JPH11243957A - 新規なアルコールアシルトランスフェラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＡＡＣＴａｓｅ産生能の高い酵母を用いて、
簡便な工程で、短縮した製造期間で、エステル香味の強
化された清酒を製造する。 【解決手段】 酵母由来の新規ＡＡＣＴａｓｅ、特に、
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、それおをコードするＤＮＡ、特に、配列番号１で示
されるＤＮＡ、そのようなＤＮＡにより形質転換された
酵母。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酵母由来の新規ア
ルコールアシルトランスフェラーゼ（以下、アルコール
アシルトランスフェラーゼをＡＡＣＴａｓｅとする）に
関する。また、本発明は、ＡＡＣＴａｓｅの生物工学的
産生能を有するＤＮＡ鎖およびこのＤＮＡ鎖により形質
転換されてエステル生産能が増加している酵母にも関す
る。

【０００２】

【従来の技術】ＡＡＣＴａｓｅは、アルコール類とアシ
ルＣｏＡを縮合させて中鎖脂肪酸エステルを産生する、
酵母によるエステル類産生の重要な酵素である。酵母の
ＡＡＣＴａｓｅによって産生されたカプロン酸エチルを
代表とするエステル類は、清酒、ビール等の酒類におい
て、その品質の評価を左右することはよく知られてい
る。ＡＡＣＴａｓｅの性質については、栗山一秀らによ
って報告されている（発酵工学会誌 第67巻 第２号
１０５−１１７，１９８９）。また、その精製について
は、水津らの報告（平成３年度 日本発酵工学会大会
講演要旨集 Ｐ２０２）がありＳＤＳ−ＰＡＧＥによる
推定分子量はＭＷ６５０００、ゲル濾過による推定分子
量は６７,０００、至適温度２５℃で、５０℃、３０分
間の処理で残存活性は１６％、至適pＨ７．１、５ｍＭ
ＰＭＳＦの添加により活性が１００％阻害される。し
かし、本発明者らの知る限りでは、酵母由来で、未だＡ
ＡＣＴａｓｅについて、この酵素を生産するＤＮＡ鎖に
関して全く報告はない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来なされてきた酒類
の製造において、清酒の製造を例に挙げるならば、特
に、吟醸酒と呼ばれるエステル香の強化された清酒製造
において、その発酵温度は通常行われる清酒製造に比
べ、より低温でしかも発酵期間は長期に及ぶ。これは、
ＡＡＣＴａｓｅによるエステル類の生産能が低いため
に、長く発酵期間をもうけエステル類を蓄積することに
つながっているのであり、これらの工程管理は原料処理
から生成酒の取得に至るまで、熟練者の経験および勘に
頼るところが多い。もし、ＡＡＣＴａｓｅ高産生能のあ
る酵母を用いることができれば、熟練を要する製造工程
が簡便となり、その製造期間も短縮してエステル香の強
化された清酒の製造を可能になる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は、
上記課題を解決すべく、酵母に存在しているＡＡＣＴａ
ｓｅについて種々検討した結果、酵母由来のアルコール
アシルトランスフェラーゼを完全精製し、その遺伝子の
単離および構造決定することに成功し、さらに、このＡ
ＡＣＴａｓｅ産生能を強化した形質転換酵母を得ること
を知り、本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明の第１の態様は、ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子
量が約５３,０００であることを特徴とする酵母由来の
アルコールアシルトランスフェラーゼである。第２の態
様は、配列表の配列番号２に示したアミノ酸配列を有す
るポリペプチドであることを特徴とするアルコールアシ
ルトランスフェラーゼである。第３の態様は、配列表の
配列番号２に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードするＤＮＡ配列からなることを特徴とするアル
コールアシルトランスフェラーゼ遺伝子である。第４の
態様は、配列表の配列番号１に示したＤＮＡ配列または
少なくともその一部と実質的に相同な塩基配列を有し、
アルコールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリ
ペプチドを生産し得るＤＮＡ鎖である。第５の態様は、
上記本発明の第３および第４の態様のアルコールアシル
トランスフェラーゼ遺伝子またはＤＮＡ鎖を含む外来遺
伝子の導入によって形質転換されてＡＡＣＴａｓｅ産生
能の富化された酵母である。

【０００６】

【発明の実施の形態】本明細書においては、「遺伝
子」、「ＤＮＡ鎖」および「ＤＮＡ配列」を実質的に同
義のものとして使用している。また、本発明によるＡＡ
ＣＴａｓｅは酵母由来のものであって、配列表の配列番
号２に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドである
が、いくつか（１個もしくは数個）のアミノ酸の付加、
挿入、欠失、削除または置換によってそのペプチドの生
理活性が変化しないことがあることは遺伝子工学あるい
は蛋白質工学の明らかにするところである。したがっ
て、本発明で示したアミノ酸配列は、配列表の配列番号
２に示したアミノ酸配列と全く同一である場合にのみに
限られず、ＡＡＣＴａｓｅ活性が保存されている限り、
上記のようないくつかのアミノ酸の改変を包含するもの
である。配列表の配列番号１に示したＤＮＡ配列と、
「少なくともその一部と実質的に相同な塩基配列」と
は、配列番号１のＤＮＡ配列またはその縮重または縮退
による改変配列を含め、上記アミノ酸の改変配列を含む
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列で、該配列番号１
のＤＮＡ配列との相同性が７０％以上のもので、ＡＡＣ
Ｔａｓｅ活性を有するポリペプチドを産生できるＤＮＡ
鎖を意味する。

【０００７】本発明のＡＡＣＴａｓｅは、具体的にはサ
ッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisi
ae）から得られたものである。本発明でいうサッカロマ
イセス・セレビシエとは、The yeast, a Taxonomic stu
dy 3rd. Edition (ed. by N.J.W. Kreger-van Rij.Else
vier, Science Publishers B.V., Amsterdam, p379,198
4)に記載されているところのサッカロマイセス・セレビ
シエおよびそのシノニムないし変異株である。本発明の
新規ＡＡＣＴａｓｅの性質のうち、代表的なものは、至
適温度、至適ｐＨ、分子量である。栗山らによって報告
されているＡＡＣＴａｓｅの至適ｐＨは８（発酵工学
第６４巻 第３号 １７５−１８０， １９８６）であ
るが、本発明のＡＡＣＴａｓｅの至適ｐＨは７．１であ
る。新規ＡＡＣＴａｓｅの分子量はＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動の結果、約５３,０００であり、水
津らが精製したＡＡＣＴａｓｅ（分子量約６５,００
０）の分子量と異なっている。水津らによって報告され
ているＡＡＣＴａｓｅの至適温度は２５℃（平成３年度
日本発酵工学会大会 講演要旨集 Ｐ２０２）である
が、本発明のＡＡＣＴａｓｅの至適温度は３０−３５℃
である。したがって、いくつかの重要な酵素学的性質や
分子量の違いなどから、本発明によるＡＡＣＴａｓｅ
は、新規なＡＡＣＴａｓｅである。塩基配列から推定さ
れる分子量は、約５１,２５５である。

【０００８】本発明によるＡＡＣＴａｓｅの酵素学的な
性質は、下記の通りである。 （１）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分
子量： 約５３,０００ （２）至適および安定pＨ 至適pＨ：７ 安定pＨ：６〜８ （３）至適および安定温度 至適温度：３０〜３５℃ 安定温度：２０℃以下で安定 （４）エタノールおよびカプロイルＣｏＡに対するＫｍ
値 エタノール：１Ｍ以上（４Ｍ以上の濃度では、反応が阻
害される。） カプロイルＣｏＡ：１．４ｍＭ 本発明のＡＡＣＴａｓｅは、サッカロマイセス・セレビ
シエである清酒酵母協会７号の培養菌体内容物からの可
溶化粗酵素の調製ならびに各種クロマトグラフィーから
なる精製方法によって得ることができる。これらの単位
工程からなるＡＡＣＴａｓｅの取得の実例を、後の実施
例に示す。

【０００９】本発明のＡＡＣＴａｓｅ遺伝子の取得は、
例えば、本発明の提供するＡＡＣＴａｓｅを産生する能
力を有するＤＮＡ鎖の一部またはすべてをプローブとし
て使用し、当該分野で公知のプラークハイブリダイゼー
ション、コロニーハイブリダイゼイション、ＰＣＲ等の
手段により行うことができる。また、ＡＡＣＴａｓｅを
産生する能力を有するＤＮＡ鎖を取得するための遺伝資
源として有用なものは、酵母に限られず、細菌、植物等
が考えられ、特に望ましい遺伝資源は、酒類あるいは発
酵食品の製造に使用されている酵母類である。このＤＮ
Ａ鎖は、配列表の配列番号２に示したアミノ酸配列を有
するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列にちょうど対
応するものであってもよく、また、その上流側または下
流側および双方にＤＮＡ配列が結合した構造のものであ
ってもよい。後者の具体例は、適当なベクターに組み込
まれたプラスミドの形状のものである。配列表の配列番
号２のアミノ酸に対応するものとして、配列表の配列番
号１に特定のＤＮＡ配列が示されているが、これは清酒
酵母協会７号から取得したＡＡＣＴａｓｅ遺伝子につい
て分析を行い、得たものであって、本発明によるＤＮＡ
配列の好ましい具体例である。

【００１０】本発明による、ＡＡＣＴａｓｅを産生する
能力を有するＤＮＡ鎖ないしＤＮＡ配列とは、ＡＡＣＴ
ａｓｅの特徴を示すＡＡＣＴａｓｅ活性を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡ鎖ないしＤＮＡ配列のことで
あり、配列表の配列番号１に示すＤＮＡ配列に限らず、
上記したように、ポリペプチドの変動に対応して変動
し、いわゆる遺伝暗号に関する知見にしたがってその最
も広い意味に解するものとする。したがって、縮重（ま
たは縮退）によって所期のアミノ酸をコードする核酸の
トリプレットは複数種ありえる。また、本発明で対象と
するＤＮＡ鎖は、天然物由来のものでも、全合成あるい
は半合成のものでもよい。

【００１１】形質転換体の作製は、遺伝子工学の分野に
おいて慣用されている方法により行うことができ、例え
ば、プロトプラスト法 （Proc. Natl. Acad. Sci., 75,
p1929, 1978）、あるいは金属処理法（J. Bacteriol.,
113, p727, 1983）によって行われる。この際用いられ
るベクターとしては、酵母用として知られているもので
あれば如何なるものでもよく、例えば、ＹＥｐ系、ＹＣ
ｐ系、ＹＩｐ系等は文献上公知であるばかりでなく、容
易に作成することができる。一方、本発明のＤＮＡ鎖の
遺伝子を酵母内で発現させるため、あるいは発現を増加
もしくは減少させるためには、転写および翻訳を制御す
るプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の５´上流域に、タ
ーミネーターを３´下流域にそれぞれ組み込めばよい。
このプロモーターおよびターミネーターとしては、ＡＡ
ＣＴａｓｅ遺伝子自身に由来するものの他、アルコール
デヒドロゲナーゼ遺伝子（J. Bio. Chem., 257, p3018,
1982）、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（Nucleic
AcidRes., 10, p7791, 1982）、グリセロールアルデヒ
ド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（J. Biol. Che
m., 254, p9839, 1979）等、既に知られているあらゆる
遺伝子由来のもの、もしくは人工的にそれを改良したも
のの使用が可能である。

【００１２】本発明において、形質転換すべき酵母、す
なわち宿主となる酵母は、分類学上酵母の範疇に入る任
意のものでよいが、本発明の目的からすれば、サッカロ
マイセス・セレビシエに属する酒類製造用酵母、具体的
には清酒酵母、ビール酵母、ワイン酵母、ウイスキー酵
母が望ましい。例えば、清酒酵母：ＩＦＯ２３４７、ビ
ール酵母：ＡＴＣＣ２６２９２、ワイン酵母：ＩＦＯ２
２６０、ウイスキー酵母：ＩＦＯ２１１２等を例示する
ことができる。宿主として好ましい他の一群は、パン酵
母である。具体的にはＡＴＣＣ３２１２０を例示するこ
とができる。上記のようにして得たＡＡＣＴａｓｅ産生
能の富化された形質転換酵母は、それぞれの用途に利用
することができる。宿主酵母が酒類製造用酵母である場
合は、本発明によりＡＡＣＴａｓｅ産生能が富化されて
いるため、安定したＡＡＣＴａｓｅ活性によりエステル
香味の富化ないし強化された酒類を製造することができ
る。

【００１３】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定される
ものではない。 実施例１ ＡＡＣＴａｓｅの製造 本発明の酵素は、サッカロマイセス属に属し、上記特性
を有する酵素を生産する酵母を培養し、その培養物から
得ることができる。好ましい製造法の一例を示せばつぎ
のとおりである。 １−（１）粗酵素液の調製 ＡＡＣＴａｓｅ活性は 、栗山らの方法（発酵工学 第
６４巻 第３号 １７５−１８０， １９８６ ）に準
じて測定した。清酒酵母協会７号をＹＰＤ培地（１％
酵母エキス、２％ バクトペプトン、２％ グルコー
ス）４００ｍｌに植菌し、３０℃で２４時間前培養し
た。その培養液を３ｌのＹＰＤ培地を入れた５ｌ容ジャ
ーファーメンターに接種し、３０℃で１６時間通気撹拌
培養した。つぎに、遠心（３,０００回転／分、１０
分）により菌体を回収し、その菌体重量の１０倍容の緩
衝液（２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、
１．５Ｍソルビトール）に懸濁させ、菌体重量の１００
０分の２量のザイモリエース１００Ｔ（生化学工業
（株）製）を加えた。これを３０℃で１時間振盪し、生
じたプロトプラストを２,０００回転／分、５分間の遠
心によって回収した。回収したプロトプラストを４００
ｍｌの菌体破砕用緩衝液（５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）、５ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭエ
チレンジアミン四酢酸二ナトリウム、２μＭペプスタチ
ンＡ）に懸濁させ、ポリトロンＰＴ１０型（ＫＩＮＥＭ
ＡＴＩＣＡ社製）菌体破砕装置を用いて細胞を破砕し
た。破砕後、４５００回転／分、１０分間遠心し、さら
にその上清を１４,０００回転／分、２０分間の遠心に
より破砕残渣を取り除き、粗酵素液を得た。

【００１４】１−（２）ミクロソーム画分の調製 １−（１）で得られた粗酵素液を、１００,０００×Ｇ
で２時間遠心し、生じた沈殿（ミクロソーム画分）を４
０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pＨ
８．０）、５ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭエチレン
ジアミン四酢酸二ナトリウム）に懸濁させた。直ちに使
用しない場合は、これを−２０℃で保存した。この操作
を１７回繰り返し、約２．７ｋｇの菌体から膜画分を調
製した。 １−（３）可溶化酵素の調製 １−（２）で得られたミクロソーム画分の半量を三角フ
ラスコに移し、緩衝液（５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）、５ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭエ
チレンジアミン四酢酸二ナトリウム ）４００ｍｌに懸
濁した後、蛋白量を測定し蛋白量と等量のＭＥＧＡ−９
を加え、４℃で泡立たないように注意して６０分間マグ
ネチックスターラーを用いて撹拌した。その後、１０
０,０００×Ｇで２時間遠心し、上清を緩衝液Ａ（５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pＨ８．０）、５ｍＭジチオ
スレイトール、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリ
ウム、２０％グリセロール）に対して１晩透析した。

【００１５】１−（４）酵素の精製 酵素の精製は、１−（３）の操作を２回繰り返して取得
した可溶化酵素液を用いて行った。まず、可溶化酵素液
を２回に分けてＱ−セファロース（ファルマシア社製）
を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製した（吸
着：緩衝液Ａ、溶出：緩衝液Ａ ０．０〜０．６Ｍ塩化
ナトリウム濃度勾配）。溶出した活性画分のうち図１に
示した矢印の画分を集め、再度Ｑ−セファロースにより
精製を行った。溶出した活性画分は、さらに下記に示す
からまでの各種のカラムクロマトグラフィーにより
順次精製した。すなわち、ハイドロキシアパタイトカ
ラムクロマトグラフィー（和光純薬社製） 吸着：１０
ｍＭリン酸緩衝液、溶出：１０〜１５０ｍＭリン酸緩衝
液（pＨ７．５）濃度勾配 と同様のカラム処理をさらに４回繰り返
す。 Ｑセファロースカラムクロマトグラフィー 吸着：緩衝液Ａ、溶出：緩衝液Ａ ０．０〜０．６Ｍ塩
化ナトリウム濃度勾配 ＰＢＥ９４カラムクロマトグラフィー（ファルマシア
社製） 吸着：緩衝液（５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pＨ８．
０）、１ｍＭジチオスレイトール、２０％グリセロー
ル）、溶出：ポリバッファー７４（pＨ３）（ファルマ
シア社製）、１ｍＭジチオスレイトール、２０％グリセ
ロール により得られた活性画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動に供した後、銀染色した結果を図２に示す。

【００１６】実施例２ ＡＡＣＴａｓｅの特徴 ２−（１）至適および安定pＨ 酵素の安定性に及ぼすｐＨの影響を調べるために、pＨ
の幅３．４〜１１．８の範囲で４℃、２４時間放置した
のち、pＨ８．０に調製し、１−（１）の方法により酵
素活性を測定した。また、酵素活性に及ぼすpＨの影響
を調べるために、pＨの幅を３．９〜８．７（pＨ３．９
〜７．８：５０ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液、pＨ７．
１〜８．７：５０ｍＭトリス−リン酸緩衝液）の範囲で
変化させて、１−（１）の方法により酵素活性を測定し
た。pＨ安定性については、pＨ６〜８の範囲で安定であ
った。また、至適pＨは７であった。 ２−（２）至適および安定温度 酵素活性に及ぼす温度の影響を調べるために、１−
（１）の方法により各温度で酵素活性を測定した。ま
た、酵素の安定性に及ぼす温度の影響を調べるために、
各温度で酵素液を１時間保持した後、１−（１）の方法
により酵素活性を測定した。結果を図３に示す。温度安
定性については、２０℃までは安定であった。また、至
適温度は、３０〜３５℃であった。

【００１７】実施例３ 部分アミノ酸配列の決定 部分アミノ酸配列の決定は、岩松のポリビニリデンジフ
ロリド膜（以下、ＰＶＤＦ膜と略記）を利用した方法
（生化学 63, p139, 1991）に従って行った。１−
（４）で取得した精製酵素を１０ｍＭギ酸３リットルで
１時間透析した後に、凍結乾燥した。これを泳動用緩衝
液（１０％グリセロール、２．５％ＳＤＳ、２％ ２−
メルカプトエタノール、６２ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（pＨ６．８））に懸濁させて、ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動に供した。泳動後、エレクトロブロッ
ティングにより当該酵素をゲルより１０ｃｍ×７ｃｍの
ＰＶＤＦ膜「Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＰＳＱ」（ミリポア
社製）へ転写した。エレクトロブロッティング装置は
「ＮＯＶＡＢＬＯＴ」 （ＬＫＢ社製）を用いて、「遺伝子
クローニングのための蛋白質構造解析」（平野 久著）
に従って、エレクトロブロッティングを７０ｍＡで１時
間行った。転写後、当該酵素の転写された部分の膜を切
りとり、約３００μｌの還元用緩衝液（６Ｍグアニジン
塩酸−０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（pＨ８．５）、０．
３％ ＥＤＴＡ、２％アセトニトリル）に浸し、１ｍｇ
のジチオスレイトールを加えて、アルゴン下で６０℃、
約１時間の還元を行った。これに、２．４ｍｇモノヨー
ド酢酸を０．５Ｎ水酸化ナトリウム液１０μｌに溶かし
たものを加えて、遮光下で２０分間撹拌した。つぎに、
ＰＶＤＦ膜を取り出し、２％アセトニトリル水溶液で十
分洗浄した後、０．１％ ＳＤＳ溶液中で５分間撹拌し
た。ついで、ＰＶＤＦ膜を水で軽く洗浄後、０．５％ポ
リビニルピロリドン４０〜１００ｍＭ酢酸に浸し、３０
分間静置した。この後、ＰＶＤＦ膜を水で十分洗浄し、
約１ｍｍ四方に切断した。これを酵素消化用緩衝液（８
％アセトニトリル、９０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pＨ
９．０））に浸し、リシルエンドペプチダーゼ（和光純
薬社製）を４ｐｍｏｌ加え、室温で１５時間消化した。
その消化物をＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ製、μ―ＢＯ
ＮＤＡＳＰＨＥＲＥ ５μＣ８ ３００Å、２．１×１
５０ｍｍ）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー
（日立社製、モデルＬ６２００）により分離して、十数
種のペプチド断片を得た。ペプチドの溶出溶媒として
は、Ａ溶媒（０．０８％トリフルオロ酢酸）、Ｂ溶媒
（０．０６５％トリフルオロ酢酸を含む２−プロパノー
ル／アセトニトリル（７：３））を用い、Ｂ溶媒に関
し、２〜５０％ ２−プロパノール／アセトニトリル
（７：３）直線濃度勾配で０．２５ｍｌ／ｍｉｎの流速
で４０分間溶出させた。プロテアーゼ消化物から得られ
たペプチド断片について、アミノ酸配列決定試験を、島
津製作所社製の気相プロテインシークエンサーＰＳＱ−
１型をマニュアルに従って用い、自動エドマン分解法に
より行った。結果を表１に示す。決定されたアミノ酸配
列（配列表の配列番号２における、第４１０番目から第
４２４番目までのアミノ酸に相当する配列）についてホ
モロジー検索を行ったところ、酵母のHypothetical 51k
Da protein in SMY2-Rps101 intergenic regionの内部
アミノ酸配列と完全に一致した。

【００１８】

【表１】

【００１９】実施例４ ＡＡＣＴａｓｅを産生するＤＮＡ鎖の清酒酵母協会７号
よりのクローニング ４−（１）清酒酵母協会７号の染色体ＤＮＡの調製 清酒酵母協会７号をＹＰＤ培地１０００ｍｌにＯ．Ｄ．
６００＝１０まで培養し、集菌後オートクレーブ処理し
た水で洗浄した。これを菌体１ｇあたり２ｍｌのＳＣＥ
液（１Ｍソルビトール、０．１２５Ｍ ＥＤＴＡ、０．
１Ｍクエン酸３ナトリウム（ｐＨ７）、０．７５％ ２
−メルカプトエタノール、０．０１％ザイモリエース１
００Ｔ（上記）に懸濁させた後、３７℃で約２時間緩や
かに振盪し、酵母を完全にプロトプラスト化させた。こ
れに、菌体あたり３．５ｍｌの溶菌液（０．５Ｍトリス
−塩酸緩衝液（pＨ９）、０．２Ｍ ＥＤＴＡ、３％
ＳＤＳ）を加えて緩やかに撹拌した。これを、６５℃で
１５分間保温し、完全に溶菌させた。溶菌後、室温まで
冷却し、あらかじめ日立超遠心チューブ４０ＰＡに作製
しておいた２３．５ｍｌの１０％〜４０％シュークロー
ス密度勾配液（０．８Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍト
リス−塩酸緩衝液（pＨ８）、０．０１ＭＥＤＴＡ、１
０％〜４０％シュークロース）に１０ｍｌずつ静かにの
せた。これを、日立超遠心機ＳＣＰ８５Ｈを用いて、４
℃で２６,０００回転／分、３時間遠心した。遠心後、
駒込ピペットを用いてチューブ底になるべく近いところ
から液を約５ｍｌずつ回収した。回収したサンプルを１
０００ｍｌのＴＥ液（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（p
Ｈ８）、１ｍＭＥＤＴＡ）で一晩透析し、染色体ＤＮＡ
を得た。 ４−（２）ゲノムライブラリーの作製

【００２０】こうして得られた染色体ＤＮＡを制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ（宝酒造社製）で消化し、ア
ガロース電気泳動に供した。２．５〜４ｋｂのゲルを切
り出しプレップＡジーン（バイオラッド社製）を用いて
染色体ＤＮＡを回収した。この染色体ＤＮＡとｐＵＣ１
９ベクターＤＮＡ（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ、アルカ
リホスファターゼ処理）とを、ライゲーションキットＶ
ｅｒ．１（宝酒造社製）で１６℃で一晩ライゲーション
した。これで大腸菌ＤＨ５を形質転換し、約１４００個
のコロニーを得た。得られたコロニーをナイロンメンブ
レンフィルターHybond-N（アマシャム社製）に、アマシ
ャム社のプロトコールに従いブロッティングした。 ４−（３）プローブの合成と標識 実施例３で得られた部分アミノ酸配列を元にサッカロマ
イセスゲノムデータベース(http://genome-www.stanfor
d.edu/Saaccharomyces)より塩基配列情報を入手し、そ
の配列をもとに、ＤＮＡシンセサイザー（アプライド・
バイオシステムズ社製、モデル３９１）を用いて、下記
のような合成プライマー（Ａ：アデニン、Ｃ：シトシ
ン、Ｇ：グアニン、Ｔ：チミン）を作製した。 プライマー２ ５´−TTGCGTAAAAAACAAAGCTTATAA−３´ プライマー４ ５´−TGTGAAGCAAGCTTTAAATATGACAGATAT −３´ 合成試薬（ＦＯＤホスホアミダイド等）は全て同社のも
のを用い、付属のオペレーターズマニュアルに従って使
用した。得られた合成ＤＮＡを、２７％アンモニア水２
ｍｌで５５℃、１時間処理し、これをＯＰＣカートリッ
ジ（アプライド・バイオシステムズ社製）で精製した。
この２種の合成ＤＮＡをプライマーとして、清酒酵母協
会７号の染色体ＤＮＡを鋳型として含む溶液（Takara E
X Taq 0.5μl、 10×EX Taq Buffer 10μl、 dNTP Mixtur
e 8μl、 テンフ゜レート(K-7 gene 0.5μg) 10μl、 フ゜ライマー 2(1
00pmol/μl、 100μM) 1μl、 フ゜ライマー4(100pmol/μl、 100
μM) 1μl、 D.W. 69.5μl ）を作成し、ＰＣＲ反応を行
いＡＡＣＴａｓｅ構造遺伝子を含む１．７ｋｂのＤＮＡ
を得た。このＤＮＡ１μｇをＥＣＬランダムプライムラ
ベリング検出システム（アマシャム社製）により、付属
のプロトコールに従い標識し、コロニーハイブリダイゼ
ーションのプローブとした。

【００２１】４−（４）コロニーハイブリダイゼーショ
ンによるＡＡＣＴａｓｅ遺伝子の単離 ハイブリダイゼーションおよびシグナルの検出方法は、
ＥＣＬランダムプライムラベリング検出システム付属の
プロトコールに従って行った。まず、第一スクリーニン
グとして、４−（２）で作製したゲノムライブラリーの
プラスミドＤＮＡをトランスファーしたメンブレン１０
枚を、４−（３）で合成・標識したプローブを用い、６
２℃、一晩のハイブリダイゼーションとシグナルの検出
を行った後、陽性のシグナルを示すコロニー２０個を第
二スクリーニングに用いた。第二スクリーニングは、シ
グナルを示した２０個のコロニーをもとの寒天培地よ
り、滅菌チップで寒天ごと打ち抜き、１ｍｌの蒸留水に
懸濁させた。この溶液を蒸留水を用いて、出現するコロ
ニー数がプレート１枚当たり５０個程度となるように適
宜それぞれ希釈し、プレーティングした。出現した２０
クローンのコロニーは、ライブラリー作製と同様にそれ
ぞれナイロンメンブレンにブロッティングした。プロー
ブを用い、６２℃、一晩のハイブリダイゼーションを行
い、陽性クローンを取得した。 ４−（５）ＡＡＣＴａｓｅ遺伝子の解析 得られた組み換えプラスミドを用いて、Ｋｉｌｏ−Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ用Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社
製）によりデリーションシリーズを作成し、蛍光標識プ
ライマーを用いたダイデオキシターミネーター法によ
り、３７３Ａ−１８オートメートシーケンシングシステ
ム（パーキンエルマー社製）により塩基配列の決定を行
った。ＡＡＣＴａｓｅをコードする部分の塩基配列を配
列表の配列番号１に、該ＤＮＡから翻訳されるポリペプ
チドのアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。ＡＡ
ＣＴａｓｅ遺伝子は１３５３塩基の構造遺伝子領域をも
ち、４５１個のアミノ酸をコードしていた。

【００２２】実施例５ ＡＡＣＴａｓｅ遺伝子を含むベクターの作製およびこの
ベクターにより形質転換された酵母のＡＡＣＴａｓｅ活
性 ４−（５）得られたＡＡＣＴａｓｅ遺伝子を挿入したｐ
ＵＣ１９ＡＣＴから、当該ＤＮＡ鎖の完全長を含む１．
５ｋｂのＭａｅＩＩＩ、ＸｈｏＩ断片を取得した。得ら
れたＤＮＡ断片を平滑末端化後、ＨｉｎｄＩＩＩリンカ
ー（ｄＣＡＡＧＣＴＴＧ：宝酒造社製）を付加し、酵母
２μｍＤＮＡの複製起点とＬＥＵ２遺伝子をマーカーに
持つ酵母用大腸菌シャトルベクターｐＡＡＨ５（Gene,
8, p121,1979）のＡＤＨ１のプロモーターとターミネー
ターとの間の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断したものと
連結して発現ベクターｐＡＡＡＣＴを作製した（図
４）。このｐＡＡＡＣＴのＡＡＣＴの構造遺伝子領域の
上流と下流にそれぞれＡＤＨＩのプロモーターとターミ
ネーターを連結した部分を、ＸｂａＩ、ＳａｌＩで切り
出し４．８ｋｂｐの断片を得た。これをｐＲＳ４１６の
マルチクローニングサイトのＸｂａＩ、ＳａｌＩサイト
にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、発現ベクターｐ
ＲＳ４１６ＡＣＴを構築した（図４）。酢酸リチウム法
（J. Bacteriol., 153, p163, 1983）を用い、ｐＲＳ４
１６ＡＣＴをサッカロマイセス・セレビシエ７Ｈ６−ｕ
ｒａ３（ α、ｕｒａ３）に形質転換し、形質転換体を
得た。

【００２３】この形質転換体は、１９９８年２月１７日
より工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１６６４０下に寄託されている。形質転換体
ｐＲＳ４１６ＡＣＴ株および対照株のＡＡＣＴａｓｅ活
性の測定は、つぎのようにして行った。すなわち、ＳＤ
液体培地（０．６７％イーストナイトロジェンベース
（ディフコ社製）、２％グルコース）５ｍｌで３０℃、
約１６時間振盪培養したものを、５０ｍｌの同培地に１
ｍｌ添加し、３０℃、２４時間静置培養した。培養液を
３,０００回転／分、１０分間遠心して菌体を回収し、
可溶化液（５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）、０．１％ポリオキシエチレンオクチルフェニルエ
ーテル、５ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭエチレンジ
アミン４酢酸ナトリウム、２０％グリセロール）５ｍｌ
で一度洗浄後、菌体の３倍量の可溶化液に懸濁した。こ
れに５００μｌのガラスビーズ（ＭＫ−２ＧＸ（直径
０．２５〜０．５ｍｍ）、シンマルエンタープライゼス
社製）を加えて、３０秒間、３回激しく撹拌することに
より細胞を破砕した。１５,０００回転／分、２０分間
遠心して取得した上清を、ＡＡＣＴａｓｅ活性測定の試
料とした。なお、対照株としては、サッカロマイセス・
セレビシエ７Ｈ６にベクターのｐＲＳ４１６を形質転換
した株を用いた。活性の測定は１−（１）の方法に従っ
て行った。また、蛋白質の定量は、プロテインアッセイ
キット（バイオラッド社製）を用い、付属のマニュアル
に従って行った。結果を表２に示す。組み換え体のＡＡ
ＣＴａｓｅ活性は、対照株に比べ１７．１倍高くなっ
た。

【００２４】

【表２】

【００２５】実施例６ 形質転換酵母サッカロマイセス・セレビシエ７Ｈ６―Ａ
ＣＴ株による発酵試験実施例５で取得した、ＡＡＣＴａ
ｓｅ遺伝子により形質転換されたサッカロマイセス・セ
レビシエ７Ｈ６―ＡＣＴ株を用いて発酵試験を行い、カ
プロン酸エチル生成量について検討した。７Ｈ６―ＡＣ
Ｔ株をＳＤ液体培地（０．６７％ イーストナイトロジ
ェンベース（ディフコ社製）、２％ グルコース）５ｍ
ｌで３０℃、約１６時間振盪培養した酵母もちい、総米
４０ｇ ２段仕込み １０℃一定で２０日間の小仕込を
し、その上澄液の香気成分を分析した。結果を表３に示
す。本発明の酵母を用いた場合、ベクターのみの対照株
と比較してカプロン酸エチルの生成量が増大し、発酵試
験においても中鎖脂肪酸エステル生成量が増加すること
がわかった。

【００２６】

【表３】

【００２７】

【発明の効果】本発明による新ＡＡＣＴａｓｅ遺伝子を
用いることによって、カプロン酸エチル等の中鎖エステ
ル産性能の増強した株を育種することができる

【００２８】

【配列表】

配列番号 １ 配列の長さ：２１８２ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名 ：サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharo
myces cerevisiae） 株 名 ：ＡＴＣＣ ２６４２１ 配 列 ： TCTTGTAAAT ATATGAGGTC TTTTCAAATC AATATACATA ATGTTACTTA TTATTTTATT 60 CCAAGCAGGT CCATTTTTTT TTTCACTTTG CACGAAATTA CATAAACATT AAAAGGACCC 120 TTGTGTATCT GCTTAATGAT TTGCAAAACC TGCGGAAACG GAACGAAAAA TGAGCAATCT 180 CGTTCCGGTT CCGAGATCCT TTTTTTTTTT TAAGTCTTGC GCATGTGCAG ATTTTAAAAG 240 GCGTCAGATA TCGGATGTCC CTGGAAGTAA TAGCTCCTCG AGTATTTCCT CCGTTTATTA 300 TTAATATGAG CAGTTTTTTA AGTTCTATTA TTACATTGAT AGTAGTTGCG TAAAAAACAA 360 AGCTCATAAA AGTTTCCGAT ATG TCA GAA GTT TCC AAA TGG CCA GCA ATC AAC 413 CCA TTC CAT TGG GGA TAC AAT GGT ACA GTT TCG CAT ATT GTC GGT GAA 461 AAT GGT TCC ATT AAA CTC CAT TTA AAA GAC AAC AAG GAG CAA GTT GAT 509 TTT GAC GAG TTC GCT AAC AAA TAT GTC CCA ACG TTG AAG AAT GGT GCC 557 CAA TTC AAA TTG AGT CCT TAC TTG TTC ACA GGT ATT TTG CAA ACT TTG 605 TAC TTA GGT GCT GCT GAT TTC TCT AAG AAA TTT CCT GTA TTC TAC GGC 653 AGG GAA ATT GTC AAA TTC TCG GAT GGT GGA GTT TGC ACC GCT GAC TGG 701 CTC ATA GAT TCA TGG AAA AAG GAT TAT GAA TTC GAT CAA AGT ACT ACG 749 AGC TTT GAT AAA AAA AAA TTT GAT GAA GAC GAG AAG GCG ACA CAT CCA 797 GAA GGA TGG CCT CGT TTA CAA CCA CGT ACA AGG TAC CTG AAA GAT AAT 845 GAG TTG GAA GAA CTA CGG GAG GTT GAT CTA CCC CTA GTA GTT ATT CTA 893 CAT GGT CTT GCT GGT GGT AGT CAT GAG CCG ATT ATA AGA TCT CTT GCT 941 GAA AAC CTG TCT CGC AGT GGG AGA TTT CAA GTG GTC GTC CTA AAT ACC 989 AGA GGT TGT GCA CGT TCC AAA ATT ACC ACC AGA AAT TTA TTT ACA GCT 1037 TAT AAC ACA ATG GAT ATT CGC GAG TTT TTG CAA AGA GAA AAG CAA AGA 1085 CAT CCA GAT AGA AAA CTA TAC GCT GTG GGA TGC TCT TTT GGT GCT ACG 1133 ATG CTG GCA AAC TAT CTG GGA GAA GAG GGC GAT AAA TCA CCT TTA TCC 1181 GCA GCT GCT ACT TTG TGC AAT CCT TGG GAT CTT CTC CTT TCA GCA ATT 1229 AGG ATG AGC CAG GAT TGG TGG TCA AGA ACT TTA TTT TCC AAA AAT ATT 1277 GCG CAA TTC TTA ACA AGA ACC GTT CAG GTT AAT ATG GGT GAA TTA GGA 1325 GTT CCA AAT GGC TCT CTC CCC GAT CAT CCT CCC ACA GTC AAG AAT CCA 1373 TCT TTC TAT ATG TTC ACG CCT GAA AAT CTA ATA AAG GCA AAG AGC TTT 1421 AAA TCG ACC CGG GAA TTT GAT GAA GTG TAC ACT GCG CCT GCT TTA GGC 1469 TTC CCA AAT GCT ATG GAG TAT TAT AAA GCG GCC AGC TCA ATA AAC AGA 1517 GTT GAT ACA ATT CGG GTT CCT ACC CTT GTT ATC AAT TCC AGG GAT GAT 1565 CCT GTT GTC GGC CCA GAT CAA CCA TAC TCA ATC GTG GAA AAG AAT CCT 1613 CGT ATT TTG TAT TGT AGA ACC GAT TTA GGT GGT CAT TTA GCT TAC CTA 1661 GAT AAA GAC AAC AAC TCG TGG GCT ACC AAG GCA ATT GCA GAA TTT TTC 1709 ACT AAG TTT GAT GAA TTA GTC GTA TGATGTCACA CAATTTTCAA ACCACTTTCC 1763 TATGTATTTA TACAACATTG GATCAATGCC CCTTTATTTT AAGTTATGTA TTTTTTGTTG 1823 TCTTCAGTAT ACCTAAAATT TAAAGTTTTT TTCCCTATGC AGTGATTTTT ATCTATATAT 1883 TTTACTTTTC GTTAATTGAA GAGAGGAATT CATTCCATAA GTCCTCCTTA ACTTTGAAAG 1943 TATGAGTACC TCTCTCAGGA AATGTCCTAT CCTCTACACT TGCAATGTAC TCCTTCAAGC 2003 CCTGAGTGGC AATATCTGTC ATATTTACAG CTTGCTTCAC AAATTTTGGG ACAGAATCGC 2063 CTTGCATCCC GAGAAGGTCA GATATAACTA GAACTTGTCC ACTGGTACCG TTACCTGCAC 2123 CGATACCTAT TGTTGGTACT GAGAGTTTAG ATGTTATGAA CTGAGCCATC TTATGGGGG 2182

【００２９】配列番号 ２ 配列の長さ：４５１ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配 列 ： Met Ser Glu Val Ser Lys Trp Pro Ala Ile Asn Pro Phe His Trp Gly 1 5 10 15 Tyr Asn Gly Thr Val Ser His Ile Val Gly Glu Asn Gly Ser Ile Lys 20 25 30 Leu His Leu Lys Asp Asn Lys Glu Gln Val Asp Phe Asp Glu Phe Ala 35 40 45 Asn Lys Tyr Val Pro Thr Leu Lys Asn Gly Ala Gln Phe Lys Leu Ser 50 55 60 Pro Tyr Leu Phe Thr Gly Ile Leu Gln Thr Leu Tyr Leu Gly Ala Ala 65 70 75 80 Asp Phe Ser Lys Lys Phe Pro Val Phe Tyr Gly Arg Glu Ile Val Lys 85 90 95 Phe Ser Asp Gly Gly Val Cys Thr Ala Asp Trp Leu Ile Asp Ser Trp 100 105 110 Lys Lys Asp Tyr Glu Phe Asp Gln Ser Thr Thr Ser Phe Asp Lys Lys 115 120 125 Lys Phe Asp Glu Asp Glu Lys Ala Thr His Pro Glu Gly Trp Pro Arg 130 135 140 Leu Gln Pro Arg Thr Arg Tyr Leu Lys Asp Asn Glu Leu Glu Glu Leu 145 150 155 160 Arg Glu Val Asp Leu Pro Leu Val Val Ile Leu His Gly Leu Ala Gly 165 170 175 Gly Ser His Glu Pro Ile Ile Arg Ser Leu Ala Glu Asn Leu Ser Arg 180 185 190 Ser Gly Arg Phe Gln Val Val Val Leu Asn Thr Arg Gly Cys Ala Arg 195 200 205 Ser Lys Ile Thr Thr Arg Asn Leu Phe Thr Ala Tyr Asn Thr Met Asp 210 215 220 Ile Arg Glu Phe Leu Gln Arg Glu Lys Gln Arg His Pro Asp Arg Lys 225 230 235 240 Leu Tyr Ala Val Gly Cys Ser Phe Gly Ala Thr Met Leu Ala Asn Tyr 245 250 255 Leu Gly Glu Glu Gly Asp Lys Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ala Thr Leu 260 265 270 Cys Asn Pro Trp Asp Leu Leu Leu Ser Ala Ile Arg Met Ser Gln Asp 275 280 285 Trp Trp Ser Arg Thr Leu Phe Ser Lys Asn Ile Ala Gln Phe Leu Thr 290 295 300 Arg Thr Val Gln Val Asn Met Gly Glu Leu Gly Val Pro Asn Gly Ser 305 310 315 320 Leu Pro Asp His Pro Pro Thr Val Lys Asn Pro Ser Phe Tyr Met Phe 325 330 335 Thr Pro Glu Asn Leu Ile Lys Ala Lys Ser Phe Lys Ser Thr Arg Glu 340 345 350 Phe Asp Glu Val Tyr Thr Ala Pro Ala Leu Gly Phe Pro Asn Ala Met 355 360 365 Glu Tyr Tyr Lys Ala Ala Ser Ser Ile Asn Arg Val Asp Thr Ile Arg 370 375 380 Val Pro Thr Leu Val Ile Asn Ser Arg Asp Asp Pro Val Val Gly Pro 385 390 395 400 Asp Gln Pro Tyr Ser Ile Val Glu Lys Asn Pro Arg Ile Leu Tyr Cys 405 410 415 Arg Thr Asp Leu Gly Gly His Leu Ala Tyr Leu Asp Lys Asp Asn Asn 420 425 430 Ser Trp Ala Thr Lys Ala Ile Ala Glu Phe Phe Thr Lys Phe Asp Glu 435 440 445 Leu Val Val 450

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明によるＡＡＣＴａｓｅのＱセファロー
スによる活性画分の溶出パターンを示す図面である。

【図２】 本発明によるＡＡＣＴａｓｅのＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動、銀染色の図面代用写真であ
る。

【図３】 本発明によるＡＡＣＴａｓｅの酵素活性に及
ぼす温度の影響を示す図面である。

【図４】 本発明によるＡＡＣＴａｓｅ遺伝子の酵母用
発現ベクターｐＲＳ４１６ＡＡＣＴの構築工程を示す図
面である

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 浜地 正昭 兵庫県西宮市今津出在家町４番９号 大関 株式会社総合研究所内 (72)発明者 熊谷 知栄子 兵庫県西宮市今津出在家町４番９号 大関 株式会社総合研究所内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
   により測定される分子量が５３,０００であることを特
   徴とする酵母由来の新規なアルコールアシルトランスフ
   ェラーゼ。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号２に示したアミノ酸配
   列を有するポリペプチドまたは該アミノ酸配列において
   １個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加
   されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを
   特徴とするアルコールアシルトランスフェラーゼ。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号２に示したアミノ酸配
   列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列からな
   ることを特徴とするアルコールアシルトランスフェラー
   ゼ遺伝子。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号１に示したＤＮＡ配
   列、または少なくともその一部と実質的に相同な塩基配
   列を有し、アルコールアシルトランスフェラーゼ活性を
   有するポリペプチドを生産し得るＤＮＡ鎖。
5. 【請求項５】 外来遺伝子の導入によって該外来遺伝子
   の形質を導入してなる酵母において、該外来遺伝子が請
   求項３あるいは請求項４のいずれか１項に記載のアルコ
   ールアシルトランスフェラーゼ遺伝子またはＤＮＡ鎖で
   あることを特徴とする形質転換されてアルコールアシル
   トランスフェラーゼ産生能の富化された酵母。
6. 【請求項６】 ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４０である請求項
   ５記載の酵母。