WO2007099885A1 - アミノ酸トランスポーター遺伝子及びその用途 - Google Patents

アミノ酸トランスポーター遺伝子及びその用途 Download PDF

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WO2007099885A1
WO2007099885A1 PCT/JP2007/053448 JP2007053448W WO2007099885A1 WO 2007099885 A1 WO2007099885 A1 WO 2007099885A1 JP 2007053448 W JP2007053448 W JP 2007053448W WO 2007099885 A1 WO2007099885 A1 WO 2007099885A1
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seq
polynucleotide
yeast
amino acid
protein
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PCT/JP2007/053448
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Yoshihiro Nakao
Yukiko Kodama
Tomoko Shimonaga
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Suntory Limited
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    • C12C12/00—Processes specially adapted for making special kinds of beer
    • C12C12/002—Processes specially adapted for making special kinds of beer using special microorganisms
    • C12C12/006—Yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
    • C12G1/00—Preparation of wine or sparkling wine
    • C12G1/02—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation

Definitions

  • the present invention relates to an amino acid transporter gene and use thereof, and in particular, to a brewer's yeast in which amino acid assimilation is controlled, alcoholic beverages produced using the yeast, a production method thereof, and the like. More specifically, the present invention relates to genes GAP1, AGP2, MUP1, or MUP3 encoding Gaplp, Agp2p, Muplp, or Mup3p, which are amino acid transporters of brewing yeast, particularly nonScGAPl, nonScAGP2, characteristic of brewer's yeast, The present invention relates to an enzyme mother whose amino acid assimilation ability is controlled by controlling the expression level of the nonScMUPl or nonScMUP3 gene, a method for producing alcoholic beverages using the yeast, and the like. Background art
  • amino and noic acid are important as taste components of alcoholic beverages and are known to be important factors affecting quality. Therefore, controlling the amount of amino acids according to the desired liquor quality is important in the development of new types of liquors.
  • amino acids are utilized as a nitrogen source by yeast during fermentation, it is extremely difficult to control the amino acid content at the end of fermentation.
  • Gapl As amino acid transporters in yeast, Gapl has low substrate specificity, and many amino acid transporters with different substrate specificities (amino acid transporter TAT2, arginine transporter Canl, proline transporter Put4, etc. (Mol Cell Biol. 14: 6597 -6606, 1994, Curr Genet 36: 317-328, 1999).
  • yeast having mutations in genes involved in amino acid incorporation (gapl, shr3, canl, put4, uga4) to control the amino acid content in alcoholic beverages (JP 2001-321159) No. 2000-316559) and examples of highly expressing the branched amino acid transporter BAP2 have been reported. Disclosure of the invention
  • yeasts with controlled amino acid utilization have been desired.
  • the present inventors have succeeded in identifying and isolating a gene encoding an amino acid transporter from brewer's yeast. Also, the obtained gene is introduced into the yeast.
  • the present invention was completed by producing transformed yeasts that were expressed and confirming that the utilization of amino acids was promoted.
  • the present invention relates to an alcoholic beverage obtained by using an amino acid transporter gene present in brewer's yeast, a protein encoded by the gene, a transformed yeast in which the expression of the gene is regulated, and a yeast in which the expression of the gene is regulated.
  • the present invention provides the following polynucleotide, a vector containing the polynucleotide, a transformed yeast introduced with the vector, a method for producing alcoholic beverages using the transformed yeast, and the like.
  • a polynucleotide comprising a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7;
  • SEQ ID NO: i SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7
  • a polynucleotide comprising a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide comprising a complementary base sequence under stringent conditions and encodes a protein having amino acid transporter activity;
  • polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the nonacid sequence and having amino acid transporter activity ;
  • polynucleotide having an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8, and an amino acid transporter activity
  • a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having:
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO:
  • a polynucleotide comprising a polynucleotide comprising a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of 7 under a highly stringent condition and encodes a protein having amino acid transporter activity. nucleotide.
  • polynucleotide according to (1) above which comprises a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7.
  • polynucleotide according to (1) above which comprises a polynucleotide encoding a protein consisting of a sequence.
  • test yeast is cultured, and the expression level of the amino acid transporter gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7 is measured.
  • a method for evaluating amino acid assimilation ability of a test yeast is measured.
  • (19a) The yeast described in (19) above is used to evaluate the test yeast, and to select yeasts with high or low expression level of the amino acid transporter gene. Yeast with high or low amino acid utilization ability How to sort out.
  • (19b) A method for producing an alcoholic beverage (for example, beer) using the yeast selected by the method described in (19a) above.
  • test yeast is cultured, and the protein described in (6) above is quantified or amino acid trans having the base sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7.
  • a method for selecting a yeast comprising measuring the expression level of a porta gene and selecting a test yeast having a production amount of the protein or an expression level of the gene according to a target amino acid assimilation ability.
  • a method for producing an alcoholic beverage comprising performing fermentation for producing an alcoholic beverage and adjusting an amino acid content.
  • FIG. 1 is a diagram showing the change over time in the amount of yeast grown in beer test brewing.
  • the horizontal axis shows the fermentation time, and the vertical axis shows the value of 0D660.
  • Fig. 2 is a diagram showing the change over time in the amount of extract consumed in beer test brewing.
  • the horizontal axis indicates fermentation time, and the vertical axis indicates appearance extract concentration (w / w%).
  • Fig. 3 shows the expression behavior of the nonScGAPl gene in yeast during brewing of beer.
  • the horizontal axis shows the fermentation time, and the vertical axis shows the detected signal brightness.
  • FIG. 4 shows the expression behavior of the nonScAGP2 gene in yeast during brewing of beer.
  • the horizontal axis shows the fermentation time, and the vertical axis shows the detected signal brightness.
  • FIG. 5 shows the expression behavior of the nonScMUPl gene in yeast during brewing of beer.
  • the horizontal axis shows the fermentation time, and the vertical axis shows the detected signal brightness.
  • FIG. 6 shows the expression behavior of the nonScMUP3 gene in yeast during brewing of beer.
  • the horizontal axis shows the fermentation time, and the vertical axis shows the detected signal brightness.
  • the present invention relates to (a) a polynucleotide containing a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7; and (b) an amino acid of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 "
  • a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein consisting of a sequence is provided,
  • the polynucleotide may be DNA or RNA.
  • the polynucleotide targeted by the present invention is not limited to the polynucleotide encoding the amino acid transporter derived from the brewer's yeast, but other polynucleotides encoding proteins functionally equivalent to the protein. Contains nucleotides.
  • Examples of functionally equivalent proteins include (c) amino acids in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, '6 or 8 Examples thereof include proteins having a sequence and having amino acid transporter activity.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 for example, 1 to 100, 1 to 90, 1 to 80, 1 to 70, 1 to 60, 1
  • a protein having amino acid transporter activity includes (d) SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 amino acid sequence and about 60% or more, about 70% or more, 71% or more, 72% or more, 73% or more, 74 % Or more, 75% or more, 76% or more, 77 ° /.
  • amino acid transporter activity can be measured by, for example, the method described in (J. Bacteriology 121: 562-570, 1975).
  • the present invention also relates to (e) a protein that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7 and has amino acid transporter activity (F) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8. Also included are polynucleotides that contain a polynucleotide that hybridizes with a nucleotide under stringent conditions and encodes a protein having amino acid transporter activity.
  • a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions means a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7, or SEQ ID NO: 2, 4, Obtained by using colony hybridization method, plaque hybridization method, Southern hybridization method, etc., using as a probe all or part of the polynucleotide encoding the amino acid sequence of 6 or 8.
  • a polynucleotide eg, DNA).
  • a method for pre-ization for example, a method described in Molecular Cloning 3rd Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997 can be used.
  • the “stringent conditions” may be any of low stringent conditions, medium stringent conditions, and high stringent conditions.
  • “Low stringent conditions” are, for example, 5 X SS 5 X Denhardt's solution, 0.5 o /. SDS, 50% formamide at conditions of 3 2 ° C.
  • the “medium stringent conditions” are, for example, conditions of 5 X SS 5 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 42 ° C.
  • “High stringency conditions” are, for example, 5 X SS (:., 5 X Denhardt's solution, 0.
  • Polynucleotides with high homology eg, DNA
  • Polynucleotides with high homology can be expected to be obtained efficiently, but factors that affect the stringency of hybridization include temperature, probe concentration, and probe length. Several factors such as ionic strength, time, and salt concentration are conceivable, and those skilled in the art can realize the same stringency by appropriately selecting these factors.
  • the membrane is subjected to a primary containing 0: 1% (w / v) SDS at 55 ° C. After washing with the washing buffer, the hybridized polynucleotide (eg, DNA) can be detected.
  • Alkphos Direct Labeling Reagents manufactured by Amersham Almacia
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 was calculated by using homology search software such as FASTA and BLAST using the default parameters. About 60% or more, about 70% or more, 71% or more, 72% or more, 73% or more, 74% or more, 75% or more, 76% or more, 77% or more, 78% or more, 79% 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% As described above, polynucleotides having the identity of 99.6% or more, 99.7% or
  • s corre 50
  • wo rd lengt h 3.
  • the polynucleotide of the present invention comprises (j) a polynucleotide encoding RNA having a base sequence complementary to the transcript of the polynucleotide (DNA) described in (5) above; (k) the above An RA-encoding polynucleotide that suppresses the expression of the polynucleotide (DNA) according to (5) by RNAi effect; (1) specifically cleaves the transcription product of the polynucleotide (DNA) according to (5) above A polynucleotide encoding an RNA having activity; or (m) a polynucleotide encoding RNA that suppresses the expression of the polynucleotide (DNA) described in (5) by a co-suppression effect.
  • polynucleotides are incorporated into a vector, and can further suppress the expression of the polynucleotides (DNA) (a) to (i) in a transformed cell into which the vector has been introduced. Therefore, it can be suitably used when it is preferable to suppress the expression of the polynucleotide (DNA).
  • polynucleotide encoding RNA having a base sequence complementary to a transcription product of DNA refers to so-called antisense DNA.
  • Antisense technology is known as a method for suppressing the expression of specific endogenous genes, and is described in various documents (eg, Hirashima and Inoue: Laboratory for Neonatal Chemistry 2 Replication and Expression of Nucleic Acid IV Genes). (Refer to pp.319-347, 1993) (Japan Biochemical Society, Tokyo Chemical Doujin). Antisense DNA sequence is complementary to the endogenous gene or part of it However, as long as gene expression can be effectively suppressed, it may not be completely complementary.
  • the transcribed RNA preferably has a complementarity of 90% or more, more preferably 95% or more, to the target gene transcript.
  • the length of the antisense DNA is at least 15 bases or more, preferably 100 bases or more, and more preferably 500 bases or more.
  • RNA interference means that when a double-stranded RA having the same or similar sequence as the target gene sequence is introduced into the cell, the expression of the introduced exogenous gene opin target endogenous gene is all suppressed. Refers to the phenomenon.
  • RNA used herein include double-stranded RA that causes RA interference of 21 to 25 bases, such as dsRA (double strand RNA), siRNA (small interfering RNA), or shRNA (short hairpin RNA). It is done.
  • RNA can be locally delivered to a desired site by a delivery system such as a ribosome, and can be locally expressed using a vector capable of producing the double-stranded RNA.
  • dsRA double-stranded RNA
  • shRNA double-stranded RNA
  • polynucleotide encoding RNA having an activity of specifically cleaving a DNA transcript generally refers to a ribozyme.
  • a ribozyme is an RNA molecule that has catalytic activity and inhibits the function of the gene by cleaving the target DNA transcript.
  • lipozymes for example, FEBS Lett. 228: 228, 1988; FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323: 349, 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733, 1990; Nucl. Res.
  • RNA that suppresses DNA expression by co-suppression refers to a nucleotide that inhibits the function of the target DNA by “co-suppression”.
  • co-suppression refers to a foreign gene introduced into a cell and a target endogenous gene by introducing a gene having a sequence identical or similar to the target endogenous gene by transformation. This is a phenomenon in which gene expression is all suppressed.
  • the present invention also provides a protein encoded by any of the polynucleotides (a) to (i).
  • a preferred protein of the present invention comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8. It is a protein having amino acid transporter activity.
  • Such a protein comprises an amino acid sequence in which the number of amino acid residues as described above is deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8. And a protein having amino acid transporter activity.
  • Examples of such a protein include a protein having an amino acid sequence having homology as described above with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, and having amino acid transporter activity.
  • deletion, substitution, insertion and / or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the protein of the present invention means that one or more amino acid sequences in the same sequence are 1 or It means that there are deletion, substitution, insertion and Z or addition of a plurality of amino acid residues, and two or more of deletion, substitution, insertion and addition may occur at the same time.
  • amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A Leucine, Isoleucine, Nonoleucine, Valine, Norvaline, Alanine, 2-Aminobutanoic acid, Methionine, 0-Methylserine, t-Butylglycine, t-Putylalanin, Cyclohexylalanine; Acid, isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid; Group C: Asparagine, glutamine; Group D: Lysine, Argin, Ornitine, 2, 4-Diaminobutanoic acid, 2, 3-Di Aminopropionic acid; Group E: proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline; Group F: serine, threonine, pomothelin; Group G: phenolenolanine, tyrosine.
  • the protein of the present invention can also be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • peptide synthesizers such as Advanced Chemtech, Perkin Elma, Pharmacia, Protein Technoguchi Ginstulment, Synthecel Vega, Perceptive, Shimadzu, etc. Can also be chemically synthesized.
  • the present invention provides a vector containing the polynucleotide described above.
  • the vector of the present invention contains the polynucleotide (DNA) according to any one of the above (a) to (i).
  • the vector of the present invention usually contains (X) a promoter that can be transcribed in yeast cells; (y) the promoters (a) to (i) bound to the promoter in a sense direction or an antisense direction.
  • a polynucleotide (DNA) according to any one of; and (z) transcription of RA molecules.
  • Concerning termination opiary polyadenylation it is constructed to contain an expression cassette that contains a signal that functions in yeast as a component.
  • the expression of the polynucleotide (DNA) ′ according to any one of the above (a) to (: 0 is promoted.
  • These polynucleotides are introduced in the sense direction with respect to the promoter.
  • the above-mentioned (a) to (i) are introduced in the antisense direction with respect to the promoter so as to suppress the expression of the polynucleotide (DNA) according to any one of the above-mentioned cases, or when the expression of the protein of the present invention is suppressed.
  • the method of Yang can be referred to publicly known literature (for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951 (1979), Methods in Enzymology, 101, 202 (1983), JP-A-6-253826.
  • the mutation is added to the promoter, or the promoter is recombined by homologous recombination.
  • the expression level of the get gene can also be controlled as described in Nucleic Acids Res. 29, 4238-4250 (2001), and the gene expression control method by converting the promoter is, for example, Appl. Environ Microbiol., 72, 5266-5273 (2006).
  • any of a multicopy type (YEp type), a single copy type (YCp type), and a chromosome integration type (Yip type) can be used.
  • the YEp type vector is YEp24 (JR Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983)
  • the YCp type vector is YCp50 ( M. p. Rose et al. , gene, 60, 237, 1987)
  • Yip type YIp5 K. Struhl et ah, Proc. Natl. Acad. Sci. USP, 76, 1035, 1979
  • any combination can be used as long as it functions in brewing yeast and is not affected by components in mash.
  • the promoter of the dalyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase gene (TDH3) and the promoter of the 3_phosphoglycerate kinase gene (PGK1) can be used.
  • TDH3 dalyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase gene
  • PGK1 3_phosphoglycerate kinase gene
  • the selection marker used for transformation since the auxotrophic force is not available in the case of brewing yeast, the dieneticin resistance gene (G418r), the copper resistance gene (CUP1) (Marin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984), cerulenin resistance gene (fas2m, PDR4) , 1991) are available.
  • the vector constructed as described above is introduced into the host yeast.
  • the host yeast include any yeast that can be used for brewing, for example, brewery yeast for beer, wine, sake and the like. Specific examples include yeasts of the genus Saccharomyces Saccha, but in this effort, beer yeasts such as Saccharomyces nos. Strianus Sacchairomyces pastorianus W34 / 70 etc., Saccharomyces' caroles benore gensis Saccha hires yces carlsbergensis) NCYC453, NCYC456 etc., Saccharomyces cerevisiae (scc srcM?
  • whiskey yeasts such as Saccharomyces cerevisiae NCYC90, wine yeasts such as association wines 1, 3 and 4, sake yeasts such as association yeasts sake 7 and 9 can be used.
  • beer yeasts such as Saccharomyces pastorianus are preferably used.
  • yeast transformation method a publicly known method can be used.
  • electroporation method “Meth. Enzym., 194, ⁇ 182 (1990)”
  • Spheroplast method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 pl929 (1978)
  • the lithium acetate method “J. Bacteriology, 153, pl63 (1983)
  • Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 pl929 (1978) Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual It can be implemented, but is not limited to this.
  • the host yeast is a standard yeast nutrient medium (for example, YEPD medium "Genetic Engineering. Vol. 1, Plenum Press, New York, 117 (1979)” etc.), and the 0D600nm value is 1-6.
  • YEPD medium Genetic Engineering. Vol. 1, Plenum Press, New York, 117 (1979)" etc.
  • the 0D600nm value is 1-6.
  • Incubate The cultured yeast is collected by centrifugation, washed, and pretreated with an alkali metal ion having a concentration of about 1 to 2 M, preferably with a lithium ion.
  • the cells are allowed to stand at about 30 ° C. for about 60 minutes, and then left at about 30 ° C. for about 60 minutes together with the DNA to be introduced (about 1 to 20 ⁇ ).
  • Polyethylene glycol preferably about 4,000 daltons, is added to a final concentration of about 20% to 50%.
  • the cell suspension is washed with a standard yeast nutrient medium, placed in a predetermined amount of fresh standard yeast nutrient medium, and allowed to stand at about 30 ° C. for about 60 minutes.
  • a transformant is obtained by planting on a standard agar medium containing antibiotics used as a selection marker.
  • alcoholic beverages characterized by amino acid composition can be produced.
  • yeast selected by the yeast evaluation method of the present invention described below can be used in the same manner.
  • alcoholic beverages include, but are not limited to, beer-taste drinks such as beer and happoshu, wine, whiskey, and sake.
  • a brewing yeast in which the expression of a target gene is suppressed an alcoholic beverage with a desired alcoholic acid whose composition is adjusted can be produced. it can.
  • a yeast introduced with the above-described vector of the present invention, and an enzyme in which the expression of the above-described polynucleotide (DNA) of the present invention is suppressed. Fermentation for liquor production using yeast selected by the mother or the yeast evaluation method of the present invention described below, and adjusting (increasing or decreasing) the content of amino acids. It is possible to produce alcoholic beverages with adjusted (increased or decreased) amino acid content.
  • a known method can be used except that the brewing mother obtained in the present invention is used in place of the parent strain. Therefore, the raw materials, production facilities, production management, etc. may be exactly the same as in the conventional method, and there is no increase in the cost for producing alcoholic beverages in which the amino acid composition is adjusted. That is, according to the present invention, the existing facility can be used and manufactured without increasing the cost.
  • the present invention evaluates the amino acid assimilation ability of a test yeast using a primer or probe designed based on the base sequence of an amino acid transporter gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7.
  • a general method of such an evaluation method is publicly known, and is described in, for example, WO 0 1/0 4 0 5 14, Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-205 0 00, and the like. This evaluation method will be briefly described below.
  • test yeast genome prepares the test yeast genome.
  • Methods of preparation such as Hereford method or potassium acetate method may be used any known methods (e.g., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pi 30 (1990))
  • 0 obtained intended for genome was Whether or not the gene or a sequence specific to the gene exists in the genome of the test yeast using a primer or probe designed based on the nucleotide sequence of the amino acid transporter gene (preferably the 0RF sequence) Find out.
  • the primer or probe can be designed using a known method.
  • Detection of a gene or a specific sequence can be performed using a known method.
  • a polynucleotide containing a part or all of a specific sequence or a polynucleotide containing a base sequence complementary to the base sequence is used as one primer, and the other primer is upstream from this sequence or
  • a polynucleotide containing part or all of the downstream sequence or a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence thereof Using the polynucleotide, the nucleic acid of yeast is amplified by PCR, and the presence or absence of the amplified product and the molecular weight of the amplified product are measured.
  • the number of bases of the polynucleotide used for the primer is usually 10 bp or more, preferably 15 to 25 bp. In addition, the base number of the sandwiched portion is usually 300 to 2000 bp.
  • the reaction conditions for the PCR method are not particularly limited. For example, denaturation temperature: 90 to 95 ° C, annealing temperature: 40 to 60 ° C, extension temperature: 60 to 75 ° C, number of cycles: 10 times or more The conditions such as can be used.
  • the obtained reaction product is separated by electrophoresis using agarose gel or the like, and the molecular weight of the amplified product can be measured. This method predicts and evaluates the amino acid assimilation ability of the yeast depending on whether the molecular weight of the amplified product is large enough to include the D-dish molecule in the specific part. In addition, by analyzing the base sequence of the amplified product, the above performance can be predicted and evaluated more accurately.
  • the test yeast is cultured, and the expression level of the amino acid transporter gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7 is measured to thereby obtain the test yeast. It is also possible to evaluate the ability of assimilating amino acids.
  • the expression level of the amino acid transporter gene can be measured by culturing the test yeast and quantifying mRNA or protein, which is a transcription product of the amino acid transporter gene. Quantification of mRNA or protein can be performed using a known method. Quantification of mRNA can be performed, for example, by Northern hybridization or quantitative RT-PCR, and protein quantification, for example, by Western blotting (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003).
  • the test yeast is cultured, and the expression level of the amino acid transporter gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7 is measured, and the above-mentioned amino acid assimilation ability according to the target amino acid assimilation ability
  • a yeast having a gene expression level a yeast suitable for brewing a desired alcoholic beverage can be selected.
  • a reference yeast and a test yeast may be cultured, the gene expression level in each fermentation mother may be measured, and the gene expression levels of the reference yeast and the test yeast may be compared to select a desired yeast.
  • the reference yeast and the test yeast are cultured, and the expression level in each yeast of the amino acid transporter gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7 is measured. Also the gene By selecting a test yeast having high expression or low expression, a yeast suitable for brewing a desired alcoholic beverage can be selected.
  • test yeast suitable for brewing a desired liquor can be selected by culturing the test yeast and selecting a yeast having a high amino acid assimilation ability.
  • test yeast or the reference yeast for example, a yeast introduced with the above-described beta of the present invention
  • a yeast subjected to a mutation treatment can be used as the test yeast or the reference yeast.
  • Mutation treatment can be performed using any method such as physical methods such as ultraviolet irradiation or radiation, chemical methods using chemical treatment such as EMS (ethyl methanesulfonate), N-methyl-N-nitrosoguanidine, etc. (For example, see Taiji Oshima, Biochemistry Experimental Method 39 Yeast Molecular Genetics Experimental Method, P 67-75, Academic Publishing Center, etc.).
  • the yeast that can be used as the reference yeast or the test yeast includes any yeast that can be used for brewing, for example, brewery yeast for beer, wine, sake and the like.
  • Specific examples include yeasts of the genus Saccharomyces ”) (for example, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces cerevisiae).
  • beer yeasts such as Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces pas tori anus) W34 / 70 etc., Saccharomyces caroles benoregens Sacchairomyces cajrlsbergensi) NCYC453, NCYC456 etc., Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae) NBRC1951 NBRC1953 Yeasts such as Association Wines No. 1, 3, and 4 can be used, but sake yeasts such as Association Yeast Sake Nos. 7 and 9 can be used, but are not limited thereto.
  • beer yeast for example, Saccharomyces pastorianus, is preferably used
  • the reference yeast and the test yeast may be selected in any combination from the above yeast group.
  • Example 1 Cloning of amino acid transporter gene (aonScGAP—1, nonScAGP2, nonScMUPl nonScMUP3)
  • Stefan 34/70 (sometimes abbreviated as “W34 / 70”) chromosomal DNA was used for PCR to obtain DNA fragments containing the full-length genes of nonScGAPl, nonScAGP2, nonScMuPl, and nonScMUP3. I got it.
  • NonScGAPl, nonScAGP2, nonScMUPl and nonScMUP3 gene fragments obtained as described above were respectively inserted into the pCR2.1-T0P0 vector (manufactured by Invitrogen) by TA cloning.
  • the nucleotide sequences of the nonScGAPl, nonScAGP2, nonScMUPl and nonScMUP3 genes were analyzed by the Sanger method (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) to confirm the nucleotide sequence.
  • Example 2 NonScGAPl gene expression analysis during beer brewing
  • the beer was brewed using the brewer's yeast Saccharomyces pastorianus strain W34 / 70, and mRNA extracted from the brewer's yeast cells during fermentation was detected with the brewer's yeast DM microarray. Wort extract concentration 12. 69%
  • Example 3 Preparation of nonScGAPl, nonScAGP2, nonScMUPl, nonScMUP3 high expression strain
  • NonScGAPl / pCR2. 1-T0P0, nonScAGP2 / pCR2. 1-TOPO, nonScMUPl / pCR2. 1-TOPO, nonScMUP3 / pCR2. 1-TOPO described in Example 1 were deleted with restriction enzymes Sacl and Notl, and the entire protein coding region A DNA fragment containing was prepared. This fragment was ligated to restriction enzymes Sacl and Notl-treated pYCGPYNot to construct high expression vectors nonScGAPl / pYCGPYNot, nonScAGP2 / pYCGPYNot, nonScMUPl / pYCGPYNot, nonScMUP3 / pYCGPYNot.
  • pYCGPYNot is a YCp-type yeast expression vector, and the introduced gene is highly expressed by the promonitor of the pyruvate kinase gene PYK1.
  • the Jiwenechishin resistance gene as a selectable marker in yeast contains and the ampicillin-resistant gene Amp r as a selective marker in or E. coli.
  • Saccharomyces pastorianus bihenstefan 34/70 strain was transformed by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 07-303475 using the high expression vector prepared by the above method. Transformants were selected on YPD plate medium (1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose, 2% agar) containing 300 mg / L of dieneticin.
  • YPD plate medium 1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose, 2% agar
  • Yeast input 5g Wet yeast cells / L wort Sampling fermented koji over time and examine changes in yeast growth (0D660) and extract consumption over time. Further, the amino acid composition of the beer after fermentation is measured using an L-8800 high-speed amino acid analyzer (manufactured by Hitachi) and a standard amino acid analysis column P / N855-3506 (manufactured by Hitachi, Ltd.).
  • Example 5 NonScGAPl, nonScAGP2, nonScMUPl or nonScMUP3 gene disruption
  • PCR using pharmacological marker-containing plasmids (pFA6a (G418r), pAG25 (natl), pAG32 (hph)) as a template according to the method of the literature (Goldstein et al., Yeast. 15 1541 (1999)) A fragment for gene disruption was prepared.
  • the prepared gene disruption fragment was used to transform strain W34 / 70 or spore clone W34 / 70-2. Transformation was performed by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 07-303475, and the concentration of the selected drug was 300 mg / L for dienetin (Geneticin) and Nosethricin (Nourseothricin), respectively.
  • Example 6 Determination of assimilation amount of ammonia in beer test brewing
  • a fermentation test using the parent strain and the nonScGAPl, nonScAGP2, nonScMUPl or nonScMUP3 disrupted strain obtained in Example 5 is performed under the following conditions.
  • Yeast input 5g Wet yeast cell ZL wort As in Example 4, the fermented koji is sampled over time, and the changes over time in the amount of yeast growth (0D660), the amount of extract consumed, the amount of ammonia, and the amount of various amino acids are examined. Industrial use available
  • the method for producing an alcoholic beverage of the present invention it is possible to control the amino acid assimilation ability of yeast, and therefore it is possible to produce an alcoholic beverage characterized by an amino acid composition and having an adjusted amino acid content.

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Description

明 細 書
アミノ酸トランスポーター遺伝子及びその用途 技術分野
本発明は、 アミノ酸トランスポーター遺伝子及びその用途に関し、 特に、 ァミノ 酸資化性を制御した醸造酵母、 該酵母を用いて製造した酒類、 その製造方法などに 関する。 さらに具体的には、 本発明は、 醸造酵母のアミノ酸トランスポーターであ る Gaplp、 Agp2p、 Muplpまたは Mup3pをコードする遺伝子 GAP1、 AGP2、 MUP1また は MUP3、 特にビール酵母に特徴的な nonScGAPl、 nonScAGP2、 nonScMUPl または nonScMUP3遺伝子の発現量を制御することによって、 アミノ酸資化能を制御した酵 母、 当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。 背景技術
一般にアミ,ノ酸は酒類の呈味成分として重要であり、 品質を左右する重要な要素 であることが知られている。 そのため、 目的の酒質にあわせてアミノ酸の量をコン トロールする事は、 新しいタイプの酒類の開発において重要である。
しかしながら、 アミノ酸は発酵中に酵母によって窒素源として資化されるため、 発酵終了時のアミノ酸の含有量をコントロールする事はきわめて困難である。
酵母が細胞外のアミノ酸を窒素源として利用するためには、 アミノ酸を菌体内に 取り込むことが必須である。 このようなアミノ酸の取り込みには酵母の細胞膜に存 在するアミノ酸トランスポーターが関与していることが明らかとなっている。
酵母のアミノ酸トランスポーターとしては基質特異性の低い Gaplや基質特異性 の異なる多くのアミノ酸トランスポーター（アミノ酸トランスポーター TAT2、 アル ギニントランスポーター Canl、 プロリントランスポーター Put4等 （Mol Cell Biol. 14 :6597 - 6606, 1994、 Curr Genet 36 : 317 - 328， 1999) が知られている。
これまでに、 酒類中のアミノ酸含量をコントロールするためにアミノ酸の取り込 みに関与する遺伝子（gapl，shr3，canl, put4, uga4)の変異を有する酵母を用いた例 (特開 2001-321159号公報)や分枝アミノ酸トランスポーター BAP2 を高発現させた 例 （特開 2000 - 316559号公報） が報告されている。 発明の開示
上記のような状況下、 酒類中のアミノ酸組成を改変し、 特徴ある品質を有する酒 類を製造するために、 アミノ酸の資化がコントロールされた酵母が望まれていた。 ' 本発明者らは、 上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、 ビール酵母から アミノ酸トランスポーターをコードする遺伝子を同定 ·単離することに成功した また、 得られた遺伝子を酵母に導入し発現させた形質転換酵母を作製し、 アミノ酸 の資化が促進されることを確認して、 本発明を完成した。
すなわち本発明は、 ビール酵母に存在するアミノ酸トランスポーター遺伝子、 該 遺伝子がコードするタンパク質、 該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、 該遺 伝子の発現が調節された酵母を用いることによる酒類の製造方法などに関する。 本 発明は、 具体的には、 次に示すポリヌクレオチド、 該ポリヌクレオチドを含有する ベクター、 該ベクターが導入された形質転換酵母、 該形質転換酵母を用いる酒類の 製造方法などを提供する。
( 1 ) 以下の（a)〜（f ) からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5または配列番号： 7の塩基配列 からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
, (b)配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6または配列番号： 8のアミノ酸 配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチ ド、； '
(c)配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6または配列番号： 8のアミノ酸 配列において、 1 もしくは複数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および Zまたは付 加したァミノ酸配列からなり、 かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパ ク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d)配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6または配列番号： 8のアミノ酸 配列に対して 60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、 かつアミノ酸トラン スポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリ ヌクレオチド；
(e)配列番号： i、 配列番号： 3、 配列番号： 5または配列番号： 7の塩基配列と 相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でハイブ リダイズし、 かつァミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする ポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
( f )配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6または配列番号： 8のアミノ酸 配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基 配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし かつアミノ酸トランスポータ一活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオ チドを含有するポリヌクレオチド。
( 2 ) 以下の（g)〜（i) からなる群から選択される （1 ) に記載のポリヌクレオチ ド、：
(g)配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号：. 6または配列番号：' 8のアミノ酸 配列、 又は配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6または配列番号： 8のアミ ノ酸配列において、 1〜10個のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入および/または付加し たァミノ酸配列からなり、 かつアミノ酸トランスポータ一活性を有するタンパク質 をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6または配列番号： 8のアミノ酸 配列に対して 90%以上の同一性を有するァミノ酸配列を有し、 かつァミノ酸トラン スポータ一活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリ ヌクレオチド；及び
(i)配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5または配列番号： 7の塩基配列 からなるポリヌクレオチド、 又は配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5また は配列番号： 7の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイス トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつァミノ酸トランスポータ一活性 を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを 含有するポリヌクレオチド。
( 3 ) 配列番号： 1または配列番号： 3または配列番号： 5または配列番号： 7の 塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記 ( 1 ) に記載のポリヌクレオチ ド、。
( 4 ) 配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6または配列番号： 8のアミノ酸 配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記 （1) に記 載のポリヌクレオチド。
(5) DNAである、 上記 （1) 〜 （4) のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
(6) 上記 （1) 〜 （5) のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタ ンパク質。
(7) 上記 （1) 〜 （5) のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するべクタ
(7a) 以下の（x)〜(z)の構成要素を含む発現カセットを含む上記 （7) に記載の べクター：
(X)酵母細胞内で転写可能なプロモーター
(y)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、 上記 (1) 〜 （5) のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及ぴ
(z)RNA分子の転写終結およびポリアデュル化に関し、 酵母で機能するシグナル <
(8) 以下の（j)〜(m)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(j)上記 （5) に記載のポリヌクレオチド （DNA) の転写産物に対して相補的な塩 基配列を有する RNAをコードするポリヌクレオチド；
(k) 上記 （5) に記載のポリヌクレオチド （DNA) の発現を R Ai効果により抑制 する RNAをコードするポリヌクレオチド；
(1) 上記 （5) に記載のポリヌクレオチド （DNA) の転写産物を特異的に切断す る活性を有する RNAをコードするポリヌクレオチド；及び
(m) 上記 （5) に記載のポリヌクレオチド （DNA) の発現を共抑制効果により抑 制する醒をコードするポリヌクレオチド。
(9) 上記 （8) に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
(10) 上記 (7) に記載のベクターが導入された酵母。
(1 1) 上記 （7) に記載のベクターを導入することによって、 アミノ酸の資化能 が増強された上記（10)に記載の酵母。
(12) 上記 （6) に記載のタンパク質の発現量を増加させることによってァミノ 酸の資化能が向上した上記 （11) に記載の酵母。
(1 3) (A) 上記 （9) に記載のベクターを導入することによって、 （B) 上記 (5) に記載のポリヌクレオチド （DNA) に係る遺伝子を破壌することによって、 (C) プロモーターに変異を加えることによって、 またはプロモーターを組み換える ことによって、 上記 （5) に記載のポリヌクレオチド （DNA) の発現を抑制するよ うにした酵母。
(14) 上記 （10) 〜 （12) のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
(15) 醸造する酒類が麦芽飲料である上記 （14) に記載の酒類の製造方法。 ，
(16) 醸造する酒類がワインである上記 （14) に記載の酒類の製造方法。
(17) 上記 （14) 〜 （16) のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
(18) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5または配列番号： 7の塩基配 列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライ マーまたはプローブを用いて、 被検酵母のアミノ酸資化能について評価する方法。
(18a) 上記 （18) .に記載の方法によって、 アミノ酸資化能が高い酵母を選別 する方法。
(18b) 上記 （18a) に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類 （例え ば、 ビール） を製造する方法。
(19) 被検酵母を培養し、 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5または配 列番号： 7の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定す ることによって、 被検酵母のアミノ酸資化能を評価する方法。
(19a) 上記 （1 9) に記載の方法で、 被検酵母を評価し、 アミノ酸トランスポ 一ター遺伝子の発現量が高い、 あるいは低い酵母を選別する、 アミノ酸資化能の高 い、 あるいは低い酵母を選別する方法。
(19b) 上記 （1 9a) に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類 （例え ば、 ビール） を製造する方法。
(20) 被検酵母を培養し、 上記 （6) に記載のタンパク質を定量または配列番 号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5または配列番号： 7の塩基配列を有するアミ ノ酸トランスポータ一遺伝子の発現量を測定し、 目的とするアミノ酸資化能に応じ た前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、 酵母 の選択方法。
(21) 基準酵母および被検酵母を培養して配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番 号： 5または配列番号： 7の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の 各酵母における発現量を測定し、 基準酵母よりも該遺伝子が高発現している、 ある いは低発現している被検酵母を選択する、 上記 （2 0 ) 記載の酵母の選択方法。 ( 2 2 ) 基準酵母およぴ被検酵母を培養して各酵母における上記 （6 ) に記載のタ ' ンパク質を定量し、 基準酵母よりも該タンパク質量の多い、 あるいは少ない被検酵 母を選択する、 上記 （2 0 ) に記載の酵母の選択方法。 ,
( 2 3 ) 上記 （1 0 ) 〜 （： 1 3 ) に記載の酵母おょぴ上記 （2 0 ) 〜 （2 2 ) に記 載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を 行い、 アミノ酸含有量を調節することを特徴とする、 酒類の製造方法。
本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、 ァ.ミノ酸の資化を制御す ることができるため、 酒類中のアミノ酸組成を改変することができ、 特徴ある品質 を有する酒類の製造が可能となる。 図面の簡単な説明
図 1は、 ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。 横軸は 発酵時間を、 縦軸は 0D660の値を示している。
図 2は、 ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。 横軸 ,は発酵時間、 縦軸は外観エキス濃度 （w/w%) を示している。
図 3は、 ビール試験醸造中の酵母における nonScGAPl遺伝子の発現挙動を示す図 である。 横軸は発酵時間、 縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
図 4は、 ビール試験醸造中の酵母における nonScAGP2遺伝子の発現挙動を示す図 である。 横軸は発酵時間、 縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
図 5は、 ビール試験醸造中の酵母における nonScMUPl遺伝子の発現挙動を示す図 である。 横軸は発酵時間、 縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
図 6は、 ビール試験醸造中の酵母における nonScMUP3遺伝子の発現挙動を示す図 である。 横軸は発酵時間、 縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。 発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、 酵母のァミノ酸トランスポーターの活性を増大させることによつ て、 さらに効率よくアミノ酸を資ィ匕させることが可能であると考えた。 このような 着想に基づいて研究を重ね、 特開 2004- 283169に開示の方法で解読したビール酵母 ゲノム情報を基に、 ビール酵母特有のアミノ酸トランスポーターをコードする nonScGAPl、 nonScAGP2、 nonScMUPl及ぴ nonScMUP3遺伝子を単離.同定した。 これ ' らの遺伝子の塩基配列を、 それぞれ、 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5 及び配列番号： 7に示す。 またこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質のァ ミノ酸配列を、 それぞれ、 配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6及び配列番 号： 8に示す。 1 . 本発明のポリヌクレオチド
まず、 本発明は、 （a)配列番号： 1、 3、 5または 7の塩基配列からなるポリヌ クレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び (b)配列番号： 2、 4、 6または 8 " のァミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリ ヌクレオチドを提供する。 ポリヌクレオチドは、 D NAであっても R NAであって もよい。
本発明で対象とするポリヌクレオチドは、 上記のビール酵母由来のアミノ酸トラ ンスポーターをコードするポリヌクレオチドに限定されるものではなく、 このタン パク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む。 機 能的に同等なタンパク質としては、 例えば、 （c)配列番号： 2、 4、' 6または 8の アミノ酸配列において、 1 もしくは複数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および/ または付加したアミノ酸配列からなり、 かつアミノ酸トランスポーター活性を有す るタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質としては、 配列番号 ： 2、 4、 6または 8のアミノ酸配列 において. 、 例えば、 1 ~100個、 1 〜90個、 1 ~80個、 1〜70個、 1〜60個、 1
〜50個、 1〜40個、 1〜39個、 1 〜38個、 1〜37個、 ：!〜 36個、 1〜35個、 1
〜34個、 1〜33個、 1〜32個、 1 〜31個、 1〜30個、 1〜29個、 1〜28個、 1
〜27個、 1〜26個、 1〜25個、 1 〜24個、 1〜23個、 1〜22個、 1〜21個、 1
〜20個、 1〜19個、 1〜18個、 1 〜17個、 1〜16個、 1〜15個、 1〜： 14個、 1
〜13個、 1〜： 12個、 1〜11個、 1 〜10個、 1〜9個、 1〜8個、 1 〜7個、 1〜6 個 （1〜数個） 、 1〜5個、 1〜4個、 1〜3個、 1〜2個、 1個のアミノ酸残基が 欠失、 置換、 揷入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつアミノ酸 トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。 上記ァミノ酸残基の欠失、 置換、 揷入および/または付加の数は、 一般的には小さい程好ましい。 また、 この ' ようなタンパク質としては、 （d)配列番号： 2、 4、 6または 8のアミノ酸配列と 約 60%以上、 約 70%以上、 71%以上、 72%以上、 73%以上、 74%以上、 75%以上、 76%以上、 77° /。以上、 78%以上、 79%以上、 80%以上、 81%以上、 82%以上、 83% 以上、 84%以上、 85%以上、 86%以上、 87%以上、 88%以上、 89%以上、 90%以上、 91%以上、 92%以上、 93%以上、 94%以上、 95%以上、 96%以上、 97%以上、 98% 以上、 99%以上、 99. 1%以上、 99. 2%以上、 99. 3%以上、 99. 4%以上、 99. 5%以上、 99. 6%以上、 99. 7%以上、 99. 8%以上、 99. 9%以上の同一性を有するアミノ酸配列 を有し、 かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。 上 記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
なお、 アミノ酸トランスポーター活性は、 例えば （J. Bacteriology 121 : 562 - 570, 1975) に記載の方法によって測定することができる。
また、 本発明は、 （e)配列番号： 1、 3、 5または 7の塩基配列と相補的な塩基 配列からなるポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でハイブリダイズし、 かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオ チドを含有するポリヌクレオチド；及び (f)配列番号： 2、 4、 6または 8のアミ ノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な 塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ し、 かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌク レオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
ここで、 「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」 とは、 配列番号： 1、 3、 5または 7の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリ ヌクレオチド又は配列番号： 2、 4、 6または 8のアミノ酸配列をコードするポリ ヌクレオチドの全 ¾5または一部をプローブとして、 コロニーハイブリダィゼーショ ン法、 プラークハイブリダィゼーション法またはサザンハイブリダィゼーション法 などを用いることにより得られるポリヌクレオチド （例えば、 DNA) をいう。 ハイ プリダイゼーシヨ ンの方法としては、 例えば Molecular Cloning 3rd Ed.、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997 などに 記載されている方法を利用することができる。
本明細書でいう 「ストリンジェントな条件」 は、 低ストリンジェントな条件、 中 ' ストリンジェントな条件及ぴ高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。 「低ス トリンジェントな条件」 は、 例えば、 5 X SS 5 Xデンハルト溶液、 0. 5o/。SDS、 50%ホルムアミド、 32°Cの条件である。 また、 「中ストリンジヱントな条件」 は、 例えば、 5 X SS 5 Xデンハルト溶液、 0. 5%SDS、 50%ホルムアミ ド、 42°Cの条件 である。 「高ストリンジェントな条件」 は、 例えば、 5 X SS (：、 5 Xデンハルト溶液、 0. 5%SDS、 50%ホルムアミド、 50°Cの条件である。 これらの条件において、 温度を 上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド （例えば、 D NA) が効率的に得 られることが期待できる。 ただし、 ハイブリダィゼーシヨンのストリンジエンシー に影響する要素としては温度、 プローブ濃度、 プローブの長さ、 イオン強度、 時間、 塩濃度など複数の要素が考えられ、 当業者であればこれら要素を適宜選択すること で同様のストリンジエンシーを実現することが可能である。
なお、 ハイブリダィゼーシヨンに市販のキットを用いる場合は、 例えば Alkphos Direct Labelling Reagents (アマシャムフアルマシア社製） を用いることができ る。 この場合は、 キットに添付のプロトコルにしたがい、 標識したプローブとの'ィ ンキュベーシヨンを一晚行った後、 メンブレンを 55°Cの条件下で 0: 1% (w/v) SDS を含む 1次洗浄バッファーで洗浄後、 ハイブリダィズしたポリヌクレオチド （例え ば、 DNA) を検出することができる。
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、 FASTA、 BLAST な どの相同性検索ソフトウエアにより、 デフォルトのパラメータを用いて計算したと きに、 配列番号： 2、 4、 6または 8のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチ ドと約 60%以上、 約 70%以上、 71%以上、 72%以上、 73%以上、 74%以上、 75% 以上、 76%以上、 77%以上、 78%以上、 79%以上、 80%以上、 81%以上、 82%以上、 83%以上、 84%以上、 85%以上、 86%以上、 87%以上、 88%以上、 89%以上、 90% 以上、 91%以上、 92%以上、 93%以上、 94%以上、 95%以上、 96%以上、 97%以上、 98%以上、 99%以上、 99. 1%以上、 99. 2%以上、 99. 3%以上、 99. 4%以上、 99. 5% 以上、 99.6%以上、 99.7%以上、 99.8%以上、 99.9%以上の同一性を有するポリヌ クレオチドをあげることができる。
なお、 ァミノ酸配列や塩基配列の同一性は、 カーリンおよびアルチユールによる アルゴリズム B LAST (proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264- 2268, 1990; proc Natl Acad Sci USA 90： 5873, 1993) を用いて決定できる。 BLASTのァ ルゴリズムに基づいた B LASTNや B LAS TXと呼ばれるプログラムが開発さ れている （Altschul SF， et al： J Mol Biol 215： 403, 1990) 。 B LASTN を用いて塩基配列を解析する場合は、 パラメータ一は、 例えば s c o r e = 100、 wo r d l e n g t h=12とする。 また、 B L A S TXを用いてアミノ酸配列を 解析する場合は、 パラメータ一は、 例えば s c o r e = 50、 wo r d l e n g t h=3とする。 BLASTと Ga p p.e d B LAS Tプログラムを用いる場合は、 各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
さらに、 本発明のポリヌクレオチドは、 （j) 上記 （5) に記載のポリヌクレオチ ド （DNA) の転写産物に対して相捕的な塩基配列を有する RNA をコードするポリヌ クレオチド； （k) 上記 （5) に記載のポリヌクレオチド （DNA) の発現を RNAi 効 果により抑制する R A コードするポリヌクレオチド； （1) 上記 （5) に記載の ポリヌクレオチド （DNA) の転写産物を特異的に切断する活性を有する RNA をコー ドするポリヌクレオチド； 又は (m) 上記 （ 5 ) に記載のポリヌクレオチド （DNA) の発現を共抑制効果により抑制する RNAをコードするポリヌクレオチドを含む。 こ れらのポリヌクレオチドは、 ベクターに組込まれ、 さらにそのベクターが導入され た形質転換細胞において上記 (a)〜（i)のポリヌクレオチド （DNA) の発現を抑制す ることができる。 したがって、 上記ポリヌクレオチド （DNA) の発現を抑制するこ とが好ましい場合に好適に利用することができる。
本明細書中、 「DNAの転写産物に対して相補的な塩基配列を有する RNAをコード するポリヌクレオチド」 とは、 いわゆるアンチセンス DNAのことをいう。 アンチセ ンス技術は、 特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法として公知であり、 種々の 文献に記載されている （例えば、 平島および井上： 新生化学実験講座 2 核酸 IV遺 伝子の複製と発現 （日本生化学会編， 東京化学同人） pp.319- 347, 1993 などを 参照） 。 アンチセンス DNAの配列は、 内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列 であることが好ましいが、 遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、 完全に 相捕的でなくてもよい。 転写された RNAは、 標的遺伝子の転写産物に対して好まし くは 90%以上、 さらに好ましくは 95%以上の相補性を有する。 アンチセンス DNA の長さは少なくとも 15塩基以上であり、 好ましくは 100塩基以上であり、 さらに ' 好ましくは 500塩基以上である。
本明細書中、 「DNAの発現を RNAi効果により抑制する RNAをコードするポリヌ クレオチド」 とは、 RNA interference (RNAi) によって内在性遺伝子の発現を抑制 するためのポリヌクレオチドのことをいう。. 「R Ai」 とは、 標的遺伝子配列と同一 もしくは類似した配列を有する二重鎖 R Aを細胞内に導入すると、 導入した外来遺 伝子おょぴ標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。 ここ で用いられる R N Aとしては、 例えば、 21〜25塩基長の R A干渉を生ずる二重鎖 R A、 例えば、 dsR A (double strand RNA)、 siRNA (small interfering RNA)又は shRNA (short hairpin RNA)が挙げられる。 このような R N Aは、 リボソームなどの 送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、 また上記二重 鎖 RNAが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。 このような二重鎖 RNA (dsR A、 siRNA又は shRNA)の,調製方法、 使用方法などは、 多 くの文献から公知である （特表 2002 - 516062号公報； 米国公開許第 2002/086356A 号； Nature Genetics, 24 (2) , 180-183， 2000 Feb.； Genesis, 26 (4) , 240 - 244, 2000 April； Nature, 407 : 6802， 319 - 20， 2002 Sep. 21； Genes & Dev.， Vol. 16, (8)， 948-958, 2002 Apr. 15； Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 99 (8) , 5515-5520， 2002 Apr. 16 ; Science, 296 (5567) , 550-553, 2002 Apr. 19； Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99 : 9， 6047-6052, 2002 Apr. 30； Nature Biotechnology, Vol. 20 (5)， 497-500, 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20 (5) , 500-505， 2002 May; Nucleic Acids Res. , 30 : 10, e46, 2002 May 15等参照) 。
本明細書中、 「DNAの転写産物を特異的に切断する活性を有する RNAをコードす るポリヌクレオチド」 とは、 一般に、 リボザィムのことをいう。 リボザィムとは触 媒活性を有する RNA分子のことをいい、 ターゲットとする DNAの転写産物を切断す ることにより、 その遺伝子の機能を阻害する。 リポザィムの設計についても種々の 公知文献を参照することができる （例えば、 FEBS Lett. 228： 228， 1988； FEBS Lett. 239: 285, 1988； Nucl. Acids. Res. 17： 7059, 1989； Nature 323： 349, 1986； Nucl. Acids. Res. 19 : 6751, 1991 ; Protein Eng 3： 733, 1990； Nucl. Acids Res. 19: 3875, 1991； Nucl. Acids Res. 19: 5125, 1991 ; Biochem Biophys Res Commun 186： 1271, 1992など参照） 。 また、 「DNAの発現を共抑制効 ' 臬により抑制する RNAをコードするポリヌクレオチド」 とは、 「共抑制」 によって、 ターゲットとなる DNAの機能を阻害するヌクレオチドをいう。 , 本明細書中、 「共抑制」 とは、 細胞中に、 標的内在性遺伝子と同一もしくは類似 した配列を有する遺伝子を形質転換により導入することにより、 導入した外来遺伝 子およぴ標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことをいう。 共抑制 効果を有するポリヌクレオチドの設計についても種々の公知文献を参照することが できる （例えば、 Smyth DR: Curr. Biol. 7： R793, 1997、 Martienssen R: Curr. Biol. 6 : 810， 1996など参照） 。
2 . 本発明のタンパク質
本発明は、 上記ポリヌクレオチド (a)〜（i)のいずれかにコードされるタンパク質 も提供する。 本発明の好ましいタンパク質は、 配列番号： 2、 4、 6または 8のァ ミノ酸配列において、 1 もしくは複数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および/ま たは付加したアミノ酸配列からなり、 かつアミノ酸トランスポーター活性を有する タンパク質である。
このようなタンパク質としては、 配列番号： 2、 4、 6または 8のアミノ酸配列 において、 上記したような数のアミノ酸残基が欠失、 置換、 挿入および/または付 加されたァミノ酸配列からなり、 かつァミノ酸トランスポーター活性を有するタン パク質が挙げられる。 また、 このようなタンパク質としては、 配列番号： 2、 4、 6または 8のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、 かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質は、 「モレキュラークロー-ング第 3版」 、 「カレント ' プロトコーノレズ.イン 'モレキュラー ·ノ ィォロジ一」 、 "Nuc. Acids. Res.， 10, 6487 (1982) " 、 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79， 6409 (1982) " 、 "Gene, 34, 315 (1985) " 、 "Nuc. Acids. Res. , 13, 4431 (1985) " 、 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) " 等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、 取得する ことができる。
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸残基が欠失、 置換、 挿入および/または付加されたとは、 同一配列中の任意かつ 1もしくは複数のアミ ノ酸配列中の位置において、 1 または複数のアミノ酸残基の欠失、 置換、 挿入及ぴ Z又は付加があることを意味し、 欠失、 置換、 挿入及び付加のうち 2種以上が同時 に生じてもよい。
以下に、 相互に置換可能なァミノ酸残基の例を示す。 同一群に含まれるアミノ酸 残基は相互に置換可能である。 A群： ロイシン、 イソロイシン、 ノノレロイシン、 バ リン、 ノルバリン、 ァラニン、 2 -アミノブタン酸、 メチォニン、 0 -メチルセリン、 t -ブチルグリシン、 t -プチルァラニン、 シクロへキシルァラニン； B 群：ァスノ ラギン酸、 グルタミン酸、 イソァスパラギン酸、 イソグルタミン酸、 2-アミノアジ ピン酸、 2-アミノスべリン酸； C群：ァスパラギン、 グルタミン； D群： リジ ン、 アルギ ン、 オル二チン、 2, 4-ジァミノブタン酸、 2， 3 -ジァミノプロピオン 酸； E群：プロリン、 3-ヒ ドロキシプロリン、 4 -ヒドロキシプロリン； F群： セリン、 スレオニン、 ポモセリン； G群： フエエノレアラニン、 チロシン。
また、 本発明のタンパク質は、 Fmoc 法 （フルォレ-ルメチルォキシカルボニル 法） 、 tBoc 法 (t -プチルォキシカルボ-ル法) 等の化学合成法によっても製造す ることができる。 また、 アドバンスドケムテック社製、 パーキンエルマ一社製、 フ アルマシア社製、 プロティンテクノ口ジーィンストウルメント社製、 シンセセル一 ベガ社製、 パーセプティブ社製、 島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合 成することもできる。
3 . 本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、 本発明は、 上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。 本 発明のベクターは、 上記（a)〜（i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド （DNA) を 含有する。 また、 本発明のベクターは、 通常、 （X)酵母細胞内で転写可能なプロモ 一ター； （y)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、 上 記（a)〜.(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド （DNA) ；及ぴ（z) R A分子の転写 終結おょぴポリアデ-ル化に関し、 酵母で機能するシグナルを構成要素として含む 発現カセットを含むように構成される。
本発明においては、 後述するビールの醸造において、 上記本発明のタンパク質を 高発現させる場合は、 上記 (a)〜（： 0のいずれかに記載のポリヌクレオチド （DNA) ' の発現を促進するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してセン ス方向に導入する。 また、 後述するビールの醸造において、 上記本発明のタンパク 質の発現を抑制させる場合は、 上記 (a)〜（i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド . (DNA) の発現を抑制するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対 してアンチセンス方向に導入する。 また、 上記本発明のタンパク質の発現を抑制さ せる場合は、 上記（j)〜(： m)のいずれかに記載のポリヌクレオチドが発現可能なよう にベクターに導入することもできる。 なお、 本発明においては、 ターゲットとする 上記遺伝子 (DNA) を破壊することによって、 上記ポリヌクレオチド （DNA) の発現 または上記タンパク質の発現を抑制することができる。 遺伝子の破壌は、 ターゲッ トとする遺伝子における遺伝子産物の発現に関与する領域、 例えば、 コード領域や プロモーター領域の内部へ単一あるいは複数の塩基を付加あるいは欠失させたり、 これらの領域全体を欠失させることにより行うことができる。 このような遺伝子破 壌の手法は、 公知の文献を参照することができる （例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951 (1979) 、 Methods in Enzymology, 101, 202 (1983)、 特開平 6 - 253826 号公報など参照） 。 また、 本発明においてはプロモーターに変異を加え ることによって、 あるいはプロモーターを相同組み換えによって組み換えることに よってターゲット遺伝子の発現量を制御することもできる。 このような変異の導入 方法は Nucleic Acids Res. 29、 4238- 4250 (2001) に、 また、 プロモーターの 変換による遺伝子の発現制御方法は、 例えば、 Appl Environ Microbiol.， 72, 5266 - 5273 (2006)に記載されている。
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、 多コピー型 （YEp型） 、 単コピー 型 （YCp型） 、 染色体組み込み型 （Yip型） のいずれもが利用可能である。 例えば、 YEp 型ベク ター と しては YEp24 (J. R. Broach et al.， Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83， 1983) 、 YCp 型ベクターとしては YCp50 (M. p. Rose et al. , gene, 60, 237， 1987) 、 Yip型 ベクターとしては YIp5 (K. Struhl et ah , Proc. Natl. Acad. Sci. USP, 76, 1035， 1979) が知られており、 容易に入手することができる。
酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター/ターミネータ一としては、 醸造用酵母中で機能するとともに、 もろみ中の成分に影響を受けなければ、 任意の ' 組み合わせでよい。 例えばダリセルアルデヒド 3 リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 (TDH3) のプロモーター、 3_ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子 （PGK1) のプロモ 一ターなどが利用可能である。 これらの遺伝子はすでにクローニングされており、 例えば M. F. Tuite et al. , ΕΜΒΟ J. , 1， 603 (1982) に詳細に記載されており、 既知の方法により容易に入手することができる。
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、 醸造用酵母の場合は栄養要求性マ 一力一が利用できないので、 ジエネチシン耐性遺伝子 （G418r) 、 銅耐性遺伝子 (CUP1) (Marin et al，， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984) 、 セルレ ニン耐性遺伝子 （fas2m， PDR4) (それぞれ猪腰淳嗣ら， 生化学， 64, 660, 1992； Hussain et et al. , gene, 101, 149, 1991) などが利用可能である。
上記のように構築されるベクターは、 宿主酵母に導入される。 宿主酵母としては、 醸造用に使用可能な任意の酵母、 例えばビール， ワイン、 清酒等の醸造用酵母等が 挙げられる。 具体的には、 サッカロマイセス Saccha進 yces 属等の酵母が挙げ られるが、 本努明においては、 ビール酵母、 例えばサッカロマイセス ノ、。ストリア ヌス Sacchairomyces pastorianus W34/70等、 サッカロマイセス'カーノレスべノレ ゲンシス Saccha雇 yces carlsbergensis) NCYC453、 NCYC456 等、 サッカロマイ セス セレビシェ（ scc srcM?ダ ces c re 'sis^ NBRCigSl NBRC1952、 NBRC1953、 NBRC1954等が使用できる。 さらにウィスキー酵母、 例えばサッカロマイセス セレ ピシェ NCYC90等、 ワイン酵母、 例えば協会ぶどう酒用 1号、 同 3号、 同 4号等、 清酒酵母、 例えば協会酵母 清酒用 7号、 同 9号等も用いることができるが、 これ に限定されない。 本発明においては、 ビール酵母、 例えばサッカロマイセス パス トリアヌスが好ましく用いられる。
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。 例えば、 エレク トロポレーシヨン法 "Meth. Enzym. , 194, ρ182 (1990) " 、 スフエロプラス ト法 " Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 pl929 (1978) " 、 酢酸リチウム法 "J. Bacteriology, 153， pl63 (1983) " 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 pl929 (1978)ヽ Methods in yeast genetics, 2000 Edition ： A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual などに記載の方法で実施可能であるが、 これに限定さ れない。
より具体的には、 宿主酵母を標準酵母栄養培地 （例えば YEPD培地 "Genetic Engineering. Vol. 1, Plenum Press, New York, 117 (1979) " 等） で、 0D600nm 値が 1〜6 となるように培養する。 この培養酵母を遠心分離して集め、 洗浄し、 濃 度約 1〜2Mのアルカリ金属イオン、 好ましくはリチヴムイオンで前処理する。 この 細胞を約 3 0 °Cで、 約 60分間静置した後、 導入する DNA (約 1〜20 μ §) とともに 約 30°Cで、 約 60分間静置する。 ポリエチレングリコール、 好ましくは約 4， 000ダ ルトンのポリエチレングリコールを、 最終濃度が約 20%〜50%となるように加え る。 約 30°Cで、 約 30分間静置した後、 この細胞を約 42°Cで約 5分間加熱処理する。 好ましくは、 この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、 所定量の新鮮な標準酵 母栄養培地に入れて、 約 30°Cで約 60分間静置する。 その後、 選択マーカーとして 用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、 形質転換体を取得する。 そ の他、 一般的なクローユング技術に関しては、 「モレキュラークローニング第 3 版」 、 'Methods in Yeast Genitics、 A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) " 等を参照することができる。 4 . 本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
上述した本発明のベクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、 その酵母を用いることによってアミノ酸の組成に特徴のある酒類を製造することが できる。 また、 下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母も同様に用 いることができる。 対象となる酒類としては、 これらに限定されないが、 例えば、 ビール、 発泡酒などのビールテイストドリンク、 ワイン、 ウィスキー、 清酒などが 挙げられる。 なお、 本発明においては、 必要に応じて、 ターゲットとなる遺伝子の 発現が抑制された醸造用酵母を用レ、ることによって、 所望の酒類でァミノ酸の組成 を調節した酒類を製造することもできる。 すなわち、 上述した本発明のベクターを 導入した酵母、 上述した本発明のポリヌクレオチド （DNA) の発現が抑制された酵 母または下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母を用いて酒類製造 のための発酵を行い、 アミノ酸の含有量を調節 （増加又は低減). することによって、 所望の酒類で、 力つアミノ酸含量が調節 （増加又は低減） された酒類を製造するこ とができる。
これらの酒類を製造する場合は、 親株の代わりに本発明において得られた醸造酵 母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。 したがって、 原料、 製造^ 備、 製造管理等は従来法と全く同一でよく、 アミノ酸の組成が調節された酒類を製 造するためのコストの増加はない。 つまり、 本発明によれば、 既存の施設を用い、 コストを増加させることなく製造することができる。
5 . 本発明の酵母の評価方法
本発明は、 配列番号： 1、 3、 5または 7の塩基配列を有するアミノ酸トランス ポータ一遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、 被検酵母のアミノ酸資化能について評価する方法に関する。 このような評価方法の 一般的手法は公知であり、 例えば、 WO 0 1 / 0 4 0 5 1 4号公報、 特開平 8— 2 0 5 9 0 0号公報などに記載されている。 以下、 この評価方法について簡単に説明 する。
まず、 被検酵母のゲノムを調製する。 調製方法は、 Hereford法や酢酸カリウム 法など、 公知の如何なる方法を用いることができる （例えば、 Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pi 30 (1990) ) 0 得られたゲノ ムを対象にして、 アミノ酸トランスポーター遺伝子の塩基配列'（好ましくは、 0RF 配列） に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、 被検酵母のゲノム にその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。 ブラ イマ一またはプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
遣伝子または特異的な配列の検出は、 公知の手法を用いて実施することができる。 例えば、 特異的配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列 に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用レ、、 もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部または 全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む ポリヌクレオチドを用いて、 PCR法によって酵母の核酸を増幅し、 増幅物の有無、 増幅物の分子量の大きさなどを測定する。 プライマーに使用するポリヌクレオチド の塩基数は、 通常、 10bp以上であり、 15~25bpであることが好ましい。 また、 挟 み込む部分の塩基数は、 通常、 300〜2000bpが適当である。
' PCR法の反応条件は、 特に限定されないが、 例えば、 変性温度： 90〜95°C、 ァニ ーリング温度： 40〜60°C、 伸長温度： 60〜75°C、 サイクル数： 10 回以上などの,条 件を用いることができる。 得られる反応生成物はァガロースゲルなどを用いた電気 泳動法等によって分離され、 増幅産物の分子量を測定することができる。 この方法 により、 増幅産物の分子量が特異部分の D皿分子を含む大きさかどうかによつて、 その酵母のアミノ酸資化能について予測 ·評価する。 また、 増幅物の塩基配列を分 析することによって、 さらに上記性能についてより正確に予測 ·評価することが可 能である。
また、 本発明においては、 被検酵母を培養し、 配列番号： 1、 3、 5または 7の 塩基配列を有するァミノ酸トランスポータ一遺伝子の発現量を測定することによつ て、 被検酵母のアミノ酸資化能を評価することもできる。 なお、 アミノ酸トランス ポーター遺伝子の発現量の測定は、 被検酵母を培養し、 アミノ酸トランスポーター 遺伝子の転写産物である mRNA又はタンパク質を定量することによって可能である。 , mRNA又はタンパク質の定量は、 公知の手法を用いて行うことができる。 mRNA の定 量は例えばノーザンハイプリダイゼーシヨンや定量的 RT- PCR によりて、 タンパク 質の定量は例えばウェスタンブロッティングによって行うことができる（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
さらに、 被検酵母を培養して、 配列番号： 1、 3、 5または 7の塩基配列を有す るアミノ酸トランスポータ一遺伝子の発現量を測定し、 目的とするアミノ酸資化能 に応じた前記遺伝子発現量の酵母を選択することによって、 所望の酒類の醸造に好 適な酵母を選択することができる。 また、 基準酵母および被検酵母を培養し、 各酵 母における前記遺伝子発現量を測定し、 基準酵母と被検酵母の前記遺伝子発現量を 比較して、 所望の酵母を選択してもよい。 具体的には、 例えば、 基準酵母および被 検酵母を培養して配列番号： 1、 3、 5または 7の塩基配列を有するアミノ酸トラ ンスポーター遺伝子の各酵母における発現量を測定し、 基準酵母よりも該遺伝子が 高発現あるいは低発現である被検酵母を選択することによって所望の酒類の醸造に 好適な酵母を選択することができる。
あるいは、 被検酵母を培養して、 アミノ酸資化能の高い酵母を選択することによ つて、 所望の酒類の醸造に好適な被検酵母を選択することができる。
' これらの場合、 被検酵母又は基準酵母としては、 例えば、 上述した本発明のベタ ターを導入した酵母、 突然変異処理が施された酵母、 自然変異した酵母などが使用 され得る。 突然変異処理は、 例えば、 紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、 EMS (ェチルメタンスルホネート） 、 N-メチル- N -二トロソグァニジンなどの薬剤処 理による化学的方法など、 いかなる方法を用いてもよい （例えば大嶋泰治編著、 生 物化学実験法 39 酵母分子遺伝学実験法、 P67- 75、 学会出版センターなど参照） 。 なお、 基準酵母、 被検酵母として使用され得る酵母としては、 醸造用に使用可能 な任意の酵母、 例えばビール、 ワイン、 清酒等の醸造用酵母などが挙げられる。 具 体的には、 サッカロマイセス Saccharomyces") 属等の酵母 （例えば、 サッカロマ イセス パストリアヌス、 サッカロマイセス セレビシェ及びサッカロマイセス 力 一ルスベルゲンシス） が挙げられるが、 本発明においては、 ビール酵母、 例えばサ ッカロマイセス パス トリアヌス 、Saccharomyces pas tori anus) W34/70等、 サッ カロマイセス カーノレスべノレゲンシス Sacchairomyces cajrlsbergensi ) NCYC453、 NCYC456等、 サッカロマイセス セレビシェ Saccharomyces cerevisiae) NBRC1951 NBRC1952、 NBRC1953、 BRC1954等が使用できる。 さらにウイスキ 酵母、 例えば サッカロマイセス セレピシェ NCYC90等、 ワイン酵母、 例えば協会ぶどう酒用 1号、 同 3号、 同 4号等、 清酒酵母、 例えば協会酵母 清酒用 7号、 同 9号等も用いるこ とができるが、 これに限定されない。 本発明においては、 ビール酵母、 例えばサッ カロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。 基準酵母、 被検酵母は、 上 記酵母群から任意の組合せで選択してもよい。 実 施 例
以下、 実施例によって本発明の詳細を述べるが、 本発明は以下の実施例に限定さ れるものではない。 実施例 1 ：アミノ酸トランスポーター遺伝子 （aonScGAP— 1， nonScAGP2, nonScMUPl nonScMUP3) のクローニング
特開 2004-283169に記載の比較データベースを用いて検索した結果、 ビール酵母 に特有のァミノ酸トランスポーター造伝子 nonScGAPl, nonScAGP2, nonScMUPl, nonScMUP3 を見出した （配列番号： 1、 3 , 5， 7 ) 。 得られた塩基配列情報を基 に、 それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマー nonSc0APl_F (配列番号： 9) /nonScGAPl_R (配列番号： 10) 、 nonSc AGP2_F (配列番号： 11) /nonSc AGP2_R (配列番号： I2) 、 nonScMUPl— F (配列番号： 13) /nonScMUPl— R (配列番号： 14) 、 nonSc MUP3_F (配列番号： 15) /nonSc MUP3_R (配列番号： 16) 、 を設計し、 ゲノ ム解読株サッカロマイセス パス ト リアヌス パイヘン.ステファン 34/70 株 ( 「W34/70株」 と略記することがある） の染色体 DNAを錶型とした PCRによって nonScGAPl, nonScAGP2, nonScMuPl及び nonScMUP3の全長遺伝子を含む DNA断片を 取得した。
上記のようにして得られた nonScGAPl, nonScAGP2, nonScMUPl 及び nonScMUP3 遺伝子断片を、 それぞれ、 TA クローニングによって pCR2. 1 - T0P0ベクター （イン ビトロジヱン社製） に挿入した。 nonScGAPl, nonScAGP2, nonScMUPl 及ぴ nonScMUP3遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、 塩基配列を確認した。 実施例 2 ： ビール試醸中の nonScGAPl遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌス W34/70株を用いてビール試醸を 行い、 発酵中のビール酵母菌体から抽出した mR Aをビール酵母 DMマイクロアレ ィで検出した。 麦汁エキス濃度 12. 69%
70L
麦汁溶存酸素濃度 8. 6ppm
発酵温度 15°C
酵母投入量 12. 8 X 106cells/mL 発酵液を経時的にサンプリングし、 酵母増殖量 （図 1 ) 、 外観エキス濃度 （図 2 ) の経時変化を観察した。 またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、 調製し た mRNAをピオチンラベルして、 特開 2004-283169に記載のビール酵母 DNAマイク ' ロアレイにハイブリダィズさせた。 シグナルの検出はジーンチップオペレーティン グシステム （GC0S ;GeneChip Operating Software 1. 0、 ァフィメトリタス社製） を 用いて行った。 nonScGAPl, nonScAGP2, nonScMuPl, nonScMUP3 遺伝子の発現パタ 一ンを図 3、 図 4、 図 5、 図 6に示す。 この結果より、 通常のビール発酵において nonScGAPl, nonScAGP2、 nonScMUPl及び nonScMUP3遺伝子がそれぞれ発現している ことを確認した。 実施例 3 ： nonScGAPl、 nonScAGP2、 nonScMUPl, nonScMUP3高発現株の作製
実施例 1 に記載の nonScGAPl/pCR2. 1-T0P0、 nonScAGP2/pCR2. 1-TOPO、 nonScMUPl/pCR2. 1-TOPO, nonScMUP3/pCR2. 1-TOPOを制限酵素 Saclおよび Notl消 化し、 タンパク質コード領域全長を含む DNA断片を調製した。 この断片を制限酵素 Sacl および Notl 処理した pYCGPYNot に連結させ、 高発現ベクター nonScGAPl/pYCGPYNot 、 nonScAGP2/pYCGPYNot 、 nonScMUPl/pYCGPYNot 、 nonScMUP3/pYCGPYNot、 を構築した。 pYCGPYNot は YCp型の酵母発現ベクターであ り、 導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子 PYK1 のプロモニターによって 高発現される。 酵母での選択マーカーとしてジヱネチシン耐性遺伝子 を、 ま た大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子 Amprを含んでいる。
上述の方法で作製した高発現ベクターを用い、 特開平 07 - 303475に記載された方 法でサッカロマイセス パストリアヌス バイへンステフアン 34/70株を形質転換 した。 ジエネチシン 300mg/Lを含む YPD平板培地 （1%酵母エキス、 2%ポリペプトン、 2%グルコース、 2%寒天） で形質転換体を選択した。 実施例 4 ： ビール試験醸造におけるアミノ酸資化量の測定
親株ならびに実施例 3 で得られた nonScGAPl、 nonScAGP2、 nonScMUPl 及び nonScMUP3高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行う。 麦汁エキス濃度 12%
麦汁容量 1L
麦汁溶存酸素濃度 約 8ppm
発酵温度 12°C—定
酵母投入量 5g湿酵母菌体/ L麦汁 発酵醪を経時的にサンプリングし、 酵母増殖量 （0D660) 、 エキス消費量の経時 変化を調べる。 さらに発酵終了後のビールのァミノ酸組成を L - 8800高速ァミノ酸 分析計 （日立社製） 及び標準アミノ酸分析カラム P/N855-3506 (日立製作所社製） を用いて測定する。 実施例 5 ： nonScGAPl, nonScAGP2、 nonScMUPlまたは nonScMUP3遺伝子の破壌
文献 (Goldstein et al. , yeast. 15 1541 (1999) ) の方法にしたがい、 薬剤而 性マーカーを含むプラスミ ド（pFA6a (G418r) , pAG25 (natl) , pAG32 (hph) ) をテン プレートとした PCRによって遺伝子破壊用断片を作製した。
作製し.た遺伝子破壊用断片で W34/70株あるいは胞子クローン W34/70- 2株を形質 転換した。 形質転換は特開平 07-303475に記載された方法で行い、 選択薬剤の濃度 はそれぞれジエネチシン（Geneticin) 300mg/L、 ノーセォスリシン（Nourseothricin)
50mg/Lとした。 実施例 6 ： ビール試験醸造におけるァンモニァぉょぴァミノ酸資化量の測定
親株ならびに実施例 5で得られる nonScGAPl、 nonScAGP2、 nonScMUPl または nonScMUP3破壊株を用いた発酵試験を、 以下の条件で行う。
麦汁エキス濃度 12。/0
麦汁容量 1L
麦汁溶存酸素濃度 約 8ppm
発酵温度 15°C—定
酵母投入量 5g湿酵母菌体 ZL麦汁 実施例 4と同様に、 発酵醪を経時的にサンプリングし、 酵母増殖量 （0D660) 、 エキス消費量、 アンモニア量及び各種アミノ量の経時変化を調べる。 産業上の利用可能个生
本発明の酒類製造法によれば、 酵母のアミノ酸資化能を制御することができる,た め、 アミノ酸含有量が調節された、 アミノ酸組成に特徴のある酒類を製造すること が可能となる。

Claims

請求の範囲
1 . 以下の（a)〜（f) からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5または配列番号： 7の塩基配 列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド； '
(b)配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6または配列番号： 8のァミノ 酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレ ォチド；
(c)配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6または配列番号： 8のァミノ 酸配列において、 1 もしくは複数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および/また は付カロしたアミノ酸配列からなり、 かつアミノ酸トランスポーター活性を有する タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d) 配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6または配列番号： 8のァミノ 酸配列に対して 60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、 かつアミノ酸ト ランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有す るポリヌクレオチド；
(e)配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5または配列番号： 7の塩基配 列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジヱン.トな条件下で ハイブリダイズし、 かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質を.コ ードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6または配列番号： 8のァミノ 酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な 塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイ ズし、 かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリ ヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
2 . 以下の（g)〜（i) からなる群から選択される請求項 1に記載のポリヌクレ ォチド：
(g)配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6または配列番号： 8のァミノ 酸配列、 又は配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6または配列番号： 8の アミノ酸配列において、 ι〜ιο 個のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入および Zまたは 付加したアミノ酸配列からなり、 かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタ ンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8のァミノ酸配 列に対して 90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、 かつアミノ酸トラジ スポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポ リヌクレオチド；及び
(i)配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5または配列番号： 7の塩基配 列からなるポリヌクレオチド、 又は配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5 または配列番号： 7の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつアミノ酸トランスポー ター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌク レオチド。
3 . 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5または配列番号： 7の塩基配 列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項 1に記載のポリヌクレオチド。
4 . 配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6または配列番号： 8のァミノ 酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項 1に 記載のポリヌクレオチド。
5 . DNAである、 請求項 1〜4のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
' 6 . 請求項 1〜 5のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパ ク質。
7 . 請求項 1〜 5のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
8 . 以下の（j)〜(！ II)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
( ) 請求項 5に記載のポリヌクレオチド （DNA) の転写産物に対して相補的な塩 基配列を有する R Aをコードするポリヌクレオチド；
(k)請求項 5に記載のポリヌクレオチド （DNA) の発現を RNAi効果により抑制す る R Aをコードするポリヌクレオチド；
(1) 請求項 5に記載のポリヌクレオチド （DNA) の転写産物を特異的に切断する 活性を有する腿をコードするポリヌクレオチド；及び (m)請求項 5に記載のポリヌクレオチド （DNA) の発現を共抑制効果により抑制 する RNAをコードするポリヌクレオチド。
. 9 . 請求項 8に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
1 0 . 請求項 7に記載のベクターが導入された酵母。
1 1 . 請求項 7に記載のベクターを導入することによって、 アミノ酸資化能が 向上した請求項 8に記載の酵母。
1 2 . 請求項 6に記載のタンパク質の発現量を増加させることによってァミノ 酸資化能が向上した請求項 1 0に記載の酵母。
1 3 . (A) 請求項 9に記載のベクターを導入することによって、 （B) 請求項 5に記載のポリヌクレオチド （DNA) に係る遺伝子を破壊することによって、 （C) プロモーターに変異を加えることによって、 またはプロモーターを組み換えるこ とによって、 請求項 5に記載のポリヌクレオチド （DNA) の発現を抑制するよう にした酵母。.
1 4 . 請求項 1 0から 1 2のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。 1 5 . 醸造する酒類が麦芽飲料である請求項 1 4に記載の酒類の製造方法。 1 6 . 醸造する酒類がワインである請求項 1 4に記載の酒類の製造方法。
1 7 . 請求項 1 4〜 1 6のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
1 8 . 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5または配列番号： 7の塩基 配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプ +ライマーまたはプローブを用いて、 被検酵母のアミノ酸資化能について評価する 方法。
1 9 . 被検酵母を培養し、 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5または 配列番号： 7の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測 定することによって、 被検酵母のァミノ酸資化能を評価する方法。
2 0 . 被検酵母を培養し、 請求項 6に記載のタンパク質を定量または配列番 号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5または配列番号： 7の塩基配列を有するァ ミノ酸トランスポータ一遺伝子の発現量を測定し、 目的とするアミノ酸資化能に 応じた前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、 酵母の選択方法。
2 1 . 基準酵母および被検酵母を培養して配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列 番号： 5または配列番号： 7の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝 子の各酵母における発現量を測定し、 基準酵母よりも該遺伝子が高発現あるいは 低発現している被検酵母を選択する、 請求項 2 0記載の酵母の選択方法.。
2 2 . 基準酵母およぴ被検酵母を培養して各酵母における請求項 6に記載のタ ンパク質を定量し、 基準酵母よりも該タンパク質量の多い、 あるいは少ない被検 酵母を選択する、 請求項 2 0に記載の酵母の選択方法。
2 3 . 請求項 1 0〜 1 3に記載の酵母および請求項 2 0〜 2 2に記載の方法に より選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、 ァ ミノ酸含有量を調節することを特徴とする、 酒類の製造方法。
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