CN101024837A

CN101024837A - 酰基CoA:乙醇O－酰基转移酶/酯酶基因及其用途

Info

Publication number: CN101024837A
Application number: CNA200610163513XA
Authority: CN
Inventors: 中尾嘉宏; 儿玉由纪子; 下永朋子
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2006-02-24
Filing date: 2006-11-29
Publication date: 2007-08-29
Also published as: EP1987140A1; US20090246317A1; KR20090003253A; JP2009527216A; AU2006338870A1; CA2632324A1; WO2007097091A1

Abstract

本发明涉及酰基CoA：乙醇O－酰基转移酶/酯酶基因及其用途，特别涉及制造香味良好的酒类的酿造酵母、使用该酵母制造的酒类、其制造方法等。更加具体地说，本发明涉及编码酿造酵母的酰基CoA：乙醇O－酰基转移酶/酯酶Ehtlp的基因EHT1，特别涉及通过控制啤酒酵母的特征基因nonScEHT1的表达量来控制赋予产品香味的酯的生成能力的酵母、使用该酵母的酒类的制造方法等。

Description

酰基CoA:乙醇O－酰基转移酶/酯酶基因及其用途

技术领域

本发明涉及酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶基因及其用途，特别涉及制造香味良好的酒类的酿造酵母、使用该酵母制造的酒类、其制造方法等。更加具体地说，本发明涉及编码酿造酵母的酰基CoA：乙醇0-酰基转移酶/酯酶Ehtlp的基因EHT1，特别涉及通过控制啤酒酵母的特征nonScEHT1基因的表达量，来控制赋予产品香味的酯的生成能力的酵母、使用该酵母的酒类的制造方法等。

背景技术

酒类中酯是重要的香味成分之一，已知清酒、葡萄酒、威士忌等中酯的增加会使酒香浓郁，提高感官评价。另一方面，对于啤酒来说，酯虽然是重要的香气成分，但过剩的酯会因酯臭而不受欢迎。因此，根据酒的种类的不同而适度控制酯生成量是重要的。

到目前为止，以提高酒的酯含量为目的，对高产酯酵母进行育种。已报道有下述方法，即，为了有效分离对酵母实施突变处理(或不实施突变处理)的高产酯酵母，利用含有阻断浅蓝菌素等脂肪酸合成酶的药剂的培养基，取得具有己酸高产能力的菌株的方法，以及利用含有5，5，5-三氟-DL-亮氨酸等亮氨酸类似物的培养基，取得异戊醇、乙酸异戊酯高产菌株的方法(日本国特开2002-253211号公报)；利用含有具有3位羟基化的孕烷骨架的类固醇的培养基，取得繁殖的菌株的方法(日本国特开2002-191355号公报)等。

另一方面，利用基因操作技术的酵母育种方法有如下报道：如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的醇乙酰转移酶基因ATF1在酿造用酵母中的高表达例子(日本国特开平06-062849号公报)、抑制ATF1表达的例子(日本国特开平06-253826号公报)、破坏酿造用酵母的酯酶基因EST2从而增加酯量的例子(日本国特开平09-234077号公报)。另外，有报告指出通过破坏酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶基因EHT1，中链脂肪酸酯减少(J.Biol.Chem.281：4446-4456，2006)。另一方面，有报告指出通过破坏EHT1，乙酸酯增加(ASBC2002 meeting AbstractP-6[online]intemet<URL：http://www.asbcnet.org/Meetings/2002/Abstracts/P-6.htm>)。

发明内容

如上所述，为了增加产品中的酯含量，实施各种措施而取得突变株，但其结果有时会出现无法预料的发酵迟缓、不期望要的香味成分增加等情况，使其成为实用酵母还存在问题。因此，期望得到不影响发酵速度、不损坏产品质量、能够生产期望量的酯的酵母的育种方法。

本发明者们为了解决上述课题进行了积极研究，结果从啤酒酵母中成功分离、鉴定出编码比已知蛋白质更有效的酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶的基因。另外，确认：将得到的基因导入酵母中制作使其表达的转化酵母，乙酸酯生成量减少；另外，确认：制作抑制得到的基因表达的转化酵母，乙酸酯的生成量增加，中链脂肪酸酯的生成量减少，从而完成了本发明。

即，本发明涉及啤酒酵母中特征性存在的新型酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶基因、该基因编码的蛋白质、该基因的表达受到调节的转化酵母、通过使用该基因表达受到调节的酵母来控制产品中酯生成量的控制方法等。具体来说，本发明提供下述所示的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、导入该载体的转化酵母、使用该转化酵母的酒类制造方法等。

(1)一种多核苷酸，其是从具有下述(a)～(f)的组中选择的多核苷酸：

(a)一种多核苷酸，其中含有具有序列号1的碱基序列的多核苷酸；

(b)一种多核苷酸，其中含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有序列号2的氨基酸序列；

(c)一种多核苷酸，其中含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列，且具有酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶活性；

(d)一种多核苷酸，其中含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序列号2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列，且具有酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶活性；

(e)一种多核苷酸，其中含有一种多核苷酸，该多核苷酸在严格条件下，与具有与序列号1的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶活性的蛋白质；以及

(f)一种多核苷酸，其中含有一种多核苷酸，该多核苷酸在严格条件下，与具有与编码具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶活性的蛋白质。

(2)如上述(1)所述的多核苷酸，其从具有下述(g)～(i)的组中选择：

(g)一种多核苷酸，其中含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有序列号2的氨基酸序列或在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10个氨基酸后的氨基酸序列，且具有酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶活性；

(h)一种多核苷酸，其中含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序列号2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶活性；以及

(i)一种多核苷酸，其中含有一种多核苷酸，该多核苷酸在高严格条件下，与具有序列号1的碱基序列的多核苷酸或与具有与序列号1的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶活性的蛋白质。

(3)如上述(1)所述的多核苷酸，其中含有具有序列号1的碱基序列的多核苷酸。

(4)如上述(1)所述的多核苷酸，其中含有编码具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸。

(5)如上述(1)～(4)中任一项所述的多核苷酸，其为DNA。

(6)一种多核苷酸，其是从具有下述(j)～(m)的组中选择的多核苷酸：

(j)一种多核苷酸，其编码RNA，该RNA具有与上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物互补的碱基序列；

(k)一种多核苷酸，其编码RNA，该RNA通过RNAi效应抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表达；

(1)一种多核苷酸，其编码RNA，该RNA对上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物具有特异切割活性；以及，

(m)一种多核苷酸，其编码RNA，该RNA通过共抑制效应抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表达。

(7)一种蛋白质，其是被上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。

(8)一种载体，其中含有上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸。

(8a)上述(8)所述的载体，其中包括表达盒，该表达盒包括下述构成要素(x)～(z)：

(x)在酵母细胞内可转录的启动子；

(y)上述(1)～(3)所述的多核苷酸，其连接在该启动子的有义或反义方向；以及

(z)涉及RNA分子的转录终止及多腺苷化作用，并在酵母内起作用的信号。

(9)一种载体，其中含有上述(6)所述的多核苷酸。

(10)一种酵母，其是导入上述(8)或(9)所述的载体的酵母。

(11)如上述(10)所述的酵母，其中，通过导入上述(8)所述的载体，酯生成能力降低。

(12)一种酵母，其是通过导入上述(9)所述的载体或者通过破坏上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的基因，上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表达受到抑制的酵母。

(13)上述(11)所述的酵母，其中，通过增加上述(7)所述的蛋白质的表达量，酯生成能力降低。

(14)一种酒类的制造方法，其中，使用上述(10)～(13)中任一项所述的酵母。

(15)上述(14)所述的酒类的制造方法，其中，酿造的酒类是麦芽饮料。

(16)上述(14)所述的酒类的制造方法，其中，酿造的酒类是葡萄酒。

(17)一种酒类，其是采用上述(14)～(16)中任一项所述的方法制造的酒类。

(18)一种评价方法，其是使用根据具有序列号1的碱基序列的酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶基因的碱基序列设计的引物或探针，对被检酵母的酯生成能力进行评价的方法。

(18a)根据上述(18)所述的方法，选择出酯生成能力高或低的酵母的方法。

(18b)使用根据上述(18a)所述的方法选择的酵母，制造酒类(如啤酒)的方法。

(19)一种评价方法，其为培养被检酵母，通过测定具有序列号1的碱基序列的酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶基因的表达量，评价被检酵母的酯生成能力的方法。

(20)一种酵母的选择方法，其为培养被检酵母，对上述(7)所述的蛋白质进行定量或者测定具有序列号1的碱基序列的酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶基因的表达量，选择与目标酯生成能力相应的所述蛋白质的量或所述基因表达量的被检酵母的方法。

(20a)一种酵母的选择方法，其为培养被检酵母，测定酯生成能力或酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶的活性，选择目标酯生成能力或酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶活性的被检酵母的方法。

(21)上述(20)所述的酵母的选择方法，其为培养标准酵母和被检酵母，测定具有序列号1的碱基序列的酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶基因在各酵母中的表达量，选择与标准酵母相比该基因为高表达或低表达的被检酵母的方法。

(22)上述(20)所述的酵母的选择方法，其为培养标准酵母和被检酵母，对各酵母中的上述(7)所述的蛋白质进行定量，选择与标准酵母相比，该蛋白质的量多或少的被检酵母的选择方法，即，培养多种酵母，对各酵母中的上述(7)所述的蛋白质进行定量，选择其中该蛋白质的量多或少的被检酵母的上述(20)所述的酵母的方法。

(23)一种酒类的制造方法，其特征在于，使用上述(10)～(13)所述的酵母和根据上述(20)～(22)所述的方法选择的酵母中的任一种酵母，进行制造酒类的发酵，调节酯生成量。

附图说明

图1表示啤酒酿造试验中酵母增殖量的经时变化图，横轴表示发酵时间，纵轴表示OD660值。

图2表示啤酒酿造试验中浸出物消耗量的经时变化图，横轴表示发酵时间，纵轴表示浸出物的表观浓度(w/w％)。

图3表示啤酒酿造试验中的酵母中nonScEHT1基因的表达行为图，横轴表示发酵时间，纵轴表示检出的信号亮度。

图4表示啤酒酿造试验中酵母增殖量的经时变化图，横轴表示发酵时间，纵轴表示OD660值，EHT1表示nonScEHT1高表达株。

图5表示啤酒酿造试验中浸出物消耗量的经时变化图，横轴表示发酵时间，纵轴表示浸出物的表观浓度(w/w％)，EHT1表示nonScEHT1高表达株。

图6表示啤酒酿造试验中酵母增殖量的经时变化，横轴表示发酵时间，纵轴表示OD660值，eht1表示nonScEHT1破坏株。

图7表示啤酒酿造试验中浸出物消耗量的经时变化图，横轴表示发酵时间，纵轴表示浸出物的表观浓度(w/w％)，eht1表示nonScEHT1破坏株。

具体实施方式

本发明者们认为，通过增大或减小酵母的酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶的活性，可以控制酯的量。本发明者们在这种构思基础上进行反复研究，根据日本国特开2004-283169号公报公开的方法中解读的啤酒酵母基因组的信息，分离、鉴定出啤酒酵母特有的编码酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶的nonScEHT1基因。该碱基序列用序列号1表示。此外，由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列用序列号2表示。

1.本发明的多核苷酸

首先，本发明提供：(a)一种多核苷酸，其是含有具有序列号1的碱基序列的多核苷酸；以及(b)一种多核苷酸，其是含有编码具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA也可以是RNA。

作为本发明对象的多核苷酸，并不限定于上述编码来源于啤酒酵母的酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶基因的多核苷酸，而且还包括编码与该蛋白质具有同等功能的蛋白质的其他多核苷酸。作为具有同等功能的蛋白质，例如可以为(c)蛋白质，其具有在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列，且具有酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶活性。

此类蛋白质可以为：具有在序列号2的氨基酸序列中如缺失、取代、插入及/或添加1～100个、1～90个、1～80个、1～70个、1～60个、1～50个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、1个氨基酸残基后的氨基酸序列，且具有酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶活性的蛋白质。上述缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸残基的个数，一般优选小的数目。另外，此类蛋白质还可以为：(d)蛋白质，其具有与序列号2的氨基酸序列有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上的同一性的氨基酸序列，且具有酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶活性。上述同源性的数值一般优选大的数值。

酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶活性，例如可根据Saerens等的方法(J.Biol.Chem.281：4446-4456，2006)进行测定。

本发明还包括：(e)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该多核苷酸在严格条件下，与具有与序列号1的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶活性的蛋白质；以及(f)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该多核苷酸在严格条件下，与具有与编码具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶活性的蛋白质。

这里所述的“严格条件下进行杂交的多核苷酸”，是指将具有与序列号1的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸、或将编码序列号2的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分作为探针，使用菌落杂交法、空斑杂交法(plaquehybridizatio法)、Southem杂交法等得到的多核苷酸(如DNA)。杂交方法可以利用如Molecular Cloning 3rd Ed.，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons 1987-1997等所述的方法。

本说明书所述的“严格条件”，可以为低严格条件、中严格条件、高严格条件中的任一种。“低严格条件”，如为5×SSC、5×Dendardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件；此外，“中严格条件”，如为5×SSC、5×Dendardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件；“高严格条件”，如为5×SSC、5×Dendardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。在这些条件中，认为温度越高越能有效得到同源性高的多核苷酸(如DNA)。当然，一般认为影响杂交的严格度的因素有温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，同领域技术人员可通过适当选择这些要素，实现相同的严格度。

使用市售的试剂盒进行杂交时，如可以使用Alkphos Direct LabellingReagents(Amersham Pharmacia公司制造)。这种情况下，按照试剂盒中附带的说明书，对标记探针过夜培养，在55℃的条件下用含有0.1％(w/v)SDS的第1次洗涤缓冲液将膜洗涤后，能够检出杂交的多核苷酸(如DNA)。

除此之外，可能杂交的多核苷酸还可以为，通过FASTA、BLAST等同源性检索软件用系统设定的默认参数进行计算时，与编码序列号2的氨基酸序列的多核苷酸有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1以上％、99.2以上％、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上同一性的多核苷酸。

氨基酸序列、碱基序列的同一性，可以使用Karlin及Altschul的BLASTAlgorithm(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873，1993)来确定。以BLAST Algorithm为基础的称为BLASTN、BLASTX的程序已在开发(Altschul SF，et al：J Mol Biol 215：403，1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，如使参数为score＝100、wordlength＝12；此外使用BLASTX分析氨基酸序列时，如使参数为score＝50、wordlength＝3；使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各程序的系统设定的默认参数值。

本发明的多核苷酸还包括：(i)多核苷酸，其编码RNA，该RNA具有与上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物互补的碱基序列；(k)多核苷酸，其编码RNA，该RNA通过RNAi效应抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表达；(1)多核苷酸，其编码RNA，该RNA对上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物具有特异切割活性；以及(m)多核苷酸，其编码RNA，该RNA通过共抑制效应抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表达。将这些多核苷酸整合到载体内，进而在导入该载体的转化细胞内能够抑制上述(a)～(i)的多核苷酸(DNA)的表达。因此，能够在期望抑制上述多核苷酸(DNA)表达时优选使用。

本说明书中所述的“编码具有与DNA的转录产物互补的碱基序列的RNA的多核苷酸”，指的是反义DNA。反义技术是公知的抑制特定的内源基因表达的方法，在各种文献中都有记载(如参照：平岛及井上：新生化学实验讲座2核酸IV基因的复制和表达(日本生化学会主编，东京化学同人)pp.319-347，1993等)(平島おょび井上：新生化学実験講座2核酸IV遺伝子の複製と発现(日本生化学会编，東京化学同人)pp.319-347，1993)。反义DNA的序列，优选为与内源基因或其中一部分互补的序列，但只要能够有效抑制基因表达，不完全互补也可以。被转录的RNA，优选其与靶基因的转录产物有90％以上的互补性，更优选有95％以上的互补性。反义DNA的长度至少为15个碱基以上，优选为100个碱基以上，更优选为500个碱基以上。

本说明书中所述的“编码通过RNAi效应抑制DNA表达的RNA的多核苷酸”，指的是通过RNA interference(RNAi)来抑制内源基因表达的多核苷酸。“RNAi”是指将具有与靶基因序列相同或类似的序列的双链RNA导入细胞内，导入的外源基因及内源靶基因的表达均被抑制的现象。这里使用的RNA，例如可以是21～25碱基长的产生RNA干扰的双链RNA，如dsRNA(double strand RNA)、siRNA(small interfering RNA)或shRNA(shorthairpin RNA)。此类RNA可以通过脂质体等输送系统局部输送到所需的部位，并且使用可生成上述双链RNA的载体能够使其局部表达。这种双链RNA(dsRNA、siRNA或shRNA)的制备方法、使用方法等，在多种文献中是公知的(参照日本国特表2002-516062号公报；美国公开专利第2002/086356A号；Nature Genetics，24(2)，180-183，2000Feb.；Genesis，26(4)，240-244，2000April；Nature，407：6802，319-20，2002Sep.21；Genes&Dev.，Vol.16，(8)，948-958，2002Apr.15；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，99(8)，5515-5520，2002Apr.16；Science，296(5567)，550-553，2002Apr.19；Proc Natl.Acad.Sci.USA，99：9，6047-6052，2002 Apr.30；Nature Biotechnology，Vol.20(5)，497-500，2002 May；Nature Biotechnology，Vol.20(5)，500-505，2002 May；Nucleic Acids Res.，30：10，e46，2002 May 15等)。

本说明书中所述的“编码对DNA转录产物具有特异切割活性的RNA的多核苷酸”，一般是指酶性核酸(Ribozyme)。酶性核酸是指具有催化活性的RNA分子，通过切割靶DNA的转录产物来阻断其基因功能。关于酶性核酸的设计可以参照各种公知文献(如参照FEBS Lett.228：228，1988；FEBSLett.239：285，1988；Nucl.Acids.Res.17：7059，1989；Nature323：349，1986；Nucl.Acids.Res.19：6751，1991；Protein Eng3：733，1990；Nucl.Acids Res.19：3875，1991；Nucl.Acids Res.19：5125，1991；BiochemBiophys Res Commun186：1271，1992等)。此外，“编码通过共抑制效应抑制DNA表达的RNA的多核苷酸”，是指通过“共抑制”来阻断靶DNA功能的核苷酸。

本说明书中所述的“共抑制”，是指通过转化作用在细胞内导入具有与内源靶基因相同或类似序列的基因，导入的外源基因和内源靶基因的表达均被抑制的现象。具有共抑制效应的多核苷酸的设计也可以参照各种公知文献(例如参照Smyth DR：Curr.Biol.7：R793，1997；Martienssen R：Curr.Biol.6：810，1996等)。

2.本发明的蛋白质

本发明还提供由上述(a)～(i)中任意一种多核苷酸所编码的蛋白质。

本发明的优选蛋白质是：具有在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列，且具有酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶活性的蛋白质。

此类蛋白质可以是具有在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加上述数量的氨基酸残基后的氨基酸序列，且具有酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶活性的蛋白质。此外，此类蛋白质还可以是具有与序列号2的氨基酸序列有上述同源性的氨基酸序列，且具有酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶活性的蛋白质。

此类蛋白质可使用《Molecular Cloning第3版》、《Current Protocols inMolecular Biology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等记载的定点诱变法获得。

本发明所述的在蛋白质的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个以上的氨基酸残基，是指在同一序列中的任意且1个或多个氨基酸序列中的位置上缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸残基，并且缺失、取代、插入及添加中的2种以上可同时发生。

下面列举可互相取代的氨基酸残基。同一组中包含的氨基酸残基可互相取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、邻-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己丙氨酸；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯基丙氨酸、酪氨酸。

本发明的蛋白质也可以通过Fmoc法(芴基甲氧基羰基法)、tBoc法(叔丁氧基羰基法)等化学合成法制造。另外，也可以利用Advanced Chem Tech公司、Perkin Elmer公司、Pharmacia公司、Protein Technology Installment公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、岛津制作所等制造的肽合成仪进行化学合成。

3.本发明的载体及导入该载体的转化酵母

本发明提供含有上述多核苷酸的载体。本发明的载体含有上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)或上述(j)～(m)中任一项所述的多核苷酸。另外，本发明的载体通常包括表达盒，该表达盒包括的结构要素为：(x)在酵母细胞内可转录的启动子，(y)上述(a)～(i)所述的多核苷酸，其连接在该启动子的有义或反义方向，以及(z)涉及RNA分子的转录终止及多腺苷化作用，并在酵母内起作用的信号。在本发明中，在下述酒类(如啤酒)的酿造中，要使上述本发明的蛋白质进行高表达时，将上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)以有义方向导入该启动子，以促进这些多核苷酸(DNA)的表达。此外，在下述酒类(如啤酒)酿造中，要抑制上述本发明的蛋白质表达时，将上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)以反义方向导入该启动子，以抑制这些多核苷酸(DNA)的表达。此外，要抑制上述本发明的蛋白质表达时，也可将上述(j)～(m)中任一项所述的多核苷酸导入其能够表达的载体内。此外，在本发明中，通过破坏作为靶基因的上述基因(DNA)，可以抑制上述多核苷酸(DNA)的表达或上述蛋白质的表达。基因破坏可通过下述方式进行，即，通过在与靶基因的基因产物表达相关的区域如编码区或启动子区的内部添加或缺失一个或多个碱基，或使上述区域整体缺失来进行。上述基因破坏的方法可参照公知文献(例如参照Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，4951(1979)、Methods inEnzymology，101，202(1983)、日本国特开平6-253826号公报等)。

导入酵母时使用的载体可以是多拷贝型(YEp型)、单拷贝型(YCp型)、染色体整合型(YIp型)中的任意一种。例如作为YEp型载体，已知有YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，Academic Press，New York，83，1983)，作为YCp型载体，已知有YCp50(M.D.Rose et al.，gene，60，237，1987)，作为YIp型载体，已知有YIp5(K.Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035，1979)，且容易获得。

用于调节酵母中的基因表达的启动子/终止子，只要在酿造用酵母中起作用的同时不受醪液中的成分影响即可，可以任意组合。例如，可使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子等。这些基因都已被克隆，如在M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中有详细记载，通过已知的方法能够容易地获得。

作为转化时使用的选择性标记，因酿造用酵母不能利用营养缺陷型标记，可利用耐氨基糖苷类抗生素(Geneticin)基因(G418r)、耐铜基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)、耐浅蓝菌素基因(fas2m，PDR4)(猪腰淳嗣等，生物化学，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991)等。

把上述构建的载体导入宿主酵母内。宿主酵母可以是在酿造中使用的任何酵母，如啤酒、葡萄酒、清酒等酿造用酵母等，具体可以为酵母属(Saccharomyces)等酵母，在本发明中，可使用啤酒酵母，如巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70等、卡氏酵母(Saccharomycescarlsbergensis)NCYC453、NCYC456等、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。另外，还可使用威士忌酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NCYC90等，葡萄酒酵母如协会葡萄酒用1号、葡萄酒用3号、葡萄酒用4号等，清酒酵母如协会酵母清酒用7号、清酒用9号等，但并不限于这些酵母。在本发明中，优选使用啤酒酵母例如巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)。

酵母的转化方法可利用一般使用的公知方法。如电穿孔法“Meth.Enzym.，194，p182(1990)”、原生质体法“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75p1929(1978)”、乙酸锂法“J.Bacteriology，153，p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75p1929(1978)、Methods in yeast genetics，2000 Edition：A ColdSpring Harbor Laboratory Course Manual等所述的方法，但并不限于这些方法。

更具体地说，将宿主酵母在标准酵母营养培养基(如YEPD培养基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等)中培养至OD600nm值为1～6。将该培养酵母离心分离并收集，洗净，用浓度约为1M～2M的碱金属离子进行前处理，优选用锂离子进行前处理。上述细胞在约30℃下，静置约60分钟后，与导入的DNA(约1～20μg)同时在约30℃下，静置约60分钟。添加聚乙二醇，优选添加约4,000道尔顿的聚乙二醇，使最终浓度约为20％～50％。约30℃下静置约30分钟后，将上述细胞在约42℃下加热处理约5分钟。优选用标准酵母营养培养基将上述细胞悬浮液洗净，加入到规定量的新鲜标准酵母营养培养基中，约30℃下静置约60分钟。然后，将其接种于含有作为选择性标记使用的抗生素等的标准琼脂培养基上，获得转化体。

一般的克隆技术可参照《Molecular Cloning第3版》、“Methods in YeastGenetics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、ColdSpring Harbor，NY)”等。

4.本发明的酒类制造方法以及根据该方法制造的酒类

将上述本发明的载体导入适于酿造目标酒类的酵母中，通过使用该酵母，能够制造出所期望的且酯量增加或减少、香味良好的酒类。此外，同样也可以使用根据下述本发明的酵母的评价方法选择出的酵母。目标酒类可以为啤酒、发泡酒等啤酒味饮料、葡萄酒、威士忌、清酒等，但并不限于这些。此外，在本发明中，可根据需要使用靶基因的表达受到抑制的酿造用酵母，由此，也能够制造所期望的且控制酯含量的酒类。即，使用导入上述本发明载体的酵母、上述本发明多核苷酸(DNA)的表达受到抑制的酵母或根据下述本发明的酵母的评价方法选择的酵母，进行制造酒类的发酵，通过调节(增加或减少)酯生成量，能够制造所期望且调节了酯含量(增加或减少)的酒类。

制造上述酒类时，除使用本发明得到的酿造酵母代替亲株之外，可利用公知的方法。因此，原料、制造设备、制造管理等与以往的方法完全相同，不会因制造控制了酯含量的酒类而增加成本。即，根据本发明，使用已有的设备，就可制造香味优良的酒类而不增加成本。

5.本发明的酵母的评价方法

本发明涉及使用根据具有序列号1碱基序列的酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶基因的碱基序列设计的引物或探针，评价被检酵母的酯生成能力的评价方法。该评价方法的一般方法为公知方法，例如在WO01/040514号公报、日本国特开平8-205900号公报等中有记载。下面，对该评价方法进行简单说明。

首先，制备被检酵母的基因组。制备方法可采用Hereford法或乙酸钾法等任何一种公知方法(如Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，p130(1990))。以得到的基因组为对象，使用根据酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶基因的碱基序列(优选ORF序列)设计的引物或探针，检测被检酵母的基因组中是否存在其基因或其基因的特异序列。可采用公知的方法设计引物或探针。

基因或特异序列的检出可采用公知的方法实施。例如，用含有特异序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有与其碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸作为一个引物，用含有该序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有与其碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸作为另一个引物，通过PCR法扩增酵母的核酸，测定扩增产物的有无、扩增产物分子量大小等。引物使用的多核苷酸的碱基数通常为10bp以上，优选15bp～25bp。此外，夹在两引物间的碱基数通常以300bp～2000bp为宜。

PCR法的反应条件无特别限定，如可采用变性温度：90℃～95℃，退火温度：40℃～60℃，延伸温度：60℃～75℃，循环数：10次以上等条件。得到的反应生成物可通过使用琼脂糖凝胶等的电泳法等进行分离，测定扩增产物的分子量。通过该方法，根据扩增产物的分子量包含特定DNA分子的大小，预测·评价该酵母的酯生成能力。另外，通过分析扩增产物的碱基序列，可以更准确地预测·评价上述能力。

在本发明中，也可通过培养被检酵母，测定具有序列号1的碱基序列的酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶基因的表达量，评价被检酵母的酯生成能力。此外，酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶基因表达量的测定，可通过培养被检酵母，对酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶基因的产物mRNA或蛋白质进行定量来进行。mRNA或蛋白质的定量可采用公知的方法进行。可采用如Northern杂交法、定量的RT-PCR对mRNA进行定量，可采用如Western印迹法对蛋白质进行定量(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons 1994-2003)。

培养被检酵母，测定具有序列号1的碱基序列的酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶基因的表达量，通过选择与目标酯生成能力相应的上述基因表达量的酵母，能够选择出适于酿造所期望的酒类的酵母。此外，培养标准酵母及被检酵母，测定上述基因在各酵母中的表达量，通过比较上述基因在标准酵母和被检酵母中的表达量，可以选择所期望的酵母。具体来说，例如培养标准酵母及被检酵母，通过测定具有序列号1的碱基序列的酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶基因在各酵母中的表达量，选择与标准酵母相比，该基因为高表达或低表达的被检酵母，能够选择出适于酿造所期望的酒类的酵母。

或者，培养被检酵母，通过选择酯生成能力高或低，或酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶活性高或低的酵母，能够选择出适于酿造所期望的酒类的被检酵母。

所述情况下，作为被检酵母或标准酵母，可以使用如导入上述本发明载体的酵母、上述本发明的多核苷酸(DNA)的表达受到调节的酵母、实施突变处理的酵母、发生自然突变的酵母等。酯生成能力可以根据如J.Am.Soc.Brew.Chem.49：152-157，1991、J.Biol.Chem.281：4446-4456，2006所述方法进行测定。酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶活性，可以根据如Saerens等的方法(J.Biol.Chem.281：4446-4456，2006)进行测定。突变处理，例如可以使用紫外线照射、放射线照射等物理方法，EMS(甲磺酸乙酯)、N-甲基-N-亚硝基胍等药剂处理的化学方法等任何方法(如参照大嵨泰治编著，生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法，p67-75、学会出版センタ一等)。

能够作为标准酵母、被检酵母使用的酵母，可以是在酿造中使用的任意酵母，如啤酒、葡萄酒、清酒等酿造用酵母等。具体地可以为酵母属(Saccharomyces)酵母(例如巴氏酵母、酿酒酵母及卡氏酵母)，在本发明中可以使用啤酒酵母，如巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70等、卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)NCYC453、NCYC456等、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。另外，也可以使用葡萄酒酵母如协会葡萄酒用1号、葡萄酒用3号、葡萄酒用4号等，清酒酵母如协会酵母清酒用7号、清酒用9号等，但并不限于这些酵母。在本发明中，优选使用啤酒酵母如巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)。标准酵母、被检酵母可以从上述酵母中任意组合选择。

实施例

以下结合实施例详细描述本发明，但本发明不限于以下实施例。

实施例1：新型酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶基因(nonScEHT1)的克隆

使用日本国特开2004-283169号公报中所述的比较数据库进行检索，结果发现啤酒酵母中特有的新型酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶基因nonScEHT1(序列号1)。根据获得的碱基序列信息，分别设计用于扩增全长基因的引物nonScEHT1_for(序列号3)/nonScEHT1_rv(序列号4)，通过以基因组解读株Saccharomyces pastorianus Weihenstepan34/70株(简称“W34/70株”)的染色体DNA为模板的PCR，取得包括nonScEHT1的全长基因的DNA片段(约1.4kb)。

将上述方法得到的nonScEHT1基因片段，通过TA克隆插入pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen公司制造)。用Sanger法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)分析并确定nonScEHT1基因的碱基序列。

实施例2：啤酒试酿中nonScEHT1基因表达分析

使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株进行试酿造，从发酵中的啤酒酵母菌体提取的mRNA通过啤酒酵母DNA微阵列检测。

麦汁浸出物浓度 12.69％

麦汁体积 70L

麦汁中溶解氧浓度 8.6ppm

发酵温度 15℃

酵母添加量 12.8×10⁶cells/mL

对发酵液进行经时采样，观察酵母增殖量(图1)、浸出物表观浓度(图2)的经时变化。与此同时，对酵母菌体进行采样，制备的mRNA用生物素进行标记，使其与啤酒酵母DNA微阵列杂交。用GeneChip Operating System(GCOS；GeneChip Operating Software1.0，Affymetrix公司制造)进行信号检出，nonScEHT1基因的表达模式如图3所示。根据该结果确认在通常的啤酒发酵中nonScEHT1基因表达。

实施例3：nonScEHT1高表达株的制作

将实施例1所述的nonScEHT1/pCR2.1-TOPO用限制酶SacI及NotI酶解，制备包括蛋白质编码区全长的DNA片段。将该片段连接于经限制酶SacI及NotI处理的pYCGPYNot上，构建nonScEHT1高表达载体nonScEHT1/pYCGPYNot。pYCGPYNot为YCp型酵母表达载体，导入的基因通过丙酮酸激酶基因PYK1的启动子进行高表达。酵母的选择性标记包括耐氨基糖苷类抗生素(Geneticin)基因G418^r，大肠菌的选择性标记包括氨苄青霉素抗性基因Amp^r。使用上述方法制作的高表达载体，使用日本国特开平07-303475号公报所述的方法，对Saccharomyces pastorianusWeihenstepan34/70株进行转化。采用含有氨基糖苷类抗生素(Geneticin)300mg/L的YPD平板培养基(1％酵母浸膏，2％多聚蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂)选择转化体。

实施例4：啤酒酿造试验中酯生成量的分析

使用亲株(W34/70株)及实施例3得到的nonScEHT1高表达株的发酵试验在下述条件下进行。

麦汁浸出物浓度 13％

麦汁体积 2L

麦汁中溶解氧浓度约8ppm

发酵温度 15℃

酵母添加量 5g/L

对发酵醪液进行经时采样，分析酵母增殖量(OD660)(图4)、浸出物消耗量(图5)的经时变化。发酵结束时乙酸酯浓度的定量，采用顶空气相色谱法(J.Am.Soc.Brew.Chem.49：152-157，1991)进行。

如表1所示，发酵结束时亲株的乙酸乙酯生成量为34.4ppm，而nonScEHT1高表达株为27.3ppm。此外，亲株的乙酸异戊酯生成量为2.1ppm，而nonScEHT1高表达株为1.6ppm。上述结果表明nonScEHT1高表达使乙酸酯生成量约减少20％。此时同时，在亲株与高表达株之间，增殖速度及浸出物消耗速度几乎没有差别。

[表1]

	亲株(W34/70)	nonScEHT1高表达株
	亲株(W34/70)	nonScEHT1高表达株	乙酸乙酯	34.4	27.3(79.3％)
乙酸异戊酯	2.1	1.6(80％)	乙酸乙酯	34.4	27.3(79.3％)

单位：ppm

()内的值表示与亲株的相对值

实施例5：nonScEHT1基因破坏

按照文献(Goldstein et al.，yeast.15 1541(1999))的方法，通过以含有抗药性标记的质粒(pFA6a(G418r)，pAG25(nat1)，pAG32(hph))为模板的PCR，制作用于破坏基因的片段。作为PCR用的引物，使用nonScEHT1_delta_for(序列号5)、nonScEHT1_delta_rv(序列号6)。

使用上述方法制作的用于破坏基因的片段，对从啤酒酵母Saccharomycespastorianus W34/70株分离的孢子克隆株(W34/70-2)进行转化。转化采用日本国特开平07-303475号公报所述的方法，采用含有氨基糖苷类抗生素(Geneticin)300mg/L、或Nourseothricin50mg/L、或Hygromycin B200mg/L的YPD平板培养基(1％酵母浸膏，2％多聚蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂)选择转化体。

实施例6：啤酒酿造试验中酯生成量的分析

使用亲株(W34/70-2株)及实施例5得到的nonScEHT1破坏株的发酵试验在下述条件下进行。

麦汁浸出物浓度 13％

麦汁体积 1L

麦汁中溶解氧浓度 8ppm

发酵温度 15℃

酵母添加量 5g/L

对发酵醪液进行经时采样，分析酵母增殖量(OD660)(图6)、浸出物消耗量(图7)的经时变化。发酵结束时乙酸酯浓度的定量采用顶空气相色谱法(J.Am.Soc.Brew.Chem.49：152-157，1991)进行。发酵结束时的中链脂肪酸酯浓度，通过在20g发酵醪液上清中加入60g乙酸乙酯，快速渗透除去水层浓缩到200μl后，采用气相色谱法(nipponn jozo kyouaishi，90：919-22，1995)进行定量。

如表2所示，发酵结束时亲株的乙酸乙酯生成量为26.2ppm，而nonScEHT1破坏株为41.1ppm。此外，亲株的乙酸异戊酯生成量为2.3ppm，而nonScEHT1破坏株为4.2ppm。上述结果表明通过nonScEHT1破坏，使乙酸酯生成量约增加50～80％。此外，对于中链脂肪酸酯，亲株的丁酸乙酯的生成量是0.061ppm，而nonScEHT1破坏株为0.046 ppm；亲株的己酸乙酯的生成量是0.092ppm，而nonScEHT1破坏株为0.077ppm；亲株的辛酸乙酯的生成量是0.28ppm，而nonScEHT1破坏株为0.205ppm，约减少15～25％。此时同时，在亲株和破坏株之间，增殖速度和浸出物消耗速度几乎没有差别。

[表2]

	亲株(W34/70-2)	nonScEHT1破坏株
	亲株(W34/70-2)	nonScEHT1破坏株	乙酸乙酯	26.2	41.1(157％)
乙酸异戊酯	2.3	4.2(183％)	乙酸乙酯	26.2	41.1(157％)
乙酸异戊酯	2.3	4.2(183％)	丁酸乙酯	0.061	0.046(75％)
己酸乙酯	0.092	0.077(84％)	丁酸乙酯	0.061	0.046(75％)
己酸乙酯	0.092	0.077(84％)	辛酸乙酯	0.28	0.205(73％)

单位：ppm

()内的值表示与亲株的相对值

由上述结果可知，如果使用本发明公开的啤酒酵母特有的酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶的表达量受到抑制的酵母，不用改变发酵工序、发酵期间，就可以控制酯的生成量，因此可以制造香味良好的酒类。

根据本发明的酒类制造方法，增加了赋予产品浓郁香味的酯含量，所以，可制造香味良好的酒类。另外，对于不期望含有过剩酯的啤酒等麦芽饮料因酯含量减少，可制造香味更加良好的酒类。

[序列表]

SEQUENCE LISTING

<110>三得利株式会社(Suntory Limited)

<120>酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶基因及其用途

(Acyl-CoA：ethanol O-acyltransferase/esterase gene and use thereof)

<130>G06-0087CN

<150>JP2006-49048

<151>2006-02-24

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1362

<212>DNA

<213>酵母属(Saccharomyces sp.)

<400>1

atgtcagaag tttcaaagtg gccagctatt aacccacttc attgggggta caacggtaca 60

gtttcacatg tcgttggtga aaatggttct gcgaagttga gtttgaagaa cgataagcag 120

caagtcgaat ttaatacgtt tgttaatgaa tacgtcccga ttttgagaaa cggggcccac 180

tataaactaa gtccttactt gttcacaggt attttacaaa ctctatactt gaacgctgct 240

gatttatcga agaagtttcc tgtcttttat ggtagggaaa tcgtcgagtt ctcggatggc 300

ggtgtctgta ctgctgattg ggtcatgaat tcctgggaaa aggaatataa tttcgaccaa 360

aacactatga aatttgatac gaagaagttt ggtctcgacg agaaggcgac gcacccagag 420

ggatggcctc gtttacaacc acgtacgagg tacctgagag acgaagagtt gaaagagcaa 480

aggaaagtag atcttcccct agttgttgtc ctccatggtc ttgccggagg cagtcatgaa 540

ccaatcataa gatctctaac tgagaacttg tctcgtatca gtaacgggaa attccaagtc 600

gtggtgctaa acacgagggg ctgcgcgcgt tctaaaatca ccactaaaaa cttattcaca 660

gcttaccaca ctatggatat tcgtgagttc ttgcaaagag aaaaagaaag atatccaaac 720

agaaaattat acaccgtagg atgctctttc ggggctacca tgttagcaaa ctatttgggt 780

gaggaaggtg acaaatcgcc tttatctgct gctgttacat tatgtaatcc atgggatctt 840

cttctttcgg cacttagaat gactgaagac tggtggtcaa aaaccttgtt ctctagaaat 900

attgcccaat ttttaactag aactgttcaa gttaacatgg gcgaattagg tgttccaaac 960

ggttctagcc ctgaccatac acctacgact caaaatccat cttactataa attcacaccc 1020

gagaatttgg aaaaggcgaa acgctttaag tcgagtcttg aattcgatga gctgtacact 1080

gcaccagctt tgggattccc aaatgctatg gaatattata gagcagccag ttcaattaac 1140

agggctgata aaatcaaagt tcctacttta gtaatcaatt ccagagatga tcctgttgta 1200

ggccccgacc aaccttattc atttgtggaa aagaaoccta atattctatt ctgtagaact 1260

gacctaggtg gccatttagc ttacctagat agcaacaacg attcgtgggt tacgaaggcg 1320

atttccgaat tcttgaataa gttcgaggaa ttagttttat ga 1362

<210>2

<211>453

<212>PRT

<213>酵母属(Saccharomyces sp.)

<400>2

Met Ser Glu Val Ser Lys Trp Pro Ala Ile Asn Pro Leu His Trp Gly

1 5 10 15

Tyr Asn Gly Thr Val Ser His Val Val Gly Glu Ash Gly Ser Ala Lys

20 25 30

Leu Ser Leu Lys Asn Asp Lys Gln Gln Val Glu Phe Asn Thr Phe Val

35 40 45

Asn Glu Tyr Val Pro Ile Leu Arg Asn Gly Ala His Tyr Lys Leu Ser

50 55 60

Pro Tyr Leu Phe Thr Gly Ile Leu Gln Thr Leu Tyr Leu Asn Ala Ala

65 70 75 80

Asp Leu Ser Lys Lys Phe Pro Val Phe Tyr Gly Arg Glu Ile Val Glu

85 90 95

Phe Ser Asp Gly Gly Val Cys Thr Ala Asp Trp Val Met Asn Ser Trp

100 105 110

Glu Lys Glu Tyr Asn Phe Asp Gln Asn Thr Met Lys Phe Asp Thr Lys

115 120 125

Lys Phe Gly Leu Asp Glu Lys Ala Thr His Pro Glu Gly Trp Pro Arg

130 135 140

Leu Gln Pro Arg Thr Arg Tyr Leu Arg Asp Glu Glu Leu Lys Glu Gln

145 150 155 160

Arg Lys Val Asp Leu Pro Leu Val Val Val Leu His Gly Leu Ala Gly

165 170 175

Gly Ser His Glu Pro Ile Ile Arg Ser Leu Thr Glu Asn Leu Ser Arg

180 185 190

Ile Ser Asn Gly Lys Phe Gln Val Val Val Leu Asn Thr Arg Gly Cys

195 200 205

Ala Arg Ser Lys Ile Thr Thr Lys Asn Leu Phe Thr Ala Tyr His Thr

210 215 220

Met Asp Ile Arg Glu Phe Leu Gln Arg Glu Lys Glu Arg Tyr Pro Asn

225 230 235 240

Arg Lys Leu Tyr Thr Val Gly Cys Ser Phe Gly Ala Thr Met Leu Ala

245 250 255

Asn Tyr Leu Gly Glu Glu Gly Asp Lys Ser Pro Leu Ser Ala Ala Val

260 265 270

Thr Leu Cys Asn Pro Trp Asp Leu Leu Leu Ser Ala Leu Arg Met Thr

275 280 285

Glu Asp Trp Trp Ser Lys Thr Leu Phe Ser Arg Asn Ile Ala Gln Phe

290 295 300

Leu Thr Arg Thr Val Gln Val Asn Met Gly Glu Leu Gly Val Pro Asn

305 310 315 320

Gly Ser Ser Pro Asp His Thr Pro Thr Thr Gln Asn Pro Ser Tyr Tyr

325 330 335

Lys Phe Thr Pro Glu Asn Leu Glu Lys Ala Lys Arg Phe Lys Ser Ser

340 345 350

Leu Glu Phe Asp Glu Leu Tyr Thr Ala Pro Ala Leu Gly Phe Pro Asn

355 360 365

Ala Met Glu Tyr Tyr Arg Ala Ala Ser Ser Ile Asn Arg Ala Asp Lys

370 375 380

Ile Lys Val Pro Thr Leu Val Ile Asn Ser Arg Asp Asp Pro Val Val

385 390 395 400

Gly Pro Asp Gln Pro Tyr Ser Phe Val Glu Lys Asn Pro Asn Ile Leu

405 410 415

Phe Cys Arg Thr Asp Leu Gly Gly His Leu Ala Tyr Leu Asp Ser Asn

420 425 430

Asn Asp Ser Trp Val Thr Lys Ala Ile Ser Glu Phe Leu Asn Lys Phe

435 440 445

Glu Glu Leu Val Leu

450

<210>3

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>3

gagctcatag cggccatgag acgtgtctcg aaagtcgaac 40

<210>4

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>4

ggatcctatg cggccgccat tcttttcgag aaaaaactat at 42

<210>5

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>5

ggccggggaa gtaatagtcc cttcgaagat tttccttact atttaacagt ccttgacagt 60

cttgacgtgc 70

<210>6

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>6

cttctgttgt atacatacat aagaatggct aggaaaagaa ccatataaca cgcacttaac 60

ttcgcatctg 70

Claims

1.一种多核苷酸，其为从具有下述(a)～(f)的组中选择的多核苷酸：

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其从具有下述(g)～(i)的组中选择：

(i)一种多核苷酸，其中含有一种多核苷酸，该多核苷酸在高严格条件下，与具有序列号1的碱基序列的多核苷酸或具有与序列号1的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶活性的蛋白质。

3.如权利要求1所述的多核苷酸，其中含有具有序列号1的碱基序列的多核苷酸。

4.如权利要求1所述的多核苷酸，其中含有编码具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸。

5.如权利要求1～4中任一项所述的多核苷酸，其为DNA。

6.一种多核苷酸，其是从具有下述(j)～(m)的组中选择的多核苷酸：

(j)一种多核苷酸，其编码RNA，该RNA具有与权利要求5所述的多核苷酸(DNA)的转录产物互补的碱基序列；

(k)一种多核苷酸，其编码RNA，该RNA通过RNAi效应抑制权利要求5所述的多核苷酸(DNA)的表达；

(1)一种多核苷酸，其编码RNA，该RNA对权利要求5所述的多核苷酸(DNA)的转录产物具有特异切割活性；以及，

(m)一种多核苷酸，其编码RNA，该RNA通过共抑制效应抑制权利要求5所述的多核苷酸(DNA)的表达。

7.一种蛋白质，其是被权利要求1～5中任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。

8.一种载体，其中含有权利要求1～5中任一项所述的多核苷酸。

9.一种载体，其中含有权利要求6所述的多核苷酸。

10.一种酵母，其是导入权利要求8或9所述的载体的酵母。

11.如权利要求10所述的酵母，其中，通过导入权利要求8所述的载体，降低酯生成能力。

12.一种酵母，其是通过导入权利要求9所述的载体，或者通过破坏权利要求5所述的多核苷酸(DNA)的基因，抑制权利要求5所述的多核苷酸(DNA)的表达的酵母。

13.如权利要求11所述的酵母，其中，通过增加权利要求7所述的蛋白质的表达量，降低酯生成能力。

14.一种酒类的制造方法，其中使用权利要求10～13中任一项所述的酵母。

15.如权利要求14所述的酒类的制造方法，其中，酿造的酒类是麦芽饮料。

16.如权利要求14所述的酒类的制造方法，其中，酿造的酒类是葡萄酒。

17.一种酒类，其为采用权利要求14～16中任一项所述的方法制造的酒类。

18.一种评价方法，其为使用根据具有序列号1的碱基序列的酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶基因的碱基序列设计的引物或探针，对被检酵母的酯生成能力进行评价的方法。

19.一种评价方法，其为培养被检酵母，通过测定具有序列号1的碱基序列的酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶基因的表达量，评价被检酵母的酯生成能力的方法。

20.一种酵母的选择方法，其为培养被检酵母，对权利要求7所述的蛋白质进行定量或测定具有序列号1的碱基序列的酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶基因的表达量，选择与目标酯生成能力相应的所述蛋白质的量或所述基因表达量的被检酵母的方法。

21.如权利要求20所述的酵母的选择方法，其为培养标准酵母和被检酵母，测定具有序列号1的碱基序列的酰基CoA：乙醇O-酰基转移酶/酯酶基因在各酵母中的表达量，选择与标准酵母相比该基因为高表达或低表达的被检酵母的方法。

22.如权利要求20所述的酵母的选择方法，其为培养标准酵母和被检酵母，对各酵母中的权利要求7所述的蛋白质进行定量，选择与标准酵母相比，该蛋白质的量多或少的被检酵母的方法。

23.一种酒类的制造方法，其特征在于，使用权利要求10～13所述的酵母和根据权利要求20～22所述的方法选择的酵母中的任一种酵母，进行制造酒类的发酵，调节酯生成量。