩增各自全长基因的引物non-ScILV2_F(序列号：3)/non-ScILV2_R(序列号：4)，以基因组解读株Saccharomyces pastorianus Weihenstephan W34/70株的染色体DNA为模板，通过PCR，获得了含有nonScILV2全长基因的DNA片段。

将如上所述得到的non-ScILV2基因片段通过TA克隆插入到pCR2.1-TOPO载体[Invitrogen公司制]。将non-ScILV2基因的碱基序列用Sanger方法(F.Sanger，Science，214：1215，1981)进行分析，以确认碱基序列。

实施例2：啤酒试验酿造中non-ScILV2基因表达分析

使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株进行啤酒试验酿造，将从发酵中的啤酒酵母菌体中提取的mRNA用酵母DNA微阵列检测。

麦芽汁浸出物浓度       12.69％

麦芽汁容量             70L

麦芽汁溶解氧浓度       8.6ppm

发酵温度               15℃

酵母投入量             12.8×10⁶细胞/mL

对发酵液经时取样，观察酵母生长量(图1)和表观浸出物浓度(图2)的经时变化。与此同时对酵母菌体取样以用于制备mRNA，对所制备的mRNA进行生物素标记，使其与啤酒酵母DNA微阵列杂交。信号检测使用GeneChip Operating System[GCOS；GeneChip Operating Software 1.0，AFFYMETRIX公司制]进行。Non-ScILV2基因表达模式如图3所示。由此结果，可确认在通常的啤酒发酵中non-ScILV2基因进行了表达。

实施例3：使用了实验室所设计的酵母菌株的nonScILV2的补充试验

用内源性ILV2基因遭到破坏的实验室所设计的酵母菌株确认了nonScILV2基因产物作为乙酰乳酸合成酶起作用。

根据文献[Goldstein et al.，yeast.151541(1999)]的方法，以含有抗药性标记的质粒[pAG25(natl)]为模板，通过PCR，制备了用于破坏ILV2基因的片段。所使用的引物的序列如序列号：5、6所示。使用此片段，用日本特开平07-303475中所述的方法转化了S.cerevisiae X2180-1A株，并用含有nourseothricin 50mg/L的YPD平板培养基(1％酵母浸出物、2％多聚蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂)进行选择。将所得到的ILV2破坏株用不含缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的SC平板培养基[0.67％无氨基酸的酵母氮源、0.2％氨基酸混合物(除缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸以外)、2％葡萄糖、2％琼脂]接种，在30℃下培养3日，确认为支链氨基酸缺陷型菌株(图4-a)。

其次，将实施例1中所述的nonScILV2/pCR2.1-TOPO用限制性内切酶SacI及NotI酶切，制备了含有蛋白质编码区域全长的DNA片段。将此片段与用限制性内切酶SacI及NotIA处理的pYCGPYNot连接，构建了nonScILV2高表达载体nonScILV2/pYCGPYNot。pYCGPYNot是YCp型的酵母表达载体，导入的基因通过丙酮酸激酶PYK1的启动子高表达。酵母中的选择性标记包含氨基糖苷类抗生素(Geneticin)抗性基因G418^r，大肠杆菌中的选择性标记包含氨苄青霉素抗性基因Amp^r。

把制备的高表达载体导入ILV2基因破坏株(X2180-1A ILV2::natl)，用RT-PCR确认nonScILV2在转化体中的高表达。作为对照，制备了不含有插入片段的pYCGPYNot的导入株。用不含有缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的SC平板培养基评价这些菌株。结果证明，nonScILV2的导入形成了支链氨基酸非缺陷型菌株(图4-b、表1)，即nonScILV2基因产物作为乙酰乳酸合成酶起作用。

表1

菌株	SC(-Leu，Ile，Val)平板培养基上的生长发育
		亲株(X2180-1A)	生长发育
ILV2破坏株(X2180-1AILV2::nat)	未生长发育
		ILV2破坏株(X2180-1A ILV2::nat)+pYCGPYNotI(无插入片段)	未生长发育
ILV2破坏株(X2180-1AILV2::nat)+nonScILV2/pYCGPYNotI	生长发育

实施例4：nonScILV2基因的破坏

按照文献(Goldstein et al.，yeast.15 1541(1999))的方法，以含有抗药性标记的质粒(pFA6a(G418r)，pAG25(natl)，pAG32(hph))为模板，通过PCR，制备了基因破坏用片段。用于PCR的引物由nonScILV2_delta_for(序列号：7)和nonScILV2_delta_rv(序列号：8)组成。

用上述方法制备的基因破坏用片段转化从啤酒酵母Saccharomycespastorianus W34/70株分离的孢子克隆株(W34/70-2)。用日本特开平07-303475号公报中所述的方法进行转化，用含有氨基糖苷类抗生素(Geneticin)300mg/L、Nourseothricin 50mg/L或潮霉素B(Hygromycin B)200mg/L的YPD平板培养基(1％酵母浸出物、2％多聚蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂)选择转化体。

实施例5：啤酒试验酿造中VDK生产量的解析

使用亲株及用实施例4得到的non-ScILV2破坏株，按以下条件进行发酵试验。

麦芽汁浸出物浓度     12％

麦芽汁容量           1L

麦芽汁溶解氧浓度     约8ppm

发酵温度             15℃恒定

酵母投入量           5g湿酵母菌体/L麦芽汁

对发酵液经时取样，观察酵母生长量(OD660)、浸出物消耗量的经时变化。使VDK(DA及PD)与羟胺反应，其生成的乙二肟衍生物与2价铁离子反应生成复合物，通过测定此复合物的吸光度，进行发酵液中总VDA的定量(Drews et al.，Mon.fur Brau.，34，1966)。此时，通过将前体物质的α-乙酰乳酸及α-乙酰羟基丁酸预先用气体洗涤法(氧化脱羧反应)分别转换为DA、PD，即可求出含有上述物质的总VDK量。

根据本发明的酒精饮料制造法，可降低产品中不良味道的VDK、特别是DA的生产量，从而易于制造出香味优异的酒精饮料。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>三得利株式会社(Suntory Limited)

<120>编码乙酰乳酸合成酶的基因及其用途

(Gene encoding acetolactate synthase and use thereof)

<130>G06-0084CN

<150>JP2006-047558

<151>2006-02-23

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2064

<212>DNA

<213>酵母属(Saccharomyces sp.)

<400>1

atgatcagac agtccacact caagaacttc gctattaagc gttgcttcca acaaatggca     60

taccgtaaca cacctgctat gagatcagtc gccctcgcgc aacgctttta tagttcatct    120

tcccgttatt atagtgcgtc tccattgcca gcttccaata gaccggaacc agccccaagt    180

ttcaacgtcg agccagtggc acaggtgccc gagccttcta aactggccaa gagactacgc    240

actgagcctg acatggacac atcctttgtc ggcttaactg gtggtcaaat attcaatgaa    300

atgatgtcta gacataatgt cgacactgta tttggctatc caggtggtgc tatcttgcct    360

gtgtatgatg ccatccacaa cagtgacaaa tttactttcg tcttaccaag acacgaacaa    420

ggtgctggcc acatggccga aggttatgcc agagcctctg gtaaaccagg tgttgtcttg    480

gtgacctccg gtccaggtgc tactaacgtc attactccaa tggcagatgc cttcgcagac    540

ggtattccaa tggtcgtttt tacagggcaa gtgccaacta gtgccatcgg taccgatgcc    600

ttccaagaag ccgatgttgt cggtatttcc agatcctgta ccaagtggaa tgtcatggca    660

aaaaccgtgg aagaattgcc attgcgtatc aacgaagctt ttgaaattgc cactagtggt    720

agaccaggtc ccgtcttggt tgacttacca aaggacgtca cagcggccat tttaagaaac    780

ccaattccaa caaaaactac tttgccatca aatgcgctaa accaattaac tagtcgtaca    840

caggatgagt tcgttttgca aaacatcaat agagcagcag atttgattaa tttggcaaag    900

aagcctgttt tatacgtcgg tgcaggtatt ttaaaccatg ctgatggtcc aagattacta    960

aaagagttaa gtgaccgtgc acaaataccc gttacaacta ctttgcaagg tttgggtgct   1020

ttcgaccaag acgatccaaa atcccttgat atgttaggta tgcatggctg tgccactgct   1080

aacttggcgg tacaaaatgc ggatttgcta attgctgtag gtgctagatt cgatgatcgt   1140

gtcaccttga atatcgctaa atttgcacca gaggcccgtc gtgctgctgc tgaaggcaga   1200

ggtggtatta tccattttga agttagcccc aaaaacataa acaaggtcgt ggagactcaa   1260

atagcggtgg aaggtgacgc tactgggaat ttggataaaa tgatgccaaa aatctttcca   1320

gtaaaggaga gatcagagtg gtttggtcaa ataaacgaat ggaagaagaa atacccatac   1380

gcttacatga tggaaactcc aggatctaaa ataaaaccac aaacagtcat aacaaaacta   1440

tccaagatcg ccaacgacac aggaagacat gttatagtca caaccggtgt cgggcaacat   1500

caaatgtggg ctgcccaaca ctggacatgg aaaaccccac gtaccttcat cacatcaggt   1560

ggtttaggta caatgggtta cggtcttcca gccgccatcg gcgctcaagt cgctaaacca   1620

gattctttgg ttattgacat tgatggtgat gcatctttca acatgacctt gaccgaattg   1680

agttctgccg tccaagctgg tactccagtg aagatcttgg ttttgaacaa tgaagaacaa   1740

ggtatggtta ctcaatggca atcactattt tacgagaatc gttattctca cacacatcag   1800

ttgaaccctg atttcataaa actagccgac gctatgggtc taaagggttt aagagtcaaa   1860

aagcaagaag aattagatgc taaattgaaa gaatttgttt ccacaaaggg ccctgtcttg   1920

cttgaagtgg aagttgacaa aaaagttcct gttttgccaa tggttccagc aggcaagggt   1980

ctagatgagt tcatatactt tgatccagag gttgaaagac aacaaaatga attacgtcac   2040

aagcgtacca atggtaagca ttga                                          2064

<210>2

<211>687

<212>PRT

<213>酵母属(Saccharomyces sp.)

<400>2

Met Ile Arg Gln Ser Thr Leu Lys Asn Phe Ala Ile Lys Arg Cys Phe

1               5                   10                  15

Gln Gln Met Ala Tyr Arg Asn Thr Pro Ala Met Arg Ser Val Ala Leu

            20                  25                  30

Ala Gln Arg Phe Tyr Ser Ser Ser Ser Arg Tyr Tyr Ser Ala Ser Pro

        35                  40                  45

Leu Pro Ala Ser Asn Arg Pro Glu Pro Ala Pro Ser Phe Asn Val Glu

    50                  55                  60

Pro Val Ala Gln Val Pro Glu Pro Ser Lys Leu Ala Lys Arg Leu Arg

65                  70                  75                  80

Thr Glu Pro Asp Met Asp Thr Ser Phe Val Gly Leu Thr Gly Gly Gln

                85                  90                  95

Ile Phe Asn Glu Met Met Ser Arg His Asn Val Asp Thr Val Phe Gly

            100                 105                 110

Tyr Pro Gly Gly Ala Ile Leu Pro Val Tyr Asp Ala Ile His Asn Ser

        115                 120                 125

Asp Lys Phe Thr Phe Val Leu Pro Arg His Glu Gln Gly Ala Gly His

    130                 135                 140

Met Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ala Ser Gly Lys Pro Gly Val Val Leu

145                 150                 155                 160

Val Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Val Ile Thr Pro Met Ala Asp

                165                 170                 175

Ala Phe Ala Asp Gly Ile Pro Met Val Val Phe Thr Gly Gln Val Pro

            180                 185                 190

Thr Ser Ala Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Ala Asp Val Val Gly

        195                 200                 205

Ile Ser Arg Ser Cys Thr Lys Trp Asn Val Met Ala Lys Thr Val Glu

    210                 215                 220

Glu Leu Pro Leu Arg Ile Asn Glu Ala Phe Glu Ile Ala Thr Ser Gly

225                 230                 235                 240

Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Leu Pro Lys Asp Val Thr Ala Ala

                245                 250                 255

Ile Leu Arg Asn Pro Ile Pro Thr Lys Thr Thr Leu Pro Ser Asn Ala

            260                 265                 270

Leu Asn Gln Leu Thr Ser Arg Thr Gln Asp Glu Phe Val Leu Gln Asn

        275                 280                 285

Ile Asn Arg Ala Ala Asp Leu Ile Asn Leu Ala Lys Lys Pro Val Leu

    290                 295                 300

Tyr Val Gly Ala Gly Ile Leu Asn His Ala Asp Gly Pro Arg Leu Leu

305                 310                 315                 320

Lys Glu Leu Ser Asp Arg Ala Gln Ile Pro Val Thr Thr Thr Leu Gln

                325                 330                 335

Gly Leu Gly Ala Phe Asp Gln Asp Asp Pro Lys Ser Leu Asp Met Leu

            340                 345                 350

Gly Met His Gly Cys Ala Thr Ala Asn Leu Ala Val Gln Asn Ala Asp

        355                 360                 365

Leu Leu Ile Ala Val Gly Ala Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Leu Asn

    370                 375                 380

Ile Ala Lys Phe Ala Pro Glu Ala Arg Arg Ala Ala Ala Glu Gly Arg

385                 390                 395                 400

Gly Gly Ile Ile His Phe Glu Val Ser Pro Lys Asn Ile Asn Lys Val

                405                 410                 415

Val Glu Thr Gln Ile Ala Val Glu Gly Asp Ala Thr Gly Asn Leu Asp

            420                 425                 430

Lys Met Met Pro Lys Ile Phe Pro Val Lys Glu Arg Ser Glu Trp Phe

        435                 440                 445

Gly Gln Ile Asn Glu Trp Lys Lys Lys Tyr Pro Tyr Ala Tyr Met Met

    450             455                     460

Glu Thr Pro Gly Ser Lys Ile Lys Pro Gln Thr Val Ile Thr Lys Leu

465             470                     475                 480

Ser Lys Ile Ala Asn Asp Thr Gly Arg His Val Ile Val Thr Thr Gly

                485                     490                 495

Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln His Trp Thr Trp Lys Thr

            500                 505                 510

Pro Arg Thr Phe Ile Thr Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly Tyr Gly

        515                  520                 525

Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Gln Val Ala Lys Pro Asp Ser Leu Val

   530                  535                 540

Ile Asp Ile Asp Gly Asp Ala Ser Phe Asn Met Thr Leu Thr Glu Leu

545                 550                 555                 560

Ser Ser Ala Val Gln Ala Gly Thr Pro Val Lys lle Leu Val Leu Asn

                565                 570                 575

Asn Glu Glu Gln Gly Met Val Thr Gln Trp Gln Ser Leu Phe Tyr Glu

            580                 585                 590

Asn Arg Tyr Ser His Thr His Gln Leu Asn Pro Asp Phe Ile Lys Leu

        595                 600                 605

Ala Asp Ala Met Gly Leu Lys Gly Leu Arg Val Lys Lys Gln Glu Glu

    610                 615                 620

Leu Asp Ala Lys Leu Lys Glu Phe Val Ser Thr Lys Gly Pro Val Leu

625                 630                 635                 640

Leu Glu Val Glu Val Asp Lys Lys Val Pro Val Leu Pro Met Val Pro

                645                 650                 655

Ala Gly Lys Gly Leu Asp Glu Phe Ile Tyr Phe Asp Pro Glu Val Glu

            660                 665                 670

Arg Gln Gln Asn Glu Leu Arg His Lys Arg Thr Asn Gly Lys His

        675                 680                 685

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>3

gagctctaga aatccactcg ccaa      24

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>4

ggatcctcaa tgcttaccat tggtac    26

<210>5

<211>120

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>5

atgatcagac aatctacgct aaaaaacttc gctattaagc gttgctttca acatatagca     60

taccgcaaca cacctgccat gagatcagta gctctcgcgc ccttgacagt cttgacgtgc    120

<210>6

<211>120

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>6

ttcagtgctt accgcctgta cgcttatgac gtaattcagt ctgttgtctt tcaacttctg     60

ggtcaaaatt tatgaactcg tctagaccgc taccacctgc cgcacttaac ttcgcatctg    120

<210>7

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>7

attgcattaa catagtctat acgcatagga gaaaacacac aatagaaatc cactcgccaa     60

ccttgacagt cttgacgtgc                                                 80

<210>8

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>8

tataagcatg gttaaataat aattaagtct aaatttttaa tggagaatgt gtttcagact    60

cgcacttaac ttcgcatctg                                                80

Claims (23)

1.多核苷酸，其选自由以下(a)～(f)组成的群组：

(a)含有由序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸的多核苷酸；

(b)含有编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；

(c)含有编码由序列号：2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的，且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；

(d)含有编码具有与序列号：2的氨基酸序列有60％或60％以上同一性的氨基酸序列，且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；

(e)含有与序列号：1的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交，且编码具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；以及

(f)含有与编码序列号：2氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸序列互补的多核苷酸在严格条件下杂交，且编码具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。

2.权利要求1中所述的多核苷酸，其选自由以下(g)～(i)组成的群组：

(g)编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质或编码序列号：2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1～10个氨基酸的氨基酸序列组成的且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸；

(h)编码与序列号：2的氨基酸序列具有90％或90％以上同一性的氨基酸序列，且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸的；以及

(i)与序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸或与序列号：1的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸在高严格条件下杂交，且编码具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质的多核苷酸。

3.权利要求1中所述的多核苷酸，其含有由序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸。

4.权利要求1中所述的多核苷酸，其含有编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。

5.权利要求1～4中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA。

6.多核苷酸，其选自由以下(j)～(m)组成的群组：

(j)编码具有权利要求5中所述多核苷酸(DNA)的转录产物互补的碱基序列的RNA的多核苷酸；

(k)编码通过RNAi作用而抑制权利要求5中所述多核苷酸(DNA)表达的RNA的多核苷酸；

(l)编码具有特异性切割权利要求5中所述多核苷酸(DNA)转录产物活性的RNA的多核苷酸；以及

(m)编码通过共抑制作用而抑制权利要求5中所述多核苷酸(DNA)表达的RNA的多核苷酸。

7.蛋白质，其由权利要求1～5中任一项所述的多核苷酸所编码。

8.载体，其含有权利要求1～5中任一项所述的多核苷酸。

9.载体，其含有权利要求6中所述的多核苷酸。

10.酵母，其中导入了权利要求8或9中所述的载体。

11.权利要求10中所述的酵母，其通过导入权利要求8或9中所述的载体，降低总连二酮的生产能力或总双乙酰的生产能力。

12.权利要求11中所述的酵母，其通过使权利要求7中所述的蛋白质的表达量减少，降低总连二酮的生产能力或总双乙酰的生产能力。

13.酵母，其通过导入权利要求8或9中所述的载体，或通过破坏与权利要求5中所述多核苷酸(DNA)有关的基因，抑制权利要求5中所述多核苷酸(DNA)的表达。

14.酒精饮料的制造方法，其包括培养权利要求10～13中任一项所述的酵母。

15.权利要求14中所述的酒精饮料的制造方法，其中所酿造的酒精饮料是麦芽饮料。

16.权利要求14中所述的酒精饮料的制造方法，其中所酿造的酒精饮料是葡萄酒。

17.酒精饮料，其用权利要求14～16中任一项所述的方法制造。

18.评价被检酵母的总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力的方法，其包括使用根据具有序列号：1碱基序列的乙酰乳酸合成酶基因的碱基序列而设计的引物或探针。

19.评价被检酵母的总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力的方法，其包括：培养被检酵母；以及测定具有序列号：1碱基序列的乙酰乳酸合成酶基因的表达量。

20.酵母的选择方法，其包括：培养被检酵母；对权利要求7中所述的蛋白质定量或测定具有序列号：1碱基序列的乙酰乳酸合成酶基因的表达量；以及根据目标总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力选择具有所述蛋白质生成量或所述基因表达量的被检酵母。

21.权利要求20中所述的酵母的选择方法，其包括：培养标准酵母及被检酵母；测定具有序列号：1的碱基序列的乙酰乳酸合成酶基因在各酵母中的表达量；以及选择该基因的表达量低于标准酵母的被检酵母。

22.权利要求20中所述的酵母的选择方法，其包括：培养标准酵母及被检酵母；对各酵母中的权利要求7中所述的蛋白质定量；以及选择该蛋白质的量比标准酵母少的被检酵母。

23.酒精饮料的制造方法，其包括：使用权利要求10～13中任一项所述的酵母或通过权利要求20～22中任一项所述的方法选择的酵母，进行用于酒精饮料制造的发酵；以及调节总连二酮的生产能力或总双乙酰的生产能力。

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