JPH07121215B2 - 酒類の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】〔発明の背景〕

【産業上の利用分野】本発明は、エンテロバクター・ア
エロゲネス ＩＦＯ １３５３４が産生するようなα‐
アセト乳酸脱炭酸酵素α‐ＡＬＤＣａｓｅ（以下α‐Ａ
ＬＤＣａｓｅという）の生物工学的産生能を有するＤＮ
Ａ鎖、およびこのＤＮＡ鎖より形質転換されてそのα‐
アセト乳酸（α‐ＡＬ）産生能が抑制されているサッカ
ロマイセス・セレビシエに属する酵母、に関連を有する
ものである。

【０００２】そして、具体的には、本発明は、この酵母
を使用する酒類の製造法に関する。

【０００３】

【従来の技術】酒類は、一般に、酵母でその基質を発酵
させることによって製造される。すなわち、具体的に
は、ビール、清酒、ワイン等の酒類は、一般に、麦汁、
果汁等の醸造原料液にサッカロマイセス・セレビシエに
属する酵母を加え、これをアルコール発酵させることに
より製造される。この発酵過程において、酵母は自己の
増殖に必要なある種のアミノ酸の生合成の中間物質とし
てα‐ＡＬを産生し、これを不可避的に細胞外、すなわ
ち発酵液中、に漏出する。このようにして発酵液中に存
在するに到ったα‐ＡＬは、発酵液中において非生物学
的な反応により、自動的にダイアセチル（ＤＡ）へと変
化する。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ＤＡは一般に「スエ
臭」または「ＤＡ臭」と呼ばれる強烈な不快臭を有する
物質であり、香味的にすぐれた（すなわちＤＡ臭のな
い）酒類を製造するためには、発酵液中のα‐ＡＬおよ
びＤＡ含量を、最終的には、仮にそのα‐ＡＬが全てＤ
Ａに変化したとしてもその全ＤＡ含量が酒類中のＤＡ臭
の弁別閾（例えば、ビールでは０．０５〜０．１mg／リ
ットル）を超えることがないように、低下させることが
必要である。

【０００５】発酵液中のＤＡは酵母の共存中では比較的
すみやかに無味無臭のアセトインへと変換されるが、発
酵液中のα‐ＡＬは酵母によっては変化を受けず、それ
が非生物学的な化学反応によりＤＡに変化したときには
じめて酵母によって分解されるようになる。しかし、発
酵液中におけるα‐ＡＬからＤＡへの変換反応は非常に
ゆっくりとした速度で進行するため、この反応が律速と
なってα‐ＡＬおよびＤＡ含量の低い（すなわちＤＡ臭
のない）酒類を製造するためには、発酵液を長期間酵母
の共存下で熟成させることが必要であった。

【０００６】α‐ＡＬＤＣａｓｅはα‐ＡＬをアセトイ
ンに分解する性質を有する酵素であって、一般的には種
々の細菌、例えばエンテロバクター・アエロゲネス、バ
シラス・リケニフォルミス、ラクトバシラス・ケーセ
イ、バシラス・ブレビス、エンテロバクター・クロアカ
エ、アセトバクター属細菌（アセトバクター・ランセン
ス、アセトバクター・アセチ等）等により産生されるこ
とが知られている。

【０００７】エンテロバクター・アエロゲネスが産生す
るα‐ＡＬＤＣａｓｅの酵素学的性質の主なものについ
て本発明者らが検討した結果を示すと次の通りである。

【０００８】 分 子 量 ：２８，０００〜２９，０００ 等 電 点 ：ｐＨ５．０〜６．０ 作用至適ｐＨ：６．５〜７．５ 〃 温度：４０〜５０℃ 熱安定性 ：６０℃付近まで安定 なお、エンテロバクター・アエロゲネスが産生するα‐
ＡＬＤＣａｓｅの酵素学的性質については、報告〔ユー
ロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Eu
r.J.Biochem.14(1970)133-137 〕もある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】

〔発明の概要〕要 旨 本発明は、ＤＡ臭のない酒類を従来法に比べてはるかに
短期間のうちに製造する方法を提供するものである。

【００１０】すなわち、本発明による酒類の製造法は、
酵母でその基質を発酵させて酒類を製造する方法におい
て、使用する酵母が、α‐アセト乳酸脱炭酸酵素活性を
有していてアミノ酸配列が実質的に図１および図２にわ
たってに示されているアミノ酸配列のうちＡからＢまで
のものであるポリペプチドをコードする塩基配列を有す
るＤＮＡ鎖によって形質転換されて、そのα‐ＡＬ産生
能が抑制されているサッカロマイセス・セレビシエに属
する酵母であること、を特徴とするものである。

【００１１】＜効 果＞本発明によるＤＮＡ鎖は、種々
の微生物、例えばサッカロマイセス・セレビシエにα‐
ＡＬＤＣａｓｅの産生能を付与してそのα‐ＡＬの産生
能を抑制したり（詳細後記）、あるいはα‐ＡＬＤＣａ
ｓｅの生物工学的産生において有効に利用することがで
きる。

【００１２】すなわち、本発明による酵母は、そのα‐
ＡＬの産生能（正確にはα‐ＡＬの細胞外への漏出）が
抑制されているので、これにより醸造原料液を発酵させ
れば、発酵液中のα‐ＡＬのレベルはきわめて低くな
り、その結果として発酵液中のα‐ＡＬの処理に要する
熟成期間、ひいては酒類の醸造期間、を著しく短縮する
ことができる。

【００１３】なお、本発明の酵母においてそのα‐ＡＬ
の産生能が抑制されるのは、発酵過程において細胞内に
α‐ＡＬが産生されても、同じく細胞内に産生されたα
‐ＡＬＤＣａｓｅによりα‐ＡＬがアセトインに変換さ
れるためであると考えられる。

【００１４】〔発明の具体的説明〕α‐ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子 定 義 本発明によるα‐ＡＬＤＣａｓｅの生物工学的産生能を
有するＤＮＡ鎖すなわちα‐ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子は、
α‐ＡＬＤＣａｓｅ活性を有していてアミノ酸配列が実
質的に図１および図２にわたってに示されているアミノ
酸配列のうちＡからＢまでのものであるポリペプチド、
をコードするもの、である。

【００１５】ここで「ＤＮＡ鎖」とはある長さを有する
ポリデオキシリボ核酸の相補的２本鎖を意味するもので
ある。そして、本発明ではこの「ＤＮＡ鎖」はそれがコ
ードするポリペプチドのアミノ酸配列によって特定され
ているところ、このポリペプチドは上記のように有限の
長さのものであるから、このＤＮＡ鎖も有限の長さのも
のである。しかし、このＤＮＡ鎖は、α‐ＡＬＤＣａｓ
ｅをコードする遺伝子を含んでいてこのポリペプチドの
生物工学的産生を行わせるのに有用なものであるとこ
ろ、この有限の長さのＤＮＡ鎖のみによってこのような
生物工学的産生が行なえるのでなく、その５′‐側上流
および（または）３′‐側下流に適当な長さのＤＮＡ鎖
が結合した状態でこのポリペプチドの生物工学的産生が
可能となる訳である。

【００１６】従って、本発明で「ＤＮＡ鎖」というとき
は、この特定の長さのもの（図１および図２の対応アミ
ノ酸配列でいえばＡ〜Ｂの長さ）の外に、この特定の長
さのＤＮＡ鎖を構成員とする鎖状または環状ＤＮＡ鎖の
形態にあるものを包含するものとする。

【００１７】本発明によるＤＮＡ鎖の存在形態のうち代
表的なものは、このＤＮＡ鎖を構成員の一部とするプラ
スミドの形態ならびにプラスミドとしてあるいはゲノム
に挿入された形で微生物、特に大腸菌および酵母菌、中
に存在する形態である。

【００１８】本発明によるＤＮＡ鎖の好ましい存在形態
は、α‐ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子が微生物中で安定に発現
しうるように外来遺伝子としての本発明のＤＮＡ鎖とプ
ロモーターおよびターミネーターとが一体に結合して、
これがプラスミドとしてあるいはゲノムに挿入された形
態で微生物中に存在するものである。プロモーターおよ
びターミネーターとしては、公知のものを適宜組合わせ
て用いることができる。

【００１９】この遺伝子がコードするポリペプチド 上記のように、本発明によるＤＮＡ鎖は、これがコード
するアミノ酸配列によって特定されている。このポリペ
プチドは、α‐ＡＬＤＣａｓｅ活性を有していてアミノ
酸配列が実質的に図１および図２にわたって示されてい
るアミノ酸配列のうちＡからＢまでのものである。ここ
で、「アミノ酸配列が実質的に図１および図２にわたっ
て示されているアミノ酸配列のうちＡからＢまでのも
の」というときの「実質的に」ということは、このペプ
チドがα‐ＡＬＤＣａｓｅ活性を有する限りアミノ酸の
いくつかについて欠失、置換、付加等があってもよいこ
とを示すものである。

【００２０】本発明での典型的なα‐ＡＬＤＣａｓｅ活
性を有するポリペプチドは図１および図２のアミノ酸配
列のうちＡ〜Ｂのものであって、２６０個のアミノ酸か
らなるものであり、従来そのアミノ酸配列は知られてい
なかったものである。

【００２１】ＤＮＡ鎖の塩基配列 α‐ＡＬＤＣａｓｅをコードするＤＮＡ鎖は、図１およ
び図２のＡ〜Ｂの塩基配列を持つものまたはその縮重異
性体ならびに上記のようなα‐ＡＬＤＣａｓｅのアミノ
酸配列の変化に対応する塩基配列を持つものまたはその
縮重異性体、である。ここで「縮重異性体」とは、縮重
コードンにおいてのみ異なっていて同一のポリペプチド
をコードすることのできるＤＮＡ鎖を意味する。たとえ
ば図１および図２のＡ〜Ｂの塩基配列をもつＤＮＡ鎖に
対して、そのアミノ酸のどれかに対応するコードンたと
えばＣ‐末端のＡｓｎに対応するコードン（ＡＡＣ）
が、これと縮重関係にあるたとえばＡＡＴに変ったもの
を本発明では縮重異性体と呼ぶものとする。

【００２２】本発明によるＤＮＡ鎖の好ましい具体例
は、３′‐側末端に接して停止コードンを少なくとも１
個（例えばＴＡＡ）をもつものである。さらに本発明の
ＤＮＡ鎖の５′‐側上流および（または）３′‐側下流
には、非翻訳領域としてのＤＮＡ鎖（３′‐側下流の最
初の部分は、ＴＡＡのような停止コードンであることが
ふつうである）がある長さで続いていてもよい。なお、
図１および図２にわたって示したＤＮＡ鎖の塩基配列
は、エンテロバクターアエロゲネスＩＦＯ １３５３４
より取得したα‐ＡＬＤＣａｓｅをコードする遺伝子に
ついて、マキサム・キルバート法およびダイデオキシ法
によって決定したものである。

【００２３】ＤＮＡ鎖の取得 上記のα‐ＡＬＤＣａｓｅのアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有するＤＮＡ鎖を取得する一つの手段は、核
酸合成の方法に従ってその鎖長の少なくとも一部を化学
合成することである。結合アミノ酸が少なくとも２６０
個であるということを考えれば、この化学合成法より
も、エンテロバクター・アエロゲネスＩＦＯ １３５３
４の染色体遺伝子ライブラリーから遺伝子工学の分野で
慣用されている方法例えば適当なプローブによるハイブ
リダイゼーション法により取得する方が好ましいといえ
る。なお、本発明者らはエンテロバクター・アエロゲネ
スＩＦＯ １３５３４のα‐ＡＬＤＣａｓｅをコードす
る塩基配列およびアミノ酸配列が未知であったため、シ
ョットガン法を用いて前記の遺伝子ライブラリーより本
発明のＤＮＡ鎖を取得した（詳細後記実施例参照）。

【００２４】α‐アセト乳酸産生能が抑制された酵母 上記のようにして取得される本発明ＤＮＡ鎖はα‐ＡＬ
ＤＣａｓｅをつくるための遺伝情報を含んでいるので、
これを生物工学的手法により、一般に酒類の醸造用酵母
として使用されている酵母（サッカロマイセス・セレビ
シエ）に導入してこれを形質転換させれば、α‐ＡＬ産
生能の抑制された醸造用酵母を得ることができる。

【００２５】酵 母 本発明における形質転換の対象となる酵母は、「ザ・イ
ースツ・ア・タクソノーミック・スタディ」（The yeas
ts, a taxonomic Study,）3rd Ed．（Yarrow,D., ed. b
y N.J.W. Kreger-Van Rij. Elsevier Science Publishe
rs B.V., Amsterdam （1984）、p379）記載のサッカロ
マイセス・セレビシエに属する酵母およびそのシノニム
ないし変異株であるが、本発明の目的からすれば、サッ
カロマイセス・セレビシエに属する酒類の醸造用酵母、
具体的にはビール酵母、ワイン酵母、清酒酵母等が好ま
しい。具体的には、たとえば、ワイン酵母：ＡＴＣＣ
３８６３７、ＡＴＣＣ ３８６３８、ビール酵母：ＡＴ
ＣＣ ２６２９２、ＡＴＣＣ ２７０４、ＡＴＣＣ ３
２６３４、清酒酵母：ＡＴＣＣ ４１３４、ＡＴＣＣ
２６４２１がある。

【００２６】なお、これらの醸造用酵母の性質について
さらに付言するならば、これらは長年にわたって醸造に
適する形質、すなわち醸造原料液を効率よく発酵するこ
と、香味の良い酒類をつくること、遺伝学的形質が安定
していること等を指標として選抜、純粋培養が重ねられ
てきた結果、遺伝学的には交雑・分離が極めて起こり難
い高次倍数体となっており、生胞子形成能は殆んど完全
に失われている。因みに、実用ビール酵母についてみる
ならば、麦汁中の糖成分であるマルトース、マルトトリ
オースの資化能が高まっている一方クリスタルバイオレ
ット感受性である等、野生味を失っている。

【００２７】形質転換 本発明のＤＮＡ鎖により酵母を形質転換させたときにそ
のα‐ＡＬの産生能が抑制されたということは本発明者
らによってはじめて確認されたことであるが、形質転換
体の作成のための手順ないし方法そのものは、分子生物
学、生物工学ないし遺伝子工学の分野において慣用され
ているものでありうるので、本発明においても下記した
ところ以外のものについてはこれら慣用技術に準じて実
施すればよい。

【００２８】酵母中で本発明ＤＮＡ鎖の遺伝子を発現さ
せるためには、まず酵母中で安定に存在するプラスミド
ベクター中にこの遺伝子をつなぎかえる必要がある。こ
の際に用いられるプラスミドベクターとしては、ＹＲｐ
系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系等種々知られている
ものすべてを用いることができる。これらのプラスミド
ベクターは、文献上公知であるばかりでなく、容易に作
成することができるものである。

【００２９】一方、本発明ＤＮＡ鎖の遺伝子を酵母中で
発現させるためには、それが有する遺伝情報を転写・翻
訳させる必要がある。そのためには、転写・翻訳を制御
するユニットにあたるプロモーターを本発明ＤＮＡ鎖の
５′‐側上流に、ターミネーターを３′‐側下流に、そ
れぞれ組み込めばよい。このプロモーターおよびターミ
ネーターとしては、すでにＡＤＨ、ＧＡＰＤＨ、ＰＨ
Ｏ、ＧＡＬ、ＰＧＫ、ＥＮＯ、ＴＲＰ、ＨＩＰ等のもの
が知られており、本発明でもこれらのいずれをも利用す
ることができる。これらは文献上公知であるばかりでな
く、容易に作成することができるものである。

【００３０】本発明によって得られるべき形質転換体を
選択するためのマーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロ
マイシンＢ、メソトレキセートとスルファニルアミドと
の組合せ、ツニカマイシン、エチオニン、コンパクチ
ン、銅イオンなどに対する耐性遺伝子を用いることがで
きる。

【００３１】本発明のＤＮＡ鎖をより安定的に酵母に保
持させるために、これを酵母のゲノムに挿入することも
できる。この場合には、プラスミドベクターに組み込ま
れた本発明ＤＮＡ鎖のゲノムＤＮＡへの挿入を容易にす
るために別途このプラスミドベクターにゲノムＤＮＡと
高い相同性を有するＤＮＡを導入しておくことが望まし
いところ、このためのＤＮＡとしてはｒＲＮＡ遺伝子、
ＨＯ遺伝子等を例示することができる。

【００３２】このうち、ｒＲＮＡ遺伝子は、１倍体酵母
ゲノム中に約１４０回縦列に反復していることが明らか
にされている（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー、４０、２６１−２７７（１９６９））。この
特徴により、この配列を組み換えのターゲット配列とし
て利用した場合は、他の遺伝子配列を利用した場合と比
較して以下の様な利点がある。 （１）形質転換頻度が上昇することが期待される。
（２）組み込みによるターゲット配列の対応形質の変化
は無視できると考えられる。（３）実施例に示した様な
構造のプラスミド（ｐＩＡＲＬ１）を使用することによ
り、プラスミドの組み込み、ベクター配列の削除という
一連の操作のくり返しで、外来遺伝子を複数個ゲノム中
へ組み込むことが可能となる。

【００３３】また、本発明において酵母の形質転換に使
用し得るＤＮＡ鎖は、それがコードするポリペプチド
が、α‐ＡＬＤＣａｓｅ活性を有する限りにおいては、
図１および図２にわたって示されているＡ〜Ｂのポリペ
プチドと異なるポリペプチドをコードするものであって
もよいことは前記したところである。

【００３４】このようなポリペプチドの具体例として
は、図１および図２にわたって示されているＡ〜Ｂのポ
リペプチドに１つ以上のアミノ酸が挿入または付加した
もの、１つ以上のアミノ酸が欠如するか別のアミノ酸で
置換されたもの、ならびに前記したバシラス・リケニフ
ォルミス、ラクトバシラス・ケーセイ、バシラス・ブレ
ビス、エンテロバクター・クロアカエ、アセトバクター
属細菌（アセトバクター・ランセンス、アセトバクター
・アセチ等）等が産生するα‐ＡＬＤＣａｓｅを、例示
することができる。このようなＤＮＡ鎖は現在の遺伝子
工学技術をもってすれば容易に入手することができよ
う。

【００３５】このようにしてつくったプラスミドによる
酵母の形質転換は、遺伝子工学ないし生物工学の分野で
慣用されている合目的的な任意の方法、例えばスフェロ
プラスト法〔プロシーディングズ・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテ
ッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Proc. Natl. Sci.US
A）、75、1929（1978）〕、リチウムアセテート法〔ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）、
153 163 （1983）〕等によって行うことができる。

【００３６】このようにして得られる本発明の酵母は、
本発明ＤＮＡ鎖によって導入された遺伝情報による新し
い形質（すなわちα‐ＡＬＤＣａｓｅの産生能が付与さ
れ、その結果、細胞内のα‐ＡＬが分解されて、α‐Ａ
Ｌの細胞外への漏出量が低下する）および使用ベクター
由来の形質ならびに場合によって生じているかも知れな
い遺伝子組換時の一部の遺伝情報の欠落による対応形質
の欠落を除けば、そのゼノタイプないしフェノタイプに
おいて形質転換前の酵母と同じである。さらに、ＹＩｐ
型プラスミドを用いて本発明ＤＮＡ鎖を酵母染色体へと
導入した後、不要ベクター配列を削除したビール酵母
（詳細後記実施例（６）参照）は、使用ベクター由来の
形質を持たない。従って、本発明による酵母は、従来の
醸造用酵母と同じである。

【００３７】従って、本発明による酵母は、従来の醸造
用酵母と本質的には全く同一の発酵条件で使用すること
が可能であり、一方で発酵液中でのα‐ＡＬの産生能が
抑制されているので、結果として発酵液のα‐ＡＬ含量
が低く、従ってその処理に要する発酵液の熟成期間を著
しく短縮することができる。

【００３８】

【実施例】(1) α‐ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子の調製 (i) α‐ＡＬＤＣａｓｅ生産株染色体ＤＮＡの精製 エンテロバクター・アエロゲネスＩＦＯ １３５３４
〔財団法人 発酵研究所より入手〕を０．５％ブドウ糖
を含むＬ‐培地で３７℃で１０時間通気培養することに
より、０．５ｇの湿菌体を得た。

【００３９】これを、５mlのサリンＥＤＴＡ緩衝液
〔０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）〕に再懸濁させた。次いで、４００μｇ／mlの
リゾチーム（生化学工業製）、２０μｇ／mlのリボヌク
レアーゼＡ（シグマ社製）で３７℃で２０分間処理し
た。次に、０．５％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）および５００μｇ／mlのプロテイナーゼＫ（シグマ
社製）で６５℃で４時間処理した。これを、予め調製し
た蔗糖密度勾配溶液（５０ｍＭトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）、０．１ＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、０．１
％ ＳＤＳ、５〜２０％蔗糖）に重層し、日立超遠心ロ
ーターＲＰＳ２７で２５ｋｒｐｍ（２０℃）で３時間遠
心処理した。２．５mlずつ分画後、０．４％アガロース
電気泳動法によって分子量を調べることにより、高分子
ＤＮＡを含む画分を集めた。これをエタノール沈殿後、
１mlのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶かし、１リットルのＴＥ緩
衝液に対して透析した。３００μｇの染色体ＤＮＡを得
た。 (ii) コスミド・ライブラリーの作成 (i) で得た染色体ＤＮＡ１２０μｇを制限酵素Ｓａｕ３
ＡＩで約４０ｋｂｐになるように部分分解した。これ
を、予め調製した蔗糖密度勾配溶液（２０ｍＭトリス‐
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴ
Ａ、１０〜４０％蔗糖）に重層し、日立超遠心ローター
ＲＰＳ２７で２６ｋｒｐｍ（２０℃）で２２時間遠心処
理した。０．５mlずつ分画後、０．４％アガロース電気
泳動法によって分子量を調べることにより、約４０ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片を含む画分を集めた。これをエタノール
沈殿後、５００μｌのＴＥ緩衝液に溶かし、１リットル
のＴＥ緩衝液に対して透析した。

【００４０】得られた約４０ｋｂｐのＤＮＡ断片０．２
μｇを、コスミドｐＪＢ８アーム（アマーシャム社製）
０．３μｇとＴ４リガーゼにより連結した。このＤＮＡ
をλＤＮＡ・インビトロ・パッケージング・キット（ア
マーシャム社製）を用いてインビトロ・パッケージング
して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１（Ｆ⁻、ｇｙｒＡ９
６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１？、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ‐
１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４、λ⁻）〔ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.)、
１６６５５７‐５８０（１９８３）：ＡＴＣＣ ３３８
４９〕に形質導入して、コスミド・ライブラリーを得
た。 (iii) α‐ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子保持株のスクリーニン
グ (ii)で得たコスミド・ライブラリーより、α‐ＡＬＤＣ
ａｓｅ活性を示す株を選び出すことによって、α‐ＡＬ
ＤＣａｓｅ遺伝子保持株を得た。

【００４１】具体的には、コスミド・ライブラリーより
３００株を１株ずつ５０μｇ／mlアンピシリンおよび
０．５％ブドウ糖を含むＬ‐寒天培地に植菌し、３７℃
で８時間培養して、それぞれについて酵素活性を測定し
た。すなわち、各株を１mlの３０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ６．２）に懸濁させ、１０μｌのトルエンを
加えて３０秒間激しく攪拌した。この細胞懸濁液につい
てα‐ＡＬＤＣａｓｅ活性をゴットフレドセン（Godfre
dsen）らの方法〔カールスバーグ・リサーチ・コミュニ
ケーション（Carlsberg. Res. Commun.,47、93 (1982)
〕に従って、測定した。この結果、２株のα‐ＡＬＤ
Ｃａｓｅ活性保持株を得た。得られたクローンのプラス
ミドをそれぞれｐＣＡ３およびｐＣＡ１３と命名した。 (iv) α‐ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子ＤＮＡ塩基配列決定 ｐＣＡ１３からサブクローニングを行なうことにより、
制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＶで切り出される１．
４ｋｂｐのＤＮＡ断片がα‐ＡＬＤＣａｓｅをコードし
ていることが示された。このＥｃｏＲＶ切断点にＨｉｎ
ｄ IIIリンカー（ｄＣＡＡＧＣＴＴＧ：宝酒造社製）を
連結し、プラスミドｐＵＣ９（ファルマシア社製）のＢ
ａｍＨＩ及びＨｉｎｄ III切断点の間に挿入したプラス
ミドを、ｐＵＡＲ５と命名した。

【００４２】ＢａｍＨＩ‐ＥｃｏＲＶ断片について、ダ
イデオキシ法〔プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユ
ナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカProc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 74、5463 (1977) 〕及びマクサム・ギル
バート法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74、560 (197
7 ）〕によりＤＮＡ塩基配列を決定した（図１および図
２）。これを解析した結果、７８０ｂｐのオープンリー
ディングフレームが存在した。ここには、アミノ酸２６
０個、分子量２万９千の蛋白質がコードされていると推
定され、この分子量は前記のα‐ＡＬＤＣａｓｅの分子
量とほぼ一致した。

【００４３】(2) α‐ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子の酵母への
導入 (i) ＡＤＨ１プロモーターの取得 サッカロミセス・セレビシエＳ２８８Ｃ〔（α、suc
２、mal 、gal ２、ＣＵＰ１）：バイオケミカル・アン
ド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
ズ (Biochem.Biophys.Res. Commun.)、５０、１８６‐
１９１（１９７３）：ＡＴＣＣ ２６１０８〕より、常
法に従って染色体ＤＮＡを調製した。実施例(1)(ii) と
同様な手法で制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ部分分解によって約
１０ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。これを制限酵素Ｂａｍ
ＨＩで切断したｐＢＲ３２２とＴ４リガーゼによって連
結し、ライブラリーを作成した。ＡＤＨ１遺伝子〔ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.B.C
） 257、3018（1982）〕のコーディング領域の７番目
から３６番目の塩基に対応する合成オリゴマーを³²Ｐで
末端標識し、これをプローブとしてライブラリーよりＡ
ＤＨ１遺伝子を得た。さらに、これを制限酵素ＳｐｈＩ
及びＳａｕ３ＡＩで切断して、ＡＤＨ１遺伝子のプロモ
ーター及びコーディング領域の一部を含む５４２ｂｐの
ＤＮＡ断片を得た。この断片のＳａｕ３ＡＩ末端をエン
ドヌクレアーゼＢａｌ３１で処理してコーディング領域
を完全に欠失させた後、Ｈｉｎｄ IIIリンカー（ｄＣＡ
ＡＧＣＴＴＧ：宝酒造社製）を付加した。このＤＮＡ断
片を、ＡＤＨ１プロモーターとして用いた。 (ii) 発現ベクターの構築及び酵母への導入 酵母内で複製可能なプラスミドＹＥｐ１３〔ジーン（Ge
ne）、 8、121 (1979)：ＡＴＣＣ 37115〕を基本的に用
いて、以下の手順で発現ベクターを作成した。

【００４４】まず、ＹＥｐ１３のＬＥＵ２遺伝子の両端
にあるＳａｌＩ‐ＳａｃＩ断片及びＸｈｏＩ‐ＳｍａＩ
断片を欠失させた。これにより、当プラスミドは制限酵
素ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ、ＳｍａＩおよびＢｇｌIIによる
切断部位をもたず、制限酵素ＳａｌＩによる切断部位を
ただ１箇所もつものとなった。次に、このプラスミド中
のｐＢＲ３２２由来の制限酵素Ｈｉｎｄ III切断点と、
２μｍＤＮＡ由来の制限酵素Ｈｉｎｄ III切断点との間
に合成オリゴヌクレオチド４１ｍｅｒを挿入した。この
合成オリゴヌクレオチドは、制限酵素ＳａｃＩ、Ｓｍａ
Ｉ、Ｂｇｌ IIおよびＸｈｏＩ切断点をもち、また下記
の塩基配列をもつ。本発明では、このプラスミドを、Ｙ
Ｅｐ１３Ｋと命名した。

【００４５】 AGCTTATGATTACGAGCTCCCGGGCAGATCTCGGCCTCGAG ATACTAATGCTCGAGGGCCCGTCTAGAGCCGGAGCTCTCGA 次に、ＹＥｐ１３ＫのＳｐｈＩ‐Ｈｉｎｄ III断片を
(i) で作成したＡＤＨ１プロモーターと置換して、発現
プラスミドベクターｐＡＫ５０３を得た。

【００４６】(1)(iv) で得られたα‐ＡＬＤＣａｓｅ遺
伝子断片を有するプラスミドｐＵＡＲ５を制限酵素Ｈｉ
ｎｃ II で切断し、Ｈｉｎｄ IIIリンカー（ｄＣＡＡＧ
ＣＴＴＧ：宝酒造社製）を付加した後、制限酵素Ｈｉｎ
ｄ IIIおよびＢａｍＨＩで切断した。得られた９４０ｂ
ｐのα‐ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子断片をｐＡＫ５０３のＨ
ｉｎｄ III‐Ｂｇｌ II 断片と置換して、プラスミドｐ
ＡＬ５０３を得た。

【００４７】さらに、Ｇ４１８耐性遺伝子を含むｐＵＣ
‐４Ｋ（ファルマシア社製）を制限酵素ＳａｌＩで切断
し、得られたＧ４１８耐性遺伝子を含む断片をｐＡＬ５
０３のＳａｌＩ切断点に挿入して、目的とするプラスミ
ドｐＡＬＧ５０３４を得た。

【００４８】ｐＡＬＧ５０３４をリチウムアセテート法
〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacterio
l.) 153、 163、(1983)〕によって酵母〔サッカロミセ
ス・セレビシエＳ２８８Ｃの変異株であるＴＤ４（ａ、
ｈｉｓ、ｕｒａ、ｌｅｕ、ｔｒｐ）株及びビール酵母Ｉ
ＦＯ ０７５１株〕に導入したところ、それぞれ１．９
〜３．３Ｕ／mgタンパクおよび１．８〜３．５Ｕ／mgタ
ンパクのα‐ＡＬＤＣａｓｅ活性を示した。

【００４９】ｐＡＬＧ５０３４を含むＩＦＯ ０７５１
株をＳＫＢ１０１と、またｐＡＬＧ５０３４を含むＴＤ
４株をＳＫＢ１０２と、呼ぶこととする。

【００５０】α‐ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子はそのコーディ
ング領域の５′末端に翻訳開始コードンであるＡＴＧが
３個連続しているが、α‐ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子断片の
５′側Ｈｉｎｃ II 切断点からエンドヌクレアーゼＢａ
ｌ３１で処理し、３個のＡＴＧのうち、５′側から１個
あるいは２個除去し、酵母ＴＤ４内で発現させて活性に
対する影響をみた。その結果、得られたα‐ＡＬＤＣａ
ｓｅの酵素活性に大きな差異は認められなかった。

【００５１】(3) 醗酵試験によるダイアセチル生成量低
減の確認 ＴＤ４株ならびにＩＦＯ ０７５１株にα‐ＡＬＤＣａ
ｓｅ遺伝子を導入した２種類の酵母（(2)-（ii）参照）
について醗酵試験を行い、これら導入株の全ダイアセチ
ル（ＴＤＡ：ＴＤＡは、ビシナルジケトン及びアセトハ
イドロキシ酸、主としてＤＡ及びその前駆物質のα‐Ａ
Ｌ、よりなる）生成量が低減することを以下の方法で確
認した。

【００５２】(i) α‐ＡＬＤＣａｓｅ産生酵母の取得 上述のようなα‐ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子を導入した２種
類の酵母（ＳＫＢ１０１株およびＳＫＢ１０２株）およ
びｐＡＬＧ５０３４導入前のそれぞれ原株（ＩＦＯ ０
７５１株およびＴＤ４株）をＹＰＤ培地で培養した。ｐ
ＡＬＧ５０３４導入株については、培地に６００μｇ／
mlとなるようにのＧ４１８を添加した。

【００５３】３０℃で１６時間の振盪培養で生育した各
々の菌体を３０００×ｇで１０分間の遠心分離で集菌
し、蒸留水で洗浄してから、醗酵試験に供した。

【００５４】(ii) 醗酵試験 １１゜Ｐに調製した麦汁に酵母添加率０．５％（ｗｅ
ｔ．ｗ／ｖ）になるように(i) で得た酵母を添加し、充
分に通気したのち、８℃で７日間静置醗酵させた。醗酵
終了後、３０００×ｇで１０分間の遠心処理及び槇過に
よって、菌体を除いた槇液について、ＴＤＡ量（全ダイ
アセチル量）を測定した。

【００５５】結果は、下表に示す通りであった。本発明
の酵母を用いた醗酵では、対照株の時と比較して、ＴＤ
Ａ生成量が大幅に減少したことがわかる。

【００５６】

【表１】 (4) 組み込み型プラスミドの構築 (i) プラスミドｐＩＡＲＬ１の構造と特徴 α‐ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子を酵母内で安定保持させるた
めに、自律増殖能をもたず、染色体に組み込まれること
によってのみ酵母に保持されうるプラスミドｐＩＡＲＬ
１を作成した。このプラスミドは、酵母内マーカーとし
て、Ｇ４１８耐性遺伝子及びβ‐ガラクトシダーゼ遺伝
子を有し、また相同的組換えにより、プラスミドが染色
体ＤＮＡに組み込まれるのに必要な配列として、ｒＲＮ
Ａ遺伝子配列を有する。α‐ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子は、
その５′端及び３′端をそれぞれＡＤＨ１プロモーター
およびＨＩＰ１ターミネーターにはさまれて、ｒＲＮＡ
遺伝子配列内に組み込まれている。このプラスミドは、
これを染色体上のｒＲＮＡ遺伝子内に効率的に組み込む
ために、予めｒＲＮＡ遺伝子配列内にあるＫｐｎＩ切断
点で切断してから形質転換に用いる。その結果、得られ
る形質転換体においては、プラスミド由来及びもともと
染色体に存在したｒＲＮＡ遺伝子配列が重複することに
なる。したがって、この形質転換体を完全培地で増殖さ
せた場合には、重複した配列において遺伝子の再組み換
えがおこって、Ｇ４１８感受性およびＬａｃ^- の菌が出
現する。このうち一部はα‐ＡＬＤＣ ａｓｅ活性を示
し、これらの菌ではＡＤＨ１プロモーター、α‐ＡＬＤ
Ｃａｓｅ遺伝子およびＨＩＰ１ターミネーターのみが染
色体上に残り、他のベクター部分は欠失していることに
なる。 (ii) ｐＩＡＲＬ１の構築 ｐＩＡＲＬ１は、酵母の組み込み型プラスミドであるＹ
Ｉｐ５（Prot.Natl.Acad.Sci.USA、76、1035-1039(197
9))をもとに作成した。

【００５７】まず、Ｇ４１８耐性遺伝子を、ｐＵＣ４Ｋ
（ファルマシア社製）よりＳａｌＩで切り出し、ＹＩｐ
５のＳａｌＩ切断点に挿入して、プラスミドｐＩＧ７を
作成した。

【００５８】続いて、ＨＩＰ１遺伝子プロモーター＋ｌ
ａｃＺ遺伝子断片として、酵母ＨＩＰ１遺伝子（Gene、
38、205-214(1985))の５′非翻訳領域約０．６ｋｂと翻
訳領域約０．４ｋｂを含むＢｇｌ II 断片に、プラスミ
ドｐＭＣ１８７１（ファルマシア社製）からＢａｍＨＩ
断片として得られたｌａｃＺ遺伝子を連結したＢｇｌII
‐ＢａｍＨＩ断片を調製し、これをｐＩＧ７のＢａｍ
ＨＩ切断点に挿入して、プラスミドｐＩＬＧ２を作成し
た。

【００５９】ｒＲＮＡ遺伝子は、ＡＤＨ１遺伝子取得に
用いたライブラリーより、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子（J.
B.C.、252 、8118-8125(1977))の５′末端４〜３２番目
の塩基に対応するオリゴマーを５′末端標識したものを
プローブとして用いて取得した。このうち、５．８Ｓｒ
ＲＮＡ遺伝子および２５ＳｒＲＮＡ遺伝子のそれぞれ一
部を含む約３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、ｐＩＬＧ２のｐ
ＢＲ３２２由来のＥｃｏＲＩ切断点に導入して、プラミ
スドｐＩＲＬ９を作成した。

【００６０】ＡＤＨ１プロモーター＋αＡＬＤＣａｓｅ
遺伝子＋ＨＩＰ１ターミネーター断片は、以下に示した
方法で取得した。

【００６１】α‐ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子を有するプラス
ミドｐＵＡＲ５をＨｉｎｃ II で切断後、Ｂａｌ３１で
処理し、Ｈｉｎｄ IIIリンカーを付加したのち、Ｈｉｎ
ｄIII及びＢａｍＨＩ切断により得られるα‐ＡＬＤＣ
ａｓｅ遺伝子断片をｐＵＣ１２（ファルマシア社製）の
ＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ III切断部位に挿入し、塩基配列
を決定し、α‐ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子の５′上流約４０
ｂｐ及び最初のＡＴＧを欠失したプラスミドｐＡＬＤＣ
３を得た。

【００６２】ｐＡＬＤＣ３をＢａｍＨＩで分解し、Ｋｌ
ｅｎｏｗ断片により平滑末端とした後、Ｈｉｎｄ III分
解により得たα‐ＡＬＤＣ遺伝子断片をｐＡＫ５０３の
Ｈｉｎｄ III−ＳｍａＩ断片と置換して、プラスミドｐ
ＡＬ５０３−３を作成した。さらに、ｐＡＬ５０３−３
のＳｐｈＩ切断点を、ＳｐｈＩ分解後、Ｓ１ヌクレアー
ゼ処理、ＢａｍＨＩリンカー付加により、ＢａｍＨＩ切
断点に変換した後、ＡＤＨ１プロモーター＋α‐ＡＬＤ
Ｃａｓｅ遺伝子断片をＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ II断片とし
て得た。

【００６３】また、ＨＩＰ１遺伝子の３′末端非翻訳領
域約０．９ｋｂと３′翻訳領域約０．１ｋｂを含むＢａ
ｍＨＩ−ＳａｌＩ断片をｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ−Ｓ
ａｌＩ断片と置換したプラスミドを作成し、このプラス
ミドのＢａｍＨＩ切断点に、上記のＡＤＨ１プロモータ
ー＋α‐ＡＬＤＣ遺伝子断片を挿入して、ＡＤＨ１プロ
モーター＋α‐ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子＋ＨＩＰ１ターミ
ネーターの順序で連結されたプラスミドｐＡＬＴ１８を
作成した。

【００６４】ＡＤＨ１プロモーター＋α‐ＡＬＤＣａｓ
ｅ遺伝子＋ＨＩＰ１ターミネーター断片は、ｐＡＬＴ１
８をＳａｌＩ分解後、Ｋｌｅｎｏｗ断片により平滑末端
とし、ＢａｍＨＩリンカーを付加した後、ＢａｍＨＩ分
解により、ＢａｍＨＩ断片として得、ｐＩＲＬ９のＢｇ
ｌ II 切断点に挿入して、目的とするプラスミドｐＩＡ
ＲＬ１を作成した。

【００６５】(5) 酵母へのｐＩＡＲＬ１の導入とα‐Ａ
ＬＤＣａｓｅ遺伝子の発現 前述のようにして作製したｐＩＡＲＬ１を用いて、次の
ようにして酵母を形質転換した。ビール酵母ＩＦＯ ０
７５１株をＹＰＤ培地でＯＤ₆₀₀ ＝１．０になるまで３
０℃で培養し、集菌してリチウムアセテート法によりｐ
ＩＡＲＬ１に接触させた。ｒＲＮＡ遺伝子配列での組換
えを促進するために、形質転換前にｐＩＡＲＬ１をｒＲ
ＮＡ遺伝子配列内のＫｐｎＩ切断点で完全分解し、直線
化してから用いた。ｐＩＡＲＬ１へ接触の後、酵母細胞
１０⁸ 個をＹＰＤ培地１mlに懸濁し、１８時間／３０℃
で振とうした後、抗生物質Ｇ４１８（５００ μｇ／m
l）を含むＹＰＤ寒天培地上に接種した。ついで、プレ
ートを３０℃で３〜５日間インキュベートして、コロニ
ーを得た。これらのコロニー中には、形質転換された細
胞の他に、ｐＩＡＲＬ１非依存的にＧ４１８耐性を獲得
した細胞が含まれているため、つまようじでＸ−ｇａｌ
色素（５′‐ブロモ‐４′‐クロロ‐３′‐インドイル
‐β‐Ｄ‐ガラクトシド）を含むＲｕｂｙらの寒天培地
（メソッド・イン・エンザイモロジー、ｖｏｌ．101 、
p.253 (1983)）に接種し、３０℃で２〜５日インキュベ
ートした。このプレートで青く発色し、β‐ガラクトシ
ダーゼ活性を示したもの（Ｌａｃ⁺ 株）を形質転換体と
判断した。このような細胞は、全て０．８〜１．８Ｕ／
mgタンパクのα‐ＡＬＤＣａｓｅ活性を示した。最も高
いα‐ＡＬＤＣａｓｅ活性を示した形質転換体（ＳＫＢ
１０３株）をＹＰＤ培地で非選択的に８０世代培養し
た。培養後のα‐ＡＬＤＣａｓｅ活性は０．９Ｕ／mgタ
ンパクであり、α‐ＡＬＤＣａｓｅ活性を示す遺伝子が
染色体に安定に組み込まれていることを示した。

【００６６】(6) 不要配列の削除とα‐ＡＬＤＣａｓｅ
遺伝子の発現 (5)で得た形質転換体（ＳＫＢ１０３株）を ＹＰＤ培
地で２０〜３０世代非選択的に培養した後、適宜希釈し
て前述のＸ−ｇａｌを含むＲｕｂｙらの寒天培地に接種
した。このプレートを３０℃で５〜７日間培養し、青色
を発色しない株（Ｌａｃ^- 株）を分離した。これらの細
胞のうち、５００μｇ／mlのＧ４１８を含むＹＰＤ寒天
培地でＧ４１８感受性を示すものを選択した。さらにα
‐ＡＬＤＣａｓｅ活性を示す細胞を得た。これらの細胞
に於いては、(4)-(i) に示したように、重複したｒＲＮ
Ａ遺伝子配列に於いて組 換えが生じ、ＡＤＨ１プロモ
ーター、α‐ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子およびＨＩＰ１ター
ミネーターのみが染色体上に残り、他のベクター部分は
欠失 していると考えられる。これらの細胞のうち、
０．２Ｕ／mgタンパクのα‐ＡＬＤＣａｓｅ活 性を示
した細胞（ＳＫＢ１０４株）を４０世代 ＹＰＤ培地で
培養したが、活性は８０％以上維持された。

【００６７】(7) 発酵試験 (5) で得たＳＫＢ１０３株ならびに (6)で得 たＳＫＢ
１０４株について醗酵試験を行ない、ＴＤＡ生成量が低
減することを以下の方法で確認した。２種の酵母を２０
℃で３日間、１０℃で１０日間ＹＰＤ培地で非選択的に
静置培養し、各々の菌体を３０００×ｇで１０分間の遠
心分離で集菌し、蒸留水で洗浄してから、醗酵試験に供
した。

【００６８】１１°Ｐに調整した麦汁に酵母添加率０．
６％（wet.w/v)になるように酵母を添加し、充分に通気
したのち、１０℃で８〜１０日間静置醗酵させた。醗酵
終了後、３０００×ｇで１０分間の遠心処理及び槇過に
よって菌体をのぞいた槇液について、ＴＤＡ量及び糖度
を測定した。結果は、下表に示すとおりであった。培
養、醗酵とも非選択条件下で行なったにもかかわらず、
対照株に比して顕著なＴＤＡ生成量の減少が見られ、α
‐ＡＬＤＣａｓｅ活性が安定に発現していることが示さ
れた。

【００６９】

【表２】

【００７０】

【表３】 微生物の寄託 本発明に関係する下記の微生物は、通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託されて次の受託番号を得
ている。 (1) ＳＫＢ１０１（ｐＡＬＧ５０３４を含む） ………微工研条寄第１２２８号 (2) ＳＫＢ１０２（ｐＡＬＧ５０３４を含む） ………微工研条寄第１２２９号（１）および（２）の受
託日は、いずれも、昭和６０年１２月１１日である。 (3) ＳＫＢ１０４ ………微工研条寄第１２２７号（３）の受託日は、昭和
６１年１２月２日である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によるＤＮＡ鎖およびアミノ酸配列の前
半を示す説明図である。

【図２】本発明によるＤＮＡ鎖およびアミノ酸配列の後
半を示す説明図である。

【図３】ｐＡＬＧ５０３４の構造を示す説明図である。

【図４】ｐＩＡＲＬ１の構造を示す説明図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】酵母でその基質を発酵させて酒類を製造す
   る方法において、使用する酵母が、α−アセト乳酸脱炭
   酸酵素活性を有していてアミノ酸配列が実質的に下記の
   アミノ酸配列のうちＡからＢまでのものであるポリペプ
   チドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ鎖によって形
   質転換されて、そのα−アセト乳酸産生能が抑制されて
   いる、サッカロマイセス・セレビシエに属する酵母であ
   ることを特徴とする、酒類の製造法。
2. 【請求項２】形質転換が、下記のアミノ酸配列のうちＡ
   からＢまでのポリペプチドをコードする塩基配列を有す
   るＤＮＡ鎖をその遺伝情報が発現可能な状態で含むプラ
   スミドによってなされている、請求項１に記載の酒類の
   製造法。
3. 【請求項３】ＤＮＡ鎖が、下記の塩基配列のうちＡから
   Ｂまでの塩基配列のものである、請求項１または２項に
   記載の酒類の製造法。