DK175566B1 - DNA-Streng, der koder for alfa-acetolactat-decarboxylase, gærsvamp transformeret med DNA-strengen, fremgangsmåde til fremstilling af en gærsvamp med nedsat alfa-acetolactat-producerende evne og fremgangsmåde til fremstilling..... - Google Patents

Description

DK 175566 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår en DNA-streng med evne til bioteknologisk produktion af a-acetolactat-decarboxylase (i det følgende betegnest α-ALDCase) som produceret af Enterobacter aeroqenes IFO 13534, og op-5 findelsen angår desuden en gærsvamp hørende til Saccha-romyces cerevisiae og transformeret med DNA-strengen, således at dens evne til produktion af a-acetolactat (i det følgende betegnet α-AL) nedsættes. Endvidere angår opfindelsen anvendelsen af DNA-strengen og gærsvam-10 pen, hhv. til fremstilling af en gærsvamp med nedsat -acetolactat-producerende evne og til fremstilling af en alkoholisk væske.

Alkoholiske drikkevarer, såsom øl, sake, vin osv., fremstilles almindeligvis ved at sætte en gærsvamp 15 hørende til Saccharomyces cerevisiae til et væskeformigt udgangsmateriale til fermentering, såsom urt, frugtsaft osv., og underkaste blandingen alkoholisk fermentering.

Ved fermenteringsprocessen vil gærsvampen producere α-AL som det intermediære stof til biosyntese af valin 20 og leucin, der er aminosyrer, som er nødvendige for væksten af gærsvampen selv, og uundgåeligt lade det sive ud af cellen, nemlig ud i den fermenterede væske. α-AL’et, der således er bragt til at foreligge i den fermenterede væske, vil omdannes spontant til diacetyl (i det føl-25 gende betegnet DA) ved en ikke-enzymatisk reaktion i den fermenterede væske.

DA er et stof med en kraftig frastødende lugt almindeligvis betegnet som "kogt lugt" eller "DA-lugt", og til fremstilling af en alkoholisk drikkevare med for-30 trinlig smag og duft (nemlig uden DA-lugt) er det nødvendigt, at indholdet af α-AL og DA i den fermenterede væske nedsættes til så lavt et niveau, at det totale DA-indhold ikke til sidst vil overskride den kritiske

I DK 175566 B1 I

I I

I tærskelværdi for DA-lugt i den alkoholiske drikkevare I

I (f.eks. 0,05 til 0,1 mg/liter i tilfælde af øl), selv I

I hvis alt α-AL'et eventuelt omdannes til DA. I

I Medens DA i den fermenterede væske under samti- I

I 5 dig tilstedeværelse af gær forholdsvis hurtigt omdannes I

I til acetoin, som er uden smag og lugt, vil α-AL i den I

I fermenterede væske ikke omdannes af gær, men det bliver I

I først nedbrydeligt for gær, efter at det er blevet om- I

I dannet til DA ved en ikke-enzymatisk kemisk reaktion. Da I

I 10 imidlertid reaktionen til omdannelse af α-AL til DA i I

I den fermenterede væske forløber med meget ringe hastig- I

I hed, bliver denne reaktion det hastighedsbegrænsende I

I trin, hvorfor det er nødvendigt, at den fermenterede I

I væske lagres under samtidig tilstedeværelse af gær i I

I 15 lang tid for at opnå en alkoholisk væske med lavt ind- I

I hold af α-AL og DA (nemlig uden DA-lugt). I

I a-ALDCase er et enzym med den egenskab, at det I

I omdanner α-AL til acetoin, og man ved, at det produceres I

I af forskellige slags bakterier, såsom Enterobacter aero- I

20 genes, Bacillus llcheniformls, Lactobacillus easel, Ba- I

I clllus brevis, Enterobacter cloacae, Acetobacter bakte- I

I rier (såsom A^ rancens, A. aceti, osv.). De vigtigste I

I enzymologiske egenskaber af den af Enterobacter aeroge- I

I nes producerede α-ALDCase undersøgtes i forbindelse med I

I 25 den foreliggende opfindelse, hvorved der opnåedes de I

I nedenstående resultater. I

I Molekylvægt: 28000-29000 I

I Isoelektrisk punkt: pH 5,0-6,0 I

Optimal pH: 6,5-7,5 I

Optimal temperatur: 40-50°C I

Termisk stabilitet: stabilt til omkring 60°C. I

Der foreligger også en rapport om de enzymologi- I

ske egenskaber af den af Enterobacter aerogenes produ- I

DK 175566 B1 3 cerede α-ALDCase [European Journal of Biochemistry (Eur.

J. Biochem.) 1Λ (1970) 133-137].

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en DNA-streng med evne til bioteknologisk produktion 5 af α-ALDCase, der er nyttig til produktion af alkoholiske drikkevarer uden nogen DA-lugt inden for et langt kortere tidspunkt sammenlignet med den kendte fremgangsmåde, og endvidere tilvejebringes der en gærsvamp, hvis α-AL-producerende evne er formindsket ved transformation 10 med DNA-strengen.

Nærmere angivet er den omhandlede DNA-streng med evne til bioteknologisk produktion af α-ALDCase ejendommelig ved, at den har en nucleotidsekvens, eller med andre ord en basesekvens, der koder for et polypeptid 15 med α-ALDCase-aktivitet, hvis aminosyresekvens, dvs. polypeptidets aminosyresekvens, er i det væsentlige som fra A til B i den i tegningens figur 1 viste aminosyresekvens .

Tilsvarende er den omhandlede, til Saccharomyces 20 cerevislae hørende gærsvamp ejendommelig ved, at dens α-AL-producerende evne er formindsket ved transformation med en DNA-streng, som har en nucleotidsekvens, der koder for polypeptidet med a-ALDCase-aktivitet, hvilket polypeptids aminosyresekvens er i det væsentlige 25 som fra A til B i den i tegningens figur l viste aminosyresekvens.

DNA-Strengen ifølge opfindelsen kan bibringe α-ALDCase-producerende evne til forskellige mikroorganismer, f.eks. Saccharomyces cerevislae til nedsættelse 30 af dens α-AL-producerende evne (som beskrevet nærmere nedenfor), eller den kan udnyttes effektivt til bioteknologisk produktion af a-ALDCase.

Da gærsvampen ifølge opfindelsen har formindsket evne til produktion af α-AL (eller rettere udsivning af i

I DK 175566 B1 I

I 4 I

I α-AL fra cellen), hvis det væskeformige udgangsmateria- I

I le til fermentering fermenteres med denne gærsvamp, vil I

I desuden koncentrationen af α-AL i den fermenterede væ- I

I ske blive meget lav med det resultat, at den nødvendige I

I 5 lagringstid til behandling af α-AL i den fermenterede I

I væske, og dermed produktionstiden for den alkoholiske I

I væske, kan afkortes i bemærkelsesværdig grad. Hos gær- I

I svampen ifølge den foreliggende opfindelse er dens α-AL- I

I producerende evne sandsynligvis formindsket som følge I

I 10 af, at α-AL'et, selvom det produceres inde i cellen ved I

I fermenteringsprocessen, vil omdannes til acetoin af den I

I ligeledes inde i cellen producerede α-ALDCase. I

I På tegningen viser I

I fig. 1 nucleotidsekvensen for DNA-strengen ifølge I

I 15 opfindelsen og den ud fra nucleotidsekvensen udledte I

I aminosyresekvens, I

I fig. 2 strukturen af pALG5043, og I

I fig. 3 strukturen af pIARLl. I

I 20 α-ALDCase-gen I

I Definition I

I DNA-Strengen ifølge opfindelsen med evne til bio- I

I 25 teknologisk produktion af α-ALDCase, nemlig α-ALDCase- I

I genet, koder for et polypeptid med α-ALDCase-aktivitet, I

I hvilket polypeptids aminosyresekvens er i det væsentlige I

I som fra A til B i den i figur 1 viste aminosyresekvens. I

I Her betyder "DNA-strengen" komplementære dobbelt- I

I 30 strenge af polydeoxyribonucleinsyre med en vis længde. I

I Da "DNA-strengen" er nærmere bestemt ved aminosyrese- I

I kvensen i det deri indkodede polypeptid, og polypeptidet I

I har en endelig længde som nævnt ovenfor, har DNA-stren- I

DK 175566 B1 5 gen også en endelig længde. Hedens DNA-strengen indeholder et gen, der koder for α-ALDCase og er nyttig til bioteknologisk produktion af polypeptidet, kan en sådan bioteknologisk produktion imidlertid ikke ske alene ved 5 hjælp af DNA-strengen med den endelige længde, men den bioteknologiske produktion af polypeptidet gøres mulig under den tilstand, hvor en DNA-streng af passende længde er knyttet "opstrøms" til dens 5'-side og/eller "nedstrøms" til dens 3'-side.

10 "DNA-Strengen" som nævnt i forbindelse med den foreliggende opfindelse omfatter følgelig, foruden DNA-strengen af specifik længde (længden A-B udtrykt ved den tilsvarende aminosyresekvens i figur 1), strenge i form af en lineær DNA-streng eller en cirkulær DNA-streng, 15 som Indeholder DNA-strengen af specifik længde.

Typisk for de eksisterende former for DNA-strengen ifølge opfindelsen er plasmidformen, der indeholder DNA-strengen som en del af den nødvendige bestanddel, og formen, der forekommer i en mikroorganisme, navnlig 20 E. coll og gær, som plasmidformen eller den integrerede form i genomet.

Den fortrinsvis forekommende form af DNA-strengen ifølge opfindelsen omfatter DNA-strengen ifølge opfindelsen som et fremmed gen knyttet til en promotor og en 25 terminator, således at α-ALDCase-genet kan eksprimeres stabilt i en mikroorganisme, hvilket gen forekommer i mikroorganismen som en plasmidform eller en integreret form i genomet. Som promotoren og terminatoren kan der benyttes kendte promotorer og terminatorer i en passende 30 kombination.

i

I DK 175566 B1 I

I I

I Polypeptld indkodet 1 genet I

I Som nævnt ovenfor er DNA-strengen ifølge opfin- I

I delsen nærmere bestemt ved aminosyresekvensen i det

I 5 deraf indkodede polypeptid. Polypeptidet har α-ALDCase- I

I aktivitet og har en aminosyresekvens, der er i det væ- I

I sentlige som fra A til B i den i figur 1 viste aminosy- I

I resekvens. Her angiver udtrykket "aminosyresekvens, der I

I er i det væsentlige som fra A til B i den i figur 1 vi- I

I 10 ste aminosyresekvens", at nogle af aminosyrerne kan ude- I

I lades, ombyttes eller tilføjes osv., sålænge peptidet I

I har α-ALDCase-aktivitet. I

I Et typisk polypeptid med α-ALDCase-aktivitet, I

I ifølge den foreliggende opfindelse, er som fra A til Bi I

I 15 den i figur 1 viste aminosyresekvens, der består af 260 I

I aminosyrer, hvilken aminosyresekvens ikke har været I

I kendt i den hidtidige teknik.

I Nucleotidsekvens i DNA-strenq I

I 20 I

I DNA-Strengen, der koder for α-ALDCase, indbefat- I

I ter en streng med nucleotidsekvensen fra A til B i figur I 1 og strenge med nudeotidsekvenser svarende til de

I ovennævnte ændringer i aminosyresekvensen i α-ALDCase I

I 25 eller degenerative isomere heraf, udtrykket "degenera- I

I tiv isomer" betyder her en DNA-streng, der kun afviger

I med hensyn til det degenerative kodon og kan kode for I

I det samme polypeptid. I forhold til DNA-strengen med nu-

I cleotidseskvensen A til B i figur 1 kaldes f.eks. I

I 30 DNA-kæden med et kodon svarende til en vilkårlig af de I

I aminosyrer, der er ændret fra f.eks. kodonet (AAC) sva- I rende til Asn i den carboxy-terminale ende til f.eks.

7 DK 175566 B1 AAT, der står i degenerativt forhold hertil, en degenerativ Isomer i forbindelse med den foreliggende opfindelse.

Et foretrukket specielt eksempel på DNA-strengen 5 ifølge den foreliggende opfindelse har mindst ét stop-kodon {f.eks. TAA) i kontakt med 3'-enden.

Opstrøms til 5’-siden og/eller nedstrøms til 3'-siden i DNA-strengen ifølge den foreliggende opfindelse kan endvidere en DNA-streng med en vis længde forekomme 10 vedvarende som ikke-translationsområde (den første del nedstrøms til 3'-siden er sædvanligvis et stopkodon, såsom TAA) ...

Nucleotidsekvensen i den i figur 1 viste DNA-streng bestemtes for genet, der koder for α-ALDCasen og 15 er klonet fra Enterobacter aeroqenes IFO 13534 efter Maxam-Gilbert-metoden og dideoxy-metoden.

Opnåelse af DNA-streng 20 Én måde til opnåelse af DNA-strengen med nucleo tidsekvensen, der koder for aminosyresekvensen i det ovennævnte α-ALDCase, er kemisk at syntetisere i det mindste en del af DNA-strengen efter fremgangsmåden til polynucleotidsyntese.

25 I betragtning af den omstændighed, at antallet af aminosyrer i α-ALDCase er mindst 260, ville det fremfor ved den ovennævnte kemiske syntesemetode være at foretrække at opnå DNA-strengen fra det genomiske bibliotek for Enterobacter aeroqenes IFO 13534 efter den metode, 30 der sædvanligvis anvendes inden for området genetisk manipulering, f.eks. hybridiseringsmetoden med anvendelse af en passende sonde.

I forbindelse med den foreliggende opfindelse klonede man DNA-strengen ifølge opfindelsen fra det

I DK 175566 B1 I

I I

I ovennævnte genomiske bibliotek ved anvendelse af "hagl- I

I geværmetoden", da nucleotidsekvensen, der koder for I

I α-ALDCasen i Enterobacter aeroqenes IF013534, og amino- I

I syresekvensen for α-ALDCase ikke var kendte (se neden- I

I 5 stående eksempler med hensyn til detaljer derom). I

I Gærsvamp med nedsat evne til produktion af g-acetolactat I

I DNA-Strengen ifølge den foreliggende opfindelse, I

I 10 klonet som beskrevet ovenfor, indeholder den genetiske I

I information til fremstilling af α-ALDCase, og den kan I

I derfor indføres i den gærsvamp, der almindeligvis anven- I

I des som gærsvamp til fermentering af alkoholiske væsker I

I (Saccharomyces cerevisiae) til transformering af gær- I

I 15. svampen, hvorved der kan opnås en gær svamp til fermente- I

I ring med nedsat α-AL-producerende evne. I

I Gærsvamp I

I 20 Den gærsvamp, der skal transformeres ved den fo- I

I religgende opfindelse, kan være en gærsvamp hørende til I

Saccharomyces cerevisiae som beskrevet i "The Yeasts, I

I a Taxonomic Study", 3. udgave (Yarrow, D., redigeret af I

I N.J.W. Kreger-Van Rij. Elsevier Science Publishers B.V., I

25 Amsterdam (1984), side 379) og dens synonym eller en mu- I

I tant, men for såvidt angår den foreliggende opfindelse I

I foretrækkes en gærsvamp til fermentering af alkoholiske I

I drikke hørende til Saccharomyces cerevisiae, specielt I

I ølgær, vingær, sakegær osv. Af specielle eksempler kan I

^0 der nævnes vingær: ATCC 38637, ATCC 38638, ølgær: ATCC I

I 29292, ATCC 2704, ATCC 32634, sakegær: ATCC 4134, ATCC I

26421 OSV. I

Som yderligere bemærkning om egenskaberne af I

disse gærsvampe til fermentering skal nævnes, at de som I

9 DK 175566 B1 følge af selektion og rendyrkning i mange år med henblik på opnåelse af de til fermentering egnede egenskaber, nemlig effektiv fermentering af det væskeformige udgangsmateriale til fermentering, produktion af alko-5 holiske væsker med god smag og lugt og stabile genetiske egenskaber osv. som tegn herpå, er blevet poly-ploider, der kun yderst vanskeligt undergår genetisk krydssegregation, og som har mistet sporedannelsesevnen praktisk taget fuldstændigt. F.eks. gælder det for den i 10 praksis anvendte ølgær, at medens den har fået forøget sin evne til at assimilere maltose og maltotriose, der er sukkerbestanddele i urten, har den mistet sin vilde karakter, f.eks. er den krystalvioletfølsom osv.

15 Transformation

Det er blevet bekræftet for første gang i forbindelse med den foreliggende opfindelse, at transformation af en gærsvamp med DNA-strengen ifølge den fore-20 liggende opfindelse bevirkede nedsættelse af dens a-AL-producerende evne. Proceduren eller selve fremgangsmåden til fremstilling af transformanten kan imidlertid være en fremgangsmåde, der konventionelt anvendes inden for området molekylær biologi, biomanipulering eller ge-25 netisk manipulering, og den foreliggende opfindelse kan derfor udøves i overensstemmelse med disse konventionelle metoder, med mindre andet er anført nedenfor.

Til eksprimering af genet i DNA-strengen ifølge den foreliggende opfindelse i en gærsvamp, kræves det 30 for det første, at genet skal bæres på den i gærsvampen stabilt forekommende plasmidvektor. Som den plasmidvek-tor, der skal anvendes ved denne operation, kan der benyttes alle de forskellige kendte typer, såsom YRp, YEp,

I DK 175566 B1 I

i 10 I

I YCp, Ylp osv. Disse plasmldvektorer kendes ikke blot i I

I litteraturen, men de kan også konstrueres med lethed. I

I For at genet i DNA-strengen ifølge opfindelsen I

I kan eksprimeres i en gærsvamp, er det på den anden side I

I 5 nødvendigt, at den i genet indeholdte genetiske informa- I

I tion transkriberes og translateres. Til dette formål som I

I enhed til kontrollering af. transkription og translation I

I kan en promotor og en terminator knyttes henholdsvis op- I

I strøms til 5'-siden og nedstrøms til 3'siden i DNA- I

I 10 strengen ifølge den foreliggende opfindelse. Som sådan I

I promotor og terminator kendes der allerede forskellige I

I slags, såsom ADH, GAPDH, PHO, GAL, PGK, ENO, TRP, HIP I

I osv., og enhver af disse kan anvendes også ved den fore- I

I liggende opfindelse. De er ikke blot kendt i litteratu- I

I 15 ren, men de kan også fremstilles ved lethed. I

I Som markør til selektering af transformanten, der I

I skal opnås ved den foreliggende opfindelse, kan der be- I

I nyttes et gen som er resistent over for G418, hygromycin I

I B, en kombination af methotrexat og sulfanylamid, tuni- I

I 20 camycin, ethionin, compactin, kobberioner osv. I

I Med henblik på at DNA-strengen ifølge den fore- I

I liggende opfindelse skal holdes mere stabil i en gær- I

I svamp, kan den også integreres i gær svampens genom. Til I

I foretagelse af en lettere integrering af DNA-strengen I

I 25 ifølge den foreliggende opfindelse båret på plasmidvek- I

I toren ind i genomet, er det ønskeligt at indføje et DNA I

I med høj homologi med genom-DNA'et i plasmidvektoren, I

I og som eksempler på DNA til dette formål kan der nævnes I

I rHNA-gen, HO-gen osv. I

I 30 Blandt dem er det kendt, at rRNA-gen gentages I

I efter hinanden ca. 140 gange i haploid gærgenom (Journal I

I of Molecular Biology 40, 261-277 (1969)). Som følge af I

I dette specielle træk er der, når denne sekvens anvendes I

11 DK 175566 B1 som målsekvensen til rekombination, følgende fordele sammenlignet med det tilfælde, hvor der anvendes en anden gensekvens. 1. Det forventes, at transformationshyppigheden kan forøges. 2. Ændringen i det tilsvarende 5 træk i målsekvensen ved rekombinering kan betragtes som ubetydelig. 3. Ved anvendelse af plasmidet med den i eksemplerne anførte struktur (pIARLl i fig. 3) bliver det muligt at integrere et flertal af fremmede gener i geno-met ved gentagelse af en række operationer til integre-10 ring af plasmid og udskæring af vektorsekvensen.

Desuden kan DNA-strengen, der kan anvendes til transformation af en gærsvamp ved den foreliggende opfindelse, også kode for et polypeptid, der er forskelligt fra det i fig. 1 viste polypeptid fra A til B, så-15 leenge det har α-ALDCase-aktivitet som tidligere nævnt.

Som eksempler på et sådant polypeptid kan der nævnes det i fig. 1 fra A til B viste polypeptid, hvori eller hvortil der er blevet indføjet eller tilføjet en eller flere aminosyrer, eller hvorfra eller hvori en eller flere 20 aminosyrer er blevet fjernet eller erstattet med andre aminosyrer, og desuden α-ALDCase produceret af Bacillus lichenlformis, Lactobacillus easel, Bacillus brevis, Enterobacter cloacae, Acetobacter bakterier (A^ rancens, A. aceti osv.) osv. Sådanne DNA-strenge vil være let 25 tilgængelige ved anvendelse af for nærværende kendte genetiske manipuleringsmetoder.

Transformation af en gærsvamp med det således fremstillede plasmid kan foretages ved en til formålet egnet vilkårlig metode som konventionelt anvendt inden 30 fQr området genetisk manipulering eller biomanipulering, f.eks. spheroplastmetoden [Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America (Proc.

Natl. Sci. USA), 75, 1929 (1978)], lithiumacetatmetoden

I DK 175566 B1 I

I 12 I

I [journal of Bacteriology (j. Bacteriol.)/ 153, 163 I

I (1983)] osv. I

I Den således opnåede gærsvamp ifølge den forelig- I

I gende opfindelse er den samme som.gærsvampen før trans- I

I 5 formation med hensyn til dens genotype eller phenotype I

I bortset fra det nye træk Ifølge den genetiske informa- I

I tion indført med DNA-strengen ifølge den foreliggende I

I opfindelse (dvs. det træk, at den er udstyret med α- I

I ALDCase-producerende evne, således at den nedbryder α-AL I

I 10 inde i cellen, hvorved den nedsætter den mængde a-AL, I

I der siver ud af cellen), de træk, der hidrører fra den I

I anvendte vektor, og de tilsvarende fejlbehæftede træk, I

I der skyldes de fejl hos en del af den genetiske Jjiforma- I

I tion under rekombinering af genet, som kan have forekom- I

I 15 met. Endvidere har ølgæren opnået ved integrering af I

I DNA-strengen ifølge den foreliggende opfindelse i gærge- I

I nomet ved anvendelse af Ylp-type-plasmid, efterfulgt af I

I udskæring af unødvendig vektorsekvens (se nedenstående I

I eksempel (6) med hensyn til detaljer), ingen træk afledt I

I 20 fra den anvendte vektor. Gærsvampen ifølge den forelig- I

I gende opfindelse er således i det væsentlige den samme I

I som den til fermentering konventionelt anvendte gærs- I

I vamp. Gærsvampen ifølge den foreliggende opfindelse kan I

I følgelig anvendes under i det væsentlige de samme fer- I

I 25 menteringsbetingelser som den kendte, til fermentering I

I anvendte gærsvamp, og desuden har den nedsat α-AL-pro- I

I ducerende evne i den fermenterede væske, hvorfor I

I a-AL-indholdet i den fermenterede væske er lavt, hvilket I

I bevirker, at den til dets behandling nødvendige la- I

I 30 gringstid for den fermenterede væske kan afkortes i be- I

I mærkelsesværdig grad. I

13 DK 175566 B1 FORSØGSEKSEMPLER (1) Kloning af a-ALDCase-qen 5(1) Rensning af chromosomalt DNA fra a-ALDCase-produce-rende stamme

Ved dyrkning under luftning af Enterobacter aero-qenes IFO 13534 (fremskaffet fra Institute for Fermenta-10 tion, Osaka, Japan) i L-medium indeholdende 0,5% glucose ved 37°C i 10 timer opnåedes der 0,5 g våd masse af mikroorganismeceller .

Denne våde masse resuspenderedes i 5 ml salt-EDTA-puffer [O,15 M NaCl, 0,1 M EDTA (pH 8,0)]. Derefter 15 behandledes den med 400 pg/ml af lysozym (fremstillet af Seikagaku Kogyo), 20 pg/ml af ribonuclease A (fremstillet af Sigma Co.) ved 37°C i 20 minutter. Derefter behandledes den med 0,5% natriumdodecylsulfat (SDS) og 500 yg/ml af proteinase K (fremstillet af Sigma Co.) ved 20 65°C i 4 timer. Blandingen hældtes i en forud fremstillet saccharose-densitetsgradient-opløsning (50 mM tris-HC1 (pH 7,4), 0,1 M NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% SDS, 5-20% saccharose) og underkastedes centrifugering i en Hitachi Ultra-centrifugal Rotor RPS 27 ved 25.000 o/min ved 25 20°C i 3 timer. Efter fraktionering i fraktioner på hver 2,5 ml undersøgtes fraktionerne med hensyn til molekylvægt ved 0,4% agarosegel-elektroforese, og man opsamlede de fraktioner, der indeholdt DNA med høj molekylvægt.

Dette udfældedes med ethanol, og bundfaldet opløstes i 1 30 ml TE-puffer (10 mM tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA) og dialyseredes mod 1 liter TE-puffer. Der opnåedes 300 Mg chromosomalt DNA.

I DK 175566 B1 I

I 14 I

I (11) Fremstilling af cosmid-bibliotek I

I 120 yg af det under (1) opnåede chromosomale DNA I

I 5 underkastedes partiel digestion med et restriktionsen- I

I zym Sau3AI til ca. 40 kbp. Blandingen hældtes i en for-

I ud fremstillet saccharose-densitetsgradient-opløsning I

I (20 mM tris-HCl ((pH β,Ο), 1 M NaCl, 5 mM EDTA, 10-40% I

I saccharose) og underkastedes centrifugering i en Hita- I

I 10 chi Ultra-centrifugal Rotor RPS 27 ved 26.000 o/min ved I

I 20°C i 22 timer. Efter fraktionering i fraktioner på I

I hver 0,5 ml undersøgtes fraktionerne med hensyn til mo- I

I lekylvægt ved 0,4%-agarosegel-elektroforese, og man op-

I samlede de fraktioner, der indeholdt DNA-fragmenter på I

I 15 ca. 40 kbp. Efter ethanol-fældning af fraktionerne op- I

I løstes bundfaldet i 500 yl TE-puffer og dialyseredes mod

I 1 liter Te-puffer. I

I 0,2 pg af de opnåede DNA-fragmenter på ca. 40 kbp I

I ligeredes med 0,3 yg af et cosmid pJB8 Arm (fremstillet I

I 20 af Amersham International) ved hjælp af T4-ligase. Dette I

I DNA blev in vitro pakket ved anvendelse af λ DNA in vi- I

I tro pakningssæt (fremstillet af Amersham International) I

I og anvendtes til transfektion af E. coll DHl (F”, I

I gyrA96, recAl, relAl?, endAl, thi-1, hsdR17, supE44, I

I 25 λ") [journal of Molecular Biology (J. Mol. Biol.), 166, I

I 557-580 (1983): ATCC 33849] til opnåelse af et cosmid- I

I bibliotek af E^_ aeroqenes genom. I

I (iii) Screening af α-ALDCase-gen-holdig transduktant I

I 30 . I

I Ved at udvælge transduktanter, der udviser α- I

I ALDCase-aktivitet, fra det under (ii) opnåede cosmid- I

I bibliotek, opnåedes der α-ALDCase-gen-holdige transduk- I

I tanter. I

15 DK 175566 B1 Nærmere angivet blev 300 transduktanter fra cos-mid-biblioteket podet én efter én på L-agarmedium indeholdende 50 pg/ml af ampicillin og 0,5% glucose, hvorefter man dyrkede dem ved 379C i 8 timer, og hver kultur 5 afprøvedes for a-ALDCase-aktivitet. Dette foregik ved, at hver transduktant suspenderedes i 1 ml 30 mM kalium-phosphatpuffer (pH 6,2) og hvirvledes kraftigt rundt under tilsætning af 10 μΐ toluen i 30 sekunder. Por cellesuspensionen bestemtes α-ALDCase-aktiviteteten efter den 10 metode, der er angivet af Godf redsen et al. [Carlsberg. Research Communication (Carlsberg. Res. Commun., 47, 93 (1982)]. Som resultat opnåedes der 2 transduktanter med α-ALDCase-aktivltet. Plasmiderne fra de opnåede kloner betegnedes som henholdsvis pCA3 og pCA13.

15 (iv) Bestemmelse af a-ALDCase-gen-DNA-nucleotidsekvens

Ved udførelse af subkloning ud fra pCA13 viste det sig, at DNA-fragmentet på 1,4 kbp, udskåret med re-20 striktionsenzymerne BamHI og EcoRV, kodede for a-ALDCase. Til EcoRV-stedet ligeredes Hindlll-linker (dCAAGCTTG: fremtillet af Takara Shuzo Co., Japan), og det ligerede produkt indføjedes mellem spaltningsstederne for BamHI og Hindlll i et plasmid pUC9 (fremtillet af 25 Pharmacia Co.) til konstruktion af et plasmid, der betegnedes som pUAR5.

Por BamHI-EcoRV-fragmentet bestemtes DNA-nucleo-tidsekvensen efter dideoxy-metoden [ Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 74, 5463 (1977)] og Maxam-Gilbert-metoden 30 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560 (1977)] (fig. 1).

Som resultat af en analyse af denne nucleotidsekvens viste der sig at foreligge en åben læseramme på 780 bp.

Her kan det anslås, at et protein med 260 aminosyrer og

I DK 175566 B1 I

I 16 I

I en molekylvægt på 29.000 er Indkodet, og molekylvægten I

I viste sig at være 1 det væsentlige sammenfaldende med I

I den ovennævnte molekylvægt for α-ALDCase. I

I 5 (2) Indføring af a-ALDCase-gen i gær I

I (1) Konstruktion af ADHl-promotor I

I Ud fra Saccharomyces cerevislae S288C £ {a^ suc2, I

I 10 mal, gal2, CUP1): Biochemical and Biophysical Research I

I Communications (Biochem. Biophys. Res. Commun.), 50, I

I 186-191 (1973): ATCC26108], fremstilledes chromosomalt I

I DNA efter en konventionel metode. Efter den samme metode I

som beskrevet i eksempel (1)(ii) opnåedes der et DNA- I

I 15 fragment på ca. 10 kpb ved partiel digestion med re- I

I striktionsenzymet Sau3AI. Dette fragment ligeredes med I

I pBR322, spaltet med restriktionsenzymet BamHl, ved hjælp I

I af T4-ligase til konstruktion af et genomisk bibliotek. I

I Den syntetiske oligomer svarende til nucleotidsekvensen I

I 20 fra det 7. til det 36. nucleotid i koderegionen i ADH1- I

I genet [journal of Biological Chemistry (J. B. C.) 257, I

I 3018 (1982)] ende-mærkedes med 32P, og ved anvendelse af I

denne som sonde klonedes ADH1-genet ud fra det genomiske I

I bibliotek. Endvidere spaltedes dette med restriktions- I

25 enzymerne Sphl og Sau3AI til opnåelse af et DNA-fragment I

I på 542 bp indeholdende promotoren og en del af kodere- I

I gionen fra ADHl-genet. Ved behandling af Sau3AI-enden I

I af dette fragment med en endonuclease Bal31 gik kodere- I

I gionen fuldstændig tabt, og derefter ligeredes Hindlll- I

I 30 linker (dCAAGCTTG: fremstillet af Takara Shuzo So., Ja- I

I pan) dermed. Dette DNA-fragment anvendtes som ADHl-pro- I

I motor. I

17 DK 175566 B1 (li) Konstruktion af ekspressionsvektor og indføring i gær.

Ved som grundlag at anvende plasmidet YEpl3 (Ge-5 ne, 8, 121 (1979): ATCC37115] konstrueredes der en ekspressionsvektor efter følgende procedure.

Først fjernedes Sall-Sacl-fragmentet og xhol-Smal-fragmentet, der forekommer i begge ender af LEU2-genet i YEpl3. Herved bragtes plasmidet til ikke at have 10 noget spaltningssted for restriktionsenzymerne Xhol,

Sacl, Smal og Bglll, men kun at have ét spaltningssted for restriktionsenzymet Sall. Dernæst indføjedes der mellem Hindlll-stedet hidrørende fra pBR322 og Hindm-stedet hidrørende fra 2 pm DNA i plasmidet det synte-15 tiske oligonucleotid 41 mer. Det syntetiske oligonucleo-tid har nedenstående nucleotidsekvens indeholdende spaltningsstedet for restriktionsenzymerne SacI, Smal,

Bglll og Xhol. Ved den foreliggende opfindelse betegnes dette plasmid som YEpi3K.

20

AGCTTATGATTACGAGCTCCCGGGCAGATCTCGGCCTCGAG

ATACTAATGCTCGAGGGCCCGTCTAGAGCCGGAGCTCTCGA

i

Dernæst ombyttedes SphI-Hindlll-fragmentet i YEpl3K med den under (i) fremstillede ADHl-promotor til 25 konstruktion af en ekspressionsplasmidvektor pAK503.

Plasmidet pUAR5 med det under (1)(iv) opnåede α-ALDCase-gen-fragment spaltedes med restriktionsenzymet Hindi, og efter tilføjelse af Hindlll-linker (dCAAGCTTG: fremstillet af Takara Shuzo Co., Japan) 30 spaltedes det med restriktionsenzymerne Hindlll og BamHI. Hindlll-Bglll-fragmentet i pAK503 erstattedes med det opnåede α-ALDCase-gen-fragment på 940 bp til konstruktion af et plasmid pAL503.

I DK 175566 B1 I

I 18 I

I videre spaltedes pUC-4K (fremstillet af Pharmacia I

I Co.) indeholdende G4i8-resistens-genet med restriktions- I

I enzymet Sall, og det opnåede fragment Indeholdende G418- I

I reslstens-genet Indføjedes på Sall-stedet 1 pAL503 til I

I 5 konstruktion af det ønskede plasmid pALG5034 (fig. 2). I

I Når pALG5034 indførtes i gær [TD4 (a, his, ura, I

I leu, trp; en mutant-stamme af Saccharomyces cerevislae I

I S288C) og ølgær IFO 0751 stammen] efter lithiumacetat- I

I metoden [journal of Bacteriology (J. Bacteriol.) 153, I

I 10 163 (1983)], udviste gæren α-ALDCase-aktiviteter på hen- I

I holdsvis 1,9-3,3 E/mg protein og 1,8-3,5 E/mg protein. I

I Den med pALG5034 transformerede IFO 0751 betegnes I

I SKB101, og TD4 transformeret med pALG5034 betegnes I

I SKBI02. I

I 15 α-ALDCase-genet har tre ATG'er, der er transla- I

I tionsstartkodonet, efter hinanden ved dets 5'-ende i I

I kodningsregionen. Efter fjernelse af den ene eller to af I

I de tre ATG'er fra 5'-siden ved behandling med endonu- I

I clease Bal31 fra HincII-stedet i 5'-siden af α-ALDCase- I

I 20 gen-fragmentet, eksprimeredes den genetiske information I

I i de opnåede fragmenter inde i gærsvampen TD4 for at se I

I virkningen på aktiviteten. Som resultat erkendtes der I

I ikke nogen stor forskel i enzymaktivitet af det opnåede I

I ALDCase. I

I 25 I

I (3) Fermenteringsprøve (bekræftelse af nedsættelsen 1 I

I mængden af produceret diacetyl) I

I Der udførtes fermenteringsprøver for de to slags I

I 30 gærsvampe TD4 og IFO 0751, i hvilke α-ALDCase-genet var I

I blevet indført som beskrevet under (2)(ii), og nedsæt- I

I teisen af mængderne af det totale diacetyl (i det føl- I

I gende betegnet TDA: TDA består af vicinale diketoner og I

19 DK 175566 B1 acetohydroxysyrer, hovedsagelig DA og dets precursor α-AL) i den fermenterede urt som følge af disse transformerede gærsvampe bekræftedes ved følgende metode.

5 (i) Opnåelse af ct-ALDCase-producerende gærceller

De to slags gærsvampe transformeret med pALG5034 som beskrevet ovenfor (SXB101 og SKB102) og de respektive værts-gærsvampe (IFO 0751 og TD4) dyrkedes i YPD-10 medium. For de stammer, hvori der var indført pALG5034, sattes der G418 til mediet i en koncentration på 600 pg/ml.

De respektive celler dyrket i rystekultur ved 30°C i 16 timer opsamledes ved centrifugering ved 3000 15 x g i 10 minutter, vaskedes med destilleret vand og stilledes derefter til rådighed til fermenteringsprøven.

(ii) Fermenteringsprøve 20 Til en urt fremstillet til 11 eP sattes den under (i) opnåede gær til et gærtilsætningsforhold på 0,5% (våd vægt/vol), og efter tilstrækkelig luftning udførtes der stationær fermentering ved 8°C i 7 dage. Efter fuldendelse af fermenteringen fjernedes cellerne ved centri-25 fugering ved 3000 x g i 10 minutter og filtrering, og filtratet underkastedes måling af mængden af TDA (mængden af total diacetyl).

Resultater var som anført i nedenstående tabel.

Ved fermentering ved anvendelse af gærsvampen ifølge 30 <3en foreliggende opfindelse kan det ses, at TDA-mængden i den fermenterede urt er nedsat i høj grad sammenlignet med kontrolstammer.

I DK 175566 B1 I

I 20 I

I Mængden af total diacetyl (TDA) i den fermenterede urt I

I 5 -:-- , I

I Stamme TDA I

I (mg/liter)

I TD4 <D 0,26 I

I © 0,30 I

I Middelværdi 0,28 I

I 10 TD4 + pALG5034 Φ 0,03 I

I (SKB102) © 0,05

I Middelværdi __ I

I 1F0 0751 Φ 0,28 I

I © 0,28 I © 0,32

I 15 Middelværdi 0,29 I

I IFO 0751 + pALG5034 φ <0,04 I

I (SKB101) © 0,07 I Θ 0,07

I Middelværdi <0,06 I

I 20 I

I (4) Konstruktion af plasmid af inteqrationstypen I

I 25 (i) struktur og egenskaber af plasmid pIARLl I

I For at få α-ALDCase-genet holdt stabilt inde i I

I gæren konstrueredes der et plasmid pIARLl, der ikke har I

I nogen uafhængig replikationsevne, og som kun kan fast- I

I 30 holdes af gæren gennem integration i genomet. Plasmidet I

I har G418-resistens-genet og β-galactosidase-genet som

I markører inde i gæren og har desuden rRNA-gen-sekvensen I

21 DK 175566 B1 som den sekvens, der er nødvendig for at plasmidet kan Integreres i genom-DNA'et ved homolog rekombination. α-ALDCase-genet er inføjet mellem ADH1-promotoren i 5'-enden og HIPl-terminatoren i 3'-enden, og det kombi-5 nerede fragment er indføjet i rRNAgen-sekvensen. For at blive integreret effektivt i rRNAgenet i chromosomet spaltes plasmidet på forhånd ved KpnI-stedet inden for rRNA-gen-sekvensen, før det anvendes til transformation.

Som resultat heraf foreligger, i den opnåede transfor-10 mant, den fra plasmidet hidrørende rRNA-gen-sekvens ved siden af den, der oprindeligt foreligger i chromsomet.

Når trans formanten dyrkes i et fuldstændigt medium sker der følgelig spontan rekombination mellem de to rRNA-gen-sekvenser, hvorved der vil fremkomme G418-sensitive 15 Lac“-celler. En del af disse vil udvise α-ALDCase-aktivitet, og kun ADHl-promotoren, α-ALDCase-genet og HIPl-terminatoren er tilbage i chromsomet i disse celler, idet andre vektordele er skåret ud.

20 (ii) Konstruktion af pIARLl pIARLl konstrueredes ud fra et gær-integrerende plasmid YIp5 (Prot. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1035-1039 (1979)).

25 Først indføjedes G418-resistens-gen-fragmentet, fremstillet efter spaltning af pUC4K (fremstillet af Pharmacia) med Sall, på Sall-stedet i Ylp5 til konstruktion af et plasmid pIG7.

Derefter indføjedes, som HIPI-gen-promotor + 30 lacZ-gen-fragment, Bglll-BamHi-fragmentet omfattende BamHI-fragmentet, der indeholder lacZ-genet fra plasmidet pMCl87l (fremstillet af Pharmacia) knyttet til Bglll-fragmentet, som indeholder ca. 0,6 kb af 5'-ikke

I DK 175566 B1 I

I 22 I

I translationsregionen og ca. 0,4 kb af translationsregionen I

I fra gærsvamp-HlPl-genet (Gene, 38, 205-214 (1985)), på

I Bamlll-stedet i pIG7 til konstruktion af plasmid plLG2. I

I rRNA-Genet klonedes ud fra det til kloning af I

I 5 ADH1-genet anvendte bibliotek ved anvendelsen af en

I 51-ende-mærket oligomer svarende til nucleotidsekvensen I

I fra det 4. til 32. nucleotid fra 5'-enden af 5,8SrRNA- I

I genet (J.B.C. 252, 8118-8125 (1977)). EcoRI-Fragmentet I

I på ca. 3 kb indeholdende en del af hver af 5,8SrRNA-ge- I

I 10 net og 25SrRNA-genet indførtes på EcoRI-stedet afledt I

I fra pBR322 i pILG2 til konstruktion af et plasmid plRL9. I

I ADHl-Promotor + α-ALDCase-gen + HIPI-terminator-

I fragment opnåedes efter den nedenfor anførte metode. I

I Efter spaltning af plasmidet pUAR5 indeholdende I

I 15 α-ALDCase-genet med Hindi behandledes fragmentet med I

I Bal31 og ligeredes til Hindm-linker, og derefter spal- I

I tedes med Hindlll og BamHI. Det opnåede α-ALDCase-gen- I

I fragment indføjedes mellem BamHI- og Hindlll-stederne i I

I pUCl2 (fremstillet af Pharmacia Co.), og nucleotidse- I

I 20 kvensen bestemtes til opnåelse af et plasmid pALDC3 med I

I ca. 40 bp på opstrømssiden af 5'-enden og med det i be- I

I gyndelsen forekommende ATG i α-ALDCase-genet udeladt. I

I pALDC3 underkastedes digestion af BamHI og blev forsynet I

I med en stump ende med Klenow-fragment, og derefter om- I

I 25 byttedes Hindm-Smal-fragmentet i pAK503 med det ved I

I Hindlll-digestion opnåede α-ALDC-gen-fragment til kon- I

I struktion af et plasmid pAL503-3. Videre underkastedes I

I SphI-stedet i pAL503-3 digestion med Sphl og omdannedes I

I derefter til BamHl-stedet ved behandling med SI nuclease I

I 30 og tilføjelse af BamHI-linker, og derefter opnåedes · I

I ADHI-promotor + α-ALDCase-gen-fragment som BamHI-Balll- I

I fragment. I

I Endvidere konstrueredes plasmidet, hvor BamHI- I

I Sall-fragmentet i pBR322 var erstattet med BamHi-Sall- I

DK 175566 B1 23 fragmentet med ca. 0,9 kbp af 3'-ende-ikke-translations-regionen og ca. 0,1 kb af 3'-translationsregionen fra HIPI-genet, og ovennævnte ADHI-promotor + a-ALDCase-gen-fragment Indføjedes på BamHl-stedet i dette plasmid 5 til konstruktion af et plasmid pALTie, hvori ADHI-promotor + α-ALDCase-gen + HIPl-terminator er sammenknyttede i den nævnte rækkefølge.

ADHl-Promotor + α-ALDCase-gen + HlPl-terminator-fragmentet, opnået som BamHI-fragmentet efter digestion 10 af pALTie med Sall og efterfølgende behandling med Kle-now-fragment, tilføjelse af BamHI-linker og BamHI-digestion, indføjedes på Bglll-stedet i pIRL9 til konstruktion af det ønskede plasmid pIARLl.

15 (5) indføring af pIARLl i gær og ekspression af a-ALDCase-qen

Ved anvendelse af pIARLl, konstrueret som beskrevet ovenfor, transformeredes gær som følger. Ølgær 20 IF00751 dyrkedes i YPD-medium ved 30°C til OD600 = 1,0, og cellerne opsamledes og transformeredes med pIARLl efter lithiumacetatmetoden. Por at fremme rekombination i rRNA-gen-sekvensen blev pIARLl underkastet fuldsætændig digestion på KpnI-stedet i rRNA-gen-sekvensen for at 25 blive gjort lineær før transformation. Efter transformation suspenderedes 10® af gærcellerne i 1 ml YPD-medium og rystedes ved 30*C i 18 timer, og kulturen spredtes derefter på YPD-agarmedium indeholdende et antibiotikum G418 (500 pg/m). Derefter inkuberedes pladen ved 30eC i 30 3 til 5 dage til opnåelse af kolonier. Foruden de transformerede celler indeholdt disse kolonier celler, der havde erhvervet G418-resistens uafhængigt på pIARLl, og de overførtes derfor med en tandstikker til agarmedium i

I DK 175566 B1 I

I 24 I

I indeholdende X-gal (S'bronw-chlor- 3' -indoyl-β-θ- I

I galactosid) Ifølge Ruby et al. (Method in Enzymology, I

I vol. 101, side 253 (1983)) og inkuberedes ved 30°C i 2 I

I til 5 dage. De celler, som dannede blåfarvede kolonier I

I på denne plade ved β-galactosidase-aktivitet (Lac+ I

I 5 stamme) blev anset for at være transformanter. Sådanne I

I celler udviste alle a-ALDCaseaktivitet på 0,8-1,8 E/mg I

I protein. Den transformant, der udviste den højeste I

I α-ALDCase-aktivitet (SKBIO3 stammen) dyrkedes ikke- I

I selektivt i YPD-medium i 80 generationer. α-ALDCase- I

I 10 aktiviteten efter dyrkning viste sig at være 0,9 E/mg I

I protein, hvilket viste, at genet, der udviste I

I α-ALDC ase-aktivitet, fastholdtes stabilt i chromosomet. I

I (6) Udskæring af uønskede sekvenser og ekspression af I

I 15 α-ALDCase-genet I

I Efter ikke-selektiv dyrkning af den under (5) I

I opnåedes transformant (SKB103) i YPD-medium i 20 I

I til 30 generationer fortyndedes kulturen i tilstrække- I

I 20 lig grad og spredtes på agarmedium indeholdende X-gal I

I ifølge Ruby et al. som beskrevet ovenfor. Pladen dyrke- I

I des ved 30°C i 5 til 7 dage, og stammerne uden dannelse I

I af blåfarvede kolonier (Lac“ stammer) udvalgtes. Af dis- I

I se stammer udvalgtes de, der udviste G418 sensitivitet I

I 25 på YPD-agarmedium indeholdende 500 pg/ml G418. Endvidere I

I opnåedes der stammer, som udviste α-ALDCase-aktivitet. I I

I disse starraner, som vist under (4)(i), kan det antages, I

I at der indtrådte rekombination mellem de dobbelte rRNA- I

I gensekvenser, hvorved kun ADHl-promotoren, α-ALDCase- I

I 30 genet og HlPl-terminatoren bliver tilbage i chromosomet, I

I idet andre vektordele er udskåret. I

I Af disse stammer dyrkedes den stamme, der udviste I

I en α-ALDCase-aktivitet på 0,2 E/mg protein (SKB104), i I

DK 175566 B1 25 YPD-medium i 40 generationer, og der bevaredes en aktivitet på 80% eller mere.

(7) Fermenterinqsprøve 5

Der udførtes fermenteringsprøver for den under (5) opnåede SKB103 og den under (6) opnåede SKB104, og nedsættelsen i TDA i fermenteret urt bekræftedes efter følgende metode. To slags gærsvampe underkastedes ikke-10 selektivt stationær dyrkning i YPD-medium ved 20°C i 3 dage og derefter ved 10°C i 10 dage, og de respektive celler opsamledes ved centrifugering ved 3000 x g i 10 > minutter, vaskedes med destilleret vand og stilledes derefter til rådighed til fermenteringsprøve.

15 Til en urt indstillet på 11 °P sattes gæren til et gært ilsætnings forhold på 0,6% (våd vægt/vol), og efter tilstrækkelig luftning udførtes der stationær fermentering ved 10°C i 8 til 10 dage. Efter fuldendelse af fermenteringen fjernedes cellerne ved centrifugering ved 20 3000 x g i 10 minutter og filtrering, og filtratet underkastedes måling af mængden af TDA og tilsyneladende ekstrakt. Resultaterne var som anført i de nedenstående tabeller. Selv om både dyrkningen og fermenteringen udførtes under ikke-selektive betingelser, observeredes 25 der et tydeligt fald i mængden af TDA i fermenteret urt sammenlignet med kontrolstammen, hvilket således viste, at prøvestammerne udviste α-ALDCase-aktivitet på stabil måde.

I DK 175566 B1 I

I 26 I

I Resultater af fermenteringsprøve med SKB103 stammen I

I ——— Tilsyne- I

_ TDA ladende · I

I Stamme (mg/Iiter) ekstrakt I

I 1F0 0751 Φ 0,68 2,4 I

<2> 0,69 2,2 I

Middelværdi 0,69 2,3 I

I 10 SKB 103 Φ 0,14 2,7 I

@ 0,14 2,9 I

I Middelværdi β,14_ ^8_ I

I 15 Resultater af fermenteringsprøve med SKB104 stammen I Tilsyne- I TDA ladende

Stamme (mg/liter) ekstrakt I ____·____(°P) I IFO 0751 Φ 1,02 2,3 20 @ 0,94 2,2 I Middelværdi 0.98 2,3 SKB 104 Φ 0.44 2,2 | © 0,51 2,0 I Middelværdi 0,48 2,1 I 25 I Deponering af mikroorganismer

De nedenfor anførte mikroorganismer, som den fo- I 30 religgende opfindelse vedrører, er blevet deponeret ved

Institute of Fermentation Research, Agency of Industrial I Science and Technology, Ministry of International Trade I and Industry, under følgende deponeringsnumre under Bu- DK 175566 B1 27 dapesttraktaten om international anerkendelse af deponering af mikroorganismer i forbindelse med behandling af patentsager.

(1) SKB101 (indeholdende pALG5034)...FERM-BP nr. 1228 5 (2) SKBI02 (indeholdende pALG5034)...FERM-BP nr. 1229 (1) og (2) blev begge deponeret den 11. december 1985.

(3) SKBI04 ...FERM-BP nr. 1227 (3) blev deponeret den 2. december 1986.

Claims (13)

1. DNA-Streng med evne til bioteknologisk produk- I I tion af a-acetolactat-decarboxylase, kendeteg- I I net ved, at den har en nucleotidsekvens, der koder I I for et polypeptid med a-acetolactat-decarboxylase-akti- I I 5 vitet, hvilket polypeptids aminosyresekvens er i det I I væsentlige som fra A til B i den i tegningens fig. i Vi- I I ste aminosyresekvens. I

2. DNA-Streng ifølge krav 1, kendeteg- I I net ved, at den nucleotidsekvens, der koder for poly- I I 10 peptidet, er en fra A til B i den i tegningens fig. 1 I I viste nucleotidsekvens eller dens degenerative isomer. I I

3. Gærsvamp hørende til Saccharomyces cerevlslae, I I kendetegnet ved, at dens α-acetolactat-pro- I I ducerende evne er blevet nedsat ved transformation med I I 15 en DNA-streng, der har en nucleotidsekvens, som koder I I for et polypeptid med a-acetolactat-decarboxylase-akti- I I vitet, hvilket polypeptids aminosyresekvens er i det væ- I I sentlige som fra A til B i den i tegningens fig. 1 viste . I I aminosyresekvens. I I 20

4, Gærsvamp ifølge krav 3,kendetegnet I I ved, at transformationen udføres med et plasmid, der in- I I deholder en DNA-streng med en nucleotidsekvens, som ko- I I der for polypeptidet med den i tegningens fig. 1 fra I I A til B viste aminosyresekvens, og i en tilstand, der I I 25 muliggør ekspression af dens genetiske information. I I

5. Gærsvamp ifølge krav 3, kendetegnet I I ved, at DNA-strengen har nucleotidsekvensen fra A til B I I i den i tegningens fig. 1 viste nucleotidsekvens. I

6. Fremgangsmåde til fremstilling af en gærsvamp I I me(j nedsat α-acetolactat-producerende evne, kende- I I tegnet ved, at man transformerer en vært-gærsvamp I DK 175566 B1 29 med en DNA-streng, der har en nueleotidsekvens, som koder for et polypeptid med a-acetolactat-decarboxylase-aktivitet, hvilket polypeptids aminosyresekvens er i det væsentlige som fra A til B i den i tegningens fig. 1 vi-5 ste aminosyresekvens.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6 til fremstilling af en gærsvamp med nedsat α-acetolactat-producerende evne, kendetegnet ved, at nucleotidsekvensen, der koder for polypeptidet, er en fra A til B i den i 10 tegningens fig. 1 viste nucleotidsekvens eller dens degenerative isomer.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6 til fremstilling af en gærsvamp med nedsat α-acetolactat-producerende evne, kendetegnet ved, at transformationen ud- 15 føres med et plasmid, der indeholder en DNA-streng med en nucleotidsekvens, som koder for polypeptidet med den i tegningens fig. 1 fra A til B viste aminosyresekvens, og i en tilstand, der muliggør ekspression af dens genetiske information.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 6 til fremstilling af en gærsvamp med nedsat α-acetolactat-producerende evne, kendetegnet ved, at DNA-strengen har en nucleotidsekvens, som fra A til B i den i tegningens fig. 1 viste nucleotidsekvens.

10. Fremgangsmåde til fremstilling af en alko holisk væske, ved hvilken man lader en gærsvamp indvirke på dens substrat til produktion af ethanol derfra, kendetegnet ved, at man som gærsvampen anvender en gærsvamp, der hører til Saccharomyces cerevisiae, 30 0g hvis α-acetolactat-producerende evne er blevet nedsat ved transformation med en DNA-streng, der har en nucleotidsekvens, som koder for et polypeptid med a-acetolactat-decarboxylase-aktivitet, hvilket polypep- I DK 175566 B1 I i 30 I I tids aminosyresekvens er i det væsentlige som fra A til I I Bi den i tegningens fig. 1 viste aminosyresekvens. I

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10 til fremstilling I I af en alkoholisk væske, kendetegnet ved, at I I 5 transformationen udføres med et plasmid, der indeholder I I en DNA-streng med en nucleotidsekvens, som koder for po- I I lypeptidet med den i tegningens fig. l fra A til B viste · - I I aminosyresekvens, og i en tilstand, der muliggør eks- I I pression af dens genetiske information. I I 10

12. Fremgangsmåde ifølge krav 10 til fremstilling I I af en alkoholisk væske, kendetegnet ved, at I I DNA-strengen har en nucleotidsekvens som fra A til Bi I I den i tegningens fig. 1 viste nucleotidsekvens. I

13. Fremgangsmåde ifølge krav 10 til fremstilling I I ^ af en alkoholisk væske, kendetegnet ved, at I I den alkoholiske væske er øl. I