JPS62228282A - α−アセト乳酸脱炭酸酵素をコ−ドするＤＮＡ鎖およびこのＤＮＡ鎖により形質転換された酵母 - Google Patents

α−アセト乳酸脱炭酸酵素をコ−ドするＤＮＡ鎖およびこのＤＮＡ鎖により形質転換された酵母

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JPS62228282A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 技術分野 本発明は、エンテロバクタ−・エアロゲネスＩＦＯ１３
５３４が産生するようなα−アセト乳酸脱炭酸酵素α−
ＡＬＤＣａｓｅ　（以下α−ＡＬＤＣａｓｅという）の
生物工学的産生能を有するＤＮＡ鎖、およびこのＤＮＡ
鎖より形質転換されてそのα−アセト乳酸（α−ＡＬ）
産生能が抑制されているサツカロマイセスやセレビシェ
に属する酵母、に関するものである。
先行技術 ビール、清酒、ワイン等の酒類は、一般に、麦汁、果汁
等の醸造原料液にサッカロマイセス・セレビシエに属す
る酵母を加え、これをアルコール発酵させることにより
製造される。この発酵過程において、酵母は自己の増殖
に必要なある種のアミノ酸の生合成の中間物質としてα
−ＡＬを産生じ、これを不可避的に細胞外、すなわち発
酵液中、に漏出する。このようにして発酵液中に存在す
るに到ったα−ＡＬは、発酵液中において非生物学的な
反応により、自動的にダイアセチル（ＤＡ）へと変化す
る。
ＤＡは一般に「スエ臭」またはｒＤＡ臭」と呼ばれる強
烈な不快臭を有する物質であり、香味的にすぐれた（す
なわちＤＡ臭のない）酒類を製造するためには、発酵液
中のα−ＡＬおよびＤＡ含はを、最終的には、仮にその
α−ＡＬが全てＤＡに変化したとしてもその全ＤＡ含量
が酒類中のＤＡ臭の弁別閾（例えば、ビールでは０．０
５〜０．１ｍｇ／リットル）を超えることがないように
、低く抑制することが必要である。
発酵液中のＤＡは酵母の共存中では比較的すみやかに無
味無臭のアセトインへと変換されるが、発酵液中のα−
ＡＬは酵母によっては変化を受けず、それが非生物学的
な化学反応によりＤＡに変化したときにはじめて酵母に
よって分解されるようになる。しかし、発酵液中におけ
るα−ＡＬからＤＡへの変換反応は非常にゆっくりとし
た速度で進行するため、この反応が律速となってα−Ａ
ＬおよびＤＡ含量の低い（すなわちＤＡ臭のない）酒類
を製造するためには、発酵液を長期間酵母の共存下で熟
成させることが必要であった。
ａ−ＡＬＤＣａｓｅはａ−ＡＬをアセトインに分解する
性質を育する酵素であって、一般的には種々の細菌、例
えばエンテロバクタ−やアエロゲネス、バシラス・リケ
ニフオルミス、ラクトバシラス・ケーセイ、バシラス・
プレビス、エンテロバクタ−・クロアカニ、アセトバク
ター属細菌（アセトバクター・ランセンス、アセトバク
ター・アセチ等）等により産生されることが知られてい
る。
エンテロバクタ−・アエロゲネスが産生するα−ＡＬＤ
Ｃａ　ｓ　ｅの酵素学的性質の主なものについて本発明
者らか検討した結果を示すと次の通りである。
分　　子　　ｒ：Ｌ：２８．　０００〜２９．　０００
等　　電　　点：ｐＨ５，０〜６．０ 作用至適ｐＨ：６．５〜７．５ 〃　温度：４０〜５０℃ 熱安定性２６０℃付近まで安定 なお、エンテロバクタ−・アエロゲネスが産生するα−
ＡＬＤＣａｓｅの酵素学的性質については、報告〔ユー
ロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅ
ｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｃｍ、１４（１９７０）１３３−
１３７〕　　もある。
〔発明の概要〕
要旨 本発明は、ＤＡ臭のない酒類を従来法に比べてはるかに
短期間のうちに製造するのに宵用な、α−ＡＬＤＣａｓ
ｅの生物工学的産生能を有するＤＮＡ鎖およびこのＤＮ
Ａ鎖により形質転換されることによりそのα−ＡＬ産生
能が抑制された酵母を提供するものである。
すなわち、本発明による、α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅの生
物工学的産生能を存するＤＮＡ鎖は、α−アセト乳酸脱
炭酸酵素活性を有していてアミノ酸配列が実質的に第１
図に示されているアミノ酸配列のうちＡからＢまでのも
のであるポリペプチドをコードする塩基配列を有するこ
と、を特徴とするものである。
また、本発明によるサツカロマイセス−セレビシェに属
する酵母は、α〜アセト乳酸脱炭酸酵素活性を白°シて
いてアミノ酸配列が実質的に第１図に示されているアミ
ノ酸配列のうちＡからＢまでのものであるポリペプチド
をコードする塩基配列を有するＤＮＡ鎖によって形質転
換され、そのα−ＡＬ産生能が抑制されていること、を
特徴とするものである。
効果 本発明によるＤＮＡ鎖は、種々の微生物、例えばサツカ
ロマイセス拳セレビシェにα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅの産
生能を付与してそのα−ＡＬの産生能を抑制したり（詳
細後記）、あるいはα−ＡＬＤＣａｓｅの生物Ｔ学的産
生において有効に利用することができる。
また、本発明による酵母は、そのα−ＡＬの産生能（正
確にはα−ＡＬの細胞外への漏出）が抑制されているの
で、これにより醸造原料液を発酵させれば、発酵液中の
α−ＡＬのレベルはきわめて低くなり、その結果として
発酵液中のα−ＡＬの処理に要する熟成期間、ひいては
酒類の醸造期間、を著しく短縮することができる。
なお、本発明の酵母においてそのα−ＡＬの産生能が抑
制されるのは、発酵過程において細胞内にα−ＡＬが産
生されても、同じく細胞内に産生されたα−ＡＬＤＣａ
　ｓ　ｅによりα−ＡＬがアセトインに変換されるため
であると考えられる。
〔発明の詳細な説明〕
α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子 定義 本発明によるα−ＡＬＤＣａｓｅの生物工学的産生能を
有するＤＮＡ鎖すなわちα−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子は、
α−ＡＬＤＣａｓｅ活性を有していてアミノ酸配列が実
質的に第１図に示されているアミノ酸配列のうちＡから
Ｂまでのものであるポリペプチド、をコードするもの、
である。
ここでｒＤＮＡ鎖」とはある長さを：釘するポリデオキ
シリボ核酸の相捕的２本鎖を意味するものである。そし
て、本発明ではこのｒＤＮＡ鎖」はそれがコードするポ
リペプチドのアミノ酸配列によって特定されているとこ
ろ、このポリペプチドは−に記のようにを限の長さのも
のであるから、このＤＮＡ鎖もを限の長さのものである
。しかし、このＤＮＡ鎖は、ａ−ＡＬＤＣａｓｅをコー
ドする遺伝子を含んでいてこのポリペプチドの生物工学
的産生を行わせるのに有用なものであるところ、この有
限の長さのＤＮＡ鎖のみによってこのような生物工学的
産生が行なえるのでなく、その５′−側上流および（ま
たは）３′　−側下流に適当な長さのＤＮＡ鎖が結合し
た状態でこのポリペプチドの生物工学的産生が可能とな
る訳である。
従って、本発明でｒＤＮＡ鎖」というときは、この特定
の長さのもの（第１図の対応アミノ酸配列でいえばＡ−
Ｂの長さ）の外に、この特定の長さのＤＮＡ鎖を構成員
とする鎖状または環状ＤＮＡ鎖の形態にあるものを包含
するものとする。
本発明によるＤＮＡ鎖の存在形態のうち代表的なものは
、このＤＮＡ鎖を構成員の一部とするプラスミドの形態
ならびにプラスミドとしであるいはゲノムに挿入された
形で微生物、特に大腸菌および酵母菌、中に存在する形
態である。
本発明によるＤＮＡ鎖の好ましい存在形態は、α−ＡＬ
ＤＣａｓｅ遺伝子が微生物中で安定に発現しつるように
外来遺伝子としての本発明のＤＮＡ鎖とプロモーターお
よびターミネータ−とが一体に結合して、これがプラス
ミドとしであるいはゲノムに挿入された形態で微生物中
に存在するものである。プロモーターおよびターミネー
タ−としては、公知のものを適宜組合わせて用いること
ができる。
この遺伝子がコードするポリペプチド 上記のように、本発明によるＤＮＡ鎖は、これがコード
するアミノ酸配列によって特定されている。このポリペ
プチドは、α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ活性を釘していてア
ミノ酸配列が実質的に第１図に示されているアミノ酸配
列のうちＡからＢまでのものである。ここで、「アミノ
酸配列が実質的に第１図に示されているアミノ酸配列の
うちＡからＢまでのもの」ということは、このペプチド
がα−ＡＬＤＣａｓｅ活性を有する限りアミノ酸のいく
つかについて欠失、置換、付加等があってもよいことを
示すものである。
本発明での典型的なα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ活性を有す
るポリペプチドは第１図のアミノ酸配列のうちＡ−Ｂの
ものであって、２６０個のアミノ酸からなるものであり
、従来そのアミノ酸配列は知られていなかったものであ
る。
ＤＮＡ鎖の塩基配列 α−ＡＬＤＣａｓｅをコードするＤＮＡ鎖は、第１図の
Ａ−Ｂの塩基配列を持つものまたその縮重異性体ならび
に上記のようなα−ＡＬＤＣａｓｅのアミノ酸配列の変
化に対応する塩基配列を持つものまたはその縮重異性体
、である。ここで「縮重異性体」とは、縮重コードンに
おいてのみ異なっていて同一のポリペプチドをコードす
ることのできるＤＮＡ鎖を意味する。たとえば第１図の
Ａ−Ｂの塩基配列をもつＤＮＡ鎖に対して、そのアミノ
酸のどれかに対応するコードンたとえばＣ−末端のＡｓ
ｎに対応するコードン（ＡＡＣ）が、これと縮重関係に
あるたとえばＡＡＴに変ったものを本発明では縮小異性
体と呼ぶものとする。
本発明によるＤＮＡ鎖の好ましい具体例は、３′　−例
末端に接して停止コードンを少なくとも１個（例えばＴ
ＡＡ）をもつものである。
さらに本発明のＤＮＡ鎖の５′　−側上流および（また
は）３′　−画下流には、非翻訳領域としてのＤＮＡ鎖
（３′　−側下流の最初の部分は、ＴＡＡのような停止
コードンであることがふつうである）がある長さで続い
ていてもよい。
なお、第１図に示したＤＮＡ鎖の塩基配列は、エンテロ
バタターアエロゲネスＩＦ０　１３５３４より分離した
α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅをコードする遺伝子について、
マキサム・キルバート法およびダイデオキシ法によって
決定したものである。
ＤＮＡ鎖の取得 」−２のα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅのアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を倚するＤＮＡ鎖を取得する一つの手段
は、核酸合成の方法に従ってその鎖長の少なくとも一部
を化学合成することである。
結合アミノ酸が少なくとも２６０個であるということを
考えれば、この化学合成法よりも、エンテロバクタ−・
アエロゲネスＩＦ０　１３５３４の染色体遺伝子ライブ
ラリーから遺伝子工学の分野で慣用されている方法例え
ば適当なプローブによるハイブリダイゼーション法によ
り取得する方が好ましいといえる。
なお、本発明者らはエンテロバクタ−・アエロゲネスＩ
ＦＯ１３５３４のａ−ＡＬＤＣａｓｅをコードする塩基
配列およびアミノ酸配列が未知であったため、ショット
ガン法を用いて前記の遺伝子ライブラリーより本発明の
ＤＮＡ鎖をスクリーニングした（詳細後記実施例参照）
。
α−アセト乳酸産生能が抑制された酵母上記のようにし
て取得される本発明ＤＮＡ鎖はα−ＡＬＤＣａｓｅをつ
くるための遺伝情報を含んでいるので、これを生物工学
的手法により、一般に酒類の醸造用酵母として使用され
ている酵母（サツカロマイセス拳セレビシェ）に導入し
てこれを形質転換させれば、α−ＡＬ産生能の抑制され
た醸造用酵母を得ることができる。
酵母 本発明における形質転換の対象となる酵母は、［ザ・イ
ースツ・ア・タフソノ−ミック・スタディＪ　　（Ｔｈ
ｃ　ｙｅａｓｔｓ、　ａ　ｔａｘｏｎｏｍｌｃ　５ｔｕ
ｄｙ、）　３ｒｄ　Ｅｄ。
（Ｙａｒｒｏｗ、　Ｄ、、　ｃｄ、　ｂｙ　Ｎ、Ｊ、Ｗ
、　Ｋｒｃｇｃｒ−Ｖａｎ　Ｒｉｊ。
Ｅｌｓｃｖｉｃｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅ
ｒｓ　Ｂ、Ｖ、、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４）　
、ｐ３７９）記載のサッカロマイセス・セレビシエに属
する酵母およびそのシノニムないシ変異株であるが、本
発明の目的からすれば、サッカロマイセス・セレビシエ
に属する酒類の醸造用酵母、具体的にはビール酵母、ワ
イン酵母、清酒酵母等が好ましい。具体的には、たとえ
ば、ワイン酵母：ＡＴＣＣ３８６３７、ＡＴＣＣ３８６
３８、ビール酵母：ＡＴＣＣ２６２９２、ＡＴＣＣ２７
０４、ＡＴＣＣ３２６３４、清酒酵母：ＡＴＣＣ４１３
４、ＡＴＣＣ２６４２１がある。
なお、これらの醸造用酵母の性質についてさらに付言す
るならば、これらは長年にわたって醸造に適する形質、
すなわち醸造原料液を効率よく発酵すること、香味の良
い酒類をつくること、遺伝学的形質が安定していること
等を指標として選抜、純粋培養が重ねられてきた結果、
遺伝学的には交雑・分離が極めて起こり難い高次倍数体
となっており、生胞子形成能は殆んど完全に失われてい
る。
因みに、実用ビール酵母についてみるならば、麦汁中の
糖成分であるマルトース、マルトトリオースの資化能が
高まっている一方クリスタルバイオレット感受性である
等、野生味を失っている。
形質転換 本発明のＤＮＡ鎖により酵母を形質転換させたときにそ
のα−ＡＬの産生能が抑制されたということは本発明者
らによってはじめて確認されたことであるが、形質転換
体の作成のための手順ないし方法そのものは、分子生物
学、生物工学ないし遺伝子工学の分野において慣用され
ているものでありうるので、本発明においても下記した
ところ以外のものについてはこれら慣用技術に準じて実
施すればよい。
酵母中で本発明ＤＮＡ鎖の遺伝子を発現させるためには
、まず酵母中で安定に存在するプラスミドベクター中に
この遺伝子をつなぎかえる必要がある。この際に用いら
れるプラスミドベクターとしては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系
、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系等種々知られているものすべてを
用いることができる。これらのプラスミドベクターは、
文献上公知であるばかりでなく、容易に作成することが
できるものである。
一方、本発明ＤＮＡ鎖の遺伝子を酵母中で発現させるた
めには、それが有する遺伝情報を転写・翻訳させる必要
がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニット
にあたるプロモーターを本発明ＤＮＡ鎖の５′　−側上
流に、ターミネータ−を３′　−側下流に、それぞれ組
み込めばよい。このプロモーターおよびターミネータ−
としては、すでにＡＤＨ，ＧＡＰＤＨ，ＰＨＯ％ＧＡＬ
。
ＰＧＫＳＥＮＯＳＴＲＰ、ＨＩ　Ｐ等のものが知られて
おり、本発明でもこれらのいずれをも利用することがで
きる。これらは文献上公知であるばがりでなく、容易に
作成することができるものである。
本発明によって得られるべき形質転換体を選択するため
のマーカーとしては、０４１８、ハイグロマイシンＢ１
メソトレキセートとスルファニルアミドとの組合せ、ツ
ニカマイシン、エチオニン、コンパクチン、銅イオンな
どに対する抵抗性遺伝子を用いることができる。
本発明のＤＮＡ鎖をより安定的に酵母に保持させるため
に、これを酵母のゲノムに挿入することもできる。この
場合には、プラスミドベクターに組み込まれた本発明Ｄ
ＮＡ鎖のゲノムＤＮＡへの挿入を容易にするために別途
このプラスミドベクターにゲノムＤＮＡと高い相同性を
存するＤＮＡを導入しておくことが望ましいところ、こ
のためのＤＮＡとしてはｒＲＮＡ遺伝子、ＨＯ遺伝子等
を例示することができる。
このうち、ｒＲＮＡ遺伝子は、１倍体酵母ゲノム中に約
１４０回線列に反復していることが明らかにされている
（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、４
０．２６１−２７７　（１９６９））。この特徴により
、この配列を組み換えのターゲット配列として利用した
場合は、他の遺伝子配列を利用した場合と比較して以下
の様な利点がある。
（１）形質転換頻度が上昇することが期待される。
（２）組み込みによるターゲット配列の対応形質の変化
は無視できると考えられる。（３）実施例に示した様な
構造のプラスミド（ｐｌＡＲＬｌ）を使用することによ
り、プラスミドの組み込み、ベクター配列の削除という
一連の操作のくり返しで、外来遺伝子を複数個ゲノム中
へ組み込むことが可能となる。
また、本発明において酵母の形質転換に使用し得るＤＮ
Ａ鎖は、それがコードするポリペプチドが、α−ＡＬＤ
Ｃａ　ｓ　ｅ活性を存する限りにおいては、第１図に示
されているＡ−Ｂのポリペプチドと異なるポリペプチド
をコードするものであってもよいことは前記したところ
である。
このようなポリペプチドの具体例としては、第１図に示
されているＡ−Ｂのポリペプチドに１つ以上のアミノ酸
が挿入または付加したもの、１つ以上のアミノ酸が欠如
するか別のアミノ酸で置換されたもの、ならびに前記し
たバシラス・リケニフォルミス、ラクトバシラス・ケー
セイ、バシラス・プレビス、エンテロバクタ−・クロア
カニ、アセトバクター属細菌（アセトバクター・ランセ
ンス、アセトバクター・アセチ等）等が産生するα−Ａ
ＬＤＣａ　ｓ　ｅを、例示することができる。
このようなりＮＡ鎖は現在の遺伝子工学技術をもってす
れば容易に人手することができよう。
このようにしてつくったプラスミドによる酵母の形質転
換は、遺伝子工学ないし生物工学の分野で慣用されてい
る合目的的な任意の方法、例えばスフェロプラスト法〔
プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・
オブ伊すイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステー
ブ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ｓｅｔ
、ＵＳＡ）　、７５．１９２９（１９７ｇ）　）　、リ
チウムアセテート法〔ジャーナル・オブ・バタテリオロ
ジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、１５３１（ｉ３　
　（１９８３）　１等によって行うことができる。
このようにして得られる本発明の酵母は、本発明ＤＮＡ
鎖によって導入された遺伝情報による新しい形質（すな
わちα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅの産生能が付与され、その
結果、細胞内のα−ＡＬが分解されて、α−ＡＬの細胞
外への漏出量が低下する）および使用ベクター由来の形
質ならびに場合によって生じているかも知れない遺伝子
組換時の一部の遺伝情報の欠落による対応形質の欠落を
除けば、そのゼノタイブないしフェノタイプにおいて形
質転換前の酵ノリと同じである。さらに、Ｙｌｐ型プラ
プラスミドいて本発明ＤＮＡ鎖を酵母染色体へと導入し
た後、不要ベクター配列を削除したビール酵母（詳細後
記実施例（６）参照）は、使用ベクター由来の形質を持
たない。従って、本発明による酵母は、従来の醸造用酵
母と同じである。
従って、本発明による酵母は、従来の醸造用酵母と本質
的には全く同一の発酵条件で使用することが可能であり
、一方で発酵液中でのα−ＡＬの産生能が抑制されてい
るので、結果として発酵液のα−ＡＬ含量が低く、従っ
てその処理に要する発酵液の熟成期間を著しく短縮する
ことができる。
実験例 製 エンテロバクタ−争アエロゲネス１Ｆ０１３５３４〔財
団法人　発酵研究所より入手〕を０、　５％ブドウ糖を
含むし一培地で３７℃で１０時間通気培養することによ
り、０．５ｇの湿菌体を得た。
これを、５ｍｌのサリンＥＤＴＡ緩衝液［０，１５Ｍ　
　ＮａＣ１，０，１Ｍ　　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０））に
再懸濁させた。次いで、４００ｇｇ　／　ｍｌのリゾチ
ーム（生化学工業製）、２０Ｍｇ／ｍｌのリボヌクレア
ーゼＡ（シグマ社製）で３７℃で２０分間処理した。次
に、０．５％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およ
び５００ｇｇ　／　ｍｌのブロテイナーゼＫ（シグマ社
製）で６５°Ｃで４時間処理した。これを、予め調製し
た蔗糖密度勾配溶液（５０ｍ　Ｍ　）リス−ＨＣＩ（ｐ
Ｈ７，４）　、０．１ＭＮａＣ１，５ｍＭＥＤＴＡ、０
．１％　ＳＤＳ、５〜２０％蔗糖）に重層し、日立超遠
心ローターＲＰＳ２７で２５ｋｒｐｍで３時間遠心処理
した。２．５ｍｌずつ分画後、０．４％アガロース電気
泳動法によって調べることにより、高分子ＤＮＡを含む
両分を集めた。これをエタノール沈殿後、１ｍｌのＴＥ
緩衝液（１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　　（ｐＨ８，０）、
１ｍＭＥＤＴＡ）に溶かし、１リツトルのＴＥ緩衝液に
対して透析した。
３００ｇｇの染色体ＤＮＡを得た。
（１ｉ）　　コスミド・ライブラリーの作成（ｉ）で得
た染色体ＤＮＡ１２０μｇを制限酵素５ａｕ３ＡＩで約
４Ｑｋｂｐになるように部分分解した。これを、予め調
製した蔗糖密度勾配溶液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ　　
（８，０）　、ＩＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、１０〜
４０％蔗糖）に重層し、日立超遠心ローターＲＰＳ２７
で２６ｋｒｐｍで２２時間遠心処理した。０．５ｍｌず
つ分画後、０．４％アガロース電気泳動法によって調べ
ることにより、約４０ｋＭのＤＮＡ断片を含む両分を集
めた。これをエタノール沈殿後、５００μｍのＴＥ緩衝
液に溶かし、１１ルソトルのＴＥ緩衝液に対して透析し
た。
得られた約４０ｋｂｐのＤＮＡ断片０．　２μｇを、コ
スミドｐＪＢ８アーム（アマ−ジャム社製）０．３μｇ
とＴ４リガーゼにより連結した。このＤＮＡをλＤＮＡ
・インビトロ・パッケージング・キット（アマ−ジャム
社製）を用いてインビトロ・パッケージングして大腸菌
（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＤＨＩ　（Ｆ−１ｇｙ　ｒＡ９６、ｒ
ｅｃＡｌ、ｒｅｌＡｌ、ｅｎｄＡｌ、ｔｈｉ−１、ｈｓ
ｄＲ１７，５ｕｐＥ４４、λ−）〔ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、）、１６６　５５７−５８０　（１９８３）
：ＡＴＣＣ３３８４９）に形質導入して、コスミド・ラ
イブラリーを得た。
（ｉｉｉ）　ａ−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ遺伝子保持株のス
クリーニング （ｉｔ）で得たコスミド・ライブラリーより、α−ＡＬ
ＤＣａ　ｓ　ｅ活性を示す株を選び出すことによって、
α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ遺伝子保持株を得た。
具体的には、コスミド・ライブラリーより３００株を１
株ずつ５０μｇ　／　ｍｌアンピシリンおよび０．　５
％ブドウ糖を含むし一寒天培地に植菌し、３７℃で８時
間培養して、それぞれについて酵素活性を測定した。す
なわち、各株を１ｍｌの３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ６，２）に懸濁させ、１０μｌのトルエンを加え
て３０秒間激しく攪拌した。この細胞懸濁液についてα
−ＡＬＤＣａｓｅ活性をゴットフレドセン（Ｇｏｄｆ’
ｒｅｄｓｅｎ）らの方法〔カールスバーグ・リサーチ拳
コミュニケーション（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、　Ｒｅｓ。
Ｃｏｍｍｕｎ、　、４７．９３　（１９８２）　）に従
って、測定した。
この結果、２株のα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ活性保持株を
得た。得られたクローンのプラスミドをそれぞれｐＣＡ
３およびｐｃＡ１３と命名した。
（ｉｖ）　　α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子ＤＮＡ塩基配列
決定 ｐｃＡ１３からサブクローニングを行なうことにより、
制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＶで切り出される１４
２２ｂｐのＤＮＡ断片がα−ＡＬＤＣａｓｅをコードし
ていることが示された。このＥｃｏＲＶ切断点にＨｉｎ
ｄｍリンカ−（ｄＣＡＡＧＣＴＴＧ：宝酒造辻製）を連
結し、プラスミドｐＵＣ９（ファルマシア社製）のＢａ
ｍＨＩ及びＨｉｎｄｍ切断点の間に挿入したプラスミド
を、ｐＵＡＲ５と命名した。
ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片について、ダイデオキシ法
〔プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナルＱアカデ
ミ−・オブφサイエンシズ會オブ・ザ・ユナイテッド・
ステーツφオブ・アメリカＰｒｏｃ、　ＮａＬｌ、Ａｅ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７４．５４６３　（１９
７７）　）及びマクサム・ギルバート法（Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　７４．
５００　（１９７７）　）によりＤＮＡ塩基配列を決定
した（第１図）。これを解析した結果、７８０ｂｐのオ
ープンリーディングフレームが存在した。ここには、ア
ミノ酸２６０個、分子量２万９千の蛋白質がコードされ
ていると推定され、この分子量は前記のα−ＡＬＤＣａ
　ｓ　ｅの分子量とほぼ一致した。
（２）α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ遺伝子の酵母への導入（
ｉ）ＡＤＨＩプロモーターの取得 サツカロミセス・セレビシェ５２８８Ｃ（（α、ｓｕｅ
　２、ｍａｔ　、ｇａｌ　２、ＣＵＰＩ）：バイオケミ
カルφアンドーバイオフィジカル・リサーチ・コミュニ
ケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、ＢＩｏｐｈｙｓ、Ｒｅ
ｓ。
Ｃｏｍｍｕｎ、）、５０．１８６−１９１　（１９７３
）：ＡＴＣＣ２６１０８）より、常法に従って染色体Ｄ
ＮＡを調製した。実施例（１）（ｉｔ）と同様な手法で
制限酵素５ａｕ３Ａ１部分分解によって約１０１ｃ　ｂ
　ｐのＤＮＡ断片を得た。これを制限酵素ＢａｍＨＩで
切断したｐＢＲ３２２とＴ４リガーゼによって連結し、
ライブラリーを作成した。
ＡＤＨＩ遺伝子〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（Ｊ、Ｂ、Ｃ）　　２５７．３０１８（＋
９８２）　）のコーディング領域の７番目から３６番口
の塩基に対応する合成オリゴマーを３２Ｐで末端標識し
、これをプローブとしてライブラリーよりＡＤＨ１ｉｌ
！伝子を得た。さらに、これを制限酵素ｓｐｈ　Ｉ及び
５ａｕ３ＡＩで切断して、ＡＤＨ１遺伝子のプロモータ
ー及びコーディング領域の一部を含む５４２ｂｐのＤＮ
Ａ断片を得た。この断片の５ａｕ３ＡＩ末端をエンドヌ
クレアーゼＢａ１３１で処理してコーディング領域を完
全に欠失させた後、ＨｉｎｄＩＩＩリンカ−（ｄＣＡＡ
ＧＣＴＴＧ　：宝酒造社製）を付加した。このＤＮＡ断
片を、ＡＤＨ１プロモーターとして用いた。
（１１）発現ベクターの構築及び酵母への導入酵母内で
複製可能なプラスミドＹＥｐｌＢ（ジーン（Ｇｅｎｅ）
、８．１２１　（１９７９）　：　Ａ　Ｔ　ＣＣ３７１
１５）を基本的に用いて、以下の手順で発現ベクターを
作成した。
まず、ＹＥｐｌＢのＬＥＵ２遺伝子の両端にある５ａｉ
ｌ−３ａｃｌ断片及びＸｈｏ　Ｉ　−ＳｍａＩ断片を欠
失させた。これにより、当プラスミドは制限酵素Ｘｈｏ
　Ｉ、Ｓａｃ　Ｌ　Ｓｍａ　ＩおよびＢｇｌＩＩによる
切断部位をもたず、制限酵素５ａｌＩによる切断部位を
ただ１箇所もつものとなった。次に、このプラスミド中
のｐＢＲ３２２由来の制限酵素ＨｉｎｄｎＩ切断点と、
２μｍＤＮ八由来のへ限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断点との
間に合成オリゴヌクレオチド４　ｊｍ　ｅ　ｒを挿入し
た。この合成オリゴヌクレオチドは、制限酵素５ａｃｌ
。
ＳｍａｌＳＢｇｌＩＩおよびＸｈｏｌ切断点をもち、ま
た下記の塩基配列をもつ。本発明では、このプラスミド
Ｇ、ＹＥｐ１３にと命名した。
次に、ＹＥｐｌＢにの５ｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を
（１）で作成したＡＤＨ１プロモーターと置換して、発
現プラスミドベクターｐ　Ａ　Ｋ　５０３を得た。
（１）（＋Ｖ）で得られたα−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子断
片を有するプラスミドｐＵＡＲ５を制限酵素Ｈｉｎｃｎ
で切断し、ＨｉｎｄＩＩＩリンカ−（ｄＣＡＡＧＣＴＴ
Ｇ　：宝酒造社製）を付加した後、制限酵素Ｈｉｎｄ■
およびＢａｍＨＩで切断した。得られた９４０ｂｐのａ
−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子断片をｐＡＫ５０３のＨｉ　ｎ
ｄＩＩ［−Ｂｇ　１■断片と置換して、プラスミドｐＡ
Ｌ　　５０３を得た。
さらに、Ｇ４１８耐性遺伝子を含むｐＵＣ−４Ｋ（ファ
ルマシア社製）を制限酵素５ａｌｌで切断し、得られた
Ｇ４１８耐性遺伝子を含む断片をｐＡＬ５０３の５ａｌ
Ｉ切断点に挿入して、目的とするプラスミドｐＡＬ０５
０３４を得た。
ｐＡＬＧ５０３４をリチウムアセテート法〔ジャーナル
φオブ・バクテリオロジー （Ｊ、　Ｂａｃｔｃｒｉｏｌ、）　１５３．１６３、（
１９８３））によって酵母〔サツカロミセス・セレビシ
ェ５２８８Ｃの変異株であるＴＤ４　（ａ、、ｈ　ｉ　
ｓ、　ｕ　ｒ　ａ。
ｌｅｕ、ｔｒｐ）株及びビール酵母ＩＦ００７５１株〕
に導入したところ、それぞれ１　、　９〜３　、　３　
Ｕ　／　ｍｇタンパクおよび１．８〜３．５　Ｕ　／　
ｍｇタンパクのａ−ＡＬＤＣａｓｅ活性を示した。
ｐＡＬ０５０３４を含むＩＦｏ　　０７５１株を５ＫＢ
ＩＯＩと、またｐＡＬ０５０３４を含むＴＤ４株を５Ｋ
Ｂ１０２と、呼ぶこととする。
α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ遺伝子はその５′末端に翻訳開
始コードンであるＡＴＧが３個連続しているが、ａ−Ａ
ＬＤＣａｓｅ遺伝子断片の５′側Ｈｉｎｄｍ切断点から
エンドヌクレアーゼＢａ　１３１で処理し、３個のＡＴ
Ｇのうち、５′側がら１個あるいは２個除去し、酵母Ｔ
Ｄ４内で発現させて活性に対する影響をみた。その結果
、得られたＡＬＤＣａｓｅの酵素活性に大きな差異は認
められなかった。
（３）醗酵試験によるダイアセチル生成量低減の確認 （２）−（ｉｉ）で記述したように、ＴＤＪ株ならびに
ＩＦｏ　　０７５１株にａ−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子を導
入した２種類の酵母について醗酵試験を行い、これら導
入株の全ダイアセチル（ＴＤＡ　：ダイアセチル並びに
その前駆物質であるα−アセト乳酸の和）生成ｍが低減
することを以下の方法で確認した。
（ｉ）　ａ　−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ産生酵母の取得上述
のようなα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ遺伝子を導入した２種
類の酵母（ＳＫＢＩＯＩ株およびＳＫＢ１０２株）およ
びｐＡＬ０５０３４導入前のそれぞれ原株（ＩＦｏ　　
０７５１株およびＴＤ４株）をＹＰＤ培地で培養した。
ｐＡＬ０５０３４導入株については、培地に６００μｇ
／ｍｌの６４１８を添加した。
３０℃で１６時間の振盪培養で生育した各々の菌体を３
０００Ｘｇで１０分間の遠心分離で集菌し、蒸留水で洗
浄してから、醗酵試験に供した。
（１１）醗酵試験 １１°Ｐに調製した麦汁に酵母添加率０．５％（ｗｅ　
ｔ、ｗ／ｖ）になるように（ｉ）で得た酵母を添加し、
充分に通気したのち、８℃で７日間静置醗酵させた。醗
酵終了後、３０００Ｘｇで１０分間の遠心処理及びン濾
過によって、菌体を除いた２戸液について、ＴＤＡ　（
全ダイアセチル量）を測定した。
結果は、下表に示す通りであった。本発明の酵母を用い
た醗酵では、対照株の時と比較して、ＴＤＡ生成量が大
幅に減少したことがわかる。
全ダイアセチル（ＴＤＡ）生成量の変化（４）組み込み
型プラスミドの構築 （ｉ）　　プラスミドｐＩＡＲＬ１の構造と特徴α−Ａ
ＬＤＣａｓ　ｅ遺伝子を酵母内で安定保持させるために
、自律増殖能をもたず、染色体に組み込まれることによ
ってのみ酵母に保持されうるプラスミドｐｌＡＲＬ１を
作成した。このプラスミドは、酵母内マーカーとして、
Ｇ４１８耐性遺伝子及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を
有し、また相同的組換えにより、プラスミドが染色体Ｄ
ＮＡに組み込まれるのに必要な配列として、ｒＲＮＡ遺
伝子配列を有する。α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ遺伝子は、
その５′端及び３′端をそれぞれＡＤＨ１プロモーター
およびＨＩＰＩターミネータ−にはさまれて、ｒＲＮＡ
遺伝子配列内に組み込まれている。このプラスミドは、
これを染色体」−のｒＲＮＡ遺伝子内に効率的に組み込
むために、予め「ＲＮＡ遺伝子配列内にあるＫｐｎＩ切
断点で切断してから形質転換に用いる。その結果、得ら
れる形質転換体においては、プラスミド由来及びもとも
と染色体に存在したｒＲＮＡ遺伝子配列が重複すること
になる。したがって、この形質転換体を完全培地で増殖
させた場合には、重複した配列において遺伝子の再組み
換えがおこって、Ｇ４１８感受性およびＬａＣ″″の菌
が出現する。このうち一部はα−ＡＬＤＣａｓｅ活性を
示し、これらの菌ではＡＤＨ１プロモーター、ａ−ＡＬ
ＤＣａｓｅ遺伝子およびＨＩＰＩターミネータ−のみが
染色体上に残り、他のベクタ一部分は欠失していること
になる。
（ｉｆ）　　ｐ　Ｉ　ＡＲＬ　１の構築ｐｌＡＲＬ１は
、酵母の組み込み型プラスミドであるＹ　Ｉ　ｐ　５　
（Ｐｒｏｔ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　
７０．１０３５−１０３９（１９７９））をもとに作成
した。
まず、０４１８耐性遺伝子を、ｐＵＣ４Ｋ（ファルマシ
ア社製）より５ａｉｌで切り出し、ＹＩｐ５の５ａｉｌ
切断点に挿入して、プラスミドｐｌＧ７を作成した。
続いて、ＨＩＰＩ遺伝子プロモーター＋１ａｃＺ遺伝子
断片は、酵母ＨＩＰＩ遺伝子（Ｇｅｎｅ、　３８．２０
５−２１４（＋９８５＞）の５′非翻訳領域約０．６ｋ
ｂと翻訳領域約０．４ｋｂを含むＢｇｌＩＩ断片に、プ
ラスミドｐＭｃ１８７１　（ファルマシア社製）からＢ
ａｍＨＩ断片として得られた１ａｃＺ遺伝子を連結した
ＢｇｌＩＩ−ＢａｎＨＩ断片を、ｐＩＧ７のＢａｎＨＩ
切断点に挿入して、プラスミドｐｌＬＧ２を作成した。
ｒＲＮＡ遺伝子は、ＡＤＨ１遺伝子取得に用いたライブ
ラリーより、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子（Ｊ、Ｂ、Ｃ，，
２５２，８１１８−８１２５（１９７７））の５′末端
４〜３２番目の塩基に対応するオリゴマーを５′末端標
識したものをプローブとして用いて取得した。
このうち、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子および２５ＳｒＲＮ
Ａ遺伝子のそれぞれ一部を含む約３ｋｂのＥｃｏＲＩ断
片を、ｐ　Ｉ　ＬＧ２のｐＢＲ３２２由来のＥｃｏＲＩ
切断点に導入して、プラミスドｐ　ＩＲＬ９を作成した
。
ＡＤＨＩプロモーター＋ａＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ遺伝子＋
ＨＩＰＩターミネータ−断片は、以下に示した方法で取
得した。
α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子を有するプラスミドｐＵＡＲ
５をＨｉｎｃＩＩで切断後、Ｂａ１３１で処理し、Ｈｉ
ｎｄｎ［リンカ−を付加したのぢ、ＨｉｎｄＩＩＩ及び
ＢａｍＨＩ切断により得られるα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ
断片をｐＵｃ１２（ファルマシア社製）のＢａｍＨＩ−
ＨｉｎｄＩ［Ｉ切断部位に挿入し、塩基配列を決定し、
α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ遺伝子の５′上流約４０ｂｐ及
び最初のＡＴＧまでを欠失したプラスミドｐＡＬＤＣ３
を得た。
ｐＡＬＤＣ３をＢａｍＨＩで分解し、 Ｋｌｅｎｏｗ断片により平滑末端とした後、ＨｉｎｄＩ
ＩＩ分解により得たα−ＡＬＤＣ遺伝子断片をｐ　Ａ　
Ｋ　５０３のＨｉｎｄＩＩ［−ＳｍａＩ断片と置換して
、プラスミドｐＡＬ５０３−３を作成した。さらに、ｐ
ＡＬ５０３−３の５ｐｈｌ切断点を、ｓｐｈ　Ｉ分解後
、Ｓ１ヌクレアーゼ処理、ＢａｍＨＩリンカ−付加によ
り、ＢａｍＨＩ切断点に変換した後、ＡＤＨ１プロモー
ター十α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子断片をＢａｍＨＩ−Ｂ
ｇｌ■断片として得た。
また、ＨＩＰＩ遺伝子の３′末端非翻訳領域約０．９ｋ
ｂと３′翻訳領域約０．１ｋｂを含むＢａｍＨＩ−Ｓａ
　Ｉ　Ｉ断片をｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ−３ａ　ｌ　
Ｉ断片と置換したプラスミドを作成し、このプラスミド
のＢａｍＨＩ切断点に、上記のＡＤＨ１＋α−ＡＬＤＣ
遺伝子断片を挿入して、ＡＤＨ１プロモーター＋α−Ａ
ＬＤＣａｓｅ遺伝子＋ＨＩＰ転子−ミネータ−の順序で
連結されたプラスミドｐＡＬＴ１８を作成した。
ＡＤＨＩプロモーター＋ａ−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子＋Ｈ
ＩＰ転子−ミネータ−断片は、ｐＡＬＴ１８を５ａｉ１
分解後、ＢａｍＨＩリンカ−を付加した後、ＢａｍＨＩ
分解により、ＢａｍＨ１断片として得、ｐｌＲＬ９のＢ
ｇｌｎ切断点に挿入して、目的とするプラスミドｐｌＡ
ＲＬ１を作成した。
（５）酵母へのｐｌＡＲＬｌの導入と発現前述のように
して作製したｐｌＡＲＬｌを用いて、次のようにして酵
母を形質転換した。ビール酵母ＩＦ０　０７５１株をＹ
ＰＤ培地で０Ｄ６ｏ。
−１，０になるまで３０℃で培養し、集菌してリチウム
アセテート法によりｐｌＡＲＬｌに接触すせた。ｒＲＮ
Ａ遺伝子配列での組換えを促進するために、形質転換前
にｐＩＡＲＬｌをｒＲＮＡ遺伝子配列内のＫ　ｐ　ｎ　
Ｉ切断点で完全分解し、直線化してから用いた。ｐｌＡ
ＲＬｌへ接触の後、酵母細胞１０８個をＹＰＤ培地培地
１定ｌ濁し、１８時間／３０℃で振とうした後、抗生物
質６４１８（５００μｇ／ｍｌ）を含むＹＰＤ寒天培地
上に接種した。ついで、プレートを３０℃で３〜５日間
インキュベートして、コロニーを得た。これらのコロニ
ー中には、形質転換された細胞の他に、ｐｌＡＲＬ１非
依存的に６４１８耐性を獲得した細胞が含まれているた
め、つまようじでＸ−ｇａ１色素（５′　　−ブロモ−
４′　−クロロ−３′　−インドイル−β−Ｄ−ガラク
トシド）を含むＲｕｂｙらの寒天培地（メソッド・仁ハ
エンザイモロジー、ｖ　ｏ　１．１０１　、ｐ、２５３
　（１９８３））に接種し、３０℃で２〜５日インキュ
ベートした。このプレ−トで青く発色し、β−ガラクト
シダーゼ活性を示したもの（Ｌａｃ＋株）を形質転換体
と判断した。このような細胞は、全て０．８〜１．８Ｕ
／ｍｇタンパクのα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ活性を示した
。
最も高いα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ活性を示した形質転換
体（ＳＫ８１０３株）をＹＰＤ培地で非選択的に８０世
代培養した。培養後のα−ＡＬＤＣａｓｅ活性は０．９
Ｕ／ｍｇタンパクであり、ａ−ＡＬＤＣａｓｅ活性を示
す遺伝子が染色体に安定に組み込まれていることを示し
た。
（６）不要配列の削除とα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅの発現
（５）で得た形質転換体（ＳＫ８１０３株）をＹＰＤ培
地で２０〜３０世代非選択的に培養した後、適宜希釈し
て前述のＸ−ｇａｌを含むＲｕｂｙらの寒天培地に接種
した。このプレートを３０°Ｃで５〜７０間培養し、青
色を発色しない株（Ｌａｃ−株）を分離した。これらの
細胞のうち、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ
寒天培地で０４１８感受性を示すものを選択した。さら
にα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ活性を示す細胞を得た。
これらの細胞に於いては、（４）−（ｉ）に示したよう
に、ｊｆ＋ｌ　１０　したｒＲＮＡ遺伝子配列に於いて
組換えが生じ、ＡＤＨＩプロモーター、α−ＡＬＤＣａ
ｓｅ遺伝子およびＨＩＰＩターミネータ−のみが染色体
上に残り、他のベクタ一部分は欠失していると考えられ
る。これらの細胞のうち、０．２Ｕ／ｍｇタンパクのａ
−ＡＬＤＣａｓｅ活性を示した細胞（ＳＫ８１０４株）
を４０世代ＹＰＤ培地で培養したが、活性は８０％以上
維持された。
（７）発酵試験 （５）で得た５Ｋ８１０３株ならびに（６）で得たＳ　
Ｋ　８１０４株について醗酵試験を行ない、ＴＤＡ生成
量が低減することを以下の方法で確認した。２種の酵母
を２０℃で３日間、１０℃で１０日間ＹＰＤ培地で非選
択的に静置培養し、各々の菌体を３０００Ｘｇで１０分
間の遠心分離で集菌し、蒸留水で洗浄してから、醗酵試
験に供した。
１１°Ｐに調整した麦汁に酵母添加率０．６％（ｗｃｔ
、ｗ／ｖ）になるように酵母を添加し、充分に通気した
のち、１０℃で８〜１０日間静置醗酵させた。醗酵終了
後、３０００Ｘｇで１０分間の遠心処理及びン濾過によ
って菌体をのぞいた炉液について、ＴＤＡ及び糖度を測
定した。結果は、下表に示すとおりであった。培養、醗
酵とも非選択条件下で行なったにもかかわらず、対照株
に比して顕著なＴＤＡ生成量の減少が見られ、α−ＡＬ
ＤＣａｓｅ活性が安定に発現していることが示された。
５Ｋ８１０３株の発酵試験の結果 ５Ｋ８１０４株の発酵試験の結果 微生物の寄託 本発明に関係する下記の微生物は、通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託されて次の受託番号を得
ている。
（１）ＳＫＢＩＯＩ　（ｐＡＬ０５０３４を含む）・・
・・・・・・・微工研条寄第１２２８号（２）ＳＫＢ１
０２　（ｐＡＬＧ５０３４を含む）・・・・・・・・・
微工研条寄第１２２９号（１）および（２）の受託口は
、いずれも、昭和６０年１２月１１０である。
（３）ＳＫＢ１０４ ・・・・・・・・・微工研条寄第１２２７号（３）の受
託口は、昭和６１年１２月２日である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明によるＤＮＡ鎖およびアミノ酸配列を
示す説明図である。 第２図は、ｐＡＬ０５０３４の構造を示す説明図である
。 第３図は、ｐｌＡＲＬｌの構造を示す説明図である。 第２図 第３図

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、α−アセト乳酸脱炭酸酵素活性を有していてアミノ
    酸配列が実質的に第１図に示されているアミノ酸配列の
    うちＡからＢまでのものであるポリペプチドをコードす
    る塩基配列を有することを特徴とする、α−アセト乳酸
    脱炭酸酵素の生物工学的産生能を有するＤＮＡ鎖。 ２、ポリペプチドをコードする塩基配列が第１図に示さ
    れている塩基配列のうちＡからＢまでのものまたはその
    縮重異性体である、特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ
    鎖。 ３、α−アセト乳酸脱炭酸酵素活性を有していてアミノ
    酸配列が実質的に第１図に示されているアミノ酸配列の
    うちＡからＢまでのものであるポリペプチドをコードす
    る塩基配列を有するＤＮＡ鎖によって形質転換され、そ
    のα−アセト乳酸産生能が抑制されていることを特徴と
    する、サッカロマイセス・セレビシエに属する酵母。 ４、形質転換が、第１図に示されているアミノ酸配列の
    うちＡからＢまでのポリペプチドをコードする塩基配列
    を有するＤＮＡ鎖をその遺伝情報が発現可能な状態で含
    むプラスミドによってなされている、特許請求の範囲第
    ３項に記載の酵母。 ５、ＤＮＡ鎖が、第１図に示されている塩基配列のうち
    ＡからＢまでの塩基配列である、特許請求の範囲第３項
    または第４項に記載の酵母。
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