FI89724C - Foerfarande foer framstaellning av -galaktosidas producerande jaeststammar, -galaktosidas producerande jaeststam och industriella utnyttjingsmetoder av saodana jaeststammar - Google Patents

Foerfarande foer framstaellning av -galaktosidas producerande jaeststammar, -galaktosidas producerande jaeststam och industriella utnyttjingsmetoder av saodana jaeststammar Download PDF

Info

Publication number
FI89724C
FI89724C FI871584A FI871584A FI89724C FI 89724 C FI89724 C FI 89724C FI 871584 A FI871584 A FI 871584A FI 871584 A FI871584 A FI 871584A FI 89724 C FI89724 C FI 89724C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
galactosidase
yeast
gene
plasmid
strain
Prior art date
Application number
FI871584A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI871584A0 (fi
FI871584A (fi
FI89724B (fi
Inventor
Pirkko-Liisa Suominen
Roy Tubb
Matti Korhola
Original Assignee
Alko Ab Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alko Ab Oy filed Critical Alko Ab Oy
Priority to FI871584A priority Critical patent/FI89724C/fi
Publication of FI871584A0 publication Critical patent/FI871584A0/fi
Publication of FI871584A publication Critical patent/FI871584A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI89724B publication Critical patent/FI89724B/fi
Publication of FI89724C publication Critical patent/FI89724C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C5/00—Other raw materials for the preparation of beer
    • C12C5/004—Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C11/00—Fermentation processes for beer
    • C12C11/003—Fermentation of beerwort
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2465—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase (3.2.1.22)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Pyrrole Compounds (AREA)

Description

89724 MENETELMÄ <X -GALAKTOSIDAASIA TUOTTAVIEN H11VARANTOJEN VAL- 1
MISTAMISEKSI, oi.-GALAKTOSIDAASIA TUOTTAVA HIIVAKANTA JA TÄLLAISTEN HIIVARANTOJEN TEOLLISET HYÖDYNTÄMISMENETELMÄT
α-galaktosidaasi (E.C. 3.2.122) on entsyymi, joka kykenee hydrolysoimaan melibioosin galaktoosiksi ja glukoosiksi. Jotkin hiivalajit (Sac-charomyces cerevisiae var. oleaceus. S. cerevisiae var. oleaginosus.
S. cerevisiae var. uvarum ja S. cerevisiae var. carlsbergensis) tuottavat tätä entsyymiä luonnostaan, mutta teollisesti käytetyt leivin-ja polttimohiivat (jotka kuuluvat Saccharomyces cerevisiae -lajiin) eivät tuota tätä entsyymiä. Melassia käytetään laajalti substraattina tuotettaessa leivin- tai polttimohiivaa tai valmistettaessa alkoholia. Koska leivin- ja polttimohiivakannat eivät tuota a-galaktosidaasia, melassin sisältämä raffinoosi tulee epätäydellisesti käytetyksi.
Tässä keksinnössä on geeniteknisiä menetelmiä hyväksikäyttäen rakennettu uusia teollisesti käyttökelpoisia a-galaktosidaasia tuottavia leivin- ja polttimohiivakantoja. Keksinnössä on rakennettu myös uusia panimohiivakantoja, jotka kykenevät tuottamaan α-galaktosidaasia, mikä tekee mahdolliseksi arvioida oluen pastöroitumisen onnistumista aiempaa paremmin, α-galaktosidaasia koodaavan geenin siirtäminen leivin-, polttimo- tai panimohiivaan mahdollistaa myös omien kantojen tai esimerkiksi valmistetun oluen merkitsemisen. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
____ Leivin- ia polttimohiiva
Melassia käytetään laajalti substraattina leivinhiivan ja polttimohii-van valmistuksessa ja eräissä maissa etanolin valmistamiseen hiivafer-mentoinnin avulla. Kaupallisten juurikasmelassien tyypillinen analyysi (19 melassia) on esitetty seuraavassa taulukossa: keskiarvo vaihtelurajat
Kuivapaino, % 80,9 72,15-88,34
Sakkaroosi, % karsta 60,0 55,2 - 67,1
Raffinoosi, % karsta 1,55 0,00-4,20
Inverttisokeri, % karsta 0,41 0,00 - 3,41 Pääasiallinen hiilihydraatti on sakkaroosi, jonka hiiva metaboloi glukoosiksi ja fruktoosiksi invertaasin katalysoiman hydrolyysin kautta seuraavan kaavion mukaisesti: 89724 2 _g Γ Is ό-O^s -s
«H
W
0 *J H a f>§ i « f T8 1 sl sj. S I * |A sj- 1 sTV^ i °
A
A
S
CM
g/^L -H
/ rCV w w /2 o g O · O <y ·— „ν5Γ 1 s a s i Λ 1 V1® £ •H U ^ g
CM
Λγ v ·;; u S g
::· f O I
As I g- Γ- fK? t Λ * * υ h
P-> ** 1 M
3- tfL O
^ Γ |j
,r>j—I—.»rV
-.. SV s ~ ϊΓΧ^Γ S I s
... XJ
•H
V)
O
4-> .* <0
«J
ÖO
. . I
TS
B 9 7 2 4 i
Mukana on myös mitattavia määriä (noin l %) raffinoosia. Koska lotvinhilvaja polttiraohiivakannat erittävät invertaasia, ne voivat hydrolysoida raffinoosin mellbloostksi ja fruktoosiksi. Useimmat leivin- ja polttimo-hiivakannat (Van der Walt'in, 1970, The Yeasts, 555-718, luokittelun perusteella Saccharomyces cerevlsiae) eivät kuitenkaan eritä a-galaktosi-daasla eivätkä kykene hydrolysoimaan melibioosia galaktoosiksi ia glukoosiksi. Tällaiset kannat voivat käyttää raffinoosista 1/3 hyödyksi, kun taas sekä invertaasia että oc-galaktos idaas i a tuottavat kannat voivat käyttää raffinoosin täydellisesti. Mel+-leivin- tai polttimokantojen konstruointi siirtämällä niihin MEL-geeni, joka mahdollistaa solunulkotsen α-galaktosldaasin tuottamisen, on houkuttelovaa siksi, että metaanien sisältämä hiilihydraatti voitaisiin käyttää täydellisemmin. Tällöin voidaan odottaa, että (i) raelasseista saadaan suurempi hiiva- tai etanolisaanto (ii) voidaan pienentää tai kokonaan poistaa kustannukset, jotka johtuvat melibioosin osuudesta biologiseen hapenkulutukseen (BOT!) melasseja fermentaatioalustana käyttävien tehtaiden jätevesissä.
Leivinhiiva on laajalle levinnyt tuote. Hiivan valmistajat ovat siten havainneet erittäin vaikeaksi suojata tai säilyttää omat kantansa, jotka kilpailijat voivat saada käyttöönsä, koska tuote on tarkoitettu yleiseen myyntiin. Tämä on johtanut kantojen kontrolloimattomaan vaihtamiseen, mikä estää valmistajien huomattavan panostamisen kantojen parantamiseen. Olemme rekombinantti-DNA -tekniikan avulla siirtäneet MELl-geenin leivinhiivakan-nan LEU2-geenlln. Näin saadaan uusi kanta, jossa on ainutlaatuinen DNA-• pätkä, joka voidaan tunnistaa käyttämällä kloonattua HELI ja/tai LEU2- geeniä koettimena (koettimina). Tällä menetelmällä voidaan "merkitä’‘ : : tuotantokanta siten, että voidaan helposti paljastaa, jos kilpailijat käyttävät sitä, ja näin ollen merkatun kannan käyttö voidaan myös estää.
"Ale”-tyyppistä olutta tuottavat panimokannat (Saccharomyces cerevlsiae) eivät muodosta α-galaktosidaasia, kun taas "lager"-tyyppistä olutta tuotta-vat kannat (S. cerevlsiae var. nvarum tai carlshergensls) kykenevät tähän _ : (so. ne ovat Mel+). u-Oalaktosldaasin mukanaolo "lager"-oluissa on osoi tettu ja on ehdotettu, että melibiaasiaktiivlsuuden mittaamista käytetään S9724 4 menetelmänä, jolla määritetään olueeseen kohdistuneiden pastörointi yksiköiden määrää (Enevoldsen, 1981, Carlsberg. Res.Commun. 4ίκ 37-42; Enevoldsen, 1983, J. Am. Soc. Rrew. Chemist' s 6_3: 183-184)
Pastöroinnin standardisointi on tärkeä oluen laadun kontrolloinnin kannalta. Tällä hetkellä ei kuitenkaan voida yleisesti soveltaa melibiaasin inaktivoitumlsmenetelmää käsittelyn kvantitoimiseen, koska entsyymiä muodostuu pieniä määriä tai "ale”-kannoi1la ei lainkaan. Viemällä rekombi-nantti-DNA -teknologian avulla kloonattu MEL-geeni panimokantoihin on mahdollista lisätä muodostuneen α-galaktosidaasin määrää 1a ulottaa F.nevoldsenin menetelmä muihinkin olutlnatuihtn kuin lager-olueeseen 1a sekä parantaa menetelmän herkkyyttä ja toistettavuutta. Koska merkittävä osa α-galaktosidaasista pysyy hiivan soluseinämässä, panimofermentaatioista saatuun ylimääräiseen hiivaan rikastuu α-galaktosidaasia, kun fermentaati-ossa käytetään kantoja, joilla on korkea a-galaktosldaasiaktilvisuus. Tällaisia rikastettuja hiivoja voidaan käyttää α-galaktosidien hydrolysoi-miseen elainrehuissa, ja niillä on sen vuoksi entistä suurempi arvo rehujen ainesosana.
α-galaktosidaaeia koodaavan geenin siirto panimohiivakantoihin tekee mahdolliseksi oman panimohiivakannan merkitsemisen kuten on kuvattu lelvin-hiivojen yhteydessä, lisäksi se tekee mahdolliseksi mvös valmistetun oluen merkitsemisen. Tämän keksinnön mukaisesti α-galaktosidaasi voidaan havaita suoraan oluesta, mikä on yksinkertainen tapa osoittaa, että a-galaktosi-daasia tuottavaa kantaa on käytetty oluen valmistuksessa. Panimohiivo Ien Mel+-ominaisuutta koodaa geeni, joka eroaa olennaisesti MELl-geenlstä (se ei muodosta DNA-DNA-hybrIdiä hybridisoitaessa; Tubb, R., Liljeström, R., Torkkeli, T. & Korhola, M. (1986) 13th International Conference on Yeast Genetics and Molecular Riology, Ranff, Alberta, Canada 1986, Yeast 2 (Spec. Iss.) 1986 S396). Siksi iopa lager-olut voidaan merkitä siirtämällä MEL1-geeni lager-hiivakantaan. Tämä tosin edellyttää, että käytössä on immunologinen menetelmä MELl-geenln koodaaman u-galaktosidaasin tunnistamiseksi.
u-GalakiosIdaasi on hyödyllinen entsyymi, jolla on käyttöä esimerkiksi (i) kun hydrolysoidaan raff Innosta ja näin helpotetaan sakkaroosin kiteytymistä juurikassokerin puhdistamisen aikana (Ohara d. & Hashimoto 3. 1976, Sugar 89724 s
Technol.Rev. 4: 209-258), (il) kun pienennetään korkeampien α-galaktosid ien (stakioosi, verbaskoosi) määriä rehuissa ja elintarvikkeissa kuten soijajauhossa tai soijapohjaisessa maitokorvikkeessa (Schuler R., Mudgett R.E. & Mahoney R.R. 1985, Enzyme Microb.Technol. _7: 207-211). Näiden galaktosidien suuret määrät ravinnossa aiheuttavat liiallista puhkuisuutta, mikä on pääasiallinen rajoitus siemenpalkokasveista saatujen elintarvikkeiden 1a rehujen hyödyntämiselle.
Saccharomyces-kantojen käyttämistä kaupallisen α-galaktosidaasln tuottamiseen on jo aikaisemminkin harkittu (Vitobello, V., Rranduzzi, P. A Oimini N. United States Patent 4174167; Olivieri, R. Panselli, P., Fascettl, E. 6 Ciuffolotti, P. United States Patent 4431737). Jotta entsyymi valmiste!ta voitaisiin käyttää sokerinvalmistusprosesseissa ne eivät saa sisältää invertaasia. Tästä syystä on ehdotettu käytettäväksi luonnossa esiintyviä S. cerevlslae var. oleaceous tai S. cerevlsiae var. oleaginosns Mel+Suc--kantoja. Osoitamme, että rekombinantti-DNA -tekniikan avulla saadut Mel+ hiivakannat tuottavat a-galaktosidaasia 2-8 kertaa niin paljon kuin luonnossa esiintyvät kannat. Tällaiset kannat sopivat α-galaktosidaasi-entsyyniin kaupalliseen tuottamiseen.
Transformanttien saanti hiivakannoista edellyttää hyvää menetelmää, jolla valitaan ne hiivasolut, jotka ovat ottaneet sisäänsä haluttua DNA:ta. Saccharomyces cerevlslae:11a suoritetuissa perustutkimuksessa tämä suorite-• taan tavallisesti laittamalla rekombinantti-DNA:han selektoitavissa oleva markkerigeeni (esim. LEU2, HIS3, URA3, TRP1), joka komplementoi vastaavan auksotrofisen mutaation valitussa vastaanottajassa. DNA-käsittelyn jälkeen :protoplastit tai solut maljataan alustalle (tai alustaan), joka ei sisällä ;‘j'· vastaanottokannan vaatimaa kasvutekijää. Sen vuoksi vain transformantit kykenevät kasvamaan.
Panimo-, leivin-, polttimo- ja viinihiivat ovat tavallisesti villihiivo ja, • · so. niillä ei ole mitään auksotrofisiä vaatimuksia. Näihin kantoihin ei ole käytännöllistä eikä toivottavaakaan tehdä auksotrofisiä mutaatioita. Teollisuushiivojen transformointi vaatii siten sellaisten dominoivien markkerigeenien käyttämistä, jotka voidaan selektoida vi111tyyppistä 89724 6 polyploiditaustaa vastaan. Esimerkiksi on käytetty geenejä, jotka antavat resistenssin aminoglykosidi-antibioottia G418 (Webster, T.D & Dickson, R.C. (1983). Gene 2£ 243-252) tai kupari-ioneja vastaan (Henderson, R.C.A., Cox B.S. and Tubb, R. (1985) Current. Genetics S.: 133-138). Toinen mahdollisuus on käyttää geeniä, joka antaa kyvyn kasvaa uudella substraatilla. Osoitamme, että hiivan MEL1-geeni voidaan siirtää teol-lisuushiivakantoihin selektoimalla transformantit alustalla, joka sisältää melibioosia ainoana hiililähteenä. Kromogeenista X-a-galaktosidi-substraattia (5 -bromi - 4 -kloori - 3 -indolyyli-a -D-galaktosidi) sisältävän alustan käyttäminen vahvistaa, että mahdolliset Mel+-transformantit tuottavat α-galaktosidaasia. Χ-α-galaktosidia voidaan lisätä alustaan, jota alussa käytetään transformanttien saamiseen, ja/tai myöhempien tarkista-mistestien aikana. Mel+-pesäkkeet muuttuvat sinivihreiksi X-a-galaktosidia sisältävällä alustalla. Tämä on siten helppo tapa tunnistaa ne transformantit, joissa siirretty DNA on stabiili. Epästabiilit transformantit muodostavat Χ-α-galaktosidia sisältävillä alustoilla valkoisia pesäkkeitä. Koska, MEL-geeni on hiivakantoihin siirrettynä helposti selektoitavissa ja geenin läsnäolo voidaan helposti osoittaa käyttämällä X-a-galak-tosidia, MEL-geenin käyttöä markkerigeeninä voidaan laajalti soveltaa rekombinantti-DNA-tekniikassa.
Χ-α-galaktosidia voidaan käyttää myös α-galaktosidaasin havaitsemiseen oluesta ja ale Mel" ja lager Mel"1"-kantojen erottamiseen (Tubb, R. and Liljeström, P. (1986), A colonycolour method which differentiates α-galaktosidase-positive strains of yeast. J.Inst.Brew. 92: 588-590).
Julkaisussa Post-Beittenmiller, M.A. et al.. Molecular and Cellular Biology, (1984), 4, s. 1238-1245, MELl-geeni on kloonattu sen transkriptionaalisen ekspression ja säätelyn tutkimiseksi haploidiin, laboratoriohiivakantaan, joka ei ole teollisesti hyödynnettävissä. Tutkimuksessa todetaan, että kasvun aikana ekspressiota säädellään transkription kautta ja että ekspression sekä perus- että indusoidut tasot riippuvat toiminnallisesta GAL4-proteiinista. Tutkimuksen mukaan ekspressi- S9724 on perustasoon GAL80s-alleeli ei vaikuta, mutta se estää ekspression indusoidun tason.
Julkaisussa Ruohola et ai.. FEMS Microbiology Letters, (1986), 34, s. 179-185 tarkastellaan MEL1:n induktion kinetiikkaa, joka muistuttaa muiden GAL4:n säätelemien geenien induktion kinetiikkaa. Galaktoosin lisäys nostaa MELl:n transkription tasoa.
Julkaisun Liljeström, P., Nucleic Acids Reasearch, (1985), 13. s. 179-185 mukaan määritettiin MELl-geenin täydellinen nukleo-tidisekvenssi.
Julkaisussa Meaden, P. et ai.. Gene, (1985), 34/ s· 325-334 DEX-geeni, joka tuottaa ekstrasellulaarista amylo-0!-l,4-glu-kosidaasia, on kloonattu Saccharomvces diastaticukselta.
Keksinnössä rakennetut kannat M12E-2, M20E-1 ja N12E-1 on 27.3.1986 tallennettu National Collection of Yeast Cultures -kokoelmaan vastaavilla tallennusnumeroilla NCYC 1567, NCYC 1568 ja NCYC 1569.
Keksintöä on seuraavassa kuvattu esimerkkien ja piirustusten avulla, joissa:
Kuvio 1 esittää pALKl2-plasmidin rakentamista,
Kuvio 2 esittää kantojen MK270 ja M12E-2 Southern blot-kuviota, kun koettimena on käytetty A) pBR 322-DNA:ta, B)MBL1-DNA:ta ja C)LEU2-DNA:ta: kaista 1: MK270-DNA, kaista 2: M12E-2-DNA,
Kuvio 3 esittää pALK20-plasmidin rakentamista,
Kuvio 4 esittää pALK52-plasmidin rakentamista,
Kuvio 5 esittää melibioosin kerääntymistä leivinhiivan kasvun aikana mitattuna HPLC:llä A) 10 tunnin B) 16 tunnin kasvun aikana.
Kuvio 6 esittää lisääntynyttä hiivasaantoa kasvatettaessa hiivaa ylimääräisessä raffinoosissa, " —-
Kuvio 7A esittää α-galaktosidaasin kokonaistuottoa hiivan kasvun aikana eri kannoilla ja kantojen kasvukäyriä, Kuvio 7B esittää kasvualustaan erittyvää a-galaktosidaasiak-tiivisuutta ajan funktiona eri kannoilla,
Kuvio 8 esittää pALK22- ja pALK23-plasmidien rakentamista.
89724 8 Tämän keksinnön kohteena on uusien teollisesti käyttökelpoista a-galaktosidaasia tuottavien hiivakantojen rakentaminen ja tällaisten hiivakantojen teolliset hyödyntämismenetelmät: Tämän keksinnön kohteena on α-galaktosidaasia tuottavien leivin-ja polttimohiivakantojen rakentaminen, jotka kykenevät käyttämään hyväkseen melassin sisältämän raffinoosin; melässi on laajalti käytetty substraatti kaupallisessa hiivan tuotannossa ja sitä käytetään substraattina myös tuotettaessa alkoholia.
Lisäksi keksinnön kohteena on teollisesti käyttökelpoisten panimo-hiivakantojen rakentaminen, jotka tuottavat α-galaktosidaasia tai joiden kykyä tuottaa o-galaktosidaasia on parannettu. Tämä tekee mahdolliseksi mitata herkällä menetelmällä oluen pastöroitumisen onnistumista ja lisää ylijäämäpanimohiivan arvoa rehuihin lisättynä.
Keksinnön kohteena on myös uusien teollisesti käyttökelpoisten hiivakantojen rakentaminen, joiden α-galaktosidaasin tuottotaso on korkeampi kuin luonnostaan of-galaktosidaasia tuottavien hiivakantojen tuottotaso, α-galaktosidaasia koodaavan geenin siirto Sue' (invertaasinegatiivisiin) hiivakantoihin mahdollistaa invertaasit-tomien entsyymivalmisteiden tuottamisen.
Tämän keksinnön mukaista ovat paitsi edellä mainittujen hiivakantojen rakentaminen myös itse hiivakannat sekä tällaisten hiivakantojen käyttö.
Tämän keksinnön mukaisesti on myös kehitetty menetelmä kaupallisten leivinhiivakantojen tai oluen "merkitsemiseksi", mikä suojaa kehiteltyjä kantoja joutumasta kilpailijan käyttöön.
Tämän keksinnön mukaisesti on edelleen kehitetty menetelmä yhdis-telmä-DNA:n viemiseksi teollisiin hiivakantoihin ja stabiilien transformanttien saanti.
«9724 9
Esimerkki L
g-galaktosidaasi -geenin sisältävän leivlnhilvakannan rakentaminen E. coll DH-l-kantaan (F~, endAl, hsdR17, supE44, thl-1, recAl, gyrA96, relAl) rakennettiin Saccharomyces cerevlslae var. uvarum-kannan ATCC9080, jossa on MELl-geenl, genoralkirjasto kuten Ruohola, H., Liljeström, p., Torkkeli , T., Kopu, 11., Lehtinen, P., Kalkkinen, N., la Korhola, M. (19Rft) FEMS Microbiology Letters 34: 179-185 ovat kuvanneet. Genontln kokonais-DNA pilkottiin osittain Sau3A~entsyymlllä ja ligoitiin BamHl-avattuun shuttle-vektoriin YEpl3 (Broach, J., Strathern, J. ja Hicks, J. (1979) Gene 8: 121-133). Saatu hiiva-DNA -kirjasto käsitti noin 11.000 Ampr-nesäkettä,
Ja hiiva-DNA -insertin keskimääräinen koko oli 7,8 kb.
MELl-geeni eristettiin tästä kirjastosta kömpiementoimalla mel1-18-mutaatio J. Hopperilta saadussa P18-la -kannassa (MATa, mell-18, leu2-3, 112, trpl, ural; Post-Beittenmiller, M., Hamilton, R. ja Hopper, .1. (lq841 Mol. Cell. Biol. 4: 1238-1245). Alkuperäinen klooni, joka antoi kvvvn tuottaa α-galaktosidaasiaktiivisuutta, sisälsi 8,5 kb pitkän insertin _· (plasmidi pALK2). Komplementointianalyysin perusteella MELl-geenl naikal- . . listettlin 2,8 kb BamHI/SalI- palaan. MELl-geenln tävdellinen DNA-sekvenssi on julkaistu (Liljeström, P. (1985) Nucl. Acids. Res. 13: 7257-7268: :··’ : Sumner-Smith, M., Bozzato, R. , Skipper, N., Davies, R. ja Hopper, .1. (1985) ' Gene 36: 333-340 ja Eurooppa-patenttihakemus 0208706).
: : Monikopioplasmidi11a (pALK2), jossa MELl-geeni on 6.5 kb pitkässä hiivan- DNA-fragraentissa YEPl3-vektorissa transformoitiin (Hinnen, A:, Hicks, J.B.
& Fink, G.R. 1978. Proc·Nat 1. Acad. Sei (USA) 75_: 1929-1933) leivinhi ivakanta MK270, jota käytetään kaupallisesti sekä leivinhiivan että etanolin valmistamiseen. Tämä kanta fermentoi seuraavla sokereita: galaktoosi, glukoosi, ··-· fruktoosi, mannoosi, maltoosi, sakkaroosi ja raffinoosi, mutta ei seuraavia: laktoosi, melibloosi ja inuliini. Kanta assimiloi seuraavla sokereita: trehaloosl, α-metvyl i-D-glukosMl, glvseroli, turmioosi ja meletsitoosi, mutta ei seuraavia: Inuliini, sellobioosi ja D-g1ukonaatti.
89724 10 MEL1-geenia käytettiin dominoivana selektiomarkkerina ja transformantit selektoltlln mellbloosia sisältävillä rainimimaljoilla. Transformointifrek-venssl oil 60-80 transformanttla/pg DNA:ta. Kun näitä transformantteja kasvatettiin epäselektilvlslllä mellblooslfermentolnnln indikaattorimal-joilla, Mel+-fenotyypln havaittiin olevan pysymättämän. Mel+-pesäkkeen soluista vain 20-30 % oli Mel+, so. sisälsi plasmldln pALK2. Mel+-transfor-mantlt voidaan osoittaa niiden tuottaman diffuntoltumattoman slnl-vlhreän värin avulla Χ-α-gal-pltoisella agar-alustalla (kts. jäljempänä). Tätä samaa testiä käytetään myös transformanttlen stablillsuuden määrittämiseen.
Pysyvämplen transformanttlen valmistamista varten konstruoitiin plasmldl pALK12 (kuvio 1), joka Integroitiin MK270-kannan kromosoraaaliseen DNArhan.
2.8 kb:n pituinen Sali- BamHl fragmentti, joka sisälsi MELl-geenln eristettiin pALK2-plasmidista ja ligoitiin Sali- ja BamHl-kohtlen väliin pBR322:ssa. Saatu plasmldl pALK7 sisälsi yhden ainoan tunnlstuskohdan restriktioentsyymille EcoRl. Tämä kohta poistettiin avaamalla plasmldl EcoRl:llä, täyttämällä kohesiiviset päät ja uudelleenligoimalla. Tätä plasmidia kutsuttiin pALKll:ksl. 2.8 kb:n pituinen Bgl2-Bgl2-fraRmenttl, joka sisälsi LEU2-geenln, eristettiin YEpl3:sta ja llgoltlin pALKll:n ainoaan BamHl-leikkauskohtaan.
Plasmidlsea pALK12 sijaitsevaa hiivan LEU2-geeniä käytettiin homologisena sekvenssinä plasmldln pALK12 ja MK270-genomin väliseen rekombinaatioon. pALK12-plasmidin liittyminen LEU2-lokukseen ohjattiin linearisoimalla plasmldl EcoRI-entsvvmlllä. joka avaa LEU2-geenln keskeltä. Transformantit valittiin jälleen mellbloosia sisältävillä minimimaljoilla. Näiden trans-formanttien Mel+-fenotyypln pysyvyys tutkittiin ja havaittiin, että 12 transformantista 4 oli 100 %:sesti stabiili (so. ei havaittu Mel~- pesäkkeitä) koeolosuhteissa. Yhtä näistä, jolle annettiin nimeksi M12E-2, tutkittiin edelleen.
Plasmldln pALKl2 liittyminen M12E-2 -kantaan vahvistettiin Southern blot-kokeella (kuvio 2)(Maniatls, T., Fritsch, E.F. & Sambrook, J. (1982) Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory pp. 382-389). MK270-kannasta ja M12E-2 -kannasta eristettiin kromosomaalinen DNA ja pilkottiin Bgl2-restrlktloentsyymlllä, joka ei suorita katkaisua pALK12- sekvensseissä.
89724 n
Alkuperäisessä leivinhiivassa MK270 ei havaittu mitään homologlaa MEL1-spesifisen tai pBR322-spesifisen koettimen kanssa. M12E-2 -kannalla havaittiin odotetusti uusi juova, joka hybridisoituu MELl-speslfisen. pBR322-speslfisen ja LEU2-spesifisen koettimen kanssa. LEU2-speslfinen koetin tunnistaa 3 juovaa MK270-kannassa johtuen luultavasti Bglll restriktioent-syymin leikkauskohtien polymorfismista polyploidlssa MK270-hiIvassa. Samat juovat olivat yhä mukana M12E-2 -kannassa osoittaen, että liittyminen ei ollut tapahtunut LEU2-kohtaan tai todennäköisemmin, että integroituminen ei ollut tapahtunut kaikkiin kromosomi III:n homologeihin polyploidissa MK270-kannassa. Liittyminen on tapahtunut erittäin todennäköisesti LEU2-kohdassa, koska on osoitettu, että plasmldlen katkaiseminen restriktloendonukleaasil-la, joka tunnistaa yhden ainoan kohdan tämän plasmldin hiivageenissä (LEU2-plasmidissa pALK12), lisää transformointitehokkuutta sekä ohjaa liittymisen tähän geeniin.
Esimerkki 2
Sellaisen leivlnhlivakannan rakentaminen, joka sisältää a-galaktosldaasi-geenln, mutta el sisällä bakteerista peräisin olevaa plasmldl-DNA:ta (M20E-1)
Hiivagenomiin yhdistetty DNA sisältää M12E-2 transformantissa sekvenssejä bakteeriplasmidista pBR322. Eräissä sovellutuksissa (esim. leivlnhllva) tämän bakteeri-DNA:n poistaminen voi olla toivottavaa.
Jotta MEL-geeni voitiin liittää leivinhiivan kromosomistoon ilman pBR322-sekvenssejä, rakennettiin plasmldi pALK20 (kuvio 3). LEU2-geenl, joka sisältyy 2.3 kb:n pituiseen Xhol-Sall-fragmenttlin, eristettiin plasmidlsta YEpl3 ja ligoitiin pALKll-plasmidin ainoaan Sali-leikkauskohtaan. Näin saatu pALK13 avattiin BamHl-restriktioentsyymi1lä ja LEU2-geeni YEpl3-plasmidista ligoitiin BamHl-kohtaan 2.8 kb:n pituisena Bgl2-fragmenttlna.
HELl-geenl integroitiin hiivakannan MK270-kromosomiin käyttämällä pALK20-plasmidin EcoRl-fragmenttia, joka sisältää ainoastaan hiivan DNA:ta (hiivan LEU2- ja MELl-geenit). Jälleen saatiin stabiileja transformantteja ja yhtä näistä, M20E-1 tutkittiin edelleen.
89724 12
Esimerkki 3
Sellaisen leivlnhlivakannan konstruointi, joka sisältää g-galaktosidaasla koodaavan geenin autonomisesti replikoitavassa plasmldlssa (pALK 52 / MK270)
Rakennettiin uusi leivinhiivakanta, joka sisältyä a-galaktosldaaslgeenln, mutta ei sekvenssejä bakteeriplasmidlsta pBR322 llgolmalla MELl-geeni autonomisesti repllkoltuvaan plasmldlln.
pALR52-plasmldi (kuvio 4) rakennettiin seuraavalla tavalla. Plasmidlsta YEpl3 eristettiin Hind3-Pstl-fragmentti, joka sisälsi 2p-replikaatio-origon. Käyttämällä Sall-linkkereitä tämä fragmentti llgoltiin pBR322-plasmidin Sali-kohtaan. Saatua plasmldla kutsuttiin pALK42:ksl. 2.8 kb:n pituinen Sall-BamHl-fragmentti, joka sisälsi MELl-geenin, ligoltlln plasmldlssa pALK42 sijaitsevan 2p-fragmentin Ndel-leikkauskohtaan. Saatua plasmidia kutsuttiin pALK52:ksi. pALK52-plasmidin 4.7 kb:n pituinen Sali-fragmentti, joka sisälsi MELl-geenin ja 2p-replikaatio-origon, eristettiin ja ligoitiin renkaaksi, jolla transformoitiin MK270-kannan soluja käyttäen MELl-geenlä selektoivana markkerina. Yksi transformanteista pALK52/MK270 osoittautui hyvin stabiiliksi, plasmidin menetys oli < 0.1 % / sukupolvi.
Esimerkki 4
Mel* leivinhlivakantojen (M12E-2 ja M20E-1) kyky käyttää hyväkseen melassin rafflnoosla
Leivinhiivan (MK270) Mel+-johdannaisista (M12E-2 ja M20E-1) tutkittiin niiden kyky käyttää melassin raffinoosia. Olosuhteet valittiin niin, että jäljiteltiin kaupallista leivinhiivan tuotantoa.
Kantojen MK270, M12E-2 ja M20E-1 lähtöviljelraiä kasvatettiin anaerobisesti galaktooeipitoisessa minimialustassa tai melasslpltolsessa minimlalustassa. 10 g näistä viljelmistä saatua hiivaa siirrostettlin sen jälkeen 1,8 litraan vettä. Melassialustaa syötettiin vähitellen siten, että 16 tunnin kasvun aikana sitä kului noin 700 ml. Fermentaatioalusta sisälsi litraa kohti: 14,55 g (NHt,)2SOl,, 2,43 g NH4tH2POl4, 0,61 g MgCl‘6H20, 0,12 mg biotiinia ja 5 % sokeria vastaavan melassimäärän.
39 724 l3
Kuten on esitetty kuviossa 5, melibioosia kerääntyy, kun kantaa MK270 kasvatetaan melassilla, mikä osoittaa että α-galaktosidi-sidos raffinoosissa ei hydrolysoidu. Muodostuneen melibioosin määrä (0,07 %) viittaa siihen, että mukanaoleva raffinoosi muuntuu täydellisesti fruktoosiksi ja meli-bioosiksi. Se, että melibioosia ei keräänny melassilla kasvun aikana viittaa siihen, että raffinoosi on hajonnut täydellisesti käyttökelpoisiksi sokereiksi (fruktoosi, glukoosi ja galaktoosi). M12E-2 transformanttia käytettäessä melibioosia ei voitu lainkaan havaita (kuvio 5). Sama koskee M20E-l-transformanttia. Melassilla kasvatetun M12E-2 transformantin tuottama α-galaktosidaasiaktiivisuus on annettu taulukossa 2.
Taulukko 2. α-galaktosidaasin tuotanto kasvatettaessa hiivoja melasstalus-talla.
Kanta Kasvatusaika (h) Kokonais- Aktiivisuus aktiivisuus (UB) alustassa (UB) M12E-2 10 2200 430 16 3380 530 MK270 10 0 0 16 0 0 Tässä tapauksessa siirroste kasvatettiin galaktoosilla, jonka tiedetään indusoivan α-galaktosidaasin synteesiä (Rew, O.M. & Douglas, H.C. (1976), J. Bacteriol. 125: 33-41). α-Galaktosidaasin kokonaisaktiivisuus kuitenkin kasvaa melassilla tapahtuvan kasvun aikana, mikä viittaa siihen, että α-galaktosidaasia muodostuu jatkuvasti. Kun melassla käytettiin siirrosteen kasvattamiseen, melibioosia ei taaskaan kerääntynyt kasvatettaessa M12E-2, mikä viittaa siihen, että myös näissä olosuhteissa muodostuu raffinoosin täydelliseen hydrolysoimiseen riittävä määrä a-galaktosidaasla.
Olemme seuraavalla tavalla osoittaneet, että raffinoosin sisältämä melibioosi käytetään hiivan kasvuun: Eri määriä raffinoosia lisättiin edellä kuvattuun fermentointialustaan ja ferraentointi suoritettiin 8 9 724 14 kuten aiemmin. Kuten kuviosta 6 näkyy M12E-2 tuotti huomattavasti enemmän biomassaa kuin MK270 samoissa olosuhteissa. Kuten oli odotettavissa lisäraffinoosi lisää myös MK270:n biomassasaantoa. Tämä johtuu raffinoosin sisältämän fruktoosin käytöstä. M12E-2 voi käyttää myös raffinoosin melibioosin ja siksi biomassasaanto on suurempi kuin MK270:llä.
Esimerkki 5 g-galaktosldaaslgeenln ekspressolntiln kykenevät polttlmohiivakannat
Koska leivinhiivakantoja käytetään joskus myös polttimoissa, M12E-2 ia M20E-1 kantojen tapaisia kantoja voidaan käyttää myös melassien fermentoin-neissa, jolloin hiilihydraatit hyödynnetään paremmin ja näin lisätään etanolisaantoa. MEL-geenl voidaan vaihtoehtoisesti siirtää kuvatulla tavalla erikoistuneisiin polttimohiivoihin, kuten kaupalliseen kantaan DCL "M", jota on aikaisemminkin geneettisesti manipuloitu käyttämällä rekombinantti-DNA:ta (Bussey, H. & Meaden, P. (1985) Current genetics _9: 285-291). Taulukossa 3 on verrattu M12E-2 ja M20E-l-kantojen ja muiden kantojen kykvä tuottaa α-galaktosidaasia standardoiduissa olosuhteissa (esimerkki 6).
Esimerkki 6 g-galakto8ldaasigeenin ekspressolntiln kykenevien panimohlivakantojen rakentaminen
Jatkokokeessa MELl-geeni liitettiin "ale"-tyyppiseen panimokantaan NCYC 1245 käyttämällä plasmidia pALK2 (ei-integroiva) ja integroivan transformoinen avulla (pALK12). Taulukosta 3 näkyy, että integroivan transformaation avulla saatu stabiili Mel+-transformantti (N12E-1) kykenee tuottamaan paljon enemmän g-galaktosidaasia kuin "lager”-tyyppinen panimohiiva-kanta (NCYC1324, joka on luonnostaan Me1+). "Lager"-tyyppisten panimokanto-jen tuottamat suhteellisen alhaiset määrät voidaan päätellä myös Enevoldsenin julkaisemista arvoista (Enevoldsen (1981) Carlberg. Res. Commun. 46^: 37-42; Enevoldsen (1985) J.Am.Soc.Brew. Chemist's 63^: 183-184). Vaikkakin "lager"-tyyppiset panimokannat ovat jo Mel+, voi olla hyödyllistä lisätä myös niiden kykyä tuottaa α-galaktosidaasia käyttämällä kloonattua MEL-geeniä. Tässä tapauksessa ei ole kuitenkaan mahdollista siirtää C 9 7 2,; 15 MEL-geenlä kuvatulla tavalla selektoimalla suoraan Mel+-transformantit. Vaihtoehtoisessa strategiassa voidaan käyttää hiivan CUPl-geenlä (antaa kupariresistenttiyden) transformantti en saantikeinona. CUPl-geenln käyttö selektio järjestelmänä, jolla liitetään PEX-geenl "lager”-tyvpisiin panimo-kantoihin, on kuvattu kirjallisuudessa (Meaden, P.G. & Tubb, R.S. (1985). In: Proceedings of the 20th European Brewery Convention Congress, Helsinki pp. 219-226. IRL Press, London).
Taulukko 3. Eri kantojen indusoitu kokonais-a-galaktosidaaslaktiivisuus. (U/ml soluja Klett-100 tiheydessä)
Kanta α-galaktosidaasiaktiivisuus Kokonaisaktiivisuus yhteensä kokonaismäärästä M12E-2:ssa (%) soluun si- alustassa toutunut(%) (%) ATCC 9080 184 60 40 14,4 M12E-2 1279 74 26 100 M20E-1 113 72 28 8,8 pALK52/MK270 970 ei tehty ei tehty 76 pALK4/MK270 920 ei tehty ei tehty 72 NRRLY12056 597 86 14 46,7 NRRLY12057 684 72 28 53,5 N12E-1 169 55 45 13,2 NCYC1324 8 100 nd* 0,6 1453-3A 549 67 33 42,9 nd* = ei havaittavaa märää Esimerkki 7
Uusi menetelmä hiiva- ja bakteerikantojen merkitsemiseksi
Esimerkissä 1 konstruoidut kannat voidaan helposti tunnistaa Southern hlot-menetelmällä (Manjatis, T., Fritsch, E.F. & Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning, a laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory pp. 382-389). Tämä on osoitettu kuviossa 2 käyttämällä kantaa M12E-2. M12E-2 kannan DNA:ssa, mutta ei MK270-kannan DNArssa, nähdään uusi DNA- fragmentti, joka voidaan tunnistaa MEL1, LEU2 ja/tai pBR322-koettimen avulla. Tämän r Q 7 ? 4 16 fragmentin mukanaolo erottaa M12E-2-kannan kalkista luonnollisista S» cerevlsiae kannoista. Samoin kalkki muut täsä hakemuksessa rakennetut kannat on merkitty uudella DNA-fragmentilla, joka voidaan tunnistaa MEL1 ja/tal LEU2-koettimellä. Samalla tavoin mikä tahansa hltvakanta voitaisiin merkitä käyttämällä MELl-geenlä. Tämä käsittää myös kannat, joissa jo on MEL-geenl, mikäli MELl-geenl ohjataan uuteen paikkaan kromosomissa (esim. LEU2-lokukseen kuten esimerkissä 1). Yhdistäminen uuteen paikkaan johtaa uuteen restriktiofragmenttiin, joka voidaan tunnistaa Southern blot-mene-telmällä.
MELl-geenlllä voidaan myös merkitä bakteeri- ja homekantoja, kun plasmldi varustetaan bakteeri- tai horaeperäisellä DNA-palalla, mikä mahdollistaa homologisen rekomblnaation vastaanottavan kromosomin ja integroitavan plasmidln välillä.
Esimerkki 8
Yhdlstelmä-DNA -tekniikoita hyväksikäyttäen rakennettujen uusien hiivakan-tojen g-galaktosidaasin tuotanto MELl-geenln koodaama α-galaktosidaasi hydrolysoi melibioosia, raffinoosia ja stakioosia ja sen vuoksi todennäköisesti myös korkeampia α-galaktosideja (esim. verbaskoosia). Taulukossa 4 on verrattu M12E-2-kannan tuottaman α-galaktosidaasin entsyymiaktiivisuuksia näitä eri substraatteja vastaan. Stakioosia hydrolysoivaa aktiivisuutta tarvitaan, kun halutaan pienentää suuria α-galaktosidi-pitoisuuksla rehuissa ja elintarvikkeissa.
Taulukko 4. Hydrolysoituneen sokerin määrä mg/h/aktiivisuusyksikkö1
Melibioosl 50 - 70
Raffinoosi 11 - 30
Stakioosi 6-20
Aktiivisuusyksikkö on se määrä entsyymiä, joka hydrolysoi mikromoolin PNPG:tä minuutissa +30OC:ssa ja pH 4,5:ssä 17 .> / L S' MELl-geenln koodaama α-galaktosidaasl hydrolysoi 0.1 mg staktoosia / h / UpNPG 10 % soijajauhossa, kun lämpötila on +40°C, pH 5.5 ja entsyymin annostelu 10 öp^pg/g soijajauhoa.
Kuvio 7 A havainnollistaa α-galaktosidaasin tuoton kinetiikkaa ja muodostuneita kokonaismääriä eri kantojen kasvun aikana YP+gal5%+glys3%4EtOH2%-alustalla. M12E-2 (leivinhiivan Mel+-johdos) tuottaa suurimman entsyymimää-rän. Tässä tapauksessa rekombinantti-DNA -tekniikkaa käyttämällä on saatu 8-kertainen kasvu entsyymin tuotossa. Alkuperäinen kanta ATCC9080 tuottaa α-galaktosidaasia vain 103 yksikköä, kun taas M12E-2 kanta tuottaa 8xl03 yksikköä. M12E-2-kannan tuottama suurempi entsyymimäärä johtuu todennäköisesti MELl-geenln suuremmasta kopioluvusta tässä kannassa. Southern blot-menetelmässä (kuvio 2) uusi LEU2:een hybridisoituva juova on tummempi kuin alkuperäiset juovat, mikä osoittaa että integroidun plasmidin kopioluku on suurempi kuin LEU2-geenin. Tätä tukee myös uuden juovan suuri koko (>30 kb). Jos LEU2-lokukseen olisi integroitunut vain yksi pALK12-plasmidikopio, uuden juovan odotettu koko olisi 16-19 kb.
S. cerevisiae var. oleaceus NRRL Y 12056 (US-patentti 4 376 167) tuottaa lähes yhtä suuren määrän entsyymiä kuin M12E-2-kanta, mutta paljon hitaammin. M12E-2 tuottaa 5xl03 yksikköä a-galaktosidaasia 8 tunnissa, kun taas NRRL Y 12056-kannalta tähän kuluu 24 tuntia (kuvio 7 A). Kantoihin NRRL Y 12056 ja NRRL Y 12057 (US-patentti 4 431 737) verrattuna M12E-2-kannalla on toisena etuna se, että se erittää 3 kertaa enemmän a-galaktosidaasia kasvatusalustaan (kuvio 7 B). Tämä on tärkeää, jos entsyymi tullaan puhdistamaan käytetystä alustasta, mikä saattaa olla toivottavaa esimerkiksi valmistettaessa α-galaktosidaasia leivinhiivatuotannon sivutuotteena.
Kannan NRRL Y 12057 (US 4 431 737) lisäämistä soijajauhoon on ehdotettu. Tämä hiiva sisältää 1.2 x 105 α-galaktosidaasiaktiivisuusyksikköä (vastaa US-patentissa 4 431 737 mainittua 11000 yksikköä) yhtä mikrobisolujen kuiva-ainegrammaa kohti. Kun kantaa M12E-2 on kasvatettu fermentorissa kuten on kuvattu esimerkissä 4, tämä hiiva sisälsi 7.8 x 105 yksikköä yhtä hiivasolujen kuiva-ainegrammaa kohti.
Edellä jo mainittiin, että sokeriteollisuuden sovellutuksissa a-galak-tosidaasivalmisteiden ei tulisi sisältää invertaasia. Tätä tarkoitusta varten MELl-geenl voidaan siirtää S. cerevlsiaen Suc“-mutanttiin a-galak- t. : i π n ' 2 I L 'v tosidaasln tuoton lisäämiseksi. Saatavissa oleva S. cerevlsiae Mel+ Suc“-mutantti 1453—3A (Sue MAL2 MEL1 his4 leu2, Veast Genetic Stock Center, Berkeley, California) tuottaa jo lähes saman määrän entsyymiä kuin luonnossa esiintyvät Suc~Mel+ hiivat-NRRL Y 12056 ja NRRL Y 12057 (taulukko 3).
MELl-geenl voidaan siirtää 1453-3A kantaan käyttämällä pALK2 tai pALK12-plasmldeja ja LEU2-geenlä selektiomarkkerina, koska 1453-3A on Leu2~-mutantti. Tämä todennäköisesti lisää 1453-3A -kannan tuottamaa a-galaktosi-daasimäärää, koska edellä on jo osoitettu, että MELl-geenln koploluvun kasvu näyttää lisäävän myös entsyymin tuottoa: vert. M12E-2-kantaa M20E-1 ja ATCC9080-kantoihin taulukossa 3. Korkea α-galaktosldaasln tuottotaso Suc“-kannan avulla voidaan myös saavuttaa inaktivoimalla SUC-geeni (-geenit) Mel+-kannassa kuten Ml2E-2-kannassa.
Edellä kuvattuun elintarvikkeiden täydentämiseen voidaan käyttää hiivaa, joka itse sisältää α-galaktosldaasiaktiivisuutta eoluselnämässä. Tämä on houkuttelevaa erityisesti ylimääräisen panlraohilvan hyödyntämisen kannalta. Taulukossa 3 on jo esitetty, että suurin osa (yli 70 %) leivinhiivan Mel+-transforraantin (so. kannat M12E-2 ja M20E-1) tuottamasta a-galaktosi-daasista on sitoutunut soluun. "Lager"-kannassa NCYC1324 (luonnostaan Mel+) kaikki havaittu α-galaktosidaasiaktiivisuus oli soluun sitoutunutta, mutta entsyymin määrä oli hyvin alhainen. "Ale"-kannan Mel+-johdannaisessa (N12E-1) soluun sitoutuneen entsyymin määrä (55 % kokonaismäärästä) on yli 10-kertainen verrattuna luonnostaan NCYC1324-kannassa olevaan määrään.
Esimerkki 9 q-galakto8ldaasin tuotannon parantaminen α-galaktosidaasin tuottoa rekombinantti-DNA -tekniikalla käsiteltyjen kantojen avulla voidaan kehittää edelleen. Olemme tässä yhteydessä osoittaneet, että α-galaktosidaasiekspression määrä glukoosialustalla kasvaa kun osia MELl-geenln säätelyalueelta on poistettu. Kts. taulukko 5, jossa on annettu α-galaktosidaasin kokonaisaktiivisuudet 5'-deletoidun plasmidin pALK22 tai pALK23 sisältävällä kannalla.
19 7 / L 4
Villityyppistä MELl-geeniä ei transkripoida glukoosin läsnäollessa (Post-Beittenmiller, M.A., Hamilton, R.W. & Hopper, J.E., 1984, Mol. Cell. Biol. _4: 1238-1245). Kaikissa taulukon 5 kannoissa MEL1 geeni on moni-kopioisessa pJDB207-plasmidissa (Beggs, J.D. 1981 In: Williamson, R. (ed.) Genetic engineering 2. Academic Press, New York pp. 175-203). Plasmidi pALK4 sisältää noin 2,8 kb:tä pitkän MELl-alueen (Ruohola, H., Lilieström, P., Torkkeli, T., Kopu, H., Lehtinen, P., Kalkkinen, N. & Korhola, M.
(1986) FEMS Microbiology Letters 34: 179-185), jonka uskotaan sisältävän kaikki säätelysekvenssit. α-galaktosidaasiaktiivisuus (31 yksikköä, taulukko 5) glukoosialustalla johtuu luultavasti MELl-geenin korkeasta kopio-luvusta, mikä johtaa normaalin glukoosirepresslon osittaiseen välttämiseen. Kaksi muuta plasmldia pALK22 ja pALK23 sisältävät vastaavasti vain 243 emäsparin ja 175 emäsparin pituiset MEL1 5’-alueet. Nämä plasmidit on rakennettu seuraavalla tavalla (kuvio 8): pALK7-plasmidl avattiin Ndel-restriktioentsyymillä ja ligoitiin uuudelleen, mistä tuloksena seurasi pienemmän Ndel-fragmentin deleetio (plasmidi pALK21). Tämän plasmidin suurempi Hind3-Pstl-fragmentti ligoitiin Hlnd3-Pstl-avatun pJDR207-plasmidin kanssa, jotta saatiin selektiomarkkeri (LEU2) ja hiivan repli-kaatio-origo uuteen plasmidiin. Tätä plasmldia kutsuttiin pALK22:ksi. Jotta saataisiin rakennettua plasmidi, jossa on vielä lyhyempi MEL1 5’-alue, Accl-Accl -fragmentti, joka sisälsi MELl-geenin, eristettiin plasmidista pALK7 ja kohesiiviset päät täytettiin. Tämä fragmentti ligoitiin Sal 1:ΐ1ä avattuun pJDB207-plasmidiin, josta kohesiiviset päät myös oli täytetty.
Tätä plasmldia kutsuttiin pALK23:ksi.
Taulukossa 5 on osoitettu, että MELl-expression normaali säätely on tuhoutunut kannoissa, joissa on edellä mainitut plasmidit. Ekspressio on varsin korkea glukoosin läsnäollessa (148 yksikköä ja 441 yksikköä); pALK23/YF135 kannalla jopa 14 kertaa korkeampi kuin pALK4/YF135 kannalla. Koska näiden plasmidien vektoriosa on sama, MELl-geenin kopioluvussa ei pitäisi olla mitään merkittävää eroa, vaan MELl-geenin suurempi ekspressio plasmissa pALK23 todennäköisesti johtuu muutetusta 5*-alueesta.
MELl-ekspresslon lisäämiseksi vieläkin suuremmaksi voidaan käyttää suuritehoisia promoottoreita (esimerkiksi PGK ja ADH, Dobson, M.J. Tuite, M.F., Roberts, N.A., Kingsman, A.J., Kingsman, S., Perkins, R.E., Conroy, S.C., Dunbar, B. & Fothergill, L.A., 1982, Nucl.Acids Res. 10: 2625-2637;
Ammerer, G. In: Methods in Enzymology 101. Academic Press, New York pp. 192-201) ohjaamaan sen transkriptiota.
·. * r t r ' 20 yli ' v
Taulukko 5. α-galaktoeidaasin kokonaIsaktiivisuudet 5' deletoldullla kannoilla. (U/ml soluja Klett-100 tiheydessä)
Kanta Hl111lähde glc 5 % gal 5% + glys 3% + EtOH 2% pALK4/YF135* 31 1146 pALK22/YFl35 148 688 pALK23/YFl35 441 866 *YF 135, a, leu 2-3, 112, hls 3-11, 15 (YF 135-hlivakanta on saatu Yhdistelmä DNA-menetelmä -kurssilla Ottavassa elokuussa 1982.
MENETELMIÄ ot-galaktosldaa8lmäärIen mittaaminen α-galaktosidaasimäärät mitattiin oleellisesti Kew'in ja Douglas'in kuvaamalla tavalla (Kew, O.H. & Douglas, H.C. (1976) J. Bacteriol. 125: 33-41). Hiivasoluja kasvatettiin sopivalla alustalla ja otetut näytteen jäähdytettiin jäillä. Kokonaisaktiivisuuksia mitattaessa käytettiin näytteenä viljelmää sellaisenaan. Lopullinen reaktioseos (450 μΐ) sisälsi 50 mM p-nitrofenyll-oc-D-galaktopyranosidla (PNPGal) puskuroituna pH-arvoon 4,0 31 mM sitruunahapolla ja 39 mM KHjPO^tlla. Reaktiot suoritettiin +30°C:ssa ja pysäytettiin lisäämällä 4,5 ml 0,1 M Na2C03, pH 11,2. Sen jälkeen solut poistettiin sentrifugoimalla ja p-nitrofenoli supernatantissa mitattiin aallonpituudella 410 nm. Entsyymiaktiivisuuden yksikkö määritettiin entsyymimääräksi, joka hydrolysoi 1,0 nmol substraattia minuutissa edellä kuvatuissa olosuhteissa.
Minlmialustat sisälsivät 0,67 % YNB-alustaa (Difco) ja 2 % sokeria ja ne oli kiinteytetty 2 %:lla agaria. Protoplasteja regeneroitaessa lisättiin IM sorbitolia. Rikkaana perusalustana käytettiin YP-alustaa (1 % Racto-hiivauute, 2 % Bacto-peptoni). Fermentoinnin indikaattorialustan avulla erotettiin kannat, jotka fermentoivat tai eivät fermentoi melibioosia.
f, r. <— r. ·. 21
Pii -i pH-muutoksesta johtuen melibioosia fermentoivat kannat muuttavat Indikaattorin keltaiseksi. Tämä alusta sisälsi 1 % Bacto-hiivauutetta, 2 % Racto-peptonla, 2 % melibioosia, 2 % Bacto-agarla ja 8 ml/1 0,4 % bromi-kresoli-purpura-liuosta. X-a-gal:ia käytettiin maljoilla seuraavalla tavalla: Χ-α-gal liuotettiin Ν' N'-dimetyyliforraamidiln (20 mg/ml) ja 0,1 ml tätä liuosta levitettiin agar- maljoille (esim. YPT), YP+galaktoosi, YNB+mellbloosl).
Plasmldit ja hllvakannat on edellä esitetyissä esimerkeissä rakennettu käyttäen MELl-geenlä Saccharomyces cerevlsiae var. uvarum -lajista. Huomattakoon, että Saccharomyces-hlivan MEL-geenln käyttö on vain esimerkki. MELl-geenin käyttö DNA-koettlmena on osoittanut, että Saccharomyces suvussa on joukko MEL-geenejä. Muut MEL-geenlt voidaan erottaa ONA-sekvenssin erojen perusteella käyttämällä restriktloentsyymi-käsittelyä ja Southern-hybridisointla (Tubb, R., Liljeström, P., Torkkeli, T., Korhola, M. (1986) 13th International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, Banff, Alberta, Canada 1986, Yeast 2 (Spec. Iss.) 1986 S396). Näin ollen on mahdollista käyttää MEL-geenlä, joka on kloonattu muista Saccharomyces-kannoista, muista hiivoista tai mistä tahansa organismista, joka kykenee tuottamaan sopivaa a-galaktosidaasia. Keinot, joilla heterologiset geenit saadaan ekspressoitumaan hiivassa, ovat ilmeisiä rekombinantti-DNA -teknologian ammattilaisille.

Claims (19)

  1. 22 /· .-s r*- r\ ''yli \
  2. 1. Menetelmä α-galaktosidaasia tuottavien teollisesti käyttökelpoisten Saccharomyces cerevisiae -leivinhiiva-, -polttimohiiva- tai -panimohiivakantojen valmistamiseksi eristämällä α-galaktosidaasia koodaava geeni sellaisesta hiivakannasta, jolla on tämä geeni luonnostaan, liittämällä geeni toimivasti vektoriin, joka kykenee transformoimaan ja kahdentumaan leivin-, polttimo- tai panimohiivasoluissa, siirtämällä saatu rekombinanttiplasmidi tai osa siitä leivin-, polttimo- tai panimohiivasoluihin itsenäisesti repli-koituvana plasmidina tai integroimalla ainakin osa sitä solun kromosomiin homologisella rekombinaatiolla, selektoimal-la stabiileja α-galaktosidaasia tuottavia hiivaklooneja käyttämällä mainittua α-galaktosidaasia dominanttimarkkerina ja tekemällä näistä puhdasviljelmiä, tunnettu siitä, että eristetty geeni on Saccharomyces cerevisiae var. uvarum-lajin MELl-geeni ja että valmistettu leivin-, polttimo- tai panimohiivakanta sisältää ainakin osan seuraavista plasmi-deista: pALK2 (sivu 8), pALK4 (sivu 18), pALK12 (kuvio 1), pALK20 (kuvio 3), pALK22 (kuvio 8) , pALK 23 (kuvio 8) tai pALK52 (kuvio 4) tai minkä tahansa näistä plasmideista yhdistelemällä saadun plasmidin.
  3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiivakanta, johon cx-galaktosidaasigeeni on siirretty, ei tuota invertaasia.
  4. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnet-tu siitä, että hiivakanta, johon α-galaktosidaasigeeni on siirretty, on MK270.
  5. 4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiivakanta, johon α-galaktosidaasigeeni on siirretty, on NCYC 1245.
  6. 5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnet-tu siitä, että hiivakanta, johon α-galaktosidaasigeeni on siirretty, on YF135. r. r*. »7 r. * y / c. '> 23
  7. 6. Patenttivaatimuksen 1 tai jonkin patenttivaatimuksen 3-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiivakanta on M12E-2 (NCYC 1567), M20E-1 (NCYC 1568), N12E-1 (NCYC 1569), pALK22/YF135, pALK23/YF135, pALK4/MK270 tai pALK52/MK270.
  8. 7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu dominanttimarkkeri detektoidaan käyttämällä χ-α-galaktosidia substraattina selektointi- tai skriinausalustassa.
  9. 8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu dominanttimarkkeri detektoidaan käyttämällä melibioosia ainoana hiilen lähteenä. 9. a-galaktosidaasia tuottava Saccharomyces cerevisiae -leivinhiiva-, -polttimohiiva- tai -panimohiivakanta, tunnettu siitä, että se sisältää α-galaktosidaasigeenin toiminnallisesti liitettynä yhdistelmä-DNA-tekniikoilla itsenäisesti replikoituvaan plasmidiin tai integroituna kromosomiin homologisen rekombinaation avulla ja että se on valmistettu minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-8 mukaisella menetelmällä.
  10. 10. Menetelmä α-galaktosidaasigeeniä teollisesti käyttökelpoisessa leivin-, polttimo- tai panimohiivassa ekspressoi-maan kykenevän plasmidin rakentamiseksi eristämällä a-galak- . . tosidaasia koodaava geeni sellaisesta hiivakannasta, joka sisältää tämän geenin luonnostaan, liittämällä geeni toiminnallisesti vektoriin, joka kykenee transformoimaan ja kahdentumaan leivin-, polttimo- tai panimohiivasoluissa, tunnettu siitä, että geeni on Saccharomyces cerevisiae var. uvarum MEL1 -geeni ja että rakennettu plasmidi sisältää ainakin osan plasmideista pALK2 (sivu 8), pALK4 (sivu 18), pALK12 (kuvio 1), pALK20 (kuvio 3), pALK22 (kuvio 8), pALK23 (kuvio 8) tai pALK52 (kuvio 4) tai että se on mikä tahansa näistä plasmideista muodostettu yhdistelmä. : 24
  11. 11. Plasmidi, joka kykenee transformoimaan teollisesti käyttökelpoisia leivin-, polttimo- tai panimohiivasoluja ja ekspressoimaan α-galaktosidaasigeeniä näissä soluissa, tunnettu siitä, että α-galaktosidaasigeeni on Saccharomyces ce-revisiae var. uvarum -lajin MEL1-geeni ja että plasmidi sisältää ainakin osan plasmideista pALK2 (sivu 8), pALK4 (sivu 18), pALK12 (kuvio 1), pALK20 (kuvio 3), pALK22 (kuvio 8), pALK23 (kuvio 8) tai pALK52 (kuvio 4) tai että se on mikä tahansa näistä plasmideista muodostettu yhdistelmä.
  12. 12. Patenttivaatimuksen 9 mukaisen leivin- tai polttimohii-vakannan käyttö raffinoosin tai korkeampien a-galaktosidien hyödyntämiseksi raaka-aineesta menetelmässä, jossa hiivakan-taa kasvatetaan käyttäen raffinoosia tai korkeampia a-galak-tosideja sisältävää raaka-ainetta.
  13. 13. Leivin- ja polttimohiivakantojen M12E-2 (NCYC 1567), M20E-1 (NCYC 1568), pALK4/MK270 tai pALK52/MK270 käyttö raffinoosin tai korkeampien α-galaktosidien hyödyntämiseksi raaka-aineesta menetelmässä, jossa ainakin yhtä näistä hii-vakannoista kasvatetaan käyttäen raffinoosia tai korkeampia α-galaktosideja sisältävää raaka-ainetta.
  14. 14. Patenttivaatimuksen 9 mukaisen leivin- tai polttimohii-vakannan käyttö α-galaktosidaasientsyymin tuotantoon menetelmässä, jossa hiivakantaa kasvatetaan sopivissa olosuhteissa ja kerätään ja puhdistetaan saatu a-galaktosidaasi-entsyymi.
  15. 15. Kantojen M12E-2 (NCYC 1567), M20E-1 (NCYC 1568), pALK22/YF135, pALK23/YF135, pALK4/MK270 tai pALK52/MK270 käyttö α-galaktosidaasientsyymin tuotantoon menetelmässä, jossa ainakin yhtä näistä hiivakannoista kasvatetaan sopivissa olosuhteissa ja kerätään ja puhdistetaan saatu a-ga-laktosidaasientsyymi.
  16. 16. Patenttivaatimuksen 9 mukaisen panimohiivakannan käyttö oluen saamien pastörointiyksiköiden mittaamisessa menetel- ,.,, - 25 mässä, jossa olut valmistetaan käyttäen panimohiivakantaa, joka tuottaa α-galaktosidaasia enemmän kuin panimohiivakan-nat kykenevät luonnostaan tuottamaan tätä entsyymiä, olut pastöroidaan ja mitataan oluessa jäljellä olevan a-galak-tosidaasiaktiivisuuden määrä.
  17. 17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen käyttö, jonka mukaisesti oluen a-galaktosidaasiaktiivisuus mitataan käyttäen x-a-gal-kromogeenista substraattia.
  18. 18. Patenttivaatimuksen 11 mukaisen plasmidin, joka sisältää α-galaktosidaasigeenin, käyttö itsenäisesti replikoitu-vana plasmidina tai integroimalla sen sisältämä a-galak-tosidaasigeeni mikro-organismin kromosomiin homologisen re-kombinaation avulla ja havaitsemalla geeni hybridisaation avulla, tunnettu siitä, että geeni on Saccharomyces cere-visiae var. uvarum -kannan MEL1-geeni.
  19. 19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että merkitty mikro-organismikanta on hiivakanta. ·: Patentkrav
FI871584A 1986-04-11 1987-04-10 Foerfarande foer framstaellning av -galaktosidas producerande jaeststammar, -galaktosidas producerande jaeststam och industriella utnyttjingsmetoder av saodana jaeststammar FI89724C (fi)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI871584A FI89724C (fi) 1986-04-11 1987-04-10 Foerfarande foer framstaellning av -galaktosidas producerande jaeststammar, -galaktosidas producerande jaeststam och industriella utnyttjingsmetoder av saodana jaeststammar

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI861548 1986-04-11
FI861548A FI861548A0 (fi) 1986-04-11 1986-04-11 Nya jaeststammar vari med gentekniska foerfaranden infoerts en -galaktosidasgen och foerfaranden foer industriellt utnyttjande av dylika jaeststammar.
FI871584 1987-04-10
FI871584A FI89724C (fi) 1986-04-11 1987-04-10 Foerfarande foer framstaellning av -galaktosidas producerande jaeststammar, -galaktosidas producerande jaeststam och industriella utnyttjingsmetoder av saodana jaeststammar

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI871584A0 FI871584A0 (fi) 1987-04-10
FI871584A FI871584A (fi) 1987-10-12
FI89724B FI89724B (fi) 1993-07-30
FI89724C true FI89724C (fi) 1993-11-10

Family

ID=8522447

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI861548A FI861548A0 (fi) 1986-04-11 1986-04-11 Nya jaeststammar vari med gentekniska foerfaranden infoerts en -galaktosidasgen och foerfaranden foer industriellt utnyttjande av dylika jaeststammar.
FI871584A FI89724C (fi) 1986-04-11 1987-04-10 Foerfarande foer framstaellning av -galaktosidas producerande jaeststammar, -galaktosidas producerande jaeststam och industriella utnyttjingsmetoder av saodana jaeststammar

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI861548A FI861548A0 (fi) 1986-04-11 1986-04-11 Nya jaeststammar vari med gentekniska foerfaranden infoerts en -galaktosidasgen och foerfaranden foer industriellt utnyttjande av dylika jaeststammar.

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP0241044B1 (fi)
AT (1) ATE155529T1 (fi)
CA (1) CA1334511C (fi)
DE (1) DE3752091T2 (fi)
DK (1) DK188087A (fi)
FI (2) FI861548A0 (fi)
IE (1) IE80696B1 (fi)
NO (1) NO871518L (fi)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1339101C (en) * 1986-06-03 1997-07-29 Nicolaas Overbeeke Production of guar alpha-galactosidase and immunologically related alpha-galactosidases by host organisms transformed with recombinant dna methods
CN110331115A (zh) * 2019-08-08 2019-10-15 河南省科学院生物研究所有限责任公司 一种用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基及其应用
CN117587057A (zh) * 2023-11-27 2024-02-23 苏州泓迅生物科技股份有限公司 一种大片段dna的酵母高效组装方法及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3122216A1 (de) * 1981-06-04 1982-12-23 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur herstellung eines mikroorganismus, welcher (alpha)-galactosidase, aber keine invertase bildet, so erhaltener mikroorganismus und seine verwendung

Also Published As

Publication number Publication date
NO871518D0 (no) 1987-04-10
EP0241044A3 (en) 1989-05-24
FI861548A0 (fi) 1986-04-11
ATE155529T1 (de) 1997-08-15
DK188087A (da) 1987-10-12
EP0241044A2 (en) 1987-10-14
DE3752091D1 (de) 1997-08-21
IE80696B1 (en) 1998-12-30
IE870872L (en) 1987-10-11
DE3752091T2 (de) 1998-02-26
NO871518L (no) 1987-10-12
FI871584A0 (fi) 1987-04-10
EP0241044B1 (en) 1997-07-16
CA1334511C (en) 1995-02-21
FI871584A (fi) 1987-10-12
FI89724B (fi) 1993-07-30
DK188087D0 (da) 1987-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0201239B1 (en) Process for the isolation of fermentation products
JP4307563B2 (ja) 糸状菌、特にアスペルギルス属に属する糸状菌のアグロバクテリウム媒介性形質転換
EP0260404B1 (en) Amylolytic enzymes producing microorganisms constructed by recombinant DNA technology and their use for fermentation processes
Watari et al. Construction of flocculent brewer's yeast by chromosomal integration of the yeast flocculation gene FLO1
WO1986007091A1 (en) Yeast expressing glucoamylase
DK175566B1 (da) DNA-Streng, der koder for alfa-acetolactat-decarboxylase, gærsvamp transformeret med DNA-strengen, fremgangsmåde til fremstilling af en gærsvamp med nedsat alfa-acetolactat-producerende evne og fremgangsmåde til fremstilling.....
EP0257115A1 (en) Amylolytic enzyme producing microorganisms, constructed by recombinant DNA technology, and their use in fermentation processes
Liljestr� m-Suominen et al. Construction of a stable α-galactosidase-producing baker's yeast strain
EP0147198B1 (en) Fermentation processes and their products
US5055401A (en) Construction of new α-galactosidase producing yeast strains and the industrial application of these strains
FI89724C (fi) Foerfarande foer framstaellning av -galaktosidas producerande jaeststammar, -galaktosidas producerande jaeststam och industriella utnyttjingsmetoder av saodana jaeststammar
Saito et al. Breeding of a new type of baker's yeast by δ-integration for overproduction of glucoamylase using a homothallic yeast
US5151354A (en) Fermentation processes using amylolytic enzyme producing microorganisms
US5108925A (en) Process for accelerated beer production by integrative expression in the PGK1 or ADC1 genes
Kimura et al. Production of HM-1 killer toxin in Saccharomyces cerevisiae transformed with the PDR4 gene and δ-sequence-mediated multi-integration system
KR100430638B1 (ko) 신규 효모 유전자
GB2247238A (en) Alpha-glucosidase gene from Candida tsukubaensis cloned and expressed in Saccharomyces cerevisiae
JPH07121215B2 (ja) 酒類の製造法
Liu et al. Integrativna ekspresija gena za glukoamilazu u soju pivskoga kvasca Saccharomyces pastorianus
JPWO2003016525A1 (ja) デンプンからアルコールを製造する方法

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: R!HM ENZYME FINLAND OY

MM Patent lapsed

Owner name: ROEHM ENZYME FINLAND OY