JPH06253826A - エステル香味の低減した酒類の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 エステル香味の低減した酒類の製造に有用な
酵母を提供する。 【構成】 サッカロマイセス・セレビシェが産出するよ
うなアルコールアセチルトランスフェラーゼの生物工学
的産生能を有するＤＮＡ鎖を利用して形質転換された、
エステル生産能が減少している酵母に関する。またこの
形質転換酵母によるエステル香味の低減した酒類の製造
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】〔発明の背景〕

【産業上の利用分野】本発明は、サッカロマイセス・セ
レビシエが産生するようなアルコールアセチルトランス
フェラーゼ（以下ＡＡＴａｓｅという）の生物工学的産
生能を有するＤＮＡ鎖を利用して形質転換された、エス
テル生産能が減少している酵母に関するものである。本
発明は、また、この形質転換酵母による、エステル香味
の低減した酒類の製造法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】清酒、ビール、ワイン、ウイスキー等の
酒類において、各種のエステル成分の量がその評価を大
きく左右することは、周知の事実である。これらのエス
テルは、一般に、発酵過程において酵母が各種の低級も
しくは高級アルコールを産生し、これをさらにエステル
へと変換することによって発酵液中に存在する。

【０００３】エステルのうちでも、とりわけ酢酸イソア
ミルは果実様の香りがするエステルであり、またその前
駆体であるイソアミルアルコールとの含量比が香りの官
能評価との相関が高いことで知られていて、例えば清酒
ではこの比率が高いものほど吟醸香が高いとして珍重さ
れてきた（醸試報告 No. 145 、p.26(1973)）。

【０００４】先に吉岡らが報告しているように（Agric.
Biol. Chem. 45, 2183(1981)）、ＡＡＴａｓｅは酢酸
イソアミルの生成において中心的役割を果たす酵素であ
って、イソアミルアルコールとアセチルＣｏＡを縮合さ
せて酢酸イソアミルを産生する性質を有する。また、Ａ
ＡＴａｓｅは幅広い基質特異性を持つことが知られてお
り、酢酸エチル等その他多くの酢酸エステルを同様の機
構により産生することが知られてきた。

【０００５】したがって、酒類の製造において酢酸イソ
アミルをはじめとするエステル類の量を増加する方法と
しては、使用する酵母のＡＡＴａｓｅの活性を増強する
ことが有効であり、従来酒類の製造においてなされてき
た原料の選定や発酵条件の管理等のうちには、結果とし
てＡＡＴａｓｅの活性を増強してきたものも多かった。

【０００６】一方、ビールにおいてはエステルは重要な
香気成分であるけれども、過剰なエステルはエステル臭
として嫌われることも事実であり、このエステル臭の生
成要因にもＡＡＴａｓｅは関与していると思われる。

【０００７】以上のように、ＡＡＴａｓｅがエステル生
成に重要であることは明らかであったが、ＡＡＴａｓｅ
そのものに関しての報告は少ない。これまでに部分精製
した報告（日本農芸化学会誌63. 435 (1989)、Agric. B
iol. Chem., 54. 1485 (1990) 、日本醸造協会誌87. 33
4 (1992)等）はあるものの、この酵素がきわめて不安定
であることから、その精製は困難であって、本発明者ら
の知る限りでは未だ完全な精製に成功した例はなく、ま
たこの酵素を産生するＤＮＡ鎖に関しても全く報告はな
かった。 〔発明の概要〕

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、酵母のＡＡ
Ｔａｓｅの構造を明らかにし、そのＤＮＡ配列を利用す
ることによって、ＡＡＴａｓｅ産生能を低減させた形質
転換酵母を得ること、ひいてはエステル香味の低減した
酒類を製造すること、を目的とするものである。

【０００９】＜要旨＞本発明は、実質的には添付図１〜
２、３〜４のいずれかのＡからＢまでおよび１９〜２０
のＡからＣまたはＢからＣまでのＤＮＡ配列、を利用し
て酵母固有のＡＡＴａｓｅ産生能を消失ないし減少させ
る技術に関するものである。

【００１０】したがって、本発明は、その第一の態様に
おいて、形質転換されてアルコールアセチルトランスフ
ェラーゼ産生能の消失ないし減少した酵母に関する。

【００１１】すなわち、本発明による形質転換されてア
ルコールアセチルトランスフェラーゼ産生能の消失ない
し減少した酵母は、下記の（１ａ）〜（１ｄ）のいずれ
かのＤＮＡ配列を利用してホスト酵母に固有のアルコー
ルアセチルトランスフェラーゼ産生遺伝子の発現を抑制
したものであること、を特徴とするものである。 （１ａ） 実質的に添付図１および２にわたって示した
ＤＮＡ配列のＡからＢまでのＤＮＡ配列。 （１ｂ） 実質的に添付図３および４にわたって示した
ＤＮＡ配列のＡからＢまでのＤＮＡ配列。 （１ｃ） 実質的に添付図１２および１３にわたって示
したＤＮＡ配列のＡからＣまでまたはＢからＣまでのＤ
ＮＡ配列。 （１ｄ） 上記（１ａ）〜（１ｃ）のいずれかのＤＮＡ
配列またはその相補体にハイブリダイズするＤＮＡ鎖。

【００１２】ここで、「ホスト酵母に固有のアルコール
アセチルトランスフェラーゼ産生遺伝子の発現を抑制し
た」ということは、具体的には、当該遺伝子をＡＡＴａ
ｓｅ産生能を失う程度に破壊したか、当該遺伝子のＡＡ
Ｔａｓｅ産生能は実質的に破壊しないがその発現の過程
に障害を設けたか、を意味する。後者の具体例は、たと
えば、当該遺伝子のｍＲＮＡと相補的なＲＮＡ、すなわ
ち所謂アンチセンスＲＮＡ、を発現するような外来ＤＮ
Ａ鎖を酵母細胞内に導入して、ｍＲＮＡによる翻訳の阻
害、ひいては遺伝子の発現の抑制、を生じさせることで
ある。このような、いわば「負」の形質転換は、酵母の
ＡＡＴａｓｅの塩基配列が明らかになったことによっ
て、はじめて可能となったものである。すなわち、この
第一の態様において所定のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列を「利用して」というこ
とは、具体的には、たとえば、当該ＤＮＡ配列をホスト
酵母に固有のＡＡＴａｓｅとの相同性は保存されている
がＡＡＴａｓｅ産生能は消失ないし減少するように改変
し、この改変ＤＮＡ配列を相同組換えによってホスト酵
母のＡＡＴａｓｅ産生遺伝子と置換して、ホスト酵母固
有のＡＡＴａｓｅ産生能を喪失ないし低下させるか、あ
るいはホスト酵母固有のＡＡＴａｓｅ産生遺伝子のｍＲ
ＮＡに相補性のＲＮＡを当該ＤＮＡ配列からつくって、
それを前記のアンチセンスＲＮＡとして使用すること、
を意味する。

【００１３】このようにＡＡＴａｓｅ産生能を消失ない
し低下させた酵母を手にすることができたところから、
本発明によればエステル香味の減少した酒類の製造が可
能となる。

【００１４】したがって、本発明は、その第二の態様に
おいて、エステル香味の減少した酒類の製造法に関す
る。

【００１５】すなわち、本発明によるエステル香味の減
少した酒類の製造法は、糖を酵母で発酵させて酒類を製
造する方法において、使用する酵母が、上記第一の態様
で示した形質転換されてアルコールアセチルトランスフ
ェラーゼ産生能の消失ないし減少した酵母であること、
を特徴とするものである。

【００１６】なお、本発明では、「ＤＮＡ鎖」、「ＤＮ
Ａ配列」、および「遺伝子」を実質的に同義のものとし
て使用している。

【００１７】＜効果＞酵母ＡＡＴａｓｅ遺伝子を遺伝子
工学的手法を用いて改変することによってＡＡＴａｓｅ
遺伝子を破壊、もしくはその発現を抑制するような外来
ＤＮＡ鎖の作製が可能である。すなわち、このＤＮＡ鎖
を核外および（または）核内遺伝子として酵母細胞内に
導入することによって、酵母のＡＡＴａｓｅ産生能を抑
制することができ、この酵母によって糖を発酵させるこ
とによってエステル香味の低減した酒類を製造すること
ができる。

【００１８】〔発明の具体的説明〕 ＜ＡＡＴａｓｅ＞本発明においてホスト酵母に固有のＡ
ＡＴａｓｅ産生遺伝子の発現を抑制すべく利用するＤＮ
Ａ配列は、ＡＡＴａｓｅ産生能を有するＤＮＡ配列であ
る。

【００１９】ＡＡＴａｓｅ、すなわちアルコールアセチ
ルトランスフェラーゼはアセチルＣｏＡよりアセチル基
をアルコール類に転移させる反応によって酢酸エステル
を産生する能力を有する酵素である。

【００２０】この場合のアルコール類とは、主として炭
素数が１から６までの直鎖もしくは分岐鎖状のアルコー
ル類であるが、本発明者らが検討したところによると、
ＡＡＴａｓｅは２‐フェニルエチルアルコールのような
さらに炭素数の多いアルコールをも基質としうることが
知られている。

【００２１】したがって、本発明でＡＡＴａｓｅの基質
アルコールを議論する必要がある場合は、「アルコール
類」は広範囲のアルコールを包含するものと理解すべき
である。

【００２２】本発明でのＡＡＴａｓｅは、酵母由来もの
である。これは具体的にはサッカロマイセス・セレビシ
エ（S. cerevisiae ）から得られたものであって、実質
的に添付図１および２にわたって示したアミノ酸配列の
ＡからＢまでのアミノ酸配列、添付図３および４にわた
って示したアミノ酸配列のＡからＢまでのアミノ酸配
列、添付図１９および２０にわたって示したアミノ酸配
列のＡからＣまでのアミノ酸配列、添付図１９および２
０にわたって示したアミノ酸配列のＢからＣまでのアミ
ノ酸配列、のいずれかを有するポリペプチドである。ポ
リペプチドの生理活性がいくつかのアミノ酸の付加、挿
入、削除、欠失または置換によって変化しないことがあ
ることは遺伝子工学あるいは蛋白工学の明らかにすると
ころである。本発明でアミノ酸配列を「実質的に」添付
図１および２にわたって示したアミノ酸配列のＡからＢ
までのアミノ酸配列というのは、本発明でいうアミノ酸
配列がたとえば添付図１および２にわたって示したアミ
ノ酸配列のＡ−Ｂのアミノ酸配列と全く同じである場合
のみに限られず、ＡＡＴａｓｅ産生能が保存されている
限り上記のようなアミノ酸の改変を包含することを示す
趣旨である。

【００２３】なお、本発明でいうサッカロマイセス・セ
レビシエは、The yeasts,a taxonomic study 3rd.Editi
on(ed.by N.J.W.Kreger-van Rij,Elsevier Science Pub
lishers B.V.,Amsterdam(1984),p379)に記載されている
ところのサッカロマイセス・セレビシエおよびそのシノ
ニムないし変異株である。

【００２４】ＡＡＴａｓｅは、その精製法も含めて、既
に報告されている（日本農芸化学会誌63. 435 (1989)、
Agric. Biol. Chem., 54. 1485 (1990) 、日本醸造協会
誌87. 334(1992) 等）。しかし、本発明者らの知る限り
では、そのＡＡＴａｓｅは純度が充分に高くないので、
そのアミノ酸配列を決定することはできなかったのであ
る。

【００２５】本発明者らは、ＡＡＴａｓｅの精製に１‐
ヘキサノールをリガンドとするアフィニティーカラムの
使用が有効であることを見いだし、これを用いてＡＡＴ
ａｓｅをサッカロマイセス・セレビシエより完全に精製
することに成功し、ここにその諸性質を明らかにし得た
のである。添付図１および２にわたって示したアミノ酸
配列は、このようにして充分に精製されたサッカロマイ
セス・セレビシエ由来のＡＡＴａｓｅについて得られた
ものである。

【００２６】今回あきらかとなったＡＡＴａｓｅの性質
のうち、代表的なものをあげるならば、ＡＡＴａｓｅの
分子量をあげることができる。すなわち、これまで推定
されていたＡＡＴａｓｅの分子量は約４５，０００〜５
６，０００であったが、今回精製されたＡＡＴａｓｅの
分子量はＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミド
電気泳動）の結果（図１０）、約６０，０００であり、
これまで報告されていた蛋白質とは異なるものであるこ
とが示唆された。なお、塩基配列から推定されるＡＡＴ
ａｓｅの分子量は約６１，０００であった。

【００２７】本発明でのＡＡＴａｓｅを酵素学的に定義
すれば下記の通りである。 ａ 作用：エチルアルコールなどの種々のアルコールお
よびアセチルＣｏＡに作用して、酢酸のエステルを生成
する。 ｂ 基質特異性：アルコールに対しては、炭素数が２か
ら５までの種々のアルコールに作用する。炭素数が２か
ら５の範囲では炭素数が多いほど良く作用する。また、
枝分かれしたアルコールよりも直鎖状のアルコールに良
く作用する。 ｃ 分子量：約６００００ ｄ 至適および安定ｐＨ： 至適ｐＨ：８．０ 安定ｐＨ：７．５−８．５ ｅ 至適および安定温度： 至適温度：２５℃ 安定温度：４℃ ｆ 阻害剤等の影響：パラクロロ水銀安息香酸（ＰＣＭ
Ｂ）、およびジチオビス安息香酸（ＤＴＮＢ）により強
い阻害を受ける。 ｇ 各種脂肪酸の活性に及ぼす影響：飽和脂肪酸によっ
ては顕著な阻害は受けないが、不飽和脂肪酸により強い
阻害を受ける。 ｈ イソアミルアルコールまたはアセチルＣｏＡに対す
るＫｍ値： イソアミルアルコール：２９．８ｍＭ アセチルＣｏＡ：１９０μＭ

【００２８】このＡＡＴａｓｅは、サッカロマイセス・
セレビシエである協会酵母７号の培養および菌体内容物
からの粗酵素の回収ならびに精製からなる方法によって
得ることができる。これらの単位工程からなるＡＡＴａ
ｓｅ取得の実際は、後記の実施例に示した通りであっ
て、１‐ヘキサノールをリガンドとするアフィニティー
カラムクロマトグラフィーを含めて本発明ＡＡＴａｓｅ
の取得は当業者にとって容易である。

【００２９】＜ＡＡＴａｓｅを産生するＤＮＡ配列ない
しＤＮＡ鎖／遺伝子＞本発明において、ＡＡＴａｓｅを
産生する能力を有するＤＮＡ配列ないしＤＮＡ鎖とはＡ
ＡＴａｓｅ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列ないしＤＮＡ鎖のことであり、それがコードする
ポリペプチドすなわちＡＡＴａｓｅのアミノ酸配列で示
せば下記の（２ａ）〜（２ｄ）からなる群から選ばれた
ものであり、その具体例を示せば、それは下記の（３
ａ）〜（３ｄ）からなる群から選ばれたものである。 （２ａ） 実質的に添付図１および２にわたって示した
アミノ酸配列のＡからＢまでのアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列からなることを特徴
とする、アルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子。 （２ｂ） 実質的に添付図３および４にわたって示した
アミノ酸配列のＡからＢまでのアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列からなることを特徴
とする、アルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子。 （２ｃ） 実質的に添付図１２および１３にわたって示
したアミノ酸配列のＡからＣまでまたはＢからＣまでの
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
配列からなることを特徴とする、アルコールアセチルト
ランスフェラーゼ遺伝子。 （２ｄ） 上記（２ａ）〜（２ｃ）のポリペプチドのい
ずれかのアミノ酸の付加、挿入、削除、欠失または置換
による変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列であることを特徴とする、アルコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子。 （３ａ） 実質的に添付図１および２にわたって示した
塩基配列のＡからＢまでの塩基配列からなる、アルコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子。 （３ｂ） 実質的に添付図３および４にわたって示した
塩基配列のＡからＢまでの塩基配列からなる、アルコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子。 （３ｃ） 実質的に添付図１９および２０にわたって示
した塩基配列のＡからＣまでまたはＢからＣまでの塩基
配列からなる、アルコールアセチルトランスフェラーゼ
遺伝子。 （３ｄ） 上記（３ａ）〜（３ｃ）のいずれかのＤＮＡ
配列またはその相補体にハイブリダイズし、かつアルコ
ールアセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプ
チドを産生しうるＤＮＡ鎖。

【００３０】ここで、このＤＮＡ配列がコードするポリ
ペプチドの定義において「実質的」ということの意味は
前記したところであって、ＤＮＡ配列もそれがコードす
るポリペプチドの変動に対応して変動する訳であるが、
このポリペプチドを「コードするＤＮＡ配列」というこ
ともまた所謂遺伝暗号に関する知見にしたがってその最
も広い意味に解するものとする。したがって、縮退（de
generacy）によって所与のアミノ酸をコードする核酸の
トリプレットは複数種ありうるし、またコードされるポ
リペプチドのＡＡＴａｓｅ産生能が保存される限り、ア
ミノ酸の付加、挿入、削除、欠失または置換に対応し
て、トリプレットのいくつかおよび（または）その構成
核酸のいくつかが変化していてもよい。なお、「コード
する」ということは、「コードする能力を有する」と同
義である。

【００３１】本発明で対象とするＤＮＡ配列は、天然物
由来のものでも、全合成したものでも、あるいは天然物
由来のものの一部を利用して合成を行なったもの、すな
わち半合成のもの、でもよい。

【００３２】このようなＤＮＡ鎖の典型的な取得法の一
つは、本発明の提供するＡＡＴａｓｅを産生する能力を
有するＤＮＡ鎖の一部をプローブとして使用して、プラ
ークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼ
ーション、ＰＣＲ等の手段を行なうことである。これら
の方法は、いずれも当該分野に関わる当業者に周知であ
って、容易に実施できるものである。

【００３３】またこのような手段によってＡＡＴａｓｅ
を産生する能力を有するＤＮＡ鎖を取得するための遺伝
子源として有用なものとしては、細菌、酵母、植物等が
考えられ、特に酒、醤油等の発酵食品の製造に使用され
ている酵母類は上記の条件に当てはまるＤＮＡ鎖を有し
ている可能性が高い。

【００３４】このＤＮＡ配列は、ＡＡＴａｓｅに丁度対
応する長さのものであってもよく、またその上流および
（または）下流側にＤＮＡ配列が結合した構造のもので
あってもよい。後者の具体例は、適当なベクターに組込
まれたプラスミドの形状のものである。

【００３５】＜形質転換＞ＡＡＴａｓｅ遺伝子を利用し
てホスト酵母のＡＡＴａｓｅ産生能発現を抑制するに
は、形質転換の手法によればよい。

【００３６】形質転換体の作製のための手順ないし方法
は遺伝子工学の分野において慣用されているものであ
り、本発明においても下記したところ以外のものについ
ては慣用基準（ANALYTICAL BIOCHEMITSTRY 163. 391 (1
987)等）に準じて実施すれば良い。

【００３７】形質転換の典型的なものは、外来遺伝子、
すなわち、本発明の場合はＡＡＴａｓｅ産生遺伝子、を
ホスト細胞、すなわち酵母、の核内および（または）核
外に導入して、その形質を発現させることからなるもの
である。

【００３８】しかし、ホスト酵母が固有のＡＡＴａｓｅ
産生遺伝子を持つものである場合に、その遺伝子の発現
を抑制することによって、ＡＡＴａｓｅ産生能の消失な
いし減少した酵母を作成することができる。すなわち、
（イ）当該遺伝子を破壊ないし不活性化するＤＮＡ鎖で
置換えて、ＡＡＴａｓｅ産生能そのものを消失にないし
減少させることができ、また（ロ）ホスト細胞固有のＡ
ＡＴａｓｅ産生遺伝子を保有させたまま、所謂アンチセ
ンスＲＮＡを発現するような外来ＤＮＡ鎖の導入により
翻訳を抑制することによって当該遺伝子の発現を抑制す
ることができる。

【００３９】この際用いられるベクターとしては、酵母
用として知られているもの、たとえば、ＹＲｐ系（酵母
染色体のＡＲＳ配列を複製起点とする酵母用マルチコピ
ーベクター）、ＹＥｐ系（酵母の２μｍＤＮＡの複製起
点を持つ酵母用マルチコピーベクター）、ＹＣｐ系（酵
母染色体のＡＲＳ配列を複製起点として持ち、かつ酵母
染色体のセントロメアのＤＮＡ配列を持つ酵母用シング
ルコピーベクター）、ＹＩｐ系（酵母の複製起点を持た
ない酵母染色体組込み用ベクター）等、知られているも
の全てを用いることができる。これらのベクターは文献
上公知（朝倉書店刊、日本農芸化学会ＡＢＣシリーズ
「物質生産のための遺伝子工学」、ｐ６８）であるばか
りでなく、容易に作製することができる。

【００４０】前者の方法（イ）は、具体的には、たとえ
ば、所謂「相同組換え」を利用するものであって、ホス
ト酵母に固有のＡＡＴａｓｅ産生遺伝子をＡＡＴａｓｅ
産生能を失う程度に破壊することからなる。

【００４１】相同組換えを利用したＡＡＴａｓｅ遺伝子
の破壊法は、二つの段階により行われる。

【００４２】まず、第一段階として破壊したいＡＡＴａ
ｓｅ遺伝子の中心部の一部を制限酵素で切り落とし、そ
の代りに適当な他の遺伝子（Ｇ４１８耐性遺伝子等）を
挿入したＤＮＡ断片を作製する。この断片はＡＡＴａｓ
ｅ遺伝子の一部が欠失し、他の断片に置き代っているた
めＡＡＴａｓｅ遺伝子が発現し得ない。

【００４３】次に、第二段階として作製したこの断片と
酵母のＡＡＴａｓｅ遺伝子を置換える。この方法は通常
の形質転換と全く同じ手順によって行われる。すなわ
ち、この断片は、両端に存在するＡＡＴａｓｅ遺伝子相
同塩基配列を利用して酵母のＡＡＴａｓｅ遺伝子を置き
代えることができ（相同組換え）、置き代った酵母はＡ
ＡＴａｓｅ遺伝子を失っている。

【００４４】なお、相同組換えによる方法の詳細につい
ては、たとえば、Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 76.4951(19
79) 、Methods in Enzymology.101 ，202(1983) 等を参
照されたい。

【００４５】後者の方法（ロ）は、たとえば、ＡＡＴａ
ｓｅ産生能は実質的に破壊しないが、ＡＡＴａｓｅ産生
遺伝子の発現の過程に障害を設けるものであって、具体
的にはアンチセンスＲＮＡを使用することからなる。

【００４６】アンチセンスＲＮＡによりＡＡＴａｓｅ遺
伝子の発現量を減少させる方法は、発現を抑制したいＡ
ＡＴａｓｅ遺伝子のｍＲＮＡと相補的なｍＲＮＡを適当
なプロモーターによって発現させることにより行われ
る。この相補的なｍＲＮＡの発現のためには、一般的に
当該遺伝子のｍＲＮＡ部分をプロモーターに逆向きに接
続する方法が採られる。本来の向きと逆向きに接続され
た遺伝子は、２本鎖ＤＮＡのうちの本来と反対側のＤＮ
Ａ鎖、つまりＡＡＴａｓｅ蛋白をコードしていない方の
ＤＮＡ、を転写する。できたアンチセンスＲＮＡはＡＡ
Ｔａｓｅ遺伝子のｍＲＮＡと細胞内でハイブリッドを形
成して、当該遺伝子のｍＲＮＡにリボソームが結合して
ＡＡＴａｓｅ蛋白を合成するのを著しく妨げる。

【００４７】本発明の前提にかかるＡＡＴａｓｅ遺伝子
のアンチセンスＲＮＡを酵母中で発現させるためあるい
は発現を増加もしくは減少させるためには、転写および
翻訳を制御するユニットであるプロモーターを本発明Ｄ
ＮＡ鎖の５′−上流域に、ターミネーターを３′−下流
域にそれぞれ組込めば良い。このプロモーターおよびタ
ーミネーターとしては、ＡＡＴａｓｅ遺伝子それ自身に
由来するものの他、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子
（J. Biol. Chem., 257 ,3018(1982) ）、ホスホグリセ
レートキナーゼ遺伝子（Nucleic Acids Res., 10, 7791
(1982) ）、グリセロールアルデヒド−３−燐酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子（J.Biol. Chem., 254, 9839(1979)）
等既に知られているあらゆる遺伝子由来のものもしくは
人工的にそれを改良したものの使用が可能である。な
お、アンチセンスＲＮＡによる方法の詳細については、
たとえば、Science, 229.,345(1985) を参照されたい。
また、酵母におけるアンチセンスＲＮＡの使用方法につ
いてはCurr.Genet.,13,283(1988)等を参照されたい。

【００４８】本発明において形質転換すべき酵母、すな
わちホスト酵母、は分類学上、酵母の範疇に入りうる任
意のものでありうるが、本発明の目的からすれば、サッ
カロマイセス・セレビシエに属する酒類製造用酵母、具
体的にはビール酵母、清酒酵母、ワイン酵母等が好まし
い。具体的には、例えば、ビール酵母：ＡＴＣＣ26292
、ＡＴＣＣ2704、ＡＴＣＣ32634 およびＡＪＬ2155、
清酒酵母：ＡＴＣＣ4134、ＡＴＣＣ26421 およびＩＦＯ
2347、ワイン酵母：ＡＴＣＣ38637 、ＡＴＣＣ38638 お
よびＩＦＯ2260を例示することができる。

【００４９】ホスト酵母として好ましい他の一群は、パ
ン酵母である。具体的にはＡＴＣＣ32120 を例示するこ
とができる。

【００５０】＜酒類の製造＞上記のようにして得た、Ａ
ＡＴａｓｅ産生能の低減した形質転換酵母は、導入され
た形質に加えてホスト酵母個有の形質を具備しているか
ら、その個有の形質に着目した各種の用途に利用するこ
とができる。

【００５１】ホスト酵母が酒類製造用酵母である場合
は、形質転換酵母も糖を資化してアルコールを産生する
能力を有しているから、本発明による形質転換酵母を使
用すれば、エステル香味の低減した酒類を製造すること
ができる。

【００５２】酒類としては清酒、ワイン、ウイスキーお
よびビールが代表的であり、酵母によるこれらの製造法
は周知である。

【００５３】

【実施例】

（１） ＡＡＴａｓｅの製造 本発明の酵素は、サッカロマイセス属に属し、前記特性
を有する酵素を生産する微生物を培養し、その培養物か
ら得ることができる。好ましい製造法の一例を示せば次
の通りである。

【００５４】（１）−（i ）アルコールアセチルトラン
スフェラーゼ活性の測定 ＡＡＴａｓｅ反応用緩衝液（２５ｍＭイミダゾール塩酸
緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭアセチルＣｏＡ、０．１
％トライトンＸ−１００、０．５％イソアミルアルコー
ル、１ｍＭジチオスレイトール、０．１Ｍ塩化ナトリウ
ム、、２０％グリセロール、または１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．５）、１ｍＭアセチルＣｏＡ、０．１％ト
ライトンＸ−１００、０．５％イソアミルアルコール、
１ｍＭジチオスレイトール、０．１Ｍ 塩化ナトリウ
ム、２０％グリセロール）、および本酵素を含む溶液１
ｍｌを２０ｍｌ容バイアルに封入した後、２５℃で１時
間反応を行ない、その後開封し０．６ｇ塩化ナトリウム
を加えることにより反応を停止した。内部標準として、
ｎ−ブタノールを５０ｐｐｍの濃度になるように加え、
再びテフロン栓で蓋をした後、ガスクロマトグラフィー
（島津 ＧＣ−９Ａ、ＨＳＳ−２Ａ）を用いて、ヘッド
スペース法により生成する酢酸イソアミルを定量した。 分析条件： カラム：ガラスカラム ２．１ｍ×３ｍｍ 充填剤：１０％ポリエチレングリコール１５４０ ダイアソリッドＬ（６０／８０メッシュ） カラム温度：７５℃ 注入温度：１５０℃ キャリア−ガス：窒素 流速 ：５０ｍｌ／分 サンプル量：０．８ｍｌ

【００５５】（１）−(ii)粗酵素液の調製 協会酵母７号をＹＰＤ培地（イーストエクストラクト１
％、バクトペプトン２％、グルコース２％）５００ｍｌ
に植菌し、１５℃で３日間前培養した。その培養液を１
０００ｍｌのＹＰＤ培地を入れた２０００ｍｌ容三角フ
ラスコ２０本に各々２５ｍｌ接種し、３０℃で１２時間
静置培養した。次に、遠心（３０００回転／分、１０分
間）により菌体を回収し、その菌体重量の１０倍容の緩
衝液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、
０．１Ｍ 亜硫酸ナトリウム、０．８Ｍ 塩化カリウ
ム）に懸濁させ、菌体重量の１０００分の１量の「ザイ
モリエース１００Ｔ」（生化学工業（株）より市販の酵
母細胞溶解酵素（第702095号特許、U.S.Patent No.3917
510 ））を加えた。これを３０℃で１時間振盪し、生じ
たプロトプラストを３０００回転／分、５分間の遠心に
よって回収した。回収したプロトプラストを４００ｍｌ
の菌体破砕用緩衝液（２５ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝
液（ｐＨ７．５）、０．６Ｍ 塩化カリウム、１ｍＭエ
チレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡと略））に
懸濁させ、「ポリトロンＰＴ１０型」（ＫＩＮＥＭＡＴ
ＩＣＡ社）菌体破砕装置を用いて細胞を破砕した。破砕
後、４５０００ｒｐｍの遠心により破砕残渣を取り除い
て粗酵素液を得た。

【００５６】（１）−(iii) ミクロソーム画分の調製 （１）−(ii)で得られた粗酵素液を１００，０００×Ｇ
で２時間遠心し、生じた沈殿（ミクロソーム画分）を
４０ｍｌの緩衝液（２５ｍＭイミダゾール−塩酸（ｐＨ
７．５）、１ｍＭ ジチオスレイトール）に懸濁させ
た。直ちに使用しない場合は、これを−２０℃で保存し
た。

【００５７】（１）−(iv)可溶化酵素の調製 （１）−(iii) で得られたミクロソーム画分を三角フラ
スコに移し、１００分の１容のトライトンＸ−１００を
加えた。これを、４℃で、泡立たないように注意して６
０分間マグネチックスタラーを用いて攪拌した。その
後、１００，０００×Ｇで２時間遠心し、上清を緩衝液
Ａ（２５ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
２）、０．１％トライトンＸ−１００、０．５％イソア
ミルアルコール、１ｍＭジチオスレイトール、２０％グ
リセロール）に対して１晩透析した。

【００５８】（１）−(v) 酵素の精製 酵素の精製は、（１）−(ii)および（１）−(iii) の操
作を２０回繰り返して取得して−２０℃で保存したミク
ロソーム画分に対して（１）−(iv)の操作を行ない、得
られた可溶化酵素液を用いて行なった。まず、可溶化酵
素液をポリバッファ−エクスチェンジャー９４（ファル
マシア社）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精
製した（吸着：緩衝液Ａ、溶出：緩衝液Ａ ０．０−
０．６Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配）。

【００５９】活性画分を、繰り返し、ポリバッファ−エ
クスチェンジャー９４により精製した。活性画分を、さ
らに、第１表に示したように精製した。すなわち、 イオン交換カラムクロマトグラフィーＤＥＡＥトヨ
パール５５（ＴＯＳＯＨ社） 吸着：緩衝液Ａ、溶出：緩衝液Ａ ０．０−０．２Ｍ塩
化ナトリウム濃度勾配 ゲルろ過カラムクロマトグラフィートヨパールＨＷ
６０（ＴＯＳＯＨ社） 緩衝液Ｂ（１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、
０．１％トライトンＸ−１００、０．５％イソアミルア
ルコール、１ｍＭジチオスレイトール、０．１Ｍ塩化ナ
トリウム、２０％グリセロール） ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー
（和光純薬社） 吸着：緩衝液Ｂ、溶出：緩衝液Ｂ １０−５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．５）濃度勾配 オクチルセファロースカラムクロマトグラフィ−
（ファルマシア社） 吸着：５０ｍＭイミダゾール−塩酸（ｐＨ７．５）、
０．５％イソアミルアルコール、１ｍＭ ジチオスレイ
トール、０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０％グリセロー
ル、溶出：５０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）、０．１％トライトンＸ−１００、０．５％イ
ソアミルアルコール、１ｍＭジチオスレイトール、０．
１Ｍ塩化ナトリウム、２０％グリセロール）により精製
した。

【００６０】第１表に示すようにこの段階で比活性で約
２０００倍に精製されていることが確認されたが、ＳＤ
Ｓポリアクリルアミド電気泳動、銀染色を行なったとこ
ろ、依然として複数のバンドが認められ、完全な精製に
は至っていなかった。

【００６１】そこで、本発明者らはＡＡＴａｓｅの基質
である１‐ヘキサノールが、ＡＡＴａｓｅと強い親和性
を持つことを利用し、１‐ヘキサノールのアフィニティ
ークロマトグラフィーを実施した。６‐アミノ‐１‐ヘ
キサノール（和光純薬社）を担体にＣＮＢｒ活性化セフ
ァロース４Ｂ（ファルマシア社）を用いてファルマシア
社のマニュアルにしたがってヘキサノールセファロース
４Ｂを作成した。この担体を用いて、アフィニティーク
ロマトグラフィーを実施した（吸着：５ｍＭリン酸バッ
ファー（ｐＨ７．２）、０．１％トライトンＸ−１０
０、２０％グリセロール、１ｍＭジチオスレイトール、
溶出：０．０−０．２Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配）、図
９のように得られた活性画分をＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動に供し、銀染色したところ、この活性画
分は図１０に示すように単一バンドを与える酵素標品で
あり、ＡＡＴａｓｅの完全な精製に成功したと判断され
た。

【００６２】 第１表 ＡＡＴａｓｅの精製（その一） 液量 活性 全活性 (ml) (ppm/ml) (ppm) 可溶化酵素 ５０５ １１９ ６０１００ PBE 94 1st. ３９５ ７７ ３０４００ PBE 94 2nd. ８６ ３０４ ２６１００ DEAE Toyoparl ２４ ５８０ １３９００ Toyopearl HW60 ２４ ７０８ １７０００ Hydoroxy apatite ７．６ １０２０ ７７５０ Octyl sepharose １．０ ２３９０ ２３９０ 第１表 ＡＡＴａｓｅの精製（その二） 蛋白量 比活性 収 率 精製率 ｐｐｍ (mg/ml) mg prot. （％） 可溶化酵素 ５．４３ ２２ １００ １ PBE 94 1st. ０．５１５ １５０ ５１ ７ PBE 94 2nd. １．０８６ ２８０ ４３ １３ DEAE Toyoparl ０．９６ ６０４ ２３ ２７ Toyopearl HW60 ０．２６２ ２７００ ２８ １２３ Hydoroxy apatite ０．１１９ ８５７０ １３ ２６６ Octyl sepharose ０．０５６ ４２７００ ４ １９４０

【００６３】（２） ＡＡＴａｓｅの特徴 （２）−(i) 基質特異性 前記の分析機器および方法により各種アルコールに対す
る基質特異性を検討したところ、炭素数が１から５まで
の種々のアルコールに作用した。炭素数が多いほど良く
作用した。また、枝分かれしたアルコールよりも直鎖状
のアルコールに良く作用した（図１１）。

【００６４】（２）−(ii)至適および安定ｐＨ 酵素の安定性に及ぼすｐＨの影響を調べるために、ｐＨ
の幅を５〜９（ｐＨ５〜６：５０ｍＭ クエン酸−リン
酸緩衝液、ｐＨ６〜８：５０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ
８〜９：５０ｍＭトリス−リン酸緩衝液）の範囲で２２
時間、４℃で保持したのち、０．２Ｍリン酸二ナトリウ
ムでｐＨ７．５に調整し、（１）−(i)の方法により酵
素活性を測定した。

【００６５】酵素の活性に及ぼすｐＨの影響を調べるた
めに、ｐＨを５〜９（ｐＨ５〜６：５０ｍＭクエン酸−
リン酸緩衝液、ｐＨ６〜８：５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐ
Ｈ８〜９：５０ｍＭトリス−リン酸緩衝液）の範囲で変
化させて、（１）−(i) の方法によって酵素活性を調べ
た。ｐＨ安定性については、ｐＨ７．５〜８．５の範囲
で安定であった。また、至適ｐＨは８．０であった。

【００６６】（２）−(iii) 至適および安定温度 酵素の活性に及ぼす温度の影響を調べるために、（１）
−(i) の方法により、各温度で活性測定を行なった。

【００６７】また、酵素の安定性に及ぼす温度の影響を
調べるために各温度で酵素液を３０分保持した後、
（１）−(i) の方法により酵素活性を測定した。至適温
度は２５℃であった。また、熱安定性については、４℃
では安定であったが、それ以上の温度では極めて不安定
であった。

【００６８】（２）−(iv)阻害剤等の影響 各種阻害剤の酵素活性に及ぼす影響についての結果を調
べるために、（１）−(i) の反応液中に各種阻害剤を第
２表に示した濃度で加えた後、（１）−(i) の方法で活
性を測定した。結果を、第２表に示す。パラクロロ水銀
安息香酸（ＰＣＭＢ）、ジチオビス安息香酸（ＤＴＮ
Ｂ）により強い阻害を受けたことから、本酵素はＳＨ酵
素であると考えられる。

【００６９】 第２表 阻害剤の影響 阻害剤 比活性 阻害剤 比活性 （１ｍＭ） （％） （１ｍＭ） （％） なし １００ ＺｎＣｌ_２ １２．７ ＫＣｌ ９８．６ ＭｎＣｌ_２ ５３．３ ＭｇＣｌ_２ ８６．２ ＨｇＣｌ_２ ０ ＣａＣｌ_２ ８７．７ ＳｎＣｌ_２ ５２．０ ＢａＣｌ_２ ７３．７ ＴＮＢＳ^＊ １６．８ ＦｅＣｌ_３ ５４．５ ＰＣＭＢ^＊ ０ ＣｏＣｌ_２ ３７．６ ＤＴＮＢ^＊ ０ ＣｄＣｌ_２ ３．１ ＰＭＳＦ^＊ ７０．２ ＮｉＣｌ_２ ２２．３ １，１０−フェナン ＣｕＳＯ_４ ０ スロリン ８７．９ ＊１ｍＭ ＴＮＢＳ：トリニトロ安息香酸 ０．１ｍＭ ＰＣＭＢ：パラクロロ水銀安息香酸 ０．１ｍＭ ＤＴＮＢ：ジチオビス（２‐ニトロ安息香
酸） １ｍＭ ＰＭＳＦ：フェニルメタンスルホニルフル
オリド

【００７０】（２）−(v) 脂肪酸の活性に及ぼす影響 各種脂肪酸を（１）−(i) の反応用緩衝液液中に２ｍＭ
の濃度になるように加えて、酵素活性に及ぼす影響を調
べた（第３表）。

【００７１】 第３表 酵素活性に及ぼす脂肪酸の影響 脂肪酸 比活性 （２ｍＭ） （％） なし １００ ミリスチン酸 Ｃ_１４Ｈ_２８Ｏ_２ ６０．５ パルミチン酸 Ｃ_１６Ｈ_３２Ｏ_２ ８８．１ パルミトオレイン酸 Ｃ_１６Ｈ_３０Ｏ_２ １６．７ ステアリン酸 Ｃ_１８Ｈ_３６Ｏ_２ ８０．５ オレイン酸 Ｃ_１８Ｈ_３４Ｏ_２ ５９．６ リノール酸 Ｃ_１８Ｈ_３２Ｏ_２ ４．３ リノレン酸 Ｃ_１８Ｈ_３０Ｏ_２ ３２．０

【００７２】（３）部分アミノ酸配列の決定 部分アミノ酸配列の決定は岩松（生化学 ６３、ｐ１３
９ （１９９１））のポリビニリデンジフロリド（ＰＶ
ＤＦ）膜を利用した方法にしたがって行なった。（１）
−(v) で取得したＡＡＴａｓｅ酵素を１０ｍＭ ギ酸３
リットルで１時間透析したのち、凍結乾燥した。これを
泳動用緩衝液（１０％グリセロール、２．５％ＳＤＳ、
２％２‐メルカプトエタノール、６２ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ６．８））に懸濁させて、ＳＤＳポリアクリ
ルアミド電気泳動に供した。泳動後、エレクトロブロッ
ティングにより当該酵素をゲルより１０ｃｍ×７ｃｍの
ＰＶＤＦ膜（「ＰｒｏＢｌｏｔ」（アプライド・バイオ
システムズ社））へ転写した。エレクトロブロッティン
グ装置としてはザルトブロットＩＩｓ型（ザルトリウス
社）を用い、島津製作所編の「プロテインシーケンサの
試料前処理方法について（１）」にしたがって、エレク
トロブロッティングを１６０ｍＡで１時間行なった。

【００７３】転写後、当該酵素の転写された部分の膜を
切りとり、約３００μｌの還元用緩衝液（６Ｍ グアニ
ジン塩酸−０．５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ３．
５）、０．３％ＥＤＴＡ、２％アセトニトリル）に浸
し、１ｍｇのジチオスレイトール（ＤＴＴと略）を加
え、アルゴン下で６０℃／約１時間の還元を行った。こ
れに、２．４ｍｇモノヨード酢酸を０．５Ｎ水酸化ナト
リウム液１０μｌに溶かしたものを加え、遮光下で２０
分攪拌した。ＰＶＤＦ膜をとりだし、２％アセトニトリ
ルで十分洗浄した後、０．１％ＳＤＳ中で５分間攪拌し
た。次に、ＰＶＤＦ膜を水で軽く洗浄後、０．５％ポリ
ビニルピロリドン‐４０‐１００ｍＭ酢酸に浸し、３０
分間静置した。こののち、ＰＶＤＦ膜を水で十分洗浄
し、約１ｍｍ四方に切断した。これを消化用緩衝液（８
％アセトニトリル、９０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
９．０））に浸し、アクロモバクタープロテアーゼＩ
（和光純薬）を１ｐｍｏｌ加え、室温で１５時間消化し
た。その消化物を、Ｃ８カラム（日本ミリポア・リミテ
ッド社、μ−Bondasphere ５Ｃ８、３００Ａ、２．１×
１５０ｍｍ）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー
（日立 Ｌ６２００）により分離して、１０数種のペプ
チド断片を得た。ペプチドの溶出溶媒としてはＡ溶媒
（０．０５％トリフルオロ酢酸）、Ｂ溶媒（０．０２％
トリフルオロ酢酸を含む２‐プロパノール／アセトニト
リル ７：３）を用い、Ｂ溶媒に関し、２〜５０％の直
線濃度勾配で０．２５ｍｌ／ｍｉｎの流速で４０分間溶
出させた。得られたペプチド断片について、アミノ酸配
列決定試験をアプライド・バイオシステムズ社の気相プ
ロテインシークエンサー４７０型をマニュアルにしたが
って用い、自動エドマン分解法により行なった。

【００７４】その結果、以下のアミノ酸配列が決定され
た。 ピーク１ Lys Trp Lys ピーク２ Lys Tyr Val Asn Ile Asp ピーク３ Lys Asn Gln Ala Pro Val Gln Gln Glu Cy
s Leu ピーク４ Lys Gly Met Asn Ile Val Val Ala Ser ピーク５ Lys Tyr Glu Glu Asp Tyr Gln Leu Leu Ar
g Lys ピーク６ Lys Gln Ile Leu Glu Glu Phe Lys ピーク７ Lys Leu Asp Tyr Ile Phe Lys ピーク８ Lys Val Met Cys Asp Arg Ala Ile Gly Ly
s ピーク９ Lys Leu Ser Gly Val Val Leu Asn Glu Gl
n Pro Glu Tyr ピーク１０ Lys Asn Val Val Gly Ser Gln Glu Ser
Leu Glu Glu Leu Cys Ser Ile Tyr Lys

【００７５】（４）ＡＡＴａｓｅを産生するＤＮＡ鎖の
清酒酵母協会７号よりのクローニング (i) 清酒酵母ライブラリーの作製 １リットルのＹＰＤ培地で酵母をＯ．Ｄ．６００＝１０
まで培養し、集菌後、オートクレーブ処理した水で洗浄
した。これを菌体１ｇあたり２ｍｌのＳＣＥ液（１Ｍソ
ルビトール、０．１２５ＭＥＤＴＡ、０．１Ｍクエン酸
３ナトリウム（ｐＨ７）、０．７５％２‐メルカプトエ
タノール、０．０１％「ザイモリエース１００Ｔ」（生
化学工業（株））に懸濁させたのち、３７℃で約２時間
緩やかに振盪し、酵母を完全にプロトプラスト化させ
た。これに、菌体あたり、３．５ｍｌのLysis Buffer
（０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）、０．２ＭＥＤ
ＴＡ、３％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳと略））を
加えて緩やかに攪拌した。これを６５℃で１５分保温
し、完全に溶菌させた。溶菌後、これを室温まで冷却
し、あらかじめ日立超遠心チューブ４０ＰＡに製作して
おいた２３．５ｍｌの１０％−４０％のシュークロース
密度勾配液（０．８Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８）、０．０１ＭＥＤＴＡ、１０％
−４０％シュークロース）に１０ｍｌずつ静かにのせ
た。これを、日立超遠心機ＳＣＰ８５Ｈを用いて、４℃
／２６０００ｒｐｍ／３ｈｒで遠心した。遠心後、コマ
ゴメピペットを用いてチューブ底になるべく近いところ
から液を約５ｍｌずつ回収した。回収したサンプルを１
リットルのＴＥ液で一晩透析した。

【００７６】次に、こうして得られた染色体ＤＮＡをFr
ischauf 等の方法（Methods in Enzymology; 152, 183
、 Academic press 1987）に準じて、制限酵素Ｓａｕ
３ＡＩで部分分解し、再び１０％−４０％のシュークロ
ース密度勾配液にのせ、２０℃／２５０００ｒｐｍ／２
２ｈｒの遠心を行なった。遠心終了後、注射針で超遠心
チューブの底に穴をあけ、０．５ｍｌずつ密度勾配液を
サンプリングチューブに分取した。分取したそれぞれの
一部をアガロースゲルによる電気泳動に付すことによっ
て、密度勾配液中に含まれる染色体ＤＮＡの分子量を確
認し、１５〜２０ｋｂのＤＮＡをあつめ、エタノール沈
殿を行なって、回収した。この染色体ＤＮＡ１μｇとλ
−ＥＭＢＬ３／ＢａｍＨＩ ｖｅｃｔｏｒ ｋｉｔ（ス
トラタジーン社製、フナコシ（株）より購入）のλ−Ｅ
ＭＢＬ３ ベクター１μｇを１６℃で一晩ライゲーショ
ンした。これをＧＩＧＡＰＡＣＫ ＧＯＬＤ（ストラタ
ジーン社製、フナコシ（株）より購入）を用いて、パッ
ケージングを行なった。ライゲーションの方法はλ−Ｅ
ＭＢＬ３ベクター付属のマニュアル、パッケージングは
ＧＩＧＡＰＡＣＫ ＧＯＬＤ付属のマニュアルにしたが
って行なった。

【００７７】次に、パッケージング液５０μｌをλ−Ｅ
ＭＢＬ３ ベクターキットに付属しているホスト菌株 P
2392に感染させた。P2392 １白金耳をＴＢ培地（１％バ
クトトリプトン（ディフコ社）、０．５％塩化ナトリウ
ム、０．２％マルトース、ｐＨ７．４）５ｍｌで３７℃
で一晩培養し、この培養液１ｍｌを５０ｍｌのＴＢ培地
に植菌し、Ｏ．Ｄ．６００＝０．５になるまで培養し、
これを氷浴上で冷却した後、集菌し、１５ｍｌの氷冷し
た１０ｍＭ硫酸マグネシウム液に懸濁させた。この菌液
１ｍｌに０．９５ｍｌのＳＭ液（０．１Ｍ塩化ナトリウ
ム、１０ｍＭ硫酸マグネシウム、５０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．５）、０．０１％ゼラチン）と５０μｌ
のパッケージング液を加えて軽く混ぜ、３７℃で１５分
保温した。これを、あらかじめ４７℃に保温しておいた
ＢＢＬ軟寒天培地（１％Tripticase peptone（ＢＢＬ
社）、０．５％塩化ナトリウム、０．５％アガロース
（シグマ社））７ｍｌに２００μｌずつ分注し、軽く混
ぜた後、あらかじめ作製した直径１５ｃｍのＢＢＬ寒天
培地（１％Tripticase peptone、０．５％塩化ナトリウ
ム、１．５％Ｂａｃｔｏａｇａｒ（ディフコ社））に重
層して広げた。

【００７８】これを３７℃で８時間保温し、寒天培地１
０枚、約３０，０００個の酵母染色体ＤＮＡ断片を含む
ファージライブラリーを完成させた。次に、このライブ
ラリーをクローニングに供するため、メンブレンにうつ
しとった。直径１５ｃｍのハイブリダイゼーショントラ
ンスファーメンブレン（ＮＥＮ社）を重層した寒天培地
に約２分接触させ、ファージをメンブレンにうつしとっ
たものを２組、計２０枚作製した。このメンブレンをア
ルカリ変性液（１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｎ水酸
化ナトリウム）をしみこませた濾紙上に、寒天培地と接
触させた面を上にして、約５分静置した。続いて、メン
ブレンを中和液（３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．８））
をしみこませた濾紙上に移動させ、約５分放置した。こ
の後、メンブレンを室温で乾燥させ、さらに８０℃で１
時間真空乾燥させた。また、うつしとりの終わった寒天
培地は４℃で保存しておいた。

【００７９】(ii)プローブの合成と標識 （３）で得られた部分アミノ酸配列のうちｐｅａｋ５お
よび２の情報をもとにアプライド・バイオシステムズ社
ＤＮＡシンセサイザー「モデル３８０Ｂ」を用いて、以
下のような合成プローブを作製した。 プローブ５ Lys Tyr Glu Glu Asp Tyr （ピーク５） ５′−AAA TAT GAA GAA GAT TAT CA−３′ G C G G C C プローブ２ Lys Tyr Val Asn Ile （ピーク２） ５′−AAA TAT GTA AAT ATT GA−３′ G C G C C C A T

【００８０】ホスホアミダイド等の合成試薬は全て同社
のものを採用し、付属のオペレーターズマニュアルにし
たがって使用した。

【００８１】得られた合成ＤＮＡを２８％アンモニア水
３ｍｌで６０℃で４ｈｒ処理し、これをアプライド・バ
イオシステムズ社製のOligonucleotide Purification C
artridges で精製した。

【００８２】合成した２種類のプローブをそれぞれ独立
に［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ（〜６０００Ｃｉ／ｍＭ）で標識
した。各プローブＤＮＡ約２５０ｎｇを１０単位のＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼ、５００μＣｉの［γ−
³²Ｐ］ＡＴＰ、およびリン酸化緩衝液（０．１ｍＭスペ
ルミジン、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ塩化マグネ
シウム、５ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．６））を含む２００μｌの反応液中で３７℃
で１ｈｒ反応させたのち、これを７０℃で１０分間保温
した。これをワットマン社製ＤＥ５２で精製して、未反
応の［γ−³²Ｐ］ＡＴＰを除去した。

【００８３】(iii) プラークハイブリダイゼーションに
よるクローニング プラークハイブリダイゼーションによるクローニング
は、以下のように第一、第二および第三の３段階のスク
リーニングをすることにより行なった。

【００８４】まず、第一スクリーニングとして、（４）
−(i) で作製した酵母ライブラリーをうつしとったメン
ブレン２０枚をハイブリダイゼーション液（６×ＳＳＰ
Ｅ（１．０８Ｍ塩化ナトリウム、０．０６Ｍリン酸化ナ
トリウム、６ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、５×デン
ハルト液（０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フ
ィコール、０．１％牛血清アルブミン）、０．５％ＳＤ
Ｓ、１０μｇ／ｍｌ一本鎖サケ精子ＤＮＡ）２００ｍｌ
に浸し、６０℃で３時間緩やかに振盪して、プレハイブ
リダイゼーションを行なった。

【００８５】次に、（４）−(ii)で作製した［γ−
³²Ｐ］ＡＴＰで標識したプローブ５を、９５℃、５分保
温し、氷水で急冷した。これとハイブリダイゼーション
液４００ｍｌとまぜた液にブレハイブリダイゼーション
の終わったメンブレン２０枚を浸し、３０℃で一晩緩や
かに振盪して、メンブレンと標識したプローブ５とをハ
イブリダイズさせた。

【００８６】ハイブリダイゼーション液を捨て、２×Ｓ
ＳＣ（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０３Ｍクエン酸ナ
トリウム）４００ｍｌ中でメンブレンを３０℃で２０分
間、緩やかに振盪し、メンブレンより過剰のプローブ５
を除く操作を２回繰り返した。この後、メンブレンをＸ
線フィルムと接触させ、一晩マイナス８０℃で露光し
た。２枚のメンブレンいずれでも感光するプラーク４９
個を陽性クローンとして第二スクリーニングに供した。

【００８７】第二スクリーニングでは、まずこれらのプ
ラークをもとの寒天培地より、滅菌パスツールでつつい
てそれぞれ１ｍｌのＳＭに懸濁させた。この溶液の１／
１０００希釈液を作り、その１００μｌをライブラリー
作製の時と同様に、それぞれＰ２３９２の菌液１００μ
ｌに感染させ、３ｍｌのＢＢＬ軟寒天培地と混ぜ、直径
９ｃｍのＢＢＬ寒天培地に広げた。プラーク出現後、
（３）−(iii) に述べたのと同じようにして、メンブレ
ンを１クローンに対し２枚、４９組調製した。（４）−
(ii)で作製した［γ−³²Ｐ］ＡＴＰで標識したプローブ
２を用い、第一スクリーニングと同様の操作を繰り返し
た。陽性クローンとして１５個のプラークを第三スクリ
ーニングに供した。

【００８８】第三スクリーニングでは、再びさらに［γ
−³²Ｐ］ＡＴＰで標識したプローブ５を用い、第二スク
リーニングと同様の操作を繰り返した。以上の操作によ
り、最終的に１４個の陽性クローンを取得した。

【００８９】次に、得られた陽性クローンより、ＤＮＡ
を抽出した。Ｐ２３９２をＴＢ培地で一晩培養したの
ち、１０ｍＭ硫酸マグネシウムを含むＴＢ培地で４倍に
濃縮した。この菌液５ｍｌに１０⁹ 〜１０¹⁰プラーク／
ｍｌの濃度に調製したそれぞれの陽性クローンを２０μ
ｌ混ぜ、３７℃で１５分保温した。これを１０ｍＭの硫
酸マグネシウムを含むＴＢ培地５０ｍｌに移し、３７℃
で６時間振盪した。これにクロロフォルム２ｍｌを加え
て３７℃で３０分振盪し、Ｐ２３９２を溶菌させたの
ち、１０，０００ｒｐｍで１０分遠心して上清を回収し
た。これにＤＮａｓｅＩ（宝酒造）、ＲＮａｓｅＩ（ベ
ーリンガー・マンハイム）をそれぞれ１０μｇ／ｍｌに
なるように加え、３７℃で３０分保温した。ポリエチレ
ングリコール液（２０％ポリエチレングリコール６００
０、２．５Ｍ塩化ナトリウム）を３０ｍｌ加え、４℃で
一晩放置した。１０，０００回転／１０分の遠心をし、
上清を捨て、沈殿を３ｍｌのＳＭに懸濁させた。ＥＤＴ
Ａ（ｐＨ７．５）、ＳＤＳをそれぞれ２０ｍＭ、０．１
％になるように加え、５５℃で４分間保温した。フェノ
ール液（フェノール（２５）：クロロホルム（２４）：
イソアミルアルコール（１））を加え、１０分間ゆっく
り攪拌し、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、ＤＮ
Ａ層（水層）を回収した。この操作をもう一度繰り返し
た後、水層に０．３３ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、７．
５ｍｌのエタノールを加えて攪拌し、−８０℃で３０分
静置した。１０，０００回転／１０分間の遠心をした
後、沈殿を７０％エタノールでリンスし、エタノールを
除去し、沈殿を乾燥させ、ＴＥ５００μｌに溶かした。
こうして得られたそれぞれのファージＤＮＡを各種制限
酵素で切断し、電気泳動して比較した。１４個の陽性ク
ローンにはＡＡＴａｓｅを産生し得るＤＮＡ鎖の全体を
含むものばかりでなく、一部欠けたものもあると思われ
たが、すべて酵母染色体上の同じ部位をクローニングし
たものであった。このうち、当該ＤＮＡ鎖の完全長を含
む６．６ｋｂのＸｂａＩフラグメントの制限酵素地図を
図５に示す。塩基配列の決定はこのＸｂａＩ断片をｐＵ
Ｃ１１９（宝酒造）にサブクローニングしたものを用
い、ジデオキシ法により行なった。ＡＡＴａｓｅをコー
ドする部分の塩基配列を図１および２にわたって示す。

【００９０】（５）ハイブリダイズするＤＮＡ鎖のビー
ル酵母よりの取得 （４）−(iii) で得られた清酒酵母ＡＡＴａｓｅ遺伝子
をプローブとすることにより、清酒酵母（協会７号）Ａ
ＡＴａｓｅ遺伝子とハイブリダイズするＤＮＡ鎖をビー
ル酵母よりクローニングした。図５に示した１．６ｋｂ
のＨｉｎｄＩＩＩ（矢印の範囲）フラグメント５０ｎｇ
をマルチプライムラベリングキット（アマシャムジャパ
ン（株））を用いて１００μＣｉの［α−³²Ｐ］ｄＣＴ
Ｐ（〜３０００Ｃｉ／ｍＭ）と反応させた。これをプロ
ーブとし、（４）−(i) とまったく同様に作製したビー
ル酵母ライブラリー３０，０００個を用い、プラークハ
イブリダイゼーションによるクローニングを行なった。
ハイブリダイゼーションの温度は５０℃とし、ハイブリ
ダイズさせたのち、メンブレンより過剰のプローブを除
くために、５０℃でメンブレンを２×ＳＳＣ中で３０
分、さらに０．２×ＳＳＣ中（０．０３Ｍ塩化ナトリウ
ム、３ｍＭクエン酸ナトリウム）で２０分間緩やかに振
盪した。第一スクリーニングで６０個の陽性クローンを
取得した。これらの陽性プラークを（４）−(iii) と同
様に第二スクリーニングに供し、同じプローブを用いて
最初と同条件でハイブリダイゼーションを繰り返したと
ころ、３０個の陽性クローンが得られた。これらの陽性
クローンよりＤＮＡを抽出して、制限酵素解析を行なっ
た。その結果、これらのクローンは２種類のＤＮＡから
なるものであり、双方の制限酵素地図が全く異なること
から、酵母染色体上の別の部位をクローニングしている
ものであると思われた。これらのクローンのＡＡＴａｓ
ｅ遺伝子を含む部分の制限酵素地図を図６（ａ）、
（ｂ）に示す。これらのクローンを以下それぞれビール
酵母ＡＡＴａｓｅ１遺伝子およびビール酵母ＡＡＴａｓ
ｅ２遺伝子と呼ぶ。

【００９１】ビール酵母ＡＡＴａｓｅ１遺伝子およびビ
ール酵母ＡＡＴａｓｅ２遺伝子の塩基配列の決定を、
（４）−(iii) と同様に行なった。ＡＡＴａｓｅ１遺伝
子の塩基配列を図３および図４にわたって、またＡＡＴ
ａｓｅ２遺伝子の塩基配列を図１２から図１３にわたっ
て示してある。なお、ＡＡＴａｓｅ２はＡからＣのＤＮ
Ａ鎖、ＢからＣのＤＮＡ鎖いずれであってもＡＡＴａｓ
ｅ活性を有するポリペプチドを産生するＤＮＡ鎖であっ
た。

【００９２】（６）ＡＡＴａｓｅ遺伝子を含むベクター
の作製およびこのベクターにより形質転換された酵母の
育種 (i) サッカロマイセス・セレビシエ用発現ベクターの構
築 （４）−(iii) で得られた図５の清酒酵母ＡＡＴａｓｅ
遺伝子の６．６ｋｂのＸｂａＩ断片（ＡＡＴ−Ｋ７）を
取得した。これを酵母２μｍＤＮＡの複製起点とＬＥＵ
２遺伝子をマーカーに持つ酵母用ベクターＹＥｐ１３Ｋ
（図１２、特開昭６２−２２８２８２号公報）をＮｈｅ
Ｉで切断したものと連結して、発現ベクターＹＡＴＫ１
１を作製した（図１３）。

【００９３】同様に（５）で取得した図６（ａ）のビー
ル酵母ＡＡＴａｓｅ１遺伝子の６．６ｋｂのＸｂａＩ断
片（ＡＡＴ−１）を取得し、ＹＥｐ１３ＫをＮｈｅＩで
切断したものと連結して、発現ベクターＹＡＴＬ１を作
製した（図１４）。また図６（ｂ）のビール酵母ＡＡＴ
ａｓｅ２遺伝子の５．６ｋｂのＢｇｌＩＩ断片（ＡＡＴ
−２）を取得し、ＹＥｐ１３ＫをＢａｍＨＩで切断した
ものと連結して、発現ベクターＹＡＴＬ２を作製した
（図１５）。

【００９４】(ii)清酒酵母協会９号用発現ベクターの構
築 Ｇ４１８耐性遺伝子を持つプラスミドｐＵＣ４ｋ（ファ
ルマシア社）を制限酵素ＳａｌＩで切断し、得られたＧ
４１８耐性遺伝子を含む断片をＳａｌＩで切断したＹＡ
ＴＫ１１と連結して、清酒酵母にＡＡＴａｓｅ遺伝子を
導入するためのベクターＹＡＴＫ１１Ｇを作製した（図
１６）。

【００９５】(iii) ビール酵母用発現ベクターの構築 (iii-a) Ｇ４１８耐性マーカーの取得 ＰＧＫ遺伝子を含む２．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片
（特開平２−２６５４８８号公報）をｐＵＣ１８（宝酒
造）にクローニングした。この断片より、図１８に示し
た手段でＰＧＫプロモーターおよびターミネーターを持
つプラスミドｐＵＣＰＧＫ２１を作製した。ｐＵＣＰＧ
Ｋ２１にＧ４１８耐性遺伝子を、プラスミドｐＮＥＯ
（ファルマシア社）より図１８に示した手段で導入して
ｐＰＧＫｎｅｏ２を作製した。

【００９６】(iii-b) 発現ベクターの構築 ｐＰＧＫＮＥＯ２をＳａｌＩで切断し、ＰＧＫプロモー
ター、Ｇ４１８耐性遺伝子およびＰＧＫターミネーター
を含む、約２．８ｋｂの断片をＹＡＴＬ１をＸｈｏＩで
切断したものと連結して、ＹＡＴＬ１Ｇを作製した（図
１７）。

【００９７】（７）ＡＡＴａｓｅ遺伝子による形質転換
酵母の取得 （４）−(iii) および（５）でクローニングしたＡＡＴ
ａｓｅ遺伝子がＡＡＴａｓｅを産生し得ることを確認す
るため、（６）で作製した各種ベクターを用いて、ＡＡ
Ｔａｓｅ遺伝子による形質転換酵母の取得を行ない、形
質転換のＡＡＴａｓｅ活性について検討を行った。サッ
カロマイセス・セレビシエＴＤ４（a, his, leu, ura,
trp)へのプラスミドの導入は酢酸リチウム法（J. Bacte
riol., 153, 163 (1983)）を用いて行ない、ＹＡＴＫ１
１／ＴＤ４、ＹＡＴＬ１／ＴＤ４およびＹＡＴＬ２／Ｔ
Ｄ４（ＳＫＢ１０５株）を取得した。

【００９８】清酒酵母協会９号の形質転換体（ＳＫＢ１
０６株）の取得は、次の通りに行った。すなわち、酢酸
リチウム法を用いてプラスミドを導入した後、３００μ
ｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ寒天培地に塗布した。
この寒天培地を３０℃で３日間保温し、生育してくるコ
ロニーを５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ寒天
培地に再び植菌し、３０℃で２日間培養して、形質転換
体を取得した。

【００９９】ビール酵母Alfred Jorgensen Laboratory
（デンマーク），２１５５株（以下、ＡＪＬ２１５５株
という）へのＹＡＴＬ１Ｇの導入は、以下のようにして
行った。酵母を１００ｍｌのＹＰＤ培地でＯ．Ｄ．６０
０＝１６になるまで３０℃で振盪培養した。集菌後、滅
菌水で１回洗浄した。続いて、１３５ｍＭのトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８．０）で１回洗浄し、同じ緩衝液に菌濃
度が２×１０⁹ ｃｅｌ１ｓ／ｍｌになるように懸濁し
た。この菌液３００μｌに１０μｇのＹＡＴＬ１Ｇとキ
ャリアーＤＮＡとして２０μｇのｃａｌｆ ｔｈｙｍｕ
ｓ ＤＮＡ（シグマ社）を加えた。これに１２００μｌ
の３５％ＰＥＧ４０００（フィルターで無菌ろ過した）
を加え、よく攪拌した。この攪拌した液７５０μｌをジ
ーンパルサー（バイオラッド社）専用のキュベットに移
し、ジーンパルサーを用いて１μＦ／１０００Ｖの条件
で電気パルス処理を１回行なった。菌液をキュベットよ
り１５ｍｌチューブに移し、３０℃で１時間静置した。
菌を３０００ｒｐｍ／５分遠心して集菌したのち、１ｍ
ｌのＹＰＤ培地に懸濁させて３０℃で４時間振盪した。
集菌後、６００μｌの滅菌水に懸濁させ、１５０μｌず
つ１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ寒天培地に
塗布した。この寒天培地を３０℃で３日間保温して、形
質転換体（ＳＫＢ１０８株）を取得した。

【０１００】ＡＡＴａｓｅ遺伝子を導入した形質転換体
および対照株のＡＡＴａｓｅ活性測定は、次のようにし
て行なった。すなわち、形質転換体の培養は、サッカロ
マイセス・セレビシエＴＤ４の場合にはロイシンを除い
たアミノ酸混合液を添加したＳＤ液体培地（０．６５％
イーストナイトロジェンベース（除アミノ酸、ディフコ
社）、２％グルコース）を用いた。清酒酵母協会９号の
場合は、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ液体
培地を用いた。ビール酵母ＡＪＬ２１５５株の場合は１
０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ液体培地を用い
た。１０００ｍｌの培地に約１６時間３０℃で振盪培養
したものを２５ｍｌ添加し、３０℃で１２時間から１８
時間静置培養した。

【０１０１】粗酵素液の調製および活性の測定は、それ
ぞれ、（１）−(ii)および（１）−(i) に準じて行なっ
た。また、タン白質の定量は、バイオラッドプロテイン
アッセイキット（バイオラッド社）を用い、マニュアル
にしたがって行なった。

【０１０２】サッカロマイセス・セレビシエＴＤ４の結
果を第４表に、清酒酵母協会９号の結果を第５表に、ビ
ール酵母ＡＪＬ２１５５の結果を第６表に示す。ＡＡＴ
ａｓｅ活性は、対照株に比べ２倍から１５倍の高さが認
められた。よって、本発明によるＡＡＴａｓｅ遺伝子を
用いることによって、容易に酢酸イソアミル等の酢酸エ
ステルを多量に生成する株を育種することができる。

【０１０３】 第４表 組換酵母菌体および粗酵素液の酵素活性 粗 酵 素 液 ｐｐｍ mg タンパク質 ＹＥｐ１３Ｋ／ＴＤ４ ７．８ ＹＡＴＫ１１／ＴＤ４ ８４．０ ＹＡＴＬ１／ＴＤ４ １１６．２ ＹＡＴＬ２／ＴＤ４（ＳＫＢ１０５） ５０．６

【０１０４】 第５表 組換酵母菌体及び粗酵素液の酵素活性 粗 酵 素 液 ｐｐｍ mg ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋ９ ３．４ ＹＡＴＫ１１Ｇ／Ｋ９（ＳＫＢ１０６） １１．６

【０１０５】 第６表 組換酵母菌体及び粗酵素液の酵素活性 粗 酵 素 液 ｐｐｍ mg ｐｒｏｔｅｉｎ ＡＪＬ２１５５ ４．１ ＹＡＴＬ１Ｇ／ＡＪＬ２１５５（ＳＫＢ１０８） ２３．４

【０１０６】（８）清酒酵母ＡＡＴａｓｅ遺伝子とハイ
ブリダイズするＤＮＡ鎖のワイン酵母からの取得 図８に示した清酒酵母ＡＡＴａｓｅ遺伝子中の２箇所と
相同なプライマーＡおよびＢを合成し、ジーンアンプＰ
ＣＲリージェントキット（宝酒造）、ＤＮＡサーマルサ
イクラー（パーキン−エルマーシータスインストゥルメ
ンツ社）によりプライマーのアニーリングを５０℃、２
分として、３０サイクルの反応を行なった。反応液をア
ガロース電気泳動し、プライマーＡからプライマーＢま
で増幅された１．１７ｋｂの大きさのＤＮＡ鎖をゲルか
ら切り出して精製した。このＤＮＡ鎖０．５μｇをニッ
クトランスレーションキット（宝酒造）を用いて１００
μＣｉ［³²Ｐ］ｄＣＴＰにより標識した。清酒酵母ＤＮ
Ａと同様に作成したワイン酵母Ｗ−３（山梨工業技術セ
ンター）のゲノムライブラリー２０，０００個とハイブ
リダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーション
を６５℃で行ない、メンブレンは６５℃で２×ＳＳＣ２
０分、さらに２×ＳＳＣ１０分、最後に０．１×ＳＳＣ
（１５ｍＭ塩化ナトリウム、１．５ｍＭクエン酸ナトリ
ウム）で１０分緩やかに振盪して洗浄した。最初１４個
の陽性プラークが得られ、これらのプラークを同様にハ
イブリダイゼーションさせて、１．１７ｋｂのＤＮＡ鎖
と強くハイブリダイズする７個の陽性プラークを得た。
この陽性プラークのファージＤＮＡを抽出精製し、制限
酵素解析を行なった。その結果、７個のクローンは全て
１種類のＤＮＡであり、その制限酵素地図は図７に示す
通りであった。

【０１０７】（９）ＡＡＴａｓｅ遺伝子欠損酵母の取得 (i) 遺伝子破壊用ベクターの作製 遺伝子破壊用ベクターは図２１に示した方法で作製し
た。すなわち、図６（ａ）に示したビール酵母ＡＡＴａ
ｓｅ１遺伝子の６．６ｋｂＸｂａＩ断片がｐＵＣ１９
（宝酒造）のＸｂａＩ切断部位に挿入されたプラスミド
ｐＡＴＬ１６をＢａｍＨＩで切断し、セルフライゲーシ
ョンを行なうことにより、ｐＡＴＬ１９６Ｂを作製し
た。一方、ＹＩｐ５より、ＵＲＡ３遺伝子を含む約１．
１ｋｂのＨｉｎｄ III断片を切り出し、ｐＵＣ１９のＨ
ｉｎｄ III切断部位に挿入し、ｐＵＣｕｒａ３を作製し
た。ｐＵＣｕｒａ３をＳｍａＩで切断して約１．１ｋｂ
のＵＲＡ３断片を取り出した。次にｐＡＴＬ１９６Ｂを
ＣｌａＩで切断し、exonucleaseIIIにより削った後、mu
ng bean nucleaseおよびklenow処理をおこなって両端を
平滑末端化したものと１．１ｋｂのＵＲＡ３断片を接続
し、ｐｄｅｌ−ＡＡＴ１を作成した。

【０１０８】(ii) ＡＡＴａｓｅ遺伝子破壊株の作成 (9)-(i) で作製したｐｄｅｌ−ＡＡＴ１をＥｃｏＲＩお
よび、ＮｒｕＩで切断したものを用いてサッカロマイセ
ス・セレビシエＴＤ４を酢酸リチウム法を用いて形質転
換して、ＡＡＴａｓｅ遺伝子破壊株（ＳＫＢ１０９株）
を取得した。形質転換体の選抜はＬ−ヒスチジン塩酸、
Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ロイシンをそれぞれ４０ｐｐ
ｍ含むＳＤ寒天培地を用いて行なった。また、ｐＵＣｕ
ｒａ３をＳｍａＩで切断したものを用いて、全く同様に
サッカロマイセス・セレビシエＴＤ４を形質転換し、得
られた形質転換体を対照株とした。

【０１０９】(iii) 形質転換株のＡＡＴａｓｅ活性の
測定 (9)-(ii)で得たＳＫＢ１０９株（ＡＡＴａｓｅ遺伝子破
壊株）および対照株を、Ｌ−ヒスチジン塩酸、Ｌ−トリ
プトファン、Ｌ−ロイシンをそれぞれ４０ｐｐｍ含むＳ
Ｄ液体培地で２０℃、４８時間振盪培養した。この培養
液１mlをそれぞれＹＭ１５培地（イーストナイロジェン
ベース１．２５％（Ｄｉｆｃｏ）、麦芽エキス１．２５
％（Ｄｉｆｃｏ）、グルコース１５％）１００mlを入れ
た５００ml三角フラスコに移し、２０℃で２４時間静置
培養した。それぞれ約１ｘ１０⁹ 個の細胞の集菌後、蒸
留水で２回洗浄し、さらにＡＡＴａｓｅ反応用緩衝液で
一度洗浄した。これを０．５mlのＡＡＴａｓｅ反応用緩
衝液に懸濁した。これにガラスビーズ（４２５−６００
μｍ、シグマ社）１．５ｇを加え、ボルテックスミキサ
ーで細胞を破砕した。懸濁液を回収し、１５０００ｇ／
２０分の遠心をして、上清を回収し、これを粗酵素液と
した。ＡＡＴａｓｅ活性の測定は、(1)-(i) に示した方
法で行なった。

【０１１０】ＡＡＴａｓｅ活性測定の結果は、第７表に
示す通りであった。ＳＫＢ１０９株（ＡＡＴａｓｅ遺伝
子破壊株）では対照株に比較してＡＡＴａｓｅ活性が約
１／５に低下していた。

【０１１１】 第７表 ＡＡＴａｓｅ遺伝子欠損酵母のＡＡＴａｓｅ活性 菌株 ＡＡＴａｓｅ活性（ppm ／mg protein ） ＳＫＢ１０９ １．６ ＴＤ４（対照株） １０．３

【０１１２】(10)ＡＡＴａｓｅ遺伝子破壊株を用いたエ
ステルの少ない酒類の製造 (9)-(ii)で得たＳＫＢ１０９株（ＡＡＴａｓｅ遺伝子破
壊株）および対照株を、Ｌ−ヒスチジン塩酸、Ｌ−トリ
プトファン、Ｌ−ロイシンをそれぞれ４０ppm 含むＳＤ
液体培地で２０℃、４８時間振盪培養した。この培養液
１mlをそれぞれＹＭ１５培地１００mlを入れた５００ml
三角フラスコに移し、２０℃で７日間静置培養した。上
清の分析結果は、第１１表に示す通りであった。対照株
に比して、酢酸イソアミルが約１／５、酢酸エチルが約
３／５に抑制されており、ＳＫＢ１０９株を用いるとエ
ステル量の少ない酒類が製造できることが確認された。

【０１１３】 第８表−１ 菌 株 エタノール(%) アセトアルデヒド(ppm) 酢酸エチル(ppm) SKB109 ７．２８ １１．５１ ６．７０ TD4-URA3 ７．２９ ９．１９ １１．１３ ^{（対照株）} 第８表−２ 菌 株 ｎ−ブタノ イソブタノ 酢酸イソア イソアミルアル ノール(ppm ール(ppm) ミル(ppm) コール(ppm) SKB109 １９．５０ ３５．８０ ０．０６ ５４．２３ TD4-URA3 ２４．７５ ３６．５８ ０．２８ ５６．４７ ^{（対照株）}

【０１１４】＜微生物の寄託＞本発明に関連する下記の
微生物は、通商産業省工業技術院微生物工業研究所に寄
託されて次の受託番号を得ている。 （１） ＳＫＢ１０５ 微工研条寄第３８２８号 （２） ＳＫＢ１０６ 微工研条寄第３８２９号 （３） ＳＫＢ１０８ 微工研条寄第３８３０号 （４） ＳＫＢ１０９ 微工研条寄第４１６６号 （５） ＥＫＢ１０１ 微工研条寄第４１６５号

【０１１５】ＹＡＴＬ２、ＹＡＴＫ１１ＧおよびＹＡＴ
Ｌ１Ｇを取得するには、それぞれＳＫＢ１０５、ＳＫＢ
１０６およびＳＫＢ１０８を所定の条件で培養し、これ
より酵母の全ＤＮＡを抽出し（参考文献Metbods in yea
st genetics 、Cold SpringHarbor Laboratory. 198
6）、この全ＤＮＡで大腸菌を形質転換したのち、アル
カリ法（参考文献Molecular Cloning 、Cold Spring Ha
rbor Laboratory. 1989）によりこのプラスミドを抽出
すればよい。ｐｄｅｌ−ＡＡＴ１を取得するには、ＥＫ
Ｂ１０１を所定の条件で培養し、これよりアルカリ法に
よりこのプラスミドを抽出すればよい。ＥＫＢ１０１
は、大腸菌ＤＨ５をｐｄｅｌ−ＡＡＴ１で形質転換した
ものである。形質転換は、ニッポンジーン社のＴｒａｎ
ｓｆｏｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＤＨ５を用い、付属のマ
ニュアルに従っておこなった。

【０１１６】本発明で開示された図１および２にわたっ
て示したＤＮＡ鎖のＡからＢまでの一部を含むＤＮＡ鎖
はＹＡＴＫ１１Ｇを適当な制限酵素で切断することによ
って得ることができる。望ましいＤＮＡ鎖の一例として
は、図５に矢印で示した１．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断
片がある。

【０１１７】

【発明の効果】ＡＡＴａｓｅ遺伝子を手にしたことによ
ってエステル香味の低減された酒類が製造できること
は、〔発明の概要〕の項において前記したところであ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によるＡＡＴａｓｅのアミノ酸および塩
基配列図である。図１および下記の図２は連続してい
る。

【図２】本発明によるＡＡＴａｓｅのアミノ酸および塩
基配列図である。上記の図１および図２は連続してい
る。

【図３】本発明による他のＡＡＴａｓｅのアミノ酸およ
び塩基配列図である。図３および下記の図４は連続して
いる。

【図４】本発明による他のＡＡＴａｓｅのアミノ酸およ
び塩基配列図である。上記の図３および図４は連続して
いる。

【図５】本発明によるＡＡＴａｓｅ遺伝子（清酒酵母由
来のもの）の制限酵素地図である。

【図６】本発明によるＡＡＴａｓｅ遺伝子（ビール酵母
由来のもの）２種の制限酵素地図である。

【図７】本発明によるＡＡＴａｓｅ遺伝子（ワイン酵母
由来のもの）の制限酵素地図である。

【図８】ワイン酵母よりＡＡＴａｓｅ遺伝子を取得する
際に用いたプローブの作製法を示す説明図である。

【図９】本発明による精製法のうち、アフィニティーク
ロマトグラフィーによるＡＡＴａｓｅ活性画分の溶出パ
ターンを示す説明図である。

【図１０】本発明によるアフィニティークロマトグラフ
ィー溶出後のＡＡＴａｓｅ活性画分のＳＤＳポリアクリ
ルアミド電気泳動図である。

【図１１】本発明によるＡＡＴａｓｅの各種アルコール
に対する基質特異性を示す説明図である。

【図１２】酵母用ベクターＹＥｐ１３Ｋの制限酵素地図
である。

【図１３】本発明によるＡＡＴａｓｅ遺伝子（清酒酵母
由来のもの）発現ベクターＹＡＴＫ１１の制限酵素地図
である。

【図１４】本発明によるＡＡＴａｓｅ１遺伝子（ビール
酵母由来のもの）発現ベクターＹＡＴＬ１の制限酵素地
図である。

【図１５】本発明によるＡＡＴａｓｅ２遺伝子（ビール
酵母由来のもの）発現ベクターＹＡＴＬ２の制限酵素地
図である。

【図１６】本発明によるＡＡＴａｓｅ遺伝子（清酒酵母
由来のもの）の清酒酵母用発現ベクターＹＡＴＫ１１Ｇ
の制限酵素地図である。

【図１７】本発明によるＡＡＴａｓｅ１遺伝子（ビール
酵母由来のもの）のビール酵母用発現ベクターＹＡＴＬ
１Ｇの制限酵素地図である。

【図１８】ビール酵母用発現ベクターの構築の過程の一
部を示した図である。

【図１９】本発明によるビール酵母ＡＡＴａｓｅ２遺伝
子のアミノ酸および塩基配列図である。図１９および下
記の図２０は連続している。

【図２０】本発明によるビール酵母ＡＡＴａｓｅ２遺伝
子のアミノ酸および塩基配列図である。図１９および図
２０は連続している。

【図２１】ＡＡＴａｓｅ遺伝子破壊用ベクターの構築の
過程を示した図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年４月８日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１１】すなわち、本発明による形質転換されてア
ルコールアセチルトランスフェラーゼ産生能の消失ない
し減少した酵母は、下記の（１ａ）〜（１ｄ）のいずれ
かのＤＮＡ配列を利用してホスト酵母に固有のアルコー
ルアセチルトランスフェラーゼ産生遺伝子の発現を抑制
したものであること、を特徴とするものである。 （１ａ） 実質的に添付図１および２にわたって示した
ＤＮＡ配列のＡからＢまでのＤＮＡ配列。 （１ｂ） 実質的に添付図３および４にわたって示した
ＤＮＡ配列のＡからＢまでのＤＮＡ配列。 （１ｃ） 実質的に添付図１９および２０にわたって示
したＤＮＡ配列のＡからＣまでまたはＢからＣまでのＤ
ＮＡ配列。 （１ｄ） 上記（１ａ）〜（１ｃ）のいずれかのＤＮＡ
配列またはその相補体にハイブリダイズするＤＮＡ鎖。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２９】＜ＡＡＴａｓｅを産生するＤＮＡ配列ない
しＤＮＡ鎖／遺伝子＞本発明において、ＡＡＴａｓｅを
産生する能力を有するＤＮＡ配列ないしＤＮＡ鎖とはＡ
ＡＴａｓｅ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列ないしＤＮＡ鎖のことであり、それがコードする
ポリペプチドすなわちＡＡＴａｓｅのアミノ酸配列で示
せば下記の（２ａ）〜（２ｄ）からなる群から選ばれた
ものであり、その具体例を示せば、それは下記の（３
ａ）〜（３ｄ）からなる群から選ばれたものである。 （２ａ） 実質的に添付図１および２にわたって示した
アミノ酸配列のＡからＢまでのアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列からなることを特徴
とする、アルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子。 （２ｂ） 実質的に添付図３および４にわたって示した
アミノ酸配列のＡからＢまでのアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列からなることを特徴
とする、アルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子。 （２ｃ） 実質的に添付図１９および２０にわたって示
したアミノ酸配列のＡからＣまでまたはＢからＣまでの
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
配列からなることを特徴とする、アルコールアセチルト
ランスフェラーゼ遺伝子。 （２ｄ） 上記（２ａ）〜（２ｃ）のポリペプチドのい
ずれかのアミノ酸の付加、挿入、削除、欠失または置換
による変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列であることを特徴とする、アルコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子。 （３ａ） 実質的に添付図１および２にわたって示した
塩基配列のＡからＢまでの塩基配列からなる、アルコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子。 （３ｂ） 実質的に添付図３および４にわたって示した
塩基配列のＡからＢまでの塩基配列からなる、アルコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子。 （３ｃ） 実質的に添付図１９および２０にわたって示
した塩基配列のＡからＣまでまたはＢからＣまでの塩基
配列からなる、アルコールアセチルトランスフェラーゼ
遺伝子。 （３ｄ） 上記（３ａ）〜（３ｃ）のいずれかのＤＮＡ
配列またはその相補体にハイブリダイズし、かつアルコ
ールアセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプ
チドを産生しうるＤＮＡ鎖。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００９１】ビール酵母ＡＡＴａｓｅ１遺伝子およびビ
ール酵母ＡＡＴａｓｅ２遺伝子の塩基配列の決定を、
（４）−（ｉｉｉ）と同様に行なった。ＡＡＴａｓｅ１
遺伝子の塩基配列を図３および図４にわたって、またＡ
ＡＴａｓｅ２遺伝子の塩基配列を図１９から図２０にわ
たって示してある。なお、ＡＡＴａｓｅ２はＡからＣの
ＤＮＡ鎖、ＢからＣのＤＮＡ鎖いずれであってもＡＡＴ
ａＳｅ活性を有するポリペプチドを産生するＤＮＡ鎖で
あった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 15/54 Ｃ１２Ｒ 1:865）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の（１ａ）〜（１ｄ）のいずれかのＤ
   ＮＡ配列を利用してホスト酵母に固有のアルコールアセ
   チルトランスフェラーゼ産生遺伝子の発現を抑制したも
   のであることを特徴とする、形質転換されてアルコール
   アセチルトランスフェラーゼ産生能の消失ないし減少し
   た酵母。 （１ａ） 実質的に添付図１および２にわたって示した
   ＤＮＡ配列のＡからＢまでのＤＮＡ配列。 （１ｂ） 実質的に添付図３および４にわたって示した
   ＤＮＡ配列のＡからＢまでのＤＮＡ配列。 （１ｃ） 実質的に添付図１２および１３にわたって示
   したＤＮＡ配列のＡからＣまでまたはＢからＣまでのＤ
   ＮＡ配列。 （１ｄ） 上記（１ａ）〜（１ｃ）のいずれかのＤＮＡ
   配列またはその相補体にハイブリダイズするＤＮＡ鎖。
2. 【請求項２】糖を酵母で発酵させて酒類を製造する方法
   において、使用する酵母が請求項１に記載のアルコール
   アセチルトランスフェラーゼ産生能の消失ないし減少し
   た酵母であることを特徴とする、エステル香味の減少し
   た酒類の製造法。