WO2007097094A1 - アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子及びその用途 - Google Patents

アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子及びその用途 Download PDF

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WO2007097094A1
WO2007097094A1 PCT/JP2006/324607 JP2006324607W WO2007097094A1 WO 2007097094 A1 WO2007097094 A1 WO 2007097094A1 JP 2006324607 W JP2006324607 W JP 2006324607W WO 2007097094 A1 WO2007097094 A1 WO 2007097094A1
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polynucleotide
yeast
protein
seq
gene
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PCT/JP2006/324607
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Yoshihiro Nakao
Yukiko Kodama
Tomoko Shimonaga
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Suntory Limited
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)

Definitions

  • Asinole CoA ethanol 0-acyltransferase / esterase
  • the present invention relates to the acyl CoA: ethanol 0-acyltransferase / esterase gene and its use, and in particular, to a brewing yeast for producing a liquor with excellent flavor, an alcohol produced using the yeast, a method for producing the same. More specifically, the present invention controls the expression level of the brewing yeast meacyl CoA: Eeblp gene encoding Eeblp, an ethanol 0-acyltransferase / esterase, particularly the non-ScEEBl gene characteristic of brewer's yeast. This relates to a yeast in which the ability to produce an ester that contributes to the flavor of the product is controlled, and a method for producing alcoholic beverages using the yeast. Background art
  • Esters are one of the important fragrance components in liquor. In sake, wine, and whiskey, an increase in esters is known to bring a gorgeous fragrance to the liquor, resulting in high sensuality. On the other hand, in beer, ester is an important aroma component, but excess ester is disliked as ester odor. Therefore, it is important to appropriately control the amount of ester produced according to the type of liquor.
  • high ester-producing yeast has been bred to increase the ester content of sake.
  • it is a drug-containing medium that inhibits fatty acid synthase such as cerulenin and has the ability to produce high-strength pro-acid.
  • a method for obtaining a certain strain, and a method for obtaining a strain that highly produces isoamyl alcohol and isoamyl acetate in a medium containing leucine analog such as 5,5,5-trifluoro-DL-leucine JP 2002-253211
  • a method for obtaining a strain grown in a medium containing a sterolide having a predanan skeleton hydroxylated at the 3-position Japanese Patent Laid-Open No. 2002-191355 has been already reported.
  • the alcohol acetyltransferase gene ATF 1 of Saccharomyces cerev ⁇ iae is used in brewing yeast.
  • Examples of high expression (JP 06-062849), ATF 1 expression suppressed (JP 06-253826), destroying the esterase gene EST2 of brewing yeast and reducing the amount of ester examples of increasing (JP 0 9 - 2340 77 No.) have been reported.
  • the destruction of medium-chain fatty acid esters is caused by disruption of the EEB1 of the syl-CoA: ethanol 0_acyltransferase / esterase gene (J. Biol. Chem.
  • mutant strains have been acquired in order to increase the ester content in the product, but as a result, unexpected fermentation delays and undesired increases in flavor components may be observed.
  • yeast There was a problem with using yeast. For this reason, there has been a demand for a method of breeding yeast capable of producing a desired amount of ester without impairing the fermentation rate and product quality.
  • the present inventors have succeeded in identifying and isolating a gene coding for asyl-CoA: etanolol 0-acinoletransferase / esterase from brewer's yeast. .
  • a transformed yeast in which the obtained gene is introduced into the yeast and expressed is produced to reduce the amount of acetate produced, and a transformed yeast in which the expression of the obtained gene is suppressed is produced.
  • the present invention was completed by confirming that the production amount of acetate ester increased and the production amount of medium chain fatty acid ester decreased.
  • the present invention relates to an acyl-CoA: ethanol 0-acyltransferase / esterase gene present in beer yeast, a protein encoded by the gene, a transformed yeast in which the expression of the gene is regulated, and the expression of the gene is regulated.
  • the present invention relates to a method for controlling the amount of ester produced in a product by using yeast.
  • the present invention provides the following polynucleotide, a vector containing the polynucleotide, a transformed yeast introduced with the vector, a method for producing alcoholic beverages using the transformed yeast, and the like.
  • a protein that hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and has an acyl-CoA: ethano-monore 0-acyltransferase / esterase activity
  • acyl-CoA ethano-monore 0-acyltransferase / esterase activity
  • (f) hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; and isyl CoA: ethanol 0-a A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having syltransferase / sterase activity.
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide comprising the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and hybridizing under stringent conditions; and
  • Casil CoA A polynucleotide containing a polynucleotide encoding a protein having ethanol 0-acyltransferase / esterase activity.
  • polynucleotide according to (1) above which comprises a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a vector comprising the polynucleotide according to any one of (1) to (5) above.
  • An acyl having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 CoA Evaluate the ester-producing ability of the test yeast using a primer or probe designed based on the nucleotide sequence of the ethanol 0-acyltransferase / esterase gene Method.
  • test yeast is cultured, and the protein described in (7) above is quantified or the acyl having the base sequence of SEQ ID NO: 1 CoA: ethanol 0-acyltransferase /
  • a method for selecting a yeast comprising measuring an expression level of an esterase gene and selecting a test yeast having the protein mass or the gene expression level according to a target ester production ability. .
  • (2 2) Culturing the reference yeast and the test yeast, quantifying the protein described in (7) above in each yeast, and selecting a test fermentation mother having a higher or lower amount of the protein than the reference yeast.
  • the method for selecting yeast according to (20) above That is, by culturing a plurality of yeasts and quantifying the protein described in (7) above in each yeast, among them, a test yeast having a large or small amount of the protein is selected, and the yeast described in (20) above Yeast selection method. '+
  • FIG. 1 is a diagram showing the change over time in the amount of yeast grown in beer test brewing.
  • the horizontal axis shows the fermentation time, and the vertical axis shows the value of 0D660.
  • Fig. 2 is a diagram showing the change over time in the amount of extract consumed in beer test brewing.
  • the horizontal axis shows fermentation time, and the vertical axis shows appearance extract concentration (w / w%).
  • Figure 3 shows the expression behavior of nonScEEBl gene in yeast during beer test brewing It is.
  • the horizontal axis shows the fermentation time, and the vertical axis shows the detected signal brightness.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION 'We are able to control the amount of ester by increasing or decreasing yeast acyl-CoA: ethanol 0-acyltransferase / esterase activity. I thought.
  • the inventors of the present invention have conducted research based on such an idea, and have beer yeast decoded by the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-283169.
  • the beer yeast-specific acyl CoA ethanol
  • SEQ ID NO: 1 The amino acid sequence of the protein encoded by this gene is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the present invention relates to (a) a polynucleotide containing a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1; and (b) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • Nucleotides are provided.
  • the polynucleotide may be DNA or RNA.
  • polynucleotides of interest in the present invention are not limited to the above-mentioned beacillary yeast-derived acyl-CoA: ethanol 0-acyltransferase / esterase gene-encoding polynucleotides.
  • functionally equivalent proteins include: (c) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted, and added or added; Examples include a protein having ethanol 0-acyltransferase / esterase activity.
  • Ethanol Ethanol
  • proteins having 0-aminotransferase / esterase activity In general, the smaller the number of amino acid residue deletions, substitutions, insertions and / or additions, the better.
  • proteins include (d) SEQ ID NO: 2 amino acid sequence and about 60% or more, about 70% or more, 71% or more, 72% or more, 73% or more, 74% or more, 75% or more 76% or more, 77% or more, 78% or more, 79% or more, 80% or more, 81% or more, 82% or more. 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88 % Or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more.
  • a protein having an amino acid sequence having the same identity and having an acyl CoA ethanol 0-acyltransferase / esterase activity.
  • the larger the homology value the better.
  • acyl CoA ethanol 0-acyltransferase / esterase activity can be measured, for example, by the method of Saerens et al. (J. Biol. Chem. 281: 4446-4456, 2006). .
  • the present invention hybridizes with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, and has an acyl CoA: ethanol 0-acyltransferase / esterase activity.
  • a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence of the polynucleotide encoding the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • polynucleotides that contain a polynucleotide that is hybridized under stringent conditions and that encodes a protein having an Acinore CoA: Ethanolol 0-Acinoletransferase / esterase activity.
  • a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions means a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a polynucleotide obtained by using the colony hybridization method, plaque hybridization method, Southern hybridization method, etc. Say.
  • As a hybridization method for example X., use the method described in Molecular Cloning ⁇ rd Ed., Urrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997, etc. it can. , ''
  • the “stringent conditions” may be any of low stringency conditions, medium stringency conditions, and high stringency conditions.
  • “Low stringent conditions” are, for example, conditions of 5 X SSC, 5 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 32 ° C.
  • the “medium stringent conditions” are, for example, conditions of 5 X SS 5 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 42 ° C.
  • “High stringent conditions” are, for example, 5 X SS (:, 5 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C. In these conditions, increase the temperature.
  • polynucleotides with a high degree of homology for example, DNA
  • factors that affect the stringency of hybridization include temperature, probe concentration, and probe Multiple factors such as length, ionic strength, time, and salt concentration are conceivable, and those skilled in the art can achieve the same stringency by appropriately selecting these factors.
  • the hybridized polynucleotide eg, DNA
  • a commercially available kit for the hybridization for example, Alkphos Direct Labeling Reagents (manufactured by Amersham Almacia) can be used. In this case, follow the protocol attached to the kit, incubate with the labeled probe, and then add 0.1% (w / v) SDS to the membrane at 55 ° C. After washing with the primary washing buffer, the hybridized polynucleotide (eg, DNA) can be detected.
  • Alkphos Direct Labeling Reagents manufactured by Amersham Almacia
  • hybridizable polynucleotides were calculated using default parameters with homology search software such as FASTA and BLAST. About 60% or more, about 70% or more, 71% or more, 72% or more, 73% or more, 74% or more, 75% or more, 76% or more, 77 % Or higher, 78% or higher, 79% or higher, 80% or higher, 81% or higher, 82% or higher, 83% or higher, 84% or higher, 85% or higher, 86% or higher, 87% or higher, 8 ⁇ % or higher, 89% or higher .90% or more, 91% or more 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3 Polynucleotides having the identity of% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more, 99.9% or more
  • B LAST and Gap p e d B LAST programs use the default parameters of each program.
  • RNAi effect (1) specifically the transcript of the polynucleotide (DNA) described in (5) above; A polynucleotide encoding an RNA having an activity of cleaving; and (m) a polynucleotide encoding an RNA that suppresses the expression of the polynucleotide (DNA) described in (5) above by a co-suppression effect.
  • Nucleotides are incorporated into vectors, and can further suppress the expression of the polynucleotides (DNA) (a) to (i) above in transformed cells into which the vectors have been introduced. Therefore, it can be suitably used when it is desirable to suppress the expression of the polynucleotide (DNA).
  • “polynucleotide encoding RNA having a base sequence complementary to a transcription product of DNA” refers to so-called antisense DNA.
  • the antisense technology is known as a method for suppressing the expression of a specific endogenous gene, and is described in various literatures (for example, Hirashima and Inoue: New Chemistry Laboratory 2 Nucleic acid IV Gene replication and Expression (Refer to pp.
  • the sequence of the antisense DNA is preferably a sequence complementary to the endogenous gene or a part thereof, but may not be completely complementary as long as the expression of the gene can be effectively suppressed.
  • the transcribed RNA is preferred 90 ° / to the transcript of the target gene. More preferably, the complementarity is 95% or more.
  • the length of the antisense DNA is at least 15 bases or more, preferably 100 bases or more, and more preferably 500 bases or more.
  • RNA interference refers to a phenomenon in which when a double-stranded RNA having the same or similar sequence as the target gene sequence is introduced into a cell, both the introduced foreign gene and the target endogenous gene are suppressed. Refers to that.
  • RNA used herein include double-stranded RNA that causes interference of 21 to 25 bases in length, such as dsRA (double strand RNA), siRNA (small interfering RNA), or shRNA (short hairpin RNA).
  • RNA can be locally delivered to a desired site by a delivery system such as ribosome, and can be locally expressed using a vector that can produce the above double-stranded RNA.
  • dsRNA, siRNA or shRNA double-stranded RNA
  • Methods for preparing and using such double-stranded RNA are known from many documents (Japanese translations of PCT publication No. 2002-516062; US Publication No. 2002 / 086356A; Nature Genetics, 24 (2), 180-183, 2000 Feb .; Genesis, 26 (4), 240-244, 2000 April; Nature, 407: 6802, 319-20, 2002 Sep. 21; Genes & Dev. , Vol. 16, (8), 948-958, 2002 Apr. 15; Proc. Natl.
  • polynucleotide encoding RNA having an activity of specifically cleaving a DNA transcript generally refers to a ribozyme.
  • a ribozyme is an RNA molecule that has catalytic activity and inhibits the function of the gene by cleaving the target DNA transcript.
  • Various known literatures can also be referred to for the design of ribozymes (for example, FEBS Lett. 228: 228, 1988; FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323: 349, 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733, 1990; Nucl. Acids Res.
  • RNA that suppresses DNA expression by co-suppression effect refers to a nucleotide that inhibits the function of the target DNA by “co-suppression”.
  • co-suppression refers to a foreign gene and a target endogenous gene introduced by introducing into a cell a gene having a sequence identical to or similar to the target endogenous gene. This refers to a phenomenon in which the expression of all is suppressed.
  • Various known literatures can also be referred to for designing a polynucleotide having a co-suppression effect (for example, Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997, Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810, 1996, etc.) See).
  • the present invention also provides a protein encoded by any of the polynucleotides (a) to (i).
  • a preferred protein of the present invention comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and Z or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and A protein with syltransferase / esterase activity.
  • Such a protein comprises an amino acid sequence in which the number of amino acid residues as described above is deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and -Proteins with acyltransferase / esterase activity.
  • Such a protein includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and the above.
  • a protein having an amino acid sequence having homology as described above and having an acyl CoA: ethanol 0-aminotransferase / esterase activity Such proteins are known as "Molecular Cloning 3rd Edition", “Current 'Pro'Tocols' In 'Molecular'Biology”,"Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982) “,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982) “,”Gene; 34, 315 (1985) ",” Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985) ",” Proc Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) "and the like can be obtained using the site-directed mutagenesis method.
  • amino acid sequence of the protein of the invention 'one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added' means that one or more amino acid sequences in the same sequence are 1 or It means that there are deletion, substitution, insertion and Z or addition of multiple amino acid residues, and two or more of deletion, substitution, insertion and addition may occur at the same time.
  • amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A Leucine, Isoleucine, Norleucine, Norin, Norpaline, Alanine, 2_Aminobutanoic acid, Methionine, 0-Methylserine, t-Butyldaricin, t-Butylalanin, Cyclohexylalanin;
  • Group B Aspartic acid, Glutamic acid, Isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2_aminosuberic acid;
  • Group C asparagine, glutamine;
  • Group D lysine, arginine, ornithine, 2, 4-diaminobutanoic acid, 2, 3-di Aminopropionic acid;
  • E group proline, 3-hydroxyproline, 4-hydride;
  • F group serine, threonine, homo
  • the protein of the present invention can also be produced by chemical synthesis methods such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). It is also possible to use peptide synthesizers such as Advanced Chemtech, Perkin Elma, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecel Vega, Perceptive, Shimadzu, etc. It can also be synthesized. 3. Vector of the present invention and transformed yeast introduced with the vector
  • the present invention provides a vector containing the polynucleotide described above.
  • the vector of the present invention contains the polynucleotide (DNA) according to any one of (a) to (i) above or the polynucleotide according to any one of (j) to (m) above.
  • the vector of the present invention usually contains (X) a promoter that can be transcribed in yeast cells; (y) any one of the above (a) to (i) that is bound in the sense direction or the antisense direction.
  • the polynucleotide (DNA) according to any one of (a) to (i) above are introduced in the sense direction with respect to the promoter so as to promote the expression of.
  • the expression of the polynucleotide (DNA) according to any one of (a) to (i) above is performed. These polynucleotides are introduced in the antisense orientation relative to the promoter so as to suppress.
  • the expression of the protein of the present invention when the expression of the protein of the present invention is suppressed, it can be introduced into a vector so that the polynucleotide according to any one of U) to (m) can be expressed.
  • the expression of the DNA or the protein can be suppressed by destroying the target gene (DNA).
  • Gene disruption can be caused by the expression of the gene product in the target gene, such as the addition or deletion of single or multiple bases within the region involved, for example, the coding region or promoter region. This can be done by deleting the entire region.
  • known literature can be referred to (for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951 (1979), Methods in Enzymology, 101, 202 (1983), (See Kaihei 6-253826).
  • the expression level of the target gene can also be controlled by adding mutation to the promoter or by recombining the promoter by homologous recombination.
  • Nucleic Acids Res. 29, 4238-4250 (2001) describes how to introduce such mutations, and also controls gene expression by converting promoters. The method is described, for example, in Appl Environ Microbiol .., 72, 5266-5273 (2006).
  • As vectors used for introduction into yeast multi-copy type (YEp type), single copy type (YCp type), and chromosome integration type (Yip type) can be used.
  • YEp type is a vector data over YEp24 (JR Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academi c Press, New York, 83, 1983), as is YCp type vector YCp50 (MD. R 0se et a l., gene , 60, 237, 1987), and Y ⁇ 5 '(K. Struhl et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA, 76, 10, 1979) is known as a Yip type vector and can be easily obtained. it can.
  • any combination may be used as long as it functions in brewing yeast and is not affected by components in mash.
  • the promoter of the dalyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase gene (TDH3) and the promoter of the 3-phosphoglycerate kinase gene (PGK1) can be used.
  • TDH3 dalyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase gene
  • PGK1 3-phosphoglycerate kinase gene
  • the auxotrophic marker cannot be used in the case of brewer's yeast, so the di ⁇ neticin resistance gene (G418r), the copper resistance gene (CUP1) (Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984), senorelenin resistance gene (fas 2 m, PDR4) (Ashigaki, et al., Biochemistry, 64, 660, 1992; Hussain et al., Gene, 101, 149, 1991) can be used.
  • the vector constructed as described above is introduced into the host yeast.
  • the host yeast include any yeast that can be used for brewing, for example, brewery yeast for beer, wine, sake and the like. Specific examples include yeasts of the genus Saccharomyces ( ⁇ accharomyces) .
  • beer yeasts such as Saccharomyces pastorianus (W34 / 70), Saccharomyces caroles benoregensis (Saccharo yces carlsbergensis) NCYC453, NCYC456, etc., Saccharomyces cereviche ("acc? Aro ces NBRCigSl, NBRC1952, NBRC1953, NBRC1954, etc. can be used.
  • whiskey yeasts such as Saccharomyces Piche NCYC90, etc.
  • wine yeasts such as association wines No. 1, 3, 4 etc.
  • sake yeasts such as association yeast sake nos. 7, 9 etc.
  • beer yeast such as Saccharomyces pastorianus is preferably used.
  • yeast transformation method a publicly known method can be used.
  • electroporation method eth. Enzym., 194, ⁇ 182 (1990)
  • spheroplast method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 pl929 (1978)
  • the lithium acetate method J. Bacteriology, 153, pl63 (l983)
  • Methods in yeast genetics, 2000 Edition Can be performed by the method described in A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, etc. Yes, but not limited to this.
  • the host yeast is a standard yeast nutrient medium (for example, YEPD medium “Genetic Engineering. Vol. 1, Plenum Press, New York, 117 (1979)” etc.), and the value of 0D600nm is 1-6.
  • YEPD medium Genetic Engineering. Vol. 1, Plenum Press, New York, 117 (1979)” etc.
  • the cultured yeast is collected by centrifugation, washed, and pretreated with an alkali metal ion having a concentration of about 1 to 2M, preferably lithium ion.
  • the cells at about 3 0 ° C, allowed to stand for about 60 minutes, with about 30 ° C DNA (about l ⁇ 20 / _i g) introducing, to stand for about 60 minutes.
  • Polyethylene glycol preferably about 4,000 danoleton polyethylene glycol, is added to a final concentration of about 20% to 50%. After leaving at about 30 ° C for about 30 minutes, heat the cells at about 42 ° C for about 5 minutes. Preferably, the cell suspension is washed with a standard yeast nutrient medium, placed in a predetermined amount of fresh standard yeast nutrient medium, and allowed to stand at about 30 ° C. for about 60 minutes. After that, a transformant is obtained by planting on a standard agar medium containing antibiotics used as a selection marker. For other general cloning techniques, see "Molecular Cloning 3rd Edition", 'Methods in Yeast Genetics ⁇ A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) ", etc. Can do.
  • the desired alcoholic beverage and the ester content is increased or decreased. Slightly superior in flavor can be produced.
  • Yeast selected by the yeast evaluation method of the present invention described below can also be used in the same manner. Examples of sake lees that are targeted include, but are not limited to, beer, beer, drinks such as happoshu, wine, whiskey, and sake.
  • sake lees include, but are not limited to, beer, beer, drinks such as happoshu, wine, whiskey, and sake.
  • alcoholic beverages with ester content controlled by desired alcoholic beverages can be produced.
  • the yeast introduced with the vector of the present invention described above the yeast in which the expression of the polynucleotide (DNA) of the present invention described above is suppressed, or the yeast selected by the yeast evaluation method of the present invention described below.
  • the yeast evaluation method of the present invention described below By performing fermentation for liquor production and adjusting (increasing or decreasing) the amount of ester produced, it is possible to produce alcoholic beverages with the desired liquor and with the ester content adjusted (increased or decreased).
  • a known method can be used except that the brewing mother obtained in the present invention is used in place of the parent strain. Therefore, the raw materials, production equipment, production management, etc. may be exactly the same as the conventional method, and the cost for producing alcoholic beverages with increased ester content will not be increased. That is, according to the present invention, superior alcohol flavor, using existing facilities, can be produced without increasing the cost c
  • the present invention evaluates the ability of a test yeast to produce an ester using a primer or probe designed based on the nucleotide sequence of a acyl CoA: ethanol 0_acyltransferase / esterase gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a general method of such an evaluation method is publicly known, and is described in, for example, W 0 0 1 Z 0 4 0 5 14, Japanese Patent Application Laid-Open No. 8 _ 2 0 5 9 0 0, and the like. This evaluation method is briefly described below.
  • test yeast genome prepares the test yeast genome.
  • Methods of preparation such as Hereford method or potassium acetate method may be used any known methods (e.g., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pl30 (1990)) directed to the 0 resulting genome , Acyl CoA: Primer designed based on the base sequence (preferably 0RF sequence) of the ethanol 0-acyltransferase / esterase gene. Or, using a probe, examine whether the gene or a sequence specific to the gene exists in the genome of the test yeast. Primer or probe design can be done using public methods.
  • Detection of a gene or a specific sequence can be performed using a known method, for example, a polynucleotide containing a part or all of a specific sequence or a base sequence complementary to the base sequence.
  • Use the contained polynucleotide as one primer Use the other primer as a polynucleotide containing part or all of the sequence upstream or downstream of this sequence or a polynucleotide containing a base sequence complementary to the base sequence
  • the number of bases of the polynucleotide used for the primer is usually 10 bp or more, preferably 15 to 25 bp.
  • the number of bases in the sandwiched region is usually 300 to 2000 bp.
  • the reaction conditions for the PCR method are not particularly limited. For example, denaturation temperature: 90 to 95 ° C, annealing temperature: 40 to 60 ° C, extension temperature: 60 to 75 ° C, number of cycles: 10 times or more The following conditions can be used.
  • the obtained reaction product is separated by electrophoresis using agarose gel or the like, and the molecular weight of the amplified product can be measured. This method predicts and evaluates the ester-producing ability of the yeast depending on whether the molecular weight of the amplified product is large enough to include a specific portion of the DNA molecule. In addition, by analyzing the base sequence of the amplified product, it is possible to predict and evaluate the above performance more accurately.
  • the test yeast is cultured, and the expression level of the acyl CoA: ethanol 0-acyltransferase / esterase gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1 is measured. It is also possible to evaluate the ester-forming ability. It should be noted that the expression level of Facil CoA: ethanol 0-acyltransferase / esterase gene is measured by culturing the test yeast, and mRNA or the product of Facil CoA: ethanol 0-acyltransferase / esterase gene. This is possible by quantifying the protein. Quantification of mRNA or protein can be performed using a known method.
  • mRNA is quantified by, for example, Northern hybridization or quantitative RT-PCR, and protein is quantified by, for example, western blotting.
  • 'Kiruru Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003
  • further cultivating the test yeast, and having the base sequence of SEQ ID NO: 1 CoA:' ethanol 0 -Yeast suitable for brewing the desired liquor can be selected by measuring the expression level of the acyltransferase / esterase gene and selecting the yeast with the gene expression level according to the target ester-producing ability .
  • the reference yeast and the test yeast are cultured, the gene expression level in each yeast is measured, and the reference yeast and the test yeast are measured.
  • a desired yeast may be selected by comparing the gene expression levels of '. Specifically, for example! Reference yeast and test yeast are cultured, and the expression level of the acyl CoA: ethanol 0-acyltransferase / esterase gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is measured in each yeast.
  • a yeast suitable for brewing a desired liquor can be selected by selecting a test yeast in which the gene is highly expressed or low expressed.
  • test yeast by culturing the test yeast and selecting a yeast with a high or low ester-producing ability, or a yeast with high or low acyl CoA: ethanol 0-acyltransferase / esterase activity, A suitable test yeast can be selected.
  • the test yeast or the reference yeast may be, for example, a yeast introduced with the vector of the present invention described above, a yeast in which the expression of the polynucleotide (DNA) of the present invention described above is regulated, or a mutation treatment Yeast that has been subjected to, naturally-mutated yeast, and the like can be used.
  • the ester-forming ability can be measured, for example, by the method described in J. Am. So Brew. Chem. 49: 152-157, 1991 and J. Biol. Chem. 281: 4446-4456, 2006. Facil CoA: ethanolol 0-acyltransferase / esterase activity can be measured, for example, by the method of Saerens et al. (J.
  • Mutation treatment can be performed by any method, for example, physical methods such as ultraviolet irradiation or radiation, chemical methods using chemical treatment such as EMS (ethimethanesulphonate), ⁇ -methinole ⁇ -nitrosoguanidine, etc. (For example, see Taiji Oshima, Biochemical Experimental Method 39 Yeast Molecular Genetics Experimental Method, ⁇ 67-75, Academic Publishing Center, etc.).
  • the yeast that can be used as the reference yeast or the test yeast includes any yeast that can be used for brewing, for example, brewing yeasts such as beer, wine, and sake.
  • Saccharomyces ⁇ Ssccharomyces genus like yeast e.g., Saccharomyces Seth path Torianusu, Saccharomyces Serepishe and Saccharomyces car Luz Bergen cis
  • lager brewing yeasts such as whip Karomaisesu Nono 0 scan Torianusu Saccharomyces pastorianus W34 / 70
  • whiskey yeasts such as Saccharomyces cerevisiae NCYC90
  • wine yeasts such as association wines No.
  • sake yeasts such as association yeasts sake 7 and 9 can be used. Not limited to this.
  • brewer's yeast such as Saccharomyces pastorianus is preferably used.
  • the reference yeast and the test yeast may be selected from the above yeasts in any combination.
  • Example 1 Facil CoA: Cloning of ethanol 0-acyltransferase / esterase gene (nonScEEBl)
  • non-ccEEBl a sacyl CoA: ethanol 0-sacyltransferase gene / esterase gene peculiar to beer yeast (SEQ ID NO: : 1).
  • primers nonScEEBl— for (SEQ ID NO: 3) / nonScEEBl_rv (SEQ ID NO: 4) are designed to amplify full-length genes.
  • a DNA fragment (approximately 1.4 kb) containing the full-length nonScEEBl gene was obtained by PCR using the chromosomal DNA of / 70 strain (sometimes abbreviated as “W34 / 70 strain”).
  • the nonScEEBl gene fragment obtained as described above was inserted into the pCR2.1-T0P0 vector (Invitrogen) by TA cloning.
  • the base sequence of the nonScEEBl gene was analyzed by the Sanger method (F. Sanger, Science, 214, 1215,. 1981) 'to confirm the base sequence.
  • Example 2 Analysis of nonScEEBl gene expression during brewing beer
  • the beer was brewed using the brewer's yeast Saccharomyces pastorianus strain W34 / 70, and the brewer's yeast DNA microarray was detected from the mRNA extracted from the brewer's yeast cells during fermentation.
  • Wort extract concentration 12. 69%
  • Yeast input 12.8 ⁇ 10 6 cel ls / mL The fermentation broth was sampled over time, and changes in yeast growth (Fig. 1) and appearance extract concentration (Fig. 2) over time were observed. At the same time, yeast cells were sampled, and the prepared mRNA was labeled with piotin and hybridized with a beer yeast DNA microarray. Signal detection was performed using a GeneChip operating system (GCOS i GeneChip Operating Software 1.0, manufactured by Affymetrix). The expression pattern of the nonScEEBl gene is shown in FIG. From this result, it was confirmed that the nonScEEBl gene was expressed in normal beer fermentation.
  • Example 3 Production of nonScEEBl high expression strain
  • NonScEEBl / pCR2. 1-T0P0 described in Example 1 is digested with restriction enzymes Sacl and Notl to prepare a DNA fragment containing the entire protein coding region. This fragment is ligated with restriction enzymes Sacl and Notl-treated pYCGPYNot to construct a nonScEEBl high expression vector nonScEEBl / pYCGPYNot.
  • pYCGPYNot is a YCp type yeast expression vector The introduced gene is highly expressed by the promoter of the pyruvate kinase gene PYK1.
  • Yeast input 5g / L Fermented mash is sampled over time to examine changes in yeast growth (0D660) and extract consumption over time.
  • the acetate concentration at the end of fermentation is quantified using headspace gas chromatography (J. Am. So Brew. Chem. 49: 152-157, 1991).
  • the medium-chain fatty acid ester concentration was determined by adding 60 g of ethyl acetate to 20 g of the fermented mash and removing the aqueous layer by vigorous permeation and concentrating to 200 zl. Quantified by Jozo Kyokai shi (Journal of the Brewing Society of Japan), 90: 919-22, 1995).
  • Example 5 Disruption of nonScEEBl gene
  • Yeast input 5g / L Fermented mash is sampled over time to examine changes in yeast growth (0D660) and extract consumption over time.
  • the acetate concentration at the end of the fermentation is quantified using a head space gas chromatography (J. Am. So Brew. Chem. 49: 152-157, 1991).
  • the medium-chain fatty acid ester concentration was determined by gas chromatography after adding 60 g of ethyl acetate to 20 g of the fermented mash and removing the aqueous layer by vigorous permeation. Quantified by Nippon Jozo Kyokai shi (Journal oi the Brewing Society of Japan), 90: 919-22, 1995).
  • the yeast having a controlled expression level of the casyl CoA: ethanol 0-acyltransferase / esterase specific to the brewer's yeast disclosed in the present invention is used.
  • the amount of ester produced can be controlled without changing the fermentation process or fermentation period. This makes it possible to produce alcoholic beverages with excellent flavor.
  • the ester content imparting a gorgeous fragrance to the product is increased, it is possible to produce an alcoholic beverage having an excellent flavor.
  • malt beverages such as beer where excess ester is not preferred will reduce the amount of ester, making it possible to produce liquors with a more preferred flavor.

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Abstract

本発明は、アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子及びその用途に関し、特に、香味に優れた酒類を製造する醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母のアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼであるEeb1pをコードする遺伝子EEB1、特にビール酵母に特徴的なnonScEEB1遺伝子の発現量を制御することによって、製品の香味に寄与するエステルの生成能を制御した酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。

Description

明 細 書
アシノレ CoA： エタノール 0 -ァシルトランスフェラーゼ /エステラーゼ ,
遺伝子及びその用途 . 技術分野
'本発明は、 ァシル CoA : エタノール 0-ァシルトランスフェラーゼ /エステラーゼ 遺伝子及びその用途に関し、 特に、 香味に優れた酒類を製造する醸造酵母、 該酵母 を用いて製造した酒類、 その製造方法などに関する。 さらに具体的には、 本発明は、 醸造酵母めァシル CoA : エタノール 0-ァシルトランスフェラーゼ /エステラーゼで ある Eeblpをコードする遺伝子 EEB1、 特にビール酵母に特徴的な non-ScEEBl遺伝 子の発現量を制御することによって、 製品の香味に寄与するエステルの生成能を制 御した酵母.、 当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。 背景技術
酒類においてエステルは重要な重要な香り成分の 1つである。 清酒やワイン、 ゥ イスキーなどではエステルの増加は酒に華やかな香りをもたらし、 官能的に高い評 価をもたらすことが知られている。 一方ビールにおいてはエステルは重要な香気成 分ではあるが、 過剰なエステルはエステル臭として嫌われる。 従って酒の種類によ つてエステル生成量を適度に制御することが重要である。
これまでに、 酒のエステル含量を高める目的でエステル高生産酵母が育種されて いる。 酵母に変異処理を施し、 （または施さずに）エステル高生産酵母を効率よく分 離するために， セルレニン等の脂肪酸合成酵素を阻害する薬剤含有培地で、 力プロ ン酸を高生産する能力のある菌株を取得する方法、 及び 5 , 5， 5—トリフルォロ —D L—ロイシン等のロイシンアナログ含有培地で、 イソアミルアルコール、 酢酸 イソアミルを高生産する菌株を取得する方法 （特開 2002-253211号公報） 、 3位が 水酸化されたプレダナン骨格を有するステロイ ドを含有する培地で生育した菌株を 取得する方法 （特開 2002- 191355号公報） 等がすでに報告されている。
一方、 遺伝子操作技術を利用した酵母の育種による方法では Saccharomyces cerev^iaeのアルコールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子 ATF 1を醸造用酵母で 高発現させた例 （特開平 06-062849 号公報） や、 ATF 1の発現を抑制した例 （特開 平 06- 253826号公報） 、 醸造用酵母のエステラーゼ遺伝子 EST2 を破壊し、 エステ ル量を増加させた例 （特開平 09- 234077号公報） が報告されている。 また、 ァ、シル CoA：エタノール 0_ァシルトランスフェラーゼ /エステラーゼ遺伝子 EEB1 を破壊す ることにより、 中鎖脂肪酸エステルが減少することが報告されている（J. Biol. Chem. 281 : 4446-4456, 2006)。 一方で EEB1 破壊により酢酸エステルが増加するこ とも報告されている（ASBC 2002 meeting Abstract P- 6 、 [onl ine] , インターネッ 卜く U R L ： http : //ww . asbcnet. org/Meetings/2002/Abstracts/P-6. htm > ) 0 発明の開示
上述のとおり、 製品中のエステル含量を増大させるために、 変異株の取得が行な われているが、 その結果予期せぬ発酵遅延や、 好ましくない香味成分の増加が認め られる場合もあり、 実用酵母とするには問題があった。 このことから、 発酵速度や 製品の品質を損なうことなく、 望みの量のエステルを生産できる酵母の育種方法が 望まれていた。
本発明者らは、 上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、 ビール酵母から ァシル CoA： エタノ ノレ 0-アシノレトランスフェラーゼ /エステラーゼをコ一ドする 遺伝子を同定 ·単離することに成功した。 また、 得られた遺伝子を酵母に導入し発 現させた形質転換酵母を作製し、 酢酸エステル生成量が減少すること、 また、 得ら れた遺伝子の発現を抑制させた形質転換酵母を作製し、 酢酸エステル生成量が増加、 中鎖脂肪酸エステル生成量が減少することを確認して、 本発明を完成した。
すなわち本発明は、 ビール酵母に存在するァシル CoA：エタノール 0-ァシルトラ ンスフヱラーゼ /エステラーゼ遺伝子、 該遺伝子がコードするタンパク質、 該遺伝 子の発現が調節された形質転換酵母、 該遺伝子の発現が調節された酵母を用いるこ とによる製品中のエステル生成量の制御方法などに関する。 本発明は、 具体的には、 次に示すポリヌクレオチド、 該ポリヌクレオチドを含有するべクタ一、 該ベクタ一 が導入された形質転換酵母、 該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供す る。
( 1 ) 以下の（a)〜（f ) からなる群から選択されるポリヌクレオチド： (a)配列番号： 1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオ チド； '
(b)配列番号： 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレ'ォ チドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号： 2のアミノ酸配列において、 1 もしくは複数個のアミノ酸が欠失 置痪、 挿入および//または付加したアミノ酸配列からなり、 かつァシル CoA：エタ ノール 0-ァシルトランスフェラーゼ /エステラーゼ活性を有するタンパク質をコ一 ドするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d)配列番号： 2のアミノ酸配列に対して 60%以上の同一性を有するアミノ酸配 列を有し、 かつァシル CoA： エタノール 0-ァシルトランスフェラ一ゼ /エステラー ゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオ チド；
(e)配列番号： 1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとス ト リンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつァシル CoA：ェタノ一ノレ 0-ァシル トランスフェラーゼ /エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌク レオチドを含有するポリヌクレオチド ；及ぴ
(f)配列番号： 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオ チドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント な条件下でハイブリダイズし、 かつァシル CoA：ェタノール 0-ァシルトランスフエ ラ一ゼ / ステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含 有するポリヌクレオチド。
( 2 ) 以下の（g)〜（i)からなる群から選択される上記 （1 ) に記載のポリヌクレオ チド：
(g)配列番号： 2のァミノ酸配列又は配列番号： 2のアミノ酸配列において、 1〜 10 個のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入および または付加したアミノ酸配列からな り、 かつァシル CoA : エタノール 0-ァシルトランスフェラーゼ /エステラーゼ活性 を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号： 2のァミノ酸配列に対して 90%以上の同一性を有するァミノ酸配 列を有し、 かつァシル CoA： エタノール 0_ァシルトランスフェラーゼ /エステラー ゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオ チド；及び ,
(i)配列番号： 1の塩基配列からなるポリヌクレオチド、 又は配列番号： 1 の'塩 基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとノ、イストリンジェントな条 件下でハイブリダィズし、 かつァシル CoA：エタノール 0-ァシルトランスフェラー ゼ /エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有す るポリヌクレオチド。
(3)配列番号： 1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記 （1) に 記載のポリヌクレオチド。 '
(4) 配列番号： 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオ チドを含有する上記 （1) に記載のポリヌクレオチド。
(5) DNAである、 上記 （1) 〜 （4) のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
(6) 以下の（j)〜（m)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(j) 上記 （5) に記載のポリヌクレオチド （DNA) の転写産物に対して相補的な塩 基配列を有する RNAをコ一ドするポリヌクレオチド；
(k)上記 （5) に記載のポリヌクレオチド （DNA) の発現を RNAi効果により抑制す る RNAをコードするポリヌクレオチド；
(1) 上記 （5) に記載のポリヌクレオチド （DNA) の転写産物を特異的に切断する 活性を有する RNAをコードするポリヌクレオチド；及び
(m)上記 （ 5 ) に記載のポリヌクレオチド （DNA) の発現を共抑制効果により抑制 する RNAをコードするポリヌクレオチド。
(7) 上記 （1) 〜 （5) のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタ ンパク質。
(8) 上記 （1) 〜 （5) のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するべクタ 一。
(8 a) 以下の（x)〜（Z)の構成要素を含む発現カセッ トを含む上記 （8) に記載の ベク々^ ；
(X)酵母細胞内で転写可能なプロモーター
(y)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、 上記 (1) 〜 （5) に記載のポリヌクレオチド；及び
(z)RNA 分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、 酵母で機能するシグ,ナル。
(9) 上記 （6) に記載のポリヌクレオチドを含有するべクタ一。 '
(10) 上記 （8) 又は （9) に記載のベクターが導入された酵母。
(1 1) 上記 （8) に記載のベクタ一を導入することによって、 エステル生成能が 低下した上記（1 0)に記載の酵母。
(1 2) (A)上記 （9) に記載のベクタ一を導入することによって、 （B)上記 （5) に記載のポリヌクレオチド （DNA) に係る遺伝子を破壊することによって、 あるい は（C)プロモーターに変異を加えることによって、 またはプロモーターを組み換え ることによって、 上記 （5) に記載のポリヌクレオチド （DNA) の発現が抑制され た酵母。
(1 3) 上記 （7) に記載のタンパク質の発現量を増加させることによってエステ ル生成能が低下した上記 （1 1) に記載の酵母。
(14) 上記 （10) 〜 （1 3) のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。 (1 5) 醸造する酒類が麦芽飲料である上記 （14) に記 の酒類の製造方法。
(16) 醸造する酒類がワインである上記 （14) に記載の酒類の製造方法。
(1 7) 上記 （14) 〜 （1 6) のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
(18)配列番号： 1の塩基配列を有するァシル CoA：エタノール 0 -ァシルトラン スフエラーゼ /エステラーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマ一また はプローブを用いて、 被検酵母のエステル生成能について評価する方法。
(1 8a) 上記 （1 8) に記載の方法によって、 エステル生成能が高い、 あるいは 低い酵母を選別する方法。
(18b) 上記 （1 8a) に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類 （例え ば、 ビール） を製造する方法。
(19) 被検酵母を培養し、 配列番号： 1の塩基配列を有するァシル CoA :エタノ
—ル 0 -ァシルトランスフェラーゼ /エステラーゼ遺伝子の発現量を測定することに よって、 被検酵母のエステル生成能を評価する方法。
(20) 被検酵母を培養して、 上記 （7) に記載のタンパク質を定量または配列番 号： 1の塩基配列を有するァシル CoA：エタノール 0-ァシルトランスフェラーゼ / エステラーゼ遺伝子の発現量を測定し、 目的とするエステル生成能に応じた前記タ ンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、 酵母の選択方法。.
( 2 0 a ) 被検酵母を培養して、 エステル生成能またはアシノレ CoA ： エタノーノレ' 0- ァシルトランスフェラ一ゼ /エステラーゼ活性を測定し、 目的とするエステル生成 能またはァシル CoA：エタノール 0-ァシルトランスフェラーゼ /エステ ーゼ活性 の被検酵母を選択する、 酵母の選択方法。
( 2 1 ) 基準酵母および被検酵母を培養して配列番号： 1の塩基配列を有するァシ ノレ CoA：エタノール 0 -ァシル卜ランスフェラーゼ /エステラーゼ遺伝子の各酵母に お έナる発現量を測定し、 基準酵母よりも該遺伝子が高発現、 あるいは低発現である 被検酵母を選択する、 上記 （2 0 ) に記載の酵母の選択方法。
( 2 2 ) 基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における上記 （7 ) に記載のタ ンパク質を定量し、 基準酵母よりも該タンパク質量の多い、 あるいは少ない被検酵 母を選択する、 上記 （2 0 ) に記載の酵母の選択方法。 即ち、 複数の酵母を培養し て各酵母における上記 （7 ) に記載のタンパク質を定量し、 その中で該タンパク質 量の多い、 あるいは少ない被検酵母を選択する、 上記 （2 0 ) に記載の酵母の選択 方法。 ' +
( 2 3 ) .上記 （1 0 ) 〜 （1 3 ) に記載の酵母および上記 （2 0 ) 〜 （2 2 ) に記 载の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を 行い、 エステル生成量を調節することを特徴とする、 酒類の製造方法。 本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、 エステル含量を制御する ことができるため、 香味に優れた酒類を製造することが可能となる。 図面の簡単な説明
図 1は、 ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。 横軸は 発酵時間を、 縦軸は 0D660の値を示している。
図 2は、 ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。 横軸 は発酵時間、 縦軸は外観エキス濃度 （w/w%) を示している。
図 3は、 ビール試験醸造中の酵母における nonScEEBl遺伝子の発現挙動を示す図 である。 横軸は発酵時間、 縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。 発明を実施するための最良の形態 ' 本発明者らは、 酵母のァシル CoA：エタノール 0_ァシルトランスフェラーゼ /ェ ステラ一ゼ活性を増大もしくは減少させることによって、 エステルの量を制御する ことが可能であると考えた。 本発明者らは、 このような着想に基づいて研究を重ね、 特開 2004-283169号公報に開示の方法で解読したビール酵母.ゲノム情報を基に、 ビ ール酵母特有のァシル CoA： エタノール 0-ァシルトランスフェラ一ゼ /エステラー ゼをコードする nonScEEBl遺伝子を単離 ·同定した。 この塩基配列を配列番号： 1 に示す。 またこの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番 号： 2に示す。
1 . 本発明のポリヌクレオチド
まず、 本発明は、 （a)配列番号： 1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有 するポリヌクレオチド.；及び（b)配列番号： 2のアミノ酸配列からなるタンパク質 をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。 ポリヌク レオチドは、 D N Aであっても R N Aであってもよい。
本.発明で対象と.するポリヌクレオチドは、 上記のビール酵母由来のァシル CoA： エタノール 0-ァシルトランスフェラ一ゼ /エステラーゼ遺伝子をコードするポリヌ クレオチドに限定されるものではなく、 このタンパク質と機能的に同等なタンパク 質をコードする他のポリヌクレオチドを含む。 機能的に同等なタンパク質としては、 例えば、 （c)配列番号： 2のアミノ酸配列において、 1 もしくは複数個のアミノ酸 が欠失、 置換、 挿入およびノまたは付加したアミノ酸配列からなり、 かつァシル CoA：エタノール 0-ァシルトランスフェラーゼ /エステラーゼ活性を有するタンパ ク質が挙げられる。
このようなタンパク質としては、 配列番号： 2のアミノ酸配列において、 例えば、 ：!〜 100個、 ：！〜 90個、 1〜80個、 ：！〜 70個、 ：！〜 60個、 ：！〜 50個、 ：！〜 40個、 1〜39個、 ：！〜 38個、 ：！〜 37個、 ：！〜 36個、 ：！〜 35個、 ：！〜 34個、 ：！〜 33個、 ：!〜 32個、 ：！〜 31個、 ：！〜 30個、 1〜29個、 ：！〜 28個、 ：！〜 27個、 ：！〜 26個、 1〜25個、 1〜24個、 1〜23個、 1〜22個、 1〜21個、 1〜20個、 ：！〜 19個、
1 〜18個、 1 〜17個、 1 〜16個、 1 〜15個、 1〜14個、 1〜13個、 ：！〜 12個、
1 〜11個、 1 〜10個、 1 〜9個、 8個、 1 〜7個、 6個 （1〜数個） 、 1 '
5個、 1〜4個、 1〜3個、 1〜2個、 1個のアミノ酸残基が欠失、 置換、 挿入およ びノまたは付加されたァミノ酸配列からなり、 かつァシル CoA：ェタノール 0 -ァシ ノレトランスフェラーゼ /エステラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。 上記 アミノ酸残基の欠失、 置換、 挿入および または付加の数は、 一般的には小さい程 好ましい。 また、 このようなタンパク質としては、 （d)配列番号： 2のアミノ酸配 列と約 60%以上、 約 70%以上、 71 %以上、 72%以上、 73%以上、 74%以上、 75% 以上、 76%以上、 77%以上、 78%以上、 79%以上、 80%以上、 81 %以上、 82%以上. 83%以上、 84%以上、 85%以上、 86%以上、 87%以上、 88%以上、 89%以上、 90% 以上、 91%以上、 92%以上、 93%以上、 94%以上、 95%以上、 96%以上、 97%以上. 98%以上、 99%以上、 99. 1 %以上、 99. 2%以上、 99. 3%以上、 99. 4%以上、 99. 5% 以上、 99. 6%以上、 99. 7%以上、 99. 8%以上、 99. 9%以上の同一性を有するァミノ 酸配列を有し、 かつァシル CoA：エタノール 0-ァシルトランスフェラーゼ /エステ ラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。 上記相同性の数値は一般的に大きい 程好ましい。
なお、 ァシル CoA：ェタノール 0 -ァシルトランスフェラーゼ /エステラ一ゼ活性 は、 例えば Saerensらの方法 （J. Biol. Chem. 281 : 4446-4456， 2006) によって測 定することができる。.
また、 本発 は、 （e)配列番号： 1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリ ヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつァシル CoA： エタノール 0-ァシルトランスフェラーゼ /エステラーゼ活性を有するタンパク質を コードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び（f)配列番号： 2 のアミノ酸配列からなるタンパク質をコ一ドするポリヌクレオチドの塩基配列と相 補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズし、 かつアシノレ CoA：ェタノ一ノレ 0-アシノレトランスフェラーゼ /エステラー ゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオ チドも包含する。 ここで、 「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」 とは、 配列番号： 1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は 配列番号： 2のァミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプ ローブとして、 コロニーハイブリダィゼーシヨン法、 プラークハイブリダィゼーシ ョン法またはサザンハイブリダイゼーシヨン法などを用いることにより得られるポ リヌクレオチド （例えば、 D N A) をいう。 ハイブリダィゼーシヨンの方法として は、 例 X.は Molecular Cloning ^rd Ed. 、 し urrent Protocols in Molecular Biology, John Wi ley & Sons 1987-1997 などに記載されている方法を利用するこ と'ができる。， ' '
本明細書でいう 「ストリンジェントな条件」 は、 低ストリンジェン卜な条件、 中 ストリンジェン卜な条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。 「低ス トリンジェントな条件」 は、 例えば、 5 X SSC、 5 Xデンハルト溶液、 0. 5%SDS、 50%ホルムアミ ド、 32°Cの条件である。 また、 「中ストリンジェン卜な条件」 は、 例えば、 5 X SS 5 Xデンハルト溶液、 0. 5%SDS、 50%ホルムアミ ド、 42°Cの条件 である。 「高ストリンジェン卜な条件」 は、 例えば、 5 X SS (：、 5 Xデンハルト溶液、 0. 5%SDS、 50%ホルムアミ ド、 50°Cの条件である。 これらの条件において、 温度を 上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド （例えば、. D N A) が効率的に得 られることが期待できる。 ただし、 ハイブリダィゼーシヨンのス トリンジエンシー に影響する要素としては温度、 プローブ濃度、 プローブの長さ、 イオン強度、 時間、 塩濃度など複数の要素が考えられ、 当業者であればこれら要素を適宜選択すること で同様のス トリンジエンシーを実現することが可能である。
なお、 ハイブリダィゼ一シヨンに市販のキットを用いる場合は、 例えば Alkphos Direct Labelling Reagents (アマシャムフアルマシア社製） を用いることができ る。 この場合は、 キットに添付のプロ トコルにしたがい、 標識したプローブとのィ ンキュベ一シヨンをー晚行った後、 メンブレンを 55°Cの条件下で 0. 1% (w/v) SDS を含む 1次洗浄バッファ一で洗浄後、 ハイブリダイズしたポリヌクレオチド （例え ば、 DNA) を検出することができる。
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、 FASTA、 BLAST な どの相同性検索ソフトウエアにより、 デフォルトのパラメータを用いて計算したと きに、 配列番号： 2のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約 60%以上 約 70%以上、 71%以上、 72%以上、 73%以上、 74%以上、 75%以上、 76% 上、 77%以上、 78%以上、 79%以上、 80%以上、 81%以上、 82%以上、 83%以上、 84% 以上、 85%以上、 86%以上、 87%以上、 8β%以上、 89%以上、 .90%以上、 91%以上 92%以上、 93%以上、 94%以上、 95%以上、 96%以上、 97%以上、 98%以上、 99% 以上、 99.1%以上、 99.2%以上、 99.3%以上、 99.4%以上、 99.5%以上、 99.6%以 上、 99.7%以上、 99.8%以上、 99.9%以上以上の同一性を有するポリヌクレオチド をあげることができる。
なお、 アミノ酸配列や塩碁配列の同一性は、 カーリンおよびアルチユールによる ァノレゴリズム B LAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268, 1990； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90， 5873, 1993) を用いて決定できる。 B LAST のアルゴリズムに基づいた B LASTNや B LAS TXと呼ばれるプログラムが開 発されている （Altschul SF, et al： J. Mol. Biol. 215： 403, 1990) 。 BLA STNを用いて塩基配列を解析する場合は、 パラメータ一は、 例えば s c o r e = 100、 wo r d l e n g t h= 1 2とする。 また、 B L A S TXを用いてァミノ 酸配列を解析する場合は、 パラメータ一は、 例えば s c o r e = 50、 wo r d l e n g t.h = 3とする。 B LASTと G a p p e d B L AS Tプログラムを用い る場合は、 各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
さら (こ、 本発明のポリヌクレオチドは、 （j) 上記 （5) に記載のポリヌクレオチ ド （DNA) の転写産物に対して相補的な塩基配列を有する RNA をコードするポリヌ クレオチド； （k)上記 （5) に記載のポリヌクレオチド （DNA) の発現を RNAi効果 により抑制する RNA をコードするポリヌクレオチド； （1) 上記 （5) に記載のポ リヌクレオチド （DNA) の転写産物を特異的に切断する活性を有する RNA をコード するポリヌクレオチド；及び（m)上記 （5) に記載のポリヌクレオチド （DNA) の発 現を共抑制効果により抑制する RNAをコードするポリヌクレオチドを含む。 これら のポリヌクレオチドは、 ベクターに組込まれ、 さらにそのベクターが導入された形 質転換細胞において上記（a)〜（i)のポリヌクレオチド （DNA) の発現を抑制するこ とができる。 したがって、 上記ポリヌクレオチド （DNA) の発現を抑制することが 好ましい場合に好適に利用することができる。 本明細書中、 「DNAの転写産物に対して相補的な塩基配列を有する RNAをコード するポリヌクレオチド」 とは、 いわゆるアンチセンス DNAのことをいう。 ア チセ ンス技術は、 特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法として公知であり、 種々の 文献に記載されている （例えば、 平島および井上： 新生化学実験講座 2 核酸 IV 遺 伝子の複製と発現 （日本生化学会編， 東京化学同人） pp. 319 347， 1993 などを 参煦） 。 アンチセンス DNAの配列は、 内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列 であることが好ましいが、 遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、 完全に 相補的でなくてもよレ、。 '転写された RNAは、 標的遺伝子の転写産物に対して好まし く ま 90°/。以上、 さらに好ましくは 95%以上の相補性を有する。 アンチセンス DNA の長さは少なくとも 15塩基以上であり、 好ましくは 100塩基以上であり、 さらに 好ましくは 500塩基以上である。
本明細書中、 「DNA の発現を RNAi 効果により抑制する RNA をコードするポリヌ クレオチド」 とは、 RNA interference (RNAi) によって内在性遺伝子の発現を抑制 するためのポリヌクレオチドのことをいう。 「RNAi」 とは、 _標的遺伝子配列と同一 もしくは類似した配列を有する二重鎖 RNAを細胞内に導入すると、 導入した外来遺 伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。 ここ で用いられる R N Aとしては、 例えば、 21〜25 塩基長の 干渉を生ずる二重鎖 RNA、 例えば、 dsR A (double strand RNA) , siRNA (smal l interfering RNA)又は shRNA (short hairpin RNA)が挙げられる。 このような R N Aは、 リボソームなどの 送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、 また上記二重 鎖 RNAが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。 このような二重鎖 RNA (dsRNA、 si RNA又は shRNA)の調製方法、 使用方法などは、 多 くの文献から公知である （特表 2002-516062 号公報； 米国公開許第 2002/086356A 号； Nature Genetics, 24 (2) , 180-183, 2000 Feb. ； Genesis, 26 (4) , 240-244, 2000 Apri l ； Nature, 407 : 6802， 319 - 20, 2002 Sep. 21； Genes & Dev.， Vol. 16, (8)， 948-958, 2002 Apr. 15； Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 99 (8) , 5515—5520， 2002 Apr. 16； Science, 296 (5567)， 550-553, 2002 Apr. 19； Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99 : 9, 6047-6052, 2002 Apr. 30； Nature Biotechnology, Vol. 20 (5)， 497 - 500， 2002 May ; Nature Biotechnology, Vol. 20 (5) , 500-505， 2002 May ; Nucleic Acids Res. ， 30 : 10, e46, 2002 May 15等参照） 。
本明細書中、 「DNAの転写産物を特異的に切断する活性を有する RNAをコードす るポリヌクレオチド」 とは、 一般に、 リボザィムのことをいう。 リボザィムとは触 媒活性を有する RNA分子のことをいい、 ターゲットとする DNAの転写産物を切断す ることにより、 その遺伝子の機能を阻害する。 リボザィムの設計についても種々の 公知文献を参照することができる （例えば、 FEBS Lett. 228： 228， 1988 ； FEBS Lett. 239： 285, 1988； Nuc l. Acids. Res. 17： 7059, 1989； Nature 323 : 349, 1986； Nucl. Acids. Res. 19： 6751， 1991； Protei n Eng 3： 733, 1990； Nuc l. Acids Res. 19： 3875, 1991； Nucl. Acids ' Res. 19： 5125, 1991； Biochem Biophys Res Commun 186： 1271, 1992など参照） 。 また、 「DNAの発現を共抑制効 果により抑制する RNAをコードするポリヌクレオチド」 とは、 「共抑制」 によって、 ターゲットとなる DNAの機能を阻害す.るヌクレオチドをいう。
本明細書中、 「共抑制」 とは、 細胞中に、 標的内在性遺伝子と同一もじくは類似 した配列を有する遺伝子を形質転換により導入することにより、 導入した外来遺伝 子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことをいう。 共抑制 効果を有するポリヌクレオチドの設計についても種々の公知文献を参照することが できる （例えば、 Smyth DR : Curr. Biol. 7： R793, 1997、 Martienssen R : Curr. Biol . 6： 810， 1996など参照） 。 2 . 本発明のタンパク賓
本発明は、 上記ポリヌクレオチド（a)〜（i)のいずれかにコードされるタンパク質 も提供する。 本発明の好ましいタンパク質は、 配列番号： 2のアミノ酸配列におい て、 1 もしくは複数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および Zまたは付加したアミ ノ酸配列からなり、 かつァシル CoA：ェタノール 0 -ァシルトランスフェラ一ゼ /ェ ステラ一ゼ活性を有するタンパク質である。 このようなタンパク質としては、 配列 番号： 2のアミノ酸配列において、 上記したような数のアミノ酸残基が欠失、 置換、 挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつァシル CoA：エタノー ノレ 0-ァシルトランスフェラーゼ /ェステラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられ る。 また、 このようなタンパク質としては、 配列番号： 2のアミノ酸配列と上記し たような相同性を有するアミノ酸配列を有し、 かつァシル CoA：エタノール 0 -ァシ ノレトランスフヱラーゼ /エステラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。，この ようなタンパク質は、 「モレキュラークロ一ニング第 3版」 、 「カレント 'プロ'ト コ一ルズ 'イン 'モレキュラー 'バイオロジー」 、 "Nuc. Ac ids. Res. , 10, 6487 (1982) " 、 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982) " 、 "Gene; 34， 315 (1985) " 、 "Nuc. Acids. Res. , 13， 4431 (1985) " 、 "Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 82， 488 (1985) " 等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、 取得すること ができる。
発明のタンパク質のアミノ酸配列において' 1以上のアミノ酸残基が欠失、 置換、 挿入および または付加されたとは、 同一配列中の任意かつ 1もしくは複数のァミ ノ酸配列中の位置において、 1 または複数のアミノ酸残基の欠失、 置換、 挿入及び Z又は付加があることを意味し、 欠失、 置換、 挿入及び付加のうち 2種以上が同時 に生じてもよレ、。
■ 以下に、 相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。 同一群に含まれるアミノ酸 残基は相互に置換可能である。 A 群： ロイシン、 イソロイシン、 ノルロイシン、 ノく リン、 ノルパリン、 ァラニン、 2_アミノブタン酸、 メチォニン、 0-メチルセリン、, t-ブチルダリシン、 t-ブチルァラニン、 シクロへキシルァラニン ； B 群 ： ァスパ ラギン酸、 グルタミン酸、 イソァスパラギン酸、 イソグルタミン酸、 2-アミノアジ ピン酸、 2_アミノスべリン酸； C 群： ァスパラギン、 グルタミン ； D 群： リジ ン、 アルギニン、 オル二チン、 2， 4-ジァミノブタン酸、 2， 3-ジァミノプロピオン 酸； E 群：プロリン、 3-ヒ ドロキシプロリン、 4-ヒ ド口.キシプロリン； F 群： セリン、 スレオニン、 ホモセリン； G群： フエニノレアラニン、 チロシン。
また、 本発明のタンパク質は、 Fmoc 法 （フルォレニルメチルォキシカルボニル 法） 、 tBoc 法 （t-ブチルォキシカルボニル法） 等の化学合成法によっても製造す ることができる。 また、 アドバンスドケムテック社製、 パーキンエルマ一社製、 フ アルマシア社製、 プロテインテクノロジーインス トウルメント社製、 シンセセル一 ベガ社製、 パーセプティブ社製、 島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化 学合成することもできる。 3 . 本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、 本発明は、 上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。 本 発明のベクターは、 上記（a)〜（i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド （DNA) 又 は上記（j)〜 （m) のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する。 また、 本発明 のベクターは、 通常、 （X)酵母細胞内で転写可能なプロモーター； （y)該プロモータ 一 ίこセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、 上記（a)〜（i)のいずれかに記 載のポリヌクレオチド （DNA) ；及び（z) RNA 分子の転写終結およびポリアデニル化 に関し、 酵母で機能する'シグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように 構 される。 .本発明においては、 後述する酒類'（例えば、 ビール） の醸造において、 上記本発明のタンパク質を高発現させる場合は、 上記 (a)〜（i )のいずれかに記載の ポリヌクレオチド （DNA) の発現を促進するようにこれらのポリヌクレオチドを該 プロモーターに対してセンス方向に導入する。 また、 後述する酒類 （例えば、 ビー ノレ） の醸造において、 上記本発明のタンパク質の発現を抑制させる場合は、 上記 (a)〜（i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド (DNA) の発現を抑制するようにこ れらのポリヌクレオチドを該プロモータ一に対してアンチセンス方向に導入する。 また、 上記本発明のタンパク質の発現を抑制させる場合は、 上記 U)〜（m)のいずれ かに記載のポリヌクレオチドが発現可能なようにベクターに導入することもできる。 なお、 本発明においては、 ターゲットとする上記遺伝子 （DNA) を破壊することに よって、 上記 DNAの発現または上記タンパク質の発現を抑制することができる。 遺 伝子の破壊は、 ターゲッ トとする遺伝子における遺伝子産物の発現 Jこ関与する領域、 例えば、 コード領域やプロモーター領域の内部へ単一あるいは複数の塩基を付加あ るいは欠失させたり、 これらの領域全体を欠失させることにより行うことができる。 このような遺伝子破壊の手法は、 公知の文献を参照することができる （例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76， 4951 (1979) 、 Methods in Enzymology, 101， 202 (1983)、 特開平 6- 253826号公報など参照） 。
また、 本発明においてはプロモータ一に変異を加えることによって、 あるいはプ 口モータ一を相同組み換えによって組み換えることによってターゲット遺伝子の発 現量を制御することもできる。 このような変異の導入方法は Nuc lei c Acids Res. 29、 4238- 4250 (2001) に、 また、 プロモーターの変換による遺伝子の発現制御 方法は、 例えば、 Appl Environ Microbiol.. , 72, 5266-5273 (2006)に記載されてい る。 ， 酵母に導入する際に用いるベクターとしては、 多コピー型 (YEp 型） 、 単コピ^" 型 （YCp型） 、 染色体組み込み型 （Yip 型） のいずれもが利用可能である。 例えば、 YEp 型ベク タ ー と して は YEp24 (J. R. Broach et al.， Experimental Manipulation of Gene Expression, Academi c Press, New York, 83, 1983) 、 YCp 型ベクターとしては YCp50 (M D. R0se et al. , gene, 60， 237， 1987) 、 Yip 型 ベクターとしては ΥΙρ5' (K. Struhl et al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA, 76， 10 ， 1979) が知られており、 容易に入手することができる。
酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター Zターミネータ一としては、 醸造用酵母中で機能するとともに、 もろみ中の成分に影響を受けなければ、 任意の 組み合わせでよい。 例えばダリセルアルデヒ ド 3 リン酸デヒ ドロゲナーゼ遺伝子 (TDH3) のプロモーター、 3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子 （PGK1) のプロモ —タ一などが利用可能である。 これらの遺伝子はすでにクローニングされており、 例えば M. F. Tu i te et al. , EMB0 J. , 1， 603 (1982) に詳細に記載されており、 既知の方法により容易に入手することができる。
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、 醸造用酵母の場合は栄養要求性マ 一力一が利用できないので、 ジヱネチシン耐性遺伝子 （G418r) 、 銅耐性遺伝子 (CUP1) (Marin et al .， Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 81， 337 1984) 、 セノレレ ニン耐性遺伝子 （fas2m, PDR4) (それぞれ猪腰淳嗣ら， 生化学， 64, 660， 1992； Hussain et al. , gene, 101, 149, 1991 ) などが利用可能である。
上記のように構築されるベクターは、 宿主酵母に導入される。 宿主酵母としては、 醸造用に使用可能な任意の酵母、 例えばビール， ワイン、 清酒等の醸造用酵母等が 挙げられる。 具体的には、 サッカロマイセス (^accharomyces) 属等の酵母が挙げ られるが、 本発明においては、 ビール酵母、 例えばサッカロマイセス パス トリア ヌス Saccharomyces pastorianus) W34/70 等、 サッカロマイセス カーノレスべノレ ゲンシス {Saccharo yces carlsbergensis) NCYC453、 NCYC456 等、 サッカロマイ セス セ レビシェ（ "acc ?aro ces
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NBRCigSl、 NBRC1952、 NBRC1953、 NBRC1954 等が使用できる。 さらにウィスキー酵母、 例えばサッカロマイセス セレ ピシェ NCYC90等、 ワイン酵母、 例えば協会ぶどう酒用 1号、 同 3号、 同 4号等、 清酒酵母、 例えば協会酵母 清酒用 7号、 同 9号等も用いることができるが、 これ に限定されない。 本発明においては、 ビール酵母、 例えばサッカロマイセス パス トリアヌスが好ましく用いられる。
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。 例えば、 エレク トロポレーシヨン法 " eth. Enzym. , 194, ρ182 (1990) " 、 スフエロプラス ト法 " Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 75 pl929 (1978) " 、 酢酸リチウム法 " J. Bacteriology, 153， pl63 (l983) " 、 Proc. Natl .■ Acad. Sci. USA, 75 pl929 (1978)、 Methods in yeast geneti cs, 2000 Edi t ion ： A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual などに記載の方法で実施可能であるが、 これに限定さ れない。
より具体的には、 宿主酵母を標準酵母栄養培地 （例えば YEPD 培地 "Genetic Engineering. Vol . 1， Plenum Press, New York, 117 (1979) " 等） で、 0D600nm の 値が 1〜6 となるように培養する。 この培養酵母を遠心分離して集め、 洗浄し、 濃 度約 1〜2Mのアルカリ金属イオン、 好ましくはリチウムイオンで前処理する。 この 細胞を約 3 0 °Cで、 約 60分間静置した後、 導入する DNA (約 l〜20 /_i g) とともに 約 30°Cで、 約 60分間静置する。 ポリエチレングリコール、 好ましくは約 4, 000ダ ノレトンのポリエチレングリコールを、 最終濃度が約 20%〜50%となるように加え る。 約 30°Cで、 約 30分間静置した後、 この細胞を約 42°Cで約 5分間加熱処理する。 好ましくは、 この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、 所定量の新鮮な標準酵 母栄養培地に入れて、 約 30°Cで約 60分間静置する。 その後、 選択マーカーとして 用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、 形質転換体を取得する。 そ の他、 一般的なクローニング技術に関しては、 「モレキュラークロ一ユング第 3 版」 、 'Methods in Yeast Genetics^ A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor, NY) " 等を参照することができる。
4 . 本発明の酒類の製法及びその製法によつて得られる酒類
上述した本発明のべクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、 その酵母を用いることによって所望の酒類でかつエステル含量が増加、 あるいは減 少し、 香味に優れた酒類を製造することができる。 また、 下記の本発明の酵母の評 価方法によって選択された酵母も同様に用いることができる。 対象となる酒顯とし ては、 これらに限定されないが、 例えば、 ビール、 発泡酒などのビ一ルティスト'ド リンク、 ワイン、 ウィスキー、 清酒などが挙げられる。 なお、 本発明においては、 必要に応じて、 ターゲットとなる遺伝子の発現が抑制された醸造用酵母を用いるこ とによって、 所望の酒類でエステル含量を制御した酒類を製造することもできる。 すなわち、 上述した本発明のベクターを導入した酵母、 上述した本発明のポリヌク レオチド （DNA) の発現が抑制された酵母または下記の本発明の酵母の評価方法に よ て選択された酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、 エステル生成量を調 節 （増加又は低減） することによって、 所望の酒類で、 かつエステル含量が調節 (増加又は低減） された酒類を製造することができる。
これらの酒類を製造する場合は、 親株の代わりに本発明において得られた醸造酵 母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。 したがって、 原料、 製造設 備、 製造管理等は従来法と全く同一でよく、 エステル含量を増加させた酒類を製造 するためのコス トを増加させることはない。 つまり、 本発明によれば、 香味に優れ た酒類を、 既存の施設を用い、 コス トを増加させることなく製造することができる c
5 . 本発明の酵母の評価方法
本発明は、 配列番号： 1の塩基配列を有するァシル CoA：エタノール 0_ァシルト ランスフェラーゼ /エステラーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー またはプローブを用いて、 被検酵母のエステル生成能について評価する方法に関す る。 このような評価方法の一般的手法は公知であり、 例えば、 W〇 0 1 Z 0 4 0 5 1 4号公報、 特開平 8 _ 2 0 5 9 0 0号公報などに記載されている。 以下、 この評 価方法について簡単に説明する。
まず、 被検酵母のゲノムを調製する。 調製方法は、 Hereford 法や酢酸カリウム 法など、 公知の如何なる方法を用いることができる （例えば、 Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pl30 (1990) ) 0 得られたゲノ ムを対象にして、 ァシル CoA： エタノール 0-ァシルトランスフェラーゼ /エステラ ーゼ遺伝子の塩基配列 （好ましくは、 0RF 配列） に基づいて設計したプライマーま たはプローブを用いて、 被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異 的な配列が存在するか否かを調べる。 プライマーまたはプローブの設計は公 の手 法を用いて行うことができる。 ' 遺伝子または特異的な配列の検出は、 公知の手法を用いて実施することができる, 例えば、 特異的配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列 に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部または 全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む ポ ヌクレオチドを用いて、 PCR 法によって酵母の核酸を増幅し、 増幅物の有無、 増幅物の分子量の大きさなどを測定する。 プライマーに使用するポリヌクレオチド の塩基数は、 通常、 10bp 以上であり、 15〜25bp であることが好ましい。 また、 挟 み込む部分の塩基数は、 通常、 300 〜2000bpが適当である。
PCR 法の反応条件は、 特に限定されないが、 例えば、 変性温度： 90〜95°C、 ァニ —リング温度： 40〜60°C、 伸長温度： 60〜75°C、 サイクル数： 10 回以上などの条 件を用いることができる。 得られる反応生成物はァガロースゲルなどを用いた電気 泳動法等によって分離され、 増幅産物の分子量を測定することができる。 この方 ¾ により、 .増幅産物の分子量が特異部分の DNA 分子を含む大きさかどうかによつて、 その酵母のエステル生産能について予測 .評価する。 また、 増幅物の塩基配列を分 析するごとによって、 さらに上記性能についてより正確に予測 ·評価することが可 能である。
また、 本発明においては、 被検酵母を培養し、 配列番号： 1の塩基配列を有する ァシル CoA : エタノール 0-ァシルトランスフェラ一ゼ /エステラーゼ遺伝子の発現 量を測定することによって、 被検酵母のエステル生成能を評価することもできる。 なお、 ァシル CoA : エタノール 0-ァシルトランスフェラ一ゼ /エステラーゼ遺伝子 の発現量の測定は、 被検酵母を培養し、 ァシル CoA：エタノール 0-ァシルトランス フェラ一ゼ /エステラーゼ遺伝子の産物である mRNA又はタンパク質を定量すること によって可能である。 mRNA 又はタンパク質の定量は、 公知の手法を用いて行うこ とができる。 mRNA の定量は例えばノーザンハイブリダィゼーシヨンや定量的 R T - P C Rによって、 タンパク質の定量は例えばウェスタンブロッティングによって 行うこと ) 、'きる (Current Protocols in Molecular Biology, John Wi ley & Sons 1994-2003) 0 , さらに、 被検酵母を培養して、 配列番号： 1の塩基配列を有するァシル CoA : 'ェ タノール 0-ァシルトランスフェラーゼ /エステラーゼ遺伝子の発現量を測定し、 目 的とするエステル生成能に応じた前記遺伝子発現量の酵母を選択することによって 所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。 また、 基準酵母および被 検酵母を培養し、 各酵母における前記遺伝子発現量を測定し、 基準酵母と被検酵母
' の前記遺伝子発現量を比較して、 所望の酵母を選択してもよい。 具体的には、 例え ば！ 基準酵母および被検酵母を培養して配列番号： 1の塩基配列を有するァシル CoA： エタノール 0-ァシルトランスフェラ一ゼ /エステラーゼ遺伝子の各酵母にお ける発現量を測定し、 基準酵母よりも該遺伝子が高発現、 あるいは低発現である被 検酵母を選択することによって所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することがで きる。
あるいは、 被検酵母を培養して、 エステル生成能の高いまたは低い、 あるいはァ シル CoA： エタノール 0 -ァシルトランスフェラーゼ /エステラーゼ活性の高いまた は低い酵母を選択することによって、 所望の酒類の醸造に好適な被検酵母を選択す ることができる。
これらの場合、 .被検酵母または基準酵母としては、 例えば、 上述した本発明のベ クタ一を導入した酵母、 上述した本発明のポリヌクレオチド （DNA) の発現が調節 された酵母、 突然変異処理が施された酵母、 自然変異した酵母などが使用され得る 。 エステル生成能は、 例えば、 J. Am. So Brew. Chem. 49： 152- 157, 1991 や J. Biol. Chem. 281 : 4446-4456, 2006 に記載の方法によって測定することができる。 ァシル CoA： エタノーノレ 0-ァシルトランスフェラーゼ /エステラーゼ活性は、 例え ば、 Saerens らの方法 （J. Biol . Chem. 281 : 4446-4456， 2006) によって測定する ことができる。 突然変異処理は、 例えば、 紫外線照射や放射線照射などの物理的方 法、 E M S (ェチ メタンスノレホネート） 、 Ν—メチノレー Ν—ニトロソグァ二ジン などの薬剤処理による化学的方法など、 いかなる方法を用いてもよい （例えば、 大 嶋泰治編著、 生物化学実験法 39 酵母分子遺伝学実験法、 ρ 67-75、 学会出版セン ターなど参照） 。 なお、 基準酵母、 被検酵母として使用され得る酵母としては、 醸造用に使用可能 な任意の酵母、 例えばビール， ワイン、 清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。，具体 的には、 サッカロマイセス ^Ssccharomyces 属等の酵母 （例えば、 サッカロマイ セス パス トリアヌス、 サッカロマイセス セレピシェ及びサッカロマイセス カー ルスベルゲンシス） が挙げられるが、 本発明においては、 ビール酵母、 例えばサッ カロマイセス ノヽ0ス トリアヌス Saccharomyces pastorianus W34/70 等、 サッカ ロマイセス カーノレスベノレゲン シス (Saccharo yces carlsbergensis) NCYC453、 NCYC456 等、 サッカロマイセスセレビシェ（ Saccharomyces cere visiae) NBRC 1951、 NBRC1952, NBRC1953, NBRC1954 等が使用できる。 さらにウィスキー酵母、 例えば サッカロマイセス セレピシェ NCYC90等、 ワイン酵母、 例えば協会ぶどう酒用 1号 、 同 3号、 同 4号等、 清酒酵母、 例えば協会酵母 清酒用 7号、 同 9号等も用いる ことができるが、 これに限定されない。 本発明においては、 ビール酵母、 例えばサ ッカロマイセスパス トリアヌスが好ましく用いられる。 基準酵母、 被検酵母は、 上 記酵母から任意の組み合わせで選択しても良い。 実 施 例
以下、 実施例によって本発明の詳細を述べるが、 本発明は以下の実施例に限定さ れるものではなレ、。 実施例 1 ： ァシル CoA： エタノール 0-ァシルトランスフェラーゼ /エステラーゼ遺 伝子 （nonScEEBl) のクローニング
特開 2004-283169号公報に記載の比較データベースを用いて検索した結果、 ビー ル酵母に特有のァシル CoA： エタノール 0-ァシルトランスフェラ一ゼ /エステラ一 ゼ遺伝子、 nonScEEBl を見出した （配列番号： 1 ) 。 得られた塩基配列情報を基に、 それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマー nonScEEBl— for (配列番号： 3 ) /nonScEEBl_rv (配列番号： 4 ) を設計し、 ゲノム解読株サッカロマイセス パス トリアヌス バイへンステフアン 34/70 株 （ 「W34/70 株」 と略記することがあ る。 ） の染色体 DNAを铸型とした PCRによって nonScEEBlの全長遺伝子を含む DNA 断片 （約 1. 4kb) を取得した。 上記のようにして得られた nonScEEBl 遺伝子断片を、 TA クロ一ニングによって pCR2. 1-T0P0ベクター （インビトロジェン社製） に挿入した。 nonScEEBl 遺伝子の 塩基配列をサンガーの方法 （F. Sanger, Science, 214, 1215, . 1981) で分析し'、 塩基配列を確認した。 実施例 2 ： ビール試醸中の nonScEEBl遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス パス トリアヌス W34/70 株を用いてビール試醸を 行い、 発酵中のビール酵母菌体から抽出した mRNAをビール酵母 DNAマイクロアレ イ 検出した。 麦汁エキス濃度 12. 69%
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8. Dppm
発酵温度 15°C
酵母投入量 12. 8 X 106cel ls/mL 発酵液を経時的にサンプリングし、 酵母増殖量 （図 1 ) .、 外観エキス濃度 （図 2 ) の経時変化を観察した。 またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、 調製し た mRNA をピオチンラベルして、 ビール酵母 DNAマイクロアレイにハイブリダイズ させた。 シグナルの検出はジーンチップオペレーティ ングシステム (GCOS i GeneChip Operating Software 1. 0、 ァフィメ トリ.クス社製） を用いて つ た。 nonScEEBl 遺伝子の発現パターンを図 3に示す。 この結果より、 通常のビール 発酵において nonScEEBl遺伝子が発現していることを確認した。 実施例 3 ： nonScEEBl高発現株の作製
実施例 1に記載の nonScEEBl/pCR2. 1-T0P0を制限酵素 Saclおよび Notl消化し、 タンパク質コード領域全長を含む DNA 断片を調製する。 この断片を制限酵素 Sacl および Notl 処理した pYCGPYNot に連結させ、 nonScEEBl 高発現ベクター nonScEEBl/pYCGPYNot を構築する。 pYCGPYNotは YCp型の酵母発現ベクターであり 導入された遺伝子はピルビン酸キナ一ゼ遺伝子 PYK1 のプロモータ一によって高発 現される。 酵母での選択マーカ一としてジヱネチシン耐性遺伝子 G418rを、 また大 腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子 Amp1'を含んでいる。 上述'の 方法で作製した高発現ベクターを用い、 特開平 07-303475号公報に記載された方法 でサッカロマイセス パス トリアヌス バイへンステフアン 34/70株を形質転換す る。 ジエネチシン 300mg/Lを含む YPD平板培地 （1%酵母エキス、 2%ポリペプトン、 2%グルコース、 2%寒天） で形質転換体を選択する。 実施例 4 ： ビール試験醸造におけるエステル生成量の解析
親株 （W34/70 株） ならびに実施例 3で得られる nonScEEBl 高発現株を用いた発 酵試験を、 以下の条件で行う。 麦汁エキス濃度 13%
麦汁容量 1 L
麦汁溶存酸素濃度 8ppm
発酵温度 15°C
酵母投入量 5g/L 発酵もろみを経時的にサンプリングし、 酵母増殖量 （0D660) 、 エキス消費量の 経時変化を調べる。 発酵終了時における酢酸エステル濃度の定量は、 へッドスぺー スガスクロマトグラフィー （J. Am. So Brew. Chem. 49： 152-157, 1991) を用いて 行う。 発酵終了時における中鎖脂肪酸エステル濃度は、 発酵もろみ上清 20 gに酢 酸ェチル 6 0 gを加え激しく浸透して水層を除去し、 200 z l まで濃縮した後、 ガ スクロマトグフフィ一 (Nippon Jozo Kyokai shi (Journal of the Brewing Society of Japan), 90 : 919-22, 1995) で定量する。 実施例 5 ： nonScEEBl遺伝子の破壊
文献 （Goldstein et al. , yeast. 15 1541 (1999) ) の方法に従い、 薬剤耐性マ
—カーを含むプラスミ ド（pFA6a (G418r) , pAG25 (natl) , pAG32 (hph) ) をテンプレ
—トとした PCRによって遺伝子破壊用断片を作製する。 PCR用のプライマーとして nonScEEBl_delta_for (配列番号： 5 ) 、 nonScEEBl_delta_rv (配列番号： 6 ) を 用いる。 , 上述の方法で作製した遺伝子破壊用断片でビール酵母サッカロマイセス パス'ト リアヌス W34/70株より分離した胞子クローン株 （W34/70- 2) を形質転換する。 形 質転換は特開平 07-303475 号公報に記載された方法で行い、 ジエネチシン (Geneticin) 300mg/Lあるいはノーセォスリシン（Nourseothri ci n 50mg/Lあるレヽ ハイグロマイシン B (Hygromycin B) 200mg/Lを含む YPD平板培地 （1%酵母エキス、 2%ポリペプトン、 2%グルコース、 2%寒天） で形質転換体を選択する。 実施例 6 ： ビール試験醸造におけるエステル生成量の解析
親株 （W34/70-2 株） ならびに実施例 5で得られる nonScEEBl 破壊株を用いた発 酵試験を、 以下の条件で行う。 麦汁エキス濃度 13%
麦汁容量 1 L
麦汁溶存酸素濃度 8ppm
発酵温度 15°C
酵母投入量 5g/L 発酵もろみを経時的にサンプリングし、 酵母増殖量 （0D660) 、 エキス消費量の 経時変化を調べる。 発酵終了時における酢酸エステル濃度の定量は、 へッドスぺー スガスクロマトグラフィ一 （J. Am. So Brew. Chem. 49： 152-157, 1991) を用いて 行う。 発酵終了時における中鎖脂肪酸エステル濃度は、 発酵もろみ上清 20 gに酢 酸ェチル 6 0 gを加え激しく浸透して水層を除去し、 200 // 1 まで濃縮した後、 ガ スクロマトグラフィー (Nippon Jozo Kyokai shi (Journal oi the Brewing Society of Japan), 90 : 919 - 22， 1995) で定量する。 以上のようにして、 本発明で開示されたビール酵母特有のァシル CoA：エタノー ル 0 -ァシルトランスフヱラーゼ /エステラーゼの発現量を制御された酵母を用いれ ば、 発酵工程や発酵期間を変えることなく、 エステルの生成量を制御することが可 能となる。 これによつて香味に優れた酒類を製造することが可能となる。 ， 産業上の利用可能性
本発明の酒類製造法によれば、 製品に華やかな香りを付与するエステル含量が增 大するため、 香味の優れた酒類を製造することが可能となる。 また、 過剰なエステ ルが好まれないビールなどの麦芽飲料においてはエステル量が減少し、 より好まし い香味の酒類を製造することが可能となる。

Claims

請求の範囲
1 . 以下の（a)〜（f)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号： 1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレ ォチド；.
(b)配列番号： 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレ ォチドを含有するポリヌクレオチド；
(
(c)配列番号： 2のアミノ酸配列において、 1 もしくは複数個のアミノ酸が欠 失、 置換、 揷入および Zまたは付加したアミノ酸配列からなり、 かつァシル CoA :エタノール 0-ァシルトランスフェラ一ゼ /エステラーゼ活性を有するタン パク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d) 配列番号： 2のァミノ酸配列に対して 60%以上の同一性を有するァミノ酸 配列を有し、 かつァシル CoA： エタノール 0-ァシル 'トランスフェラーゼ /エステ ラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌ クレオチド； '
(e)配列番号： 1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと ス トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつァシル CoA： ェタノール 0- ァシルトランスフェラーゼ /エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする ポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号： 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレ ォチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェ ントな条件下でハイブリダイズし、 かつァシル CoA：ェタノ一ノレ 0-ァシルトラン スフエラーゼ /エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオ チドを含有するポリヌクレオチド。
2 . 以下の（g)〜（i)からなる群から選択される請求項 1に記載のポリヌクレオ チド：
(g)配列番号： 2のアミノ酸配列又は配列番号： 2のアミノ酸配列において、 1 〜10 個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および または付加したアミノ酸配列か らなり、 かつアシノレ CoA： エタノーノレ 0_アシノレトランスフェラーゼ /エステラー ゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレ, ォチド ；
(h) 配列番号： 2のアミノ酸配列に対して 90%以上の同一性を有するアミノ酸 配列を有し、 かつァシル， CoA： エタノール 0-アシノレトランスフェラ一ゼ /エステ ラーゼ活性を有するタンパク質をコ一ドするポリヌクレオチドを含有するポリヌ クレオチド；及び
(i)配列番号： 1の塩基配列からなるポリヌクレオチド、 又は配列番号： 1 の 塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェント な条件下でハイブリダィズし、 かつァシル CoA :エタノール 0-ァシルトランスフ エラーゼ /エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド を含有するポリヌクレオチド。
3 . 配列番号： 1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項 1に 記載のポリヌクレオチド。
4 . 配列番号： 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレ ォチドを含有する請求項 1に記載のポリヌクレオチド。
5 . DNAである、 請求項 1〜4のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
6 . 以下の（j)〜（m)からなる群から選択される記載のポリヌクレオチド：
(j) 請求項 5に記載のポリヌクレオチド （DNA) の転写産物に対して相補的な塩 基配列を有する RNAを —ドするポリヌクレオチド；
(k)請求項 5に記載のポリヌクレオチド （DNA) の発現を RNAi効果により抑制す る RNAをコードするポリヌクレオチド；
(1) 請求項 5に記載のポリヌクレオチド （DNA) の転写産物を特異的に切断する 活性を有する RNAをコードするポリヌクレオチド；及び
(m)請求項 5に記載のポリヌクレオチド （DNA) の発現を共抑制効果により抑制 する RNAをコードするポリヌクレオチド。
7 . 請求項 1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコ一ドされるタンパ ク質。
8 . 請求項 1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
9 . 請求項 6に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
1 0 . , 請求項 8又は 9に記載のベクタ一が導入された酵母。 ，
1 1 . 請求項 8に記載のベクターを導入することによって、 エステル生成能が 低下した請求項 1 0に記載の酵母。
1 2 . (A)請求項 9に記載のベクターを導入することによって、 （B)請求項 5に 記載のポリヌクレオチド （DNA) に係る遺伝子を破壊することによって、 あるい は（C)プロモーターに変異を加えることによって、 またはプロモータ一を組み換 えることによって、 請求項 5に記載のポリヌクレオチド （DNA) の発現が抑制さ れた酵母。 ■ .
1 3 . 請求項 7に記載のタンパク質の発現量を増加させることによってエステ ル生成能が低下した請求項 1 1に記載の酵母。
1 4 . 請求項 1 0〜 1 3のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
1 5 . 醸造する酒類が麦芽飲料である請求項 1 4に記載の酒類の製造方法。
1 6 . 醸造する酒類がワインである請求項 1 4に記載の酒類の製造方法。
1 7 . 請求項 1 4〜 1 6のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
1 8 . 配列番号： 1の塩基配列を有するァシル CoA：エタノール 0-ァシルトラ ンスフェラーゼ /エステラーゼ遺伝子の塩基配列に基づレ、て設計したプライマー またはプローブを用いて、 被検酵母のエステル生成能について評価する方法。.
1 9 . 被検酵母を培養し、 配列番号： 1め塩基配列を有するァシル CoA :エタ ノール 0 -ァシルトランスフェラーゼ /エステラーゼ遺伝子の発現量を測定するこ とによって、 被検酵母のエステル生成能を評価する方法。
2 0 . 被検酵母を培養して、 請求項 7に記載のタンパク質を定量または配列番 号： 1の塩基配列を有す ァシル CoA：エタノール 0-アシノレトランスフェラーゼ /エステラーゼ遺伝子の発現量を測定し、 目的とするエステル生成能に応じた前 記タンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、 酵母の選択方法。
2 1 . 基準酵母および被検酵母を培養して配列番号： 1の塩基配列を有するァ シル CoA : エタノール 0_ァシルトランスフェラーゼ /エステラーゼ遺伝子の各酵 母における発現量を測定し、 基準酵母よりも該遺伝子が高発現、 あるいは低発現 である被検酵母を選択する、 請求項 2 0に記載の酵母の選択方法。
2 2 . 基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項 7に記載のタ ンパク質を定量し、 基準酵母よりも該タンパク質量の多い.、 あるいは少ない被 酵母を選択する、 請求項 2 0に記載の酵母の選択方法。
2 3 . 請求項 1 0〜 1 3に記載の酵母および請求項 2 0〜 2 2に記載の方法に より選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、 ェ ステル生成量を調節することを特徴とする、 酒類の製造方法。
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