JPH07147971A

JPH07147971A - 選択マーカー遺伝子を含まない組換え体株、その作製方法及びその株の使用

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Publication number: JPH07147971A
Application number: JP6170877A
Authority: JP
Inventors: Gerardus Cornelis Maria Selten; コルネリスマリアセルテンヘラルデュス; Bart Willem Swinkels; ウィーレムスウィンケルスバート; Gorcom Robertus Franciscus Maria Van; フランシスクスマリアファンホルコムロベルテュス
Original assignee: Gist Brocades NV
Current assignee: Gist Brocades NV
Priority date: 1993-07-23
Filing date: 1994-07-22
Publication date: 1995-06-13
Anticipated expiration: 2021-10-18
Also published as: EP0635574B1; IE20030875A1; FI114481B; FI117388B; FI20041124A; US6955909B1; FI943485A0; IE940591A1; CA2128589C; EP1321523A2; US5876988A; AU690909B2; CA2128589A1; NZ264065A; ATE238425T1; CN100347301C; AU6862894A; DK0635574T3; JP2005296019A; DE69432543D1

Abstract

(57)【要約】【構成】所望のＤＮＡフラグメント及び選択マーカー
遺伝子を含むベクターで形質転換された糸状菌であっ
て、選択マーカー遺伝子が欠失していることを特徴とす
る上記糸状菌。【効果】形質転換細胞の選択に用いられた選択マーカ
ー又はクローニングに用いられた他のＤＮＡを残さず
に、所望の染色体部位に導入された所望の遺伝子のみを
含む菌株が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、選択マーカー遺伝子を
含まない組換え体株、その作製方法及びその使用を開示
するものである。更に、本発明の方法は、菌株を改良す
るのに用いられる。

【０００２】

【従来の技術】組換えＤＮＡ技術の使用について社会的
関心が増加している。組換えＤＮＡ技術の有望な適用領
域の１つが菌株の改良である。初期の発酵生産法から始
まって、生産に用いられる菌株の生産性の改良が必要と
された。工業的に使用された微生物の古典的な菌株改良
研究は、主としてランダム突然変異誘発に基づき、その
後選択するものである。変異誘発法は多く記載されてお
り、突然変異原として紫外線、ＮＴＧ又はＥＭＳの使用
が挙げられている。これらの方法は、“Biotechnology
: a comprehensive treatise in 8 vol.”VolumeI, Mi
crobial fundamentals, Chapter 5b, Verlag Chemie Gm
bH, Weinheim, Germany 等多くに記載されている。選択
法は、一般に適切なアッセイについて開発され、主に野
生型と突然変異株との識別において重要である。これら
の古典的な方法は改良の可能性が限定されることが判明
している。一般的には、減少している収量を菌株改良す
ると所望の生産物の収量が増加する。これは、使用され
た突然変異誘発法のランダム性のために少なくとも部分
的なものである。所望の突然変異とは別に、これらの方
法は好ましくなくかつ菌株の他の特徴に否定的に影響す
る突然変異も生じる。

【０００３】これらの欠点のために、組換えＤＮＡ法を
使用すると著しく改良されたことが理解される。一般
に、菌株改良研究において用いられる組換えＤＮＡ法は
所望の遺伝子産物の発現を増大する。遺伝子産物はそれ
自体興味深いタンパク質であり、一方コードされた遺伝
子産物が他の産物の合成において調節タンパク質として
働くことも可能である。所望のタンパク質コーディング
遺伝子の多数のコピーを特定の宿主生物に導入すること
により、菌株を改良することができる。しかしながら、
調節遺伝子を導入することにより発現レベルを増大させ
ることも可能である。遺伝子は、遺伝子を導入するため
に伝達体として働くベクターを用いて導入される。かか
るベクターは、プラスミド、コスミド又はファージとす
ることができる。ベクターは遺伝子を発現することがで
き、その場合、ベクターは通常自己複製することができ
る。しかしながら、ベクターは組込むことができるだけ
でもよい。発現産物が改変表現型特性に基づいて容易に
選択することができない場合、ベクターのもう１つの特
徴は、ベクターが容易に選択することができるマーカー
を備えていることである。

【０００４】ベクターを生物内に見ることができないの
であるいは他の生物から利用できるベクターをほとんど
又は全く修飾せずに用いることができるので、ベクター
は既知のすべての微生物から単離されていない。同じこ
とが選択マーカー遺伝子にも当てはまる。最近、特定の
マーカー遺伝子の広範囲な使用及びその後の展開が検討
されるようになった。これは特に、抗生物質及び抗生物
質選択マーカーを使用すると、抗生物質耐性になった菌
株が望ましくない展開を生じるという発見によるもので
ある。これにより、さらに強力な新規な抗生物質を継続
して開発することが必要である。従って、大量生産にお
いて、抗生物質耐性遺伝子を全く含まないか又はより一
般には外来ＤＮＡをできるだけわずかしか含まない組換
え微生物を用いる一般的傾向があることは驚くべきこと
ではない。形質転換微生物は、遺伝子内に所望の遺伝
子、そのフラグメント又は修飾のみ含み、更にクローニ
ングに用いられる残りのＤＮＡをできるだけわずかしか
含まないか又は全く含まないことが理想的である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、組換え体宿
主微生物から容易に欠失することができる選択マーカー
遺伝子を開示するものである。該マーカー遺伝子の欠失
は優性選択に基づくものである。マーカーは、細菌、糸
状菌(filamenfous fungi）及び酵母のような異なった種
で用いられる。本明細書で用いられる選択マーカーの有
利な活性は、下記２段階原理に基づいている：ａ）遺伝子が宿主生物のゲノムに組込まれ、組換え体細
胞が選択される、ｂ）形質転換細胞が基質上で発育され、気質がマーカー
遺伝子をコードした活性によってその細胞に致命的な生
産物に変換される。選択された細胞は組換え体であり、
選択マーカー遺伝子を欠失している。一般的には、本発
明は、ゲノムに修飾を有する動物又は植物細胞及び微生
物である細胞であって、ａｍｄＳ遺伝子又はそれから誘
導されたｃＤＮＡを用いて改変が導入されることを特徴
とする上記細胞を開示するものである。

【０００６】このようにして用いられる選択マーカー遺
伝子の例はアセトアミダーゼ遺伝子である。本遺伝子
は、好ましくは糸状菌、更に好ましくはコウジカビ属
(Aspergillus)、最も好ましくはアスペルギルスニドゥ
ランス (Aspergillus nidulans)由来である。本発明
は、更にマーカーとしてアセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）
遺伝子を用いて選択する宿主生物における所望の異種又
は同種遺伝子又はＤＮＡ分子の導入、欠失又は修飾を示
すものである。引き続きａｍｄＳが欠失される。ａｍｄ
Ｓ及び所望の遺伝子は部位特異的に導入されることが好
ましい。本発明は、下記のものを含むベクターを開示す
るものである：ａ）宿主ゲノムに導入するために予定された所望のＤＮ
Ａフラグメント、ｂ）場合によってはベクターを宿主株のゲノムに組込む
（部位特異的に）ことを可能にするＤＮＡ配列、ｃ）ＤＮＡ反復間のアセトアミダーゼ（例えばA.ニドゥ
ランス由来のａｍｄＳ）をコードする遺伝子。

【０００７】本発明は、更に該ベクターで形質転換され
た宿主生物を開示するものである。本発明は、更に選択
マーカー遺伝子を含まない組換え体微生物を開示するも
のである。詳細には、本発明は、外来ＤＮＡを更に存在
させずに部位特異的に導入した遺伝子を含む生物を開示
するものである。従って、本方法は、宿主ゲノムの反復
修飾、例えば所定の遺伝子座に多重遺伝子コピーを連続
導入するのにも適する。本発明は、下記段階を含む選択
マーカー遺伝子を含まない組換え体株を作製する方法を
提供するものである：ａ）菌株のゲノムに所望のＤＮＡフラグメント及び選択
マーカーを組込む、ｂ）組換え体を選択する、ｃ）好ましくは選択マーカーが隣接する反復間に内部組
換えを用いて選択マーカーを欠失する、ｄ）選択マーカーが存在しないことに対して逆選択(cou
nter-selection) する。

【０００８】これは選択マーカー遺伝子を含まない組換
え体株を作製する好ましい方法であるが、本発明はこの
方法の変更、例えば：所望のＤＮＡフラグメント及び選
択マーカーが２種類のＤＮＡ分子に存在してもよく同時
形質転換される。選択マーカーは必ずしも菌株のゲノム
に組込まず、キュアされるエピソームＤＮＡ分子に存在
してもよい。本発明は、本マーカー遺伝子が微量、即ち
クローニングに用いたＤＮＡを残さずに形質転換された
生物のゲノムから欠失されることも説明するものであ
る。本発明は、「宿主」生物の染色体から所望の遺伝子
を欠失するためにａｍｄＳ遺伝子の使用も開示するもの
である。このような修飾技術は糸状菌、酵母及び細菌に
も当てはまる。個々の実施態様においては、次の菌株、
アスペルギルス (Aspergillus)、トリコデルマ (Tricho
derma)、ペニシリウム (Penicillium)、バシラス (Baci
llus) 、E.コリ (E.coli) 、クルイベロミセス (Kluyve
romyces)及びサッカロミセス (Saccharomyces)が用いら
れる。本発明の方法は、同じ又は他のベクターを用いて
手順を反復することにより得られたゲノム修飾を含む組
換え体株を提供するものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、形質転換宿主
株を選択するマーカーの使用を開示するものである。選
択マーカー遺伝子は、エピソームＤＮＡベクター上で用
いることができる。しかしながら、本発明においては、
マーカー遺伝子を宿主株のゲノムに組込むことが好まし
い。本発明の選択マーカーの利点は、優性非抗生物質選
択マーカーであることである。本発明の選択マーカーの
別の利点は、形質転換宿主生物から容易に欠失すること
ができることである。マーカーの欠失は、優性選択に基
づいている。本発明の選択マーカーはそれだけで優性か
つ二方向選択マーカーである。知る限りでは、これは二
方向及び両方向に優性である唯一の有効な選択マーカー
である。本発明の説明においては、「選択マーカー遺伝
子」という用語が用いられる。この用語は、それが実際
の遺伝子かあるいはそれから誘導されたｃＤＮＡである
かに無関係な機能上の形でマーカータンパク質をコード
するＤＮＡを意味する。遺伝子又はｃＤＮＡは、宿主生
物及びスプライシングの予想される問題点によって用い
られる。

【００１０】本発明においては、「ベクター」という用
語が用いられる。これは、ベクターが宿主細胞のゲノム
に組込むかあるいはエピソームを維持するかに無関係な
選択宿主に導入することができる任意のＤＮＡ分子を意
味する。ベクターは、選択宿主において機能する選択性
マーカー遺伝子を含むか又はそのような選択マーカー遺
伝子を含む別のＤＮＡで同時形質転換することができ
る。本発明の説明には、「所望の相同又は非相同遺伝子
又はＤＮＡフラグメント」という用語が用いられる。こ
れは、宿主株又は別の種もしくは株から得られるＤＮＡ
フラグメントを意味する。所望のＤＮＡフラグメント
は、遺伝子（一部又は完全な遺伝子座をコードする）、
ｃＤＮＡ、プロモーター、ターミネーター、イントロ
ン、シグナル配列、ＤＮＡ結合タンパク質の調節ＤＮＡ
配列又は認識配列のような遺伝要素、その一部又はその
組合わせを含むことができる。そのフラグメントは、修
飾されている、即ち１種以上のヌクレオチド改変（例え
ば、挿入、欠失、置換）を含むＤＮＡ配列であってもよ
い。本発明の説明には、更に、所望の遺伝子又はＤＮＡ
フラグメントの「導入」という用語が用いられる。これ
は、選択宿主細胞における挿入、欠失、置換を意味す
る。

【００１１】本発明で用いられる「遺伝的修飾」という
用語は、上記所望のＤＮＡフラグメントのいずれか１種
を宿主細胞に、好ましくは形質転換又は同時形質転換に
よって導入する結果である選択宿主細胞におけるＤＮＡ
配列の任意の修飾を意味する。一般に、これらの遺伝的
修飾はすべて本発明の方法を用いて行われ、引き続き選
択マーカー遺伝子を欠失することができる。そのような
遺伝的修飾を含む組換え体株が選択マーカー遺伝子を含
有しない事実のために、本発明の手順を反復することが
でき、上記で示した修飾が組換え体株に組合わせられ
る。結局、本発明の手順は、望ましくないすべての活性
が対応する遺伝要素の欠失又は不活性化によって除去さ
れておりかつ所望のコピー数、好ましくは所望のかつ特
定された遺伝子座の対応する所望のＤＮＡフラグメント
を引き続き導入することにより所望レベルの所望活性を
含む組換え体株が得られる点まで反復して用いることが
できる。

【００１２】A.ニドゥランスアセトアミダーゼ（ａｍｄ
Ｓ）遺伝子であると、A.ニドゥランスは単独のＮ源とし
てアセトアミド上で発育する。単独のＮ源としてアセト
アミドを用いる可能性がないか又は極めて限定された能
力しかない微生物の場合、アセトアミドが細胞によって
吸収されるならばアセトアミダーゼ遺伝子は理論上選択
マーカーとして用いることができる。ａｍｄＳ遺伝子
は、アスペルギルス(Kelly, Hynes (1985) EMBO J. 4,
475-479; Christensenら, (1988) Bio/technology 6, 1
419-1422) 、ペニシリウム(Beri and Turner (1987) Cu
rr. Genet. 11, 639-641) 及びトリコデルマ(Pentillae
ら (1987) Gene 61, 155-164) においてマーカー遺伝子
として巧く用いられている。

【００１３】本発明は、糸状菌以外の生物において選択
マーカーとしてA.ニドゥランス由来のａｍｄＳ遺伝子の
使用を初めて開示するものである。この選択マーカーの
使用は、細菌及び酵母において開示される。詳細には、
S.セレビシエ (S.cerevisiae) 、K.ラクチス (K.lacti
s) 、B.サチリス (B.subtilis) 、B.リケニホルミス(B.
licheniformis)及びE.コリ (E.coli) における使用が示
される。真菌、酵母及び細菌のような異なった群より選
ばれた種における選択マーカーの適用が開示されている
ために、マーカーはこれらの群に属する他の種にも適用
できることが予想される。従って、本マーカーの使用
は、開示されている種に限定されない。A.ニドゥランス
由来のａｍｄＳ遺伝子は、アセトアミドをアンモニア及
び酢酸に変換することができる。この特性のため、A.ニ
ドゥランスは単独のＮ源又はＣ源としてアセトアミドを
含有する培地上で発育することが可能である。

【００１４】ａｍｄＳ遺伝子の別の特性は、フルオロア
セトアミドをアンモニア及びフルオロ酢酸にも変換する
ことができることである。しかしながら、フルオロ酢酸
は、細胞に有毒である。本発明のもう１つの態様、即ち
マーカー遺伝子を含まない組換え体株作製の根拠をなす
のがこの特性である。フルオロアセトアミド変換特性に
より、形質転換細胞の逆選択が可能である。ａｍｄＳ遺
伝子は宿主株に導入され、相同的組換えによりゲノムに
組込まれる。単独のＮ源としてアセトアミドを含有する
培地上にこの形質転換菌株が選択される。引き続きこの
選択された菌株が単独のＮ源としてフルオロアセタミド
及び尿素（又は他の好ましい特定Ｎ源）を含有する培地
上で発育される。生存菌株は、ａｍｄＳ遺伝子を欠失し
ている。

【００１５】本発明は、アセトアミドマーカー遺伝子と
してA.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子を使用するものであ
る。A.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子がコードされたアセ
トアミダーゼによって生じる適切な特性、即ちアセトア
ミドのアンモニア及び酢酸塩への加水分解能及びフルオ
ロ酢酸のフルオロアセトアミドからの遊離能も他の起源
からのアセトアミダーセによって生じる。従って、アセ
トアミダーゼマーカー遺伝子の使用は、機能アセトアミ
ダーゼをコードするＤＮＡ配列を含む以外はA.ニドゥラ
ンスａｍｄＳ遺伝子に限定されない。マーカー欠失の頻
度は、染色体内相同的組換えに対する遺伝子の能力を増
加することにより実質的に増加する。本ａｍｄＳ遺伝子
を達成するためにはＤＮＡ反復間に配置することが好ま
しい。これらの反復は、単一交差組込みによって作られ
る以外は必ずしもベクター内に共に存在しない。また、
隣接反復を取り除き、マーカー遺伝子の除去又は不活性
化のための他のメカニズムによるものである。しかしな
がら、その場合結果は予想できなくなり、マーカー遺伝
子を除去せずむしろ単に不活性化する結果となる。

【００１６】ベクターは、マーカー遺伝子の欠失後、無
関係の外来ＤＮＡ（問題のＤＮＡ以外）が宿主株の染色
体内に残らないようにして構築される。本発明は、下記
のものを含むベクターを開示するものである：ａ）宿主ゲノムに導入されることになる所望のＤＮＡ配
列、ｂ）任意によりベクターを宿主株のゲノムに組込ませる
（部位特異的）ＤＮＡ配列、ｃ）ＤＮＡ反復間でアセトアミダーゼ（例えばA.ニドゥ
ランス由来のａｍｄＳ遺伝子）をコードする遺伝子。宿
主ゲノムに導入されることになるＤＮＡフラグメント及
び選択可能なマーカー遺伝子（例えばアセトアミダーゼ
遺伝子）が同時形質転換される２種類のＤＮＡ分子に存
在する場合にも同一の結果が得られ、その場合選択可能
なマーカーを含むＤＮＡ分子は必ずしも宿主ゲノムに組
込まずキュアすることができるエピソームＤＮＡ分子に
存在させてもよい。

【００１７】ｂ）によって言及される組込みに用いられ
る配列は、部位特異的（遺伝子座特異的の方が良い）組
込みが所望される場合に用いられる。そのような配列が
存在しない場合にもベクターはゲノムに組込むことがで
きる。これにより、選択マーカー遺伝子の欠失能に影響
されない。上記の優性逆選択は、種々の方法で工業生産
株の開発に用いることができる。優性逆選択を使用する
と、これらの菌株がしばしば二倍体又は倍数体であると
いう事実のために改良された生産株の開発に特に有利で
ある。ａｍｄＳ遺伝子の組込みに用いられるベクターは
問題の他の遺伝子を含むことが好ましい。即ち、本発明
は、更にマーカーとしてａｍｄＳ遺伝子を用いて選択す
る宿主生物において所望の外来もしくは相同遺伝子又は
ＤＮＡ要素の導入が可能である。引き続きａｍｄＳ遺伝
子が欠失される。ａｍｄＳ及び所望の遺伝子又はＤＮＡ
要素を部位特異的に導入し、その後ａｍｄＳ遺伝子を欠
失させることが好ましい。

【００１８】詳細には、本発明は、外来ＤＮＡを更に存
在させずに部位特異的に導入された遺伝子を含む生物を
開示するものである。本発明は、所定のゲノム遺伝子座
の所望の遺伝子又はＤＮＡ要素の多重コピーを組込むの
に用いられる。本発明は、下記の段階を含むマーカー遺
伝子を含まない組換え体株を選択する方法を提供するも
のである： − 所望の遺伝子又はＤＮＡ要素及び選択マーカーを、
発現カセットに取込まれた配列と宿主染色体上の配列の
間の相同的組換えによって組込む、 − 優性の選択マーカー遺伝子を用いて選択する、 − 選択マーカー遺伝子隣接領域を用いて選択マーカー
遺伝子を欠失する、 − 選択マーカー遺伝子が存在しないことに対して選択
する（逆選択）。本発明は、更に、本マーカー遺伝子が
微量、即ちクローニングに用いたＤＮＡを残さずに形質
転換生物の染色体から欠失することができることを示す
ものである。更に、本発明は、所望の遺伝子又はＤＮＡ
要素及び選択マーカーが同時形質転換される２種類のＤ
ＮＡ分子に存在すると同一の結果を得ることができなく
ても似ていることを示すものである。

【００１９】最後に、本発明は、「宿主」生物の染色体
から所望の遺伝子を欠失するａｍｄＳ遺伝子の使用を開
示するものである。上記の観点から、本発明は、理想的
には、食品、飼料又は医薬用途に用いられるタンパク質
をコードする遺伝子又は抗生物質及び他の生活性化合物
の生合成、即ち厳密な記載に要求される組換え体タンパ
ク質及び／又は宿主生物に関与する遺伝子のクローニン
グ及び発現に適しているがこれらに限定されない。この
ようなタンパク質の例は当該技術において周知であり、
キモシン、フィターゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、セ
ルラーゼ及びヘミセルラーゼ、サイトカイン及び他の医
薬タンパク質等が挙げられる。

【００２０】同様の方法が、ゲノム内にマーカー遺伝子
を残さずに所望のタンパク質の生産レベルに影響するタ
ンパク質をコードする遺伝子の欠失に用いられる。この
ようなタンパク質としては、宿主株内で高度に発現さ
れ、従って所望のタンパク質の生産及び／又は分泌の可
能性が減少した所望の生産物を活発に消化するプロテア
ーゼがある。ある遺伝子を欠失するのに好ましい方法
は、５′〜３′の順序の次の要素：欠失されるべき配列
５′遺伝子、直接融合された欠失されるべき配列３′遺
伝子、下流に続く機能上の選択マーカー遺伝子（好まし
くはアセトアミダーゼ遺伝子）、下流に続く欠失される
べき配列３′遺伝子を含有するＤＮＡ構築物を使用す
る。この場合、欠失されるべき３′遺伝子の両配列を選
択して選択マーカー遺伝子に隣接する反復を形成する。
このＤＮＡ構築物を形質転換し、引き続き欠失されるべ
き遺伝子の染色体コピーを欠失されるべき配列５′及び
３′遺伝子に交差点を有するＤＮＡ構築物で置き換える
と、ある遺伝子を欠失することになる。引き続き選択マ
ーカー遺伝子に隣接する反復間の染色体内組換え及びこ
れらの組換えに対する逆選択により、最後にある遺伝子
が欠失した選択マーカーを含まない菌株を生じる。この
欠失に用いられるＤＮＡ構築物は、欠失のある菌株内に
外来ＤＮＡ又は他の微量の遺伝的修飾が残らないように
構築することができる。

【００２１】本発明は、選択マーカー遺伝子を含まない
組換え体微生物を開示するものである。その微生物は、
開示した技術を使用した後、所望の遺伝子（相同あるい
は非相同）の過剰コピーを含有する生物とすることがで
きる。同じ技術を連続して用いることにより、その微生
物を何度も再形質転換して問題の同じ又は他の遺伝子の
コピーを更に挿入又は欠失することができる。これらの
微生物は、また、所定の遺伝子が所望の方法で欠失又は
改変されていることを特徴とするものである。本発明の
方法は、所望のタンパク質の生産を微細調整することを
可能にするものである。この可能性は、挿入及び欠失を
反復することができる容易さに基づくものである。本方
法は、所望の遺伝子コピー数の挿入又は欠失を可能にす
るものである。即ち、タンパク質が所望量及び所望比で
生産される。これは、タンパク質又は酵素の混合物の生
産に特に有効である。アセトアミダーゼ遺伝子がアスペ
ルギルスにおいて単独のＮ源としてアセトアミドを変換
することができることは既知であるが、アセトアミダー
ゼ遺伝子が形質転換アスペルギルスのゲノムから容易に
欠失されることはここに示されている。これを達成する
ために、ａｍｄＳ遺伝子を直列反復間でクローン化す
る。原則として内部組換えができる直列反復を用いるこ
とができる。本発明の実施例において、これは３′アミ
ログルコシダーゼ（ｇｌａＡ）非コーディングＤＮＡ配
列間でａｍｄＳ遺伝子をクローン化することにより示さ
れる。

【００２２】ａｍｄＳ遺伝子は、Ｎ源としてフルオロア
セトアミド及び尿素を含有する培地上のプレーティング
で組込み及び欠失されることが示されている。更に、ア
ミログルコシダーゼ遺伝子をアスペルギルスのゲノムか
ら欠失することができることも証明される。ｇｌａＡプ
ロモーターの一部、全部で３個の読み枠に停止コドンを
含む合成ＤＮＡ配列、A.ニドゥランスグリセロアルデヒ
ド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼプロモーターの
調節によるA.ニドゥランス由来の３′ｇｌａＡ非コーデ
ィング配列が隣接するａｍｄＳ遺伝子を含む置換ベクタ
ーが構築される。A.ニガー (A.niger)の形質転換後、二
重交差によりベクターを組込み、そのことによりアミロ
グルコシダーゼ遺伝子が効果的に置換される。ａｍｄＳ
活性の選択後、形質転換株をフルオロアセトアミド及び
尿素に塗布する。選択によりａｍｄＳ遺伝子が欠失した
菌株が得られた。本実施例は、アスペルギルス株のゲノ
ムから所望の遺伝子を欠失するａｍｄＳ遺伝子を使用す
る可能性を具体的に説明するものである。他の遺伝子
は、同様の方法で除去又は修飾することができる。

【００２３】更に実施例において、遺伝子がゲノム内の
所定部位にマーカーを含まない遺伝子を挿入することが
できることが示されている。A.ニガーｇｌａＡ遺伝子座
及び３′ｇｌａＡ非コーディング２反復が隣接したａｍ
ｄＳ遺伝子を含む組込みベクターが構築される。この構
築物はアミログルコシダーゼ遺伝子座に組込むことが示
されている。フルオロアセトアミドで選択した後、ａｍ
ｄＳが欠失される。このようにして、マーカーＤＮＡを
残さずに特定の遺伝子座に遺伝子コピーが組込まれる。
上記のことから、本明細書に記載される手順により、当
業者が後に選択マーカーＤＮＡを残さずに所定の遺伝子
座に所望の遺伝子を組込むかあるいは欠失することがで
きることは明らかである。本方法は、遺伝子増幅及び遺
伝子置換に用いることができる。特に重要な適用は、所
望の遺伝子を組込むことである。菌株を古典的に改良し
た後、古典的菌株改良によって逆に影響する遺伝子を問
題の遺伝子の影響されない新しいコピーに発現レベルの
ロスなしで置き換える。

【００２４】上記アスペルギルスについて記載した系
は、単独のＮ源としてアセトアミド上で発育することが
できないことが知られている真菌の他の菌株を用いる場
合に同様の結果を得ることが予想される。選択マーカー
としてａｍｄＳ遺伝子を使用することが特にペニシリウ
ム及びトリコデルマに記載されている。更に、ａｍｄＳ
遺伝子は、不十分にもかかわらず単独のＮ源としてアセ
トアミドを使用することができる糸状菌においてさえも
使用することができる。この場合、選択培地にＣｓＣｌ
を含めることにより、発育の不十分な形質転換されない
細胞の背景を抑制することができる(Tilburn, J.ら (19
83) Gene, 26, 205-221)。従って、この系は、一般に糸
状菌に適用できることが予想される。本明細書の１実施
態様においては、驚くべきことにA.ニドゥランスａｍｄ
Ｓ遺伝子がK.ラクチスにおいて選択マーカーとして用い
ることができることが示されている。本実施例において
は、２種類のK.ラクチス株が単独のＮ源としてのアセト
アミド上で発育することができないことが示されてい
る。K.ラクチス２株は、ａ）Ｎ源を含まない以外は完全である、ｂ）アセトアミドを含む以外はａ）として、ｃ）硫酸アンモニウムを含む以外はａ）としてＹＣＢ培
地上に塗布される。

【００２５】これらの菌株はｂ）の培地上で発育しない
がｃ）の培地上で発育することが示されている。従っ
て、アセトアミドが酵母細胞によって吸収されかつａｍ
ｄＳ遺伝子がK.ラクチス内で発現することができれば、
この系は少なくとも選択マーカーとしても酵母内で適用
することができる。フルオロアセトアミドを用いる逆選
択に関して、更に若干の要求を満たさねばならない。酵
素アセチル−ＣｏＡ−シンテターゼによって活性化され
る場合、フルオロアセテートは有毒である。従って、ａ
ｍｄＳ⁺酵母に作用するフルオロアセトアミド逆選択に
対する必要条件は次のことである：１）フルオロアセトアミドがａｍｄＳ酵母に有毒であっ
てはならない、２）酵母細胞壁及び原形質膜がフルオロアセトアミドに
対して透過性でなければならない及び３）酵素アセチル−ＣｏＡ−シンテターゼが活性でなけ
ればならない。

【００２６】これを試験するために、ａｍｄＳ遺伝子を
K.ラクチス内でクローン化した。K.ラクチスにおいてA.
ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子のスプライシングの問題の
可能性を避けるために、A.ニドゥランス由来のａｍｄＳ
ｃＤＮＡを実験の項に示されているようにクローン化し
た。引き続き、別のマーカー（ホスホトランスフェラー
ゼ−Ｇ４１８）を含むベクターの酵母プロモーター（Ｌ
ＡＣ４、ＡＤＨ１、Ｋ１ＥＦ）の下流にａｍｄＳをクロ
ーン化した。このクローニングは実施例８に記載されて
いる。Ｇ４１８マーカー及びａｍｄＳ遺伝子を共に含有
するベクターをＧ４１８マーカーを用いて選択し、次い
でａｍｄＳ＋表現型の選択条件を最適化するために用い
た。K.ラクチスの直接選択は、本発明の別の実施態様に
おいて示されており、S.セレビシエの場合実施例１１に
直接選択が示されている。

【００２７】引き続き、形質転換酵母菌に逆選択を用い
てａｍｄＳ遺伝子を除去することが示されている。ａｍ
ｄＳ遺伝子系は、酵母内遺伝子のマーカー遺伝子を含ま
ない挿入及びマーカー遺伝子を含まない欠失の双方に用
いられる。更に実施態様においてはラクターゼ遺伝子が
K.ラクチスから欠失されるが、実施例１４においてはキ
モシン遺伝子のコピーがK.ラクチスゲノムに挿入され
る。挿入及び欠失にここで用いられる遺伝子は、例とし
て用いられているにすぎない。他の遺伝子又はＤＮＡ要
素を用いて同様の技術を当てはめることができる。前述
のように挿入又は欠失に用いられるＤＮＡフラグメント
は、突然変異遺伝子、プロモーター配列、調節配列等と
することができる。すべての場合において、これらの配
列を所望のゲノム部位及び所望の数で後にマーカー遺伝
子を残さずに挿入又は欠失することが可能である。

【００２８】他の酵母菌において本系の使用が可能であ
ることは明らかである。本発明の系を細菌に使用する第
１段階として、バシラスサチリス (Bacillus subtilis)
及びE.コリが単独のＮ源としてのアセトアミド上で発育
することができないことが実施例１５に示されている。
実施例１６には、バシラス及びE.コリで使用するために
構築されているベクターが記載されている。実施例１７
及び１８にはバシラス及びE.コリにおいてａｍｄＳ遺伝
子を選択マーカーとして効果的に用いることができるこ
とが示され、実施例１９には細菌のａｍｄＳ⁺形質転換
細胞のフルオロアセトアミド逆選択が示される。本発明
の系の利点は多数である。最も注目すべき利点を下記に
示す： − ａｍｄＳ系は普遍的に適用でき（植物細胞、動物細
胞、酵母、細菌及び糸状菌等）、問題の宿主が単独のＣ
又はＮ源としてアセトアミド上で発育することができな
いか又は十分に発育することができないが単独のＣ又は
Ｎ源として各々酢酸塩あるいはアンモニアを使用するこ
とができることだけを必要とすることが示される。

【００２９】− ａｍｄＳ系は、二方向及び優性選択系
のみを表すものである。天然単離物及び／又は工業的菌
株によくあるこの特徴は、倍数体又は異数体菌株で用い
るのに便利である。 − 菌株を古典的に改良した後、所望の遺伝子が十分に
特定された遺伝子座に組込まれている事実により、所望
の遺伝子の突然変異コピーを非突然変異コピーに遺伝子
置換により容易に置き換えることができる。即ち、それ
らの遺伝子が非突然変異遺伝子に発現レベルに影響せず
に置き換えられる。 − 十分に特定された従って非ランダム遺伝子座に多数
の組込みを導入することができる能力のために、好まし
くない特徴が遺伝子増幅の際に菌株内に生じないことは
確かである。 − 環境における種々の選択マーカーの解離に関する成
長は提示した系によって克服される。所望の遺伝子又は
他の遺伝的修飾を導入した後、選択マーカー遺伝子又は
他の不要な又は所望されないＤＮＡ配列は生産株内に存
在させることを必要としない。

【００３０】実験一般分子クローニング技術本明細書に記載される実施例において、核酸の単離及び
精製、核酸の電気泳動酵素的修飾、核酸の切断及び／又
は増幅、E.コリの形質転換等の分子クローニング標準法
を文献 (Sambrookら (1989) "Molecular Cloning: a la
boratory manual", Cold Spring Harbour Laboratorie
s, Cold Spring Harbour, New York; Innisら (eds.)(1
990) "PCR Protocols, a guide to methods and applic
ations" Academic Press, San Diego) に記載されてい
るように行った。オリゴデオキシヌクレオチドの合成及
びＤＮＡ配列分析は、製造業者によって備えられたユー
ザーマニュアルに従って各々Applied Biosystems 380B
ＤＮＡシンセサイザー及び 373A ＤＮＡシークエンサ
ーで行った。

【００３１】A.ニガーの形質転換 A.ニガーの形質転換を Tilburn, J.ら (1983) Gene 26,
205-225及び Kelly,J. & Hynes, M. (1985) EMBO J.,
4, 475-479 に記載されている方法を下記のように変更
して行った： − 胞子をアスペルギルス最少培地で回転振盪器中３０
０ rpm，３０℃で１６時間発育させる。アスペルギルス
最少培地は、次の成分からなる：１リットル当たり６ｇ
のＮａＮＯ₃；0.５２ｇのＫＣｌ；1.５２ｇのＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄；1.１２mlの４M ＫＯＨ；0.５２ｇのＭｇＳＯ₄・
７Ｈ₂Ｏ；１０ｇのグルコース；１ｇのカザアミノ酸；
２２mgのＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ；１１mgのＨ₃ＢＯ₃；
５mgのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ； 1.７mgのＣｏＣｌ₂・
６Ｈ₂Ｏ；1.６mgのＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ；５mgのＭｎ
Ｃｌ₂・４Ｈ₂Ｏ；1.５mgのＮａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ
₂Ｏ；５０mgのＥＤＴＡ；２mgのリボフラビン；２mgの
チアミン・ＨＣｌ；２mgのニコチンアミド；１mgのピリ
ドキシン・ＨＣｌ；0.２mgのパントテン酸；４μg のビ
オチン；１０mlのペニシリン（５０００IU/ml)／ストレ
プトマイシン（５０００IU/ml)溶液(Gibco) 。

【００３２】− Novozym 234(Novo Industri)のみをヘ
リカーゼなしでプロトプラストの形成に用いた； − プロトプラスト形成（６０−９０分）後、ＫＣバッ
ファー（0.８M ＫＣｌ，9.５mMクエン酸，ｐＨ6.２）を
４５ml量まで加え、プロトプラスト懸濁液をスインギン
グ−バケットローターで２５００ｇ，４℃で１０分間遠
心した。プロトプラストを２０mlのＫＣバッファーに再
懸濁した。次いで、２５mlのＳＴＣバッファー（1.２M
ソルビトール，１０mMトリスＨＣｌｐＨ7.５，５０mMＣ
ａＣｌ₂)を加え、次にプロトプラスト懸濁液をスインギ
ング−バケットローターで２５００ｇ，４℃で１０分間
遠心し、ＳＴＣバッファーで洗浄し、ＳＴＣバッファー
に１０⁸プロトプラスト/ml の濃度で再懸濁した； − ２００μl のプロトプラスト懸濁液にＤＮＡフラグ
メントをＴＥバッファー（１０mMトリスＨＣｌｐＨ7.
５，0.１mMＥＤＴＡ）中１０μl 量で加え、次に１００
μl のＰＥＧ溶液（２０％ＰＥＧ４０００(Merck),0.８
M ソルビトール，１０mMトリスＨＣｌｐＨ7.５，５０mM
ＣａＣｌ₂)を加えた；

【００３３】− ＤＮＡプロトプラスト懸濁液を室温で
１０分間インキュベートした後、1.５mlのＰＥＧ溶液
（６０％ＰＥＧ４０００(Merck),１０mMトリスＨＣｌｐ
Ｈ7.５，５０mMＣａＣｌ₂)を徐々に試験管を繰り返し混
合しながら加えた。室温で２０分間インキュベートした
後、懸濁液を５mlのＳＴＣバッファーで希釈し、転化に
より混合し、２０００ｇ，室温で１０分間遠心した。プ
ロトプラストを１mlの1.２M ソルビトールに穏やかに再
懸濁し、リボフラビン、チアミン・ＨＣｌ、ニコチンア
ミド、ピリドキシン・ＨＣｌ、パントテン酸、ビオチ
ン、カザアミノ酸及びグルコースを含まないが単独の窒
素源としてアセトアミド、１M スクロースを含む２％細
菌学的寒天 #1 (Oxoid, England)で固化したアスペルギ
ルス最少培地からなる再生選択培地に塗布した。３０℃
で６−１０日間発育させた後、プレートをスクロースの
代わりに２％グルコース及び寒天の代わりに1.５％アガ
ロースを含むアスペルギルス再生選択培地からなるアセ
トアミド選択プレート上にレプリカ培養した。３０℃で
５−１０日間発育させた後、単一形質転換細胞を単離し
た。

【００３４】A.オリゼ (A.oryzae) の形質転換 Christensen, T.らの欧州特許出願第0 238 023 A2号に
記載されている方法に従って、A.オリゼを形質転換し
た。T.リーサイ (T.reesei) の形質転換 Penttillae M., Knowles, J. (1987) Gene 61 155-164
に記載されている方法に従って、T.リーサイを形質転換
した。P.クリソゲナム (P.chrysogenum)の形質転換Ｃａ−ＰＥＧ仲介プロトプラスト形質転換手順を用い
る。プロトプラストの調製及びP.クリソゲナムの形質転
換を Goukaら, Journal of Biotechnology 20(1991), 1
89-200に記載されている方法をを下記のように変更して
行った： − 形質転換した後、プロトプラストを単独の窒素源と
して0.１％アセトアミドを含む1.２M スクロースで浸透
的に安定化しかつ1.５％細菌学的寒天 #1 (Oxoid, Engl
and)で固化したアスペルギルス最少培地からなる再生選
択培地に塗布した。 − ２５℃で５−８日間インキュベートした後、形質転
換細胞が出現した。

【００３５】K.ラクチスの形質転換細胞 Ito H.ら (1983) J. Bacteriol. 153, 163-168に記載さ
れている酢酸リチウム法を次のように変更して酵母K.ラ
クチスを形質転換した： − 形質転換の場合、K.ラクチス培養物をＯＤ₆₁₀0.５
〜1.0 で用いた。 − ５分後、熱ショック形質転換細胞懸濁液、１mlのＹ
ＥＰＤ／ＹＮＢ（１％酵母エキス、２％バクトペプト
ン、２％グルコース及び0.１７％酵母窒素塩基ｗ／ｏア
ミノ酸（ＹＮＢ；Difco)を加え、細胞懸濁液を振盪イン
キュベーターで３０℃で１５０−１８０分間インキュベ
ートした。 − 上記のインキュベーション（３０℃で１５０−１８
０分間）後、細胞懸濁液を２０００ｇ，室温で５分間遠
心し、２％バクト寒天 (Difco)で固化したＹＥＰＤ／Ｇ
４１８二重層培地に塗布した。ＹＥＰＤ／Ｇ４１８二重
層プレートを次のように調製した：細胞懸濁液を塗布す
る１０分前に、Ｇ４１８を含まない１５mlのＹＥＰＤ寒
天（２％バクト寒天 (Difco)で固化した１％酵母エキ
ス、２％バクトペプトン、２％グルコース）を５０μg
のＧ４１８／mlを含めた１５mlのＹＥＰＤ寒天に注ぎ入
れた。これにより、抗生物質の拡散後２５μg のＧ４１
８／mlを含むＹＥＰＤ／Ｇ４１８二重層プレートを得
る。このＹＥＰＤ／Ｇ４１８二重層プレートは、K.ラク
チス株 CBS 683又は CBS 2360 の場合各々２５μg Ｇ４
１８／ml又は１００μg Ｇ４１８／mlを含有した。

【００３６】アスペルギルス、トリコデルマ、ペニシリ
ウム及び酵母由来ＤＮＡの単離アスペルギルス及びトリコデルマ由来ＤＮＡは、Yelton
ら (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 1470-1474 に
記載されている手順に従って単離した。ペニシリウム由
来ＤＮＡは、 Kolarら, Gene 62 (1988), 127-134 に記
載されている手順に従って単離した。K.ラクチス又はS.
セレビシエ由来ＤＮＡは、Fujimura, Sakuma (1993), B
iotechniques 14, 538に記載されている手順に従って単
離した。

【００３７】バシラス形質転換及びＤＮＡ単離 Bron (1990)"Plasmids": Molecular Biological Method
s for Bacillus, Harwood, CR, Cutting, SM, eds., se
ries Modern Microbiological Methods, JohnWiley & S
ons, Chichester, UKに記載されているように、異種バ
シラス種の形質転換及びこれらの種由来プラスミド又は
染色体ＤＮＡの単離を行った。B.サチリス BS-154 (CBS
363.94)の形質転換の場合受容能力をもつ細胞を用い、
B.リケニホルミス T5 (CBS 470.83)の形質転換の場合プ
ロトプラスト形質転換を用いた。ネオマイシン選択の場
合には、濃度２０μg/mlを用いた。B.サチリス形質転換
細胞のアセトアミド選択の場合、カザアミノ酸及び酵母
エキスが２０mMアセトアミドに置き換えられた最少培地
寒天を用いた。B.リケニホルミス形質転換細胞のアセト
アミド選択の場合、硫酸アンモニウムが２０mMアセトア
ミドに置き換えられたプロトプラスト再生培地を用い
た。

【００３８】ａｍｄＳ選択マーカーの除去アスペルギルス、トリコデルマ及びペニシリウムに関す
るほとんどの例におけるａｍｄＳマーカーをアミログル
コシダーゼ遺伝子の３′非コーディング領域の一部から
なる反復間でクローン化する。ａｍｄＳ選択マーカーに
隣接する３′ｇｌａＡ非コーディング反復間での内部組
換えあるいは単一交差結果による組込みによって生じる
反復間での相同的組換えにより、ａｍｄＳ選択マーカー
を除去する。ａｍｄＳ選択マーカーを消失した細胞は、
フルオロアセトアミドを含有するプレート上で発育させ
ることにより選択する。ａｍｄＳ遺伝子がある細胞は、
フルオロアセトアミドを細胞に有毒なアンモニウム及び
フルオロアセテートに代謝する。従って、ａｍｄＳ遺伝
子を消失した細胞のみがフルオロアセトアミドを含有す
るプレート上で発育することができる。

【００３９】アスペルギルス形質転換細胞からａｍｄＳ
マーカーを除去する場合には、これらの形質転換細胞の
胞子を１０mMアセトアミドの代わりに３２mMフルオロア
セトアミド及び５mM尿素、１M スクロースの代わりに1.
１％グルコース及び２％細菌学的寒天 #1 (Oxoid, Engl
and)の代わりに1.１％を含有する再生選択培地（上記）
に塗布した。３５℃で７−１０日間発育させた後、単一
コロニーを回収し、0.４％ジャガイモデキストロース寒
天(Oxoid, England)上に塗布した。トリコデルマ形質転
換細胞からａｍｄＳマーカーを除去する場合には、これ
らの形質転換細胞の胞子を１０mMフルオロアセトアミド
で補足した非選択最少培地プレート（１リットル当た
り：２０ｇのグルコース、５ｇの（ＮＨ₄)₂ＳＯ₄、１
５ｇのＫＨ ₂ＰＯ₄、0.６ｇのＭｇＳＯ₄、0.６ｇのＣ
ａＣｌ₂、0.００５ｇのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、0.００
１６ｇのＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ、0.００１４ｇのＺｎＳＯ
₄・７Ｈ₂Ｏ、0.００２ｇのＣｏＣｌ₂；ｐＨ5.５）に
塗布した。３０℃で５−１０日後、コロニーを収集し、
0.４％ジャガイモデキストロース寒天(Oxoid, England)
に塗布した。ペニシリウム形質転換細胞からａｍｄＳを
除去する場合には、これらの形質転換細胞の胞子を1.５
％細菌学的寒天 #1 (Oxoid, England)で固化した１０mM
フルオロアセトアミド及び５％グルコースを含むアスペ
ルギルス最少培地からなる選択培地プレート上に塗布し
た。２５℃で５−１０日発育させた後、耐性コロニーが
出現した。

【００４０】A.ニガー形質転換細胞によるグルコアミラ
ーゼ生産の決定胞子又は菌糸を製造業者の説明書に従って調製したＰＤ
Ａプレート（ジャガイモデキストロース寒天, Oxoid)上
に塗布して、組換え体及び対照A.ニガー株の胞子を集め
た。３０℃で３−７日間発育させた後、プレートに0.０
１％トリトン X-100を加えて胞子を集めた。滅菌水で洗
浄した後、約１０⁷胞子の選択形質転換細胞及び対照菌
株を１リットル当たり３０ｇのマルトース・ＨＯ；５
ｇの酵母エキス；１０ｇの加水分解カゼイン；１ｇのＫ
Ｈ₂ＰＯ₄;0.５ｇのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ；３ｇのトゥ
イーン 80;１０mlのペニシリン（５０００IU/ml)／スト
レプトマイシン（５０００UG/ml)；ｐＨ5.５を含有する
２０mlの液状予備培養基を含む振盪フラスコに植菌し
た。これらの培養物を３４℃で２０−２４時間発育させ
た。５−１０mlのこの培養物を１リットル当たり７０ｇ
のマルトデキストリン；２５ｇの加水分解カゼイン；１
2.５ｇの酵母エキス；１ｇのＫＨ₂ＰＯ₄;２ｇのＫ₂Ｓ
Ｏ₄;0.５ｇのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ；0.０３ｇのＺｎＣ
ｌ₂;0.０２ｇのＣａＣｌ₂;0.０１ｇのＭｎＳＯ₄・４Ｈ
₂Ｏ；0.３ｇのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ；１０mlのペニシ
リン（５０００IU/ml)／ストレプトマイシン（５０００
UG/ml)を含有し４N Ｈ₂ＳＯ₄でｐＨ5.６に調整した１
００mlの発酵培地に植菌した。これらの培養物を３４℃
で５−１０日間発育させた。発酵中種々の時点でグルコ
アミラーゼ生産を分析するために、試料を採取した。こ
の発酵ブイヨン試料を遠心（１０分，１0,０００×ｇ）
し、上清を集めた。

【００４１】0.０３２M ＮａＡＣ／ＨＡＣｐＨ4.０５中
１０μl の６倍希釈試料の培養上清を0.０３２M ＮａＡ
Ｃ／ＨＡＣｐＨ4.０５中１１５μl の0.２％(w/v) p-ニ
トロフェニルα−Ｄ−グルコピラノシド (Sigma)とイン
キュベートすることにより、グルコアミラーゼ活性を求
めた。室温で３０分インキュベートした後、５０μlの
0.３M Ｎａ₂ＣＯ₃を加え、波長４０５nmの吸収を測定
した。Ａ_405nmは、ＡＧ生産の尺度である。

【００４２】ａｍｄＳｃＤＮＡのクローニング A.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子は、３種の小さなイント
ロンを含んでいる(Corrickら (1987) Gene 53, 63-71)
。これらのイントロンの酵母内スプライシングの不正
確さ又は細菌内スプライシングの欠如に起因する問題を
避けるために、酵母及び細菌において発現するａｍｄＳ
ｃＤＮＡを用いた。A.ニドゥランスポリＡ ⁺ＲＮＡ標品
由来ａｍｄＳ遺伝子のクローニングは、 Corrickら((19
87), Gene53, 63-71)に記載されている。本実施例にお
いては、A.ニガー NRRLL 3135 形質転換細胞 #4 を用
い、プラスミドｐＡＦ２−２Ｓを含むA.ニドゥランスａ
ｍｄＳ遺伝子の多重コピーによって形質転換した (van
Hartingsveldら (1993) Gene 127, 87-94)。 Auffrayら
((1980) Eur.J.Biochem. 107, 303-314)を変更した方法
による直接ＬｉＣｌ沈降で全ＲＮＡを単離した。A.ニガ
ー胞子が発芽し、炭素源としてグルコース及び単独の窒
素源としてアセトアミドで補足した最少培地(Cove (196
6) Biochim. Biophys. Acta 113, 51-56) 中３７℃で一
晩発育させた。

【００４３】菌糸が得られ、ろ過で乾燥し、次に基礎と
されるべき液体窒素で凍結した。この粉末を０℃で３M
ＬｉＣｌ、６M 尿素に分散し、４℃で一晩維持した。１
6,０００ｇで３０分間遠心しフェノール／クロロホルム
／イソアミルアルコール（５０：４８：２）で２連続抽
出した後、全細胞ＲＮＡを得た。ＲＮＡをエタノールで
沈降し、１mlの１０mMトリスＨＣｌ（ｐＨ7.４) 、0.５
％ＳＤＳに溶解した。ポリＡ⁺選択の場合、全ＲＮＡ試
料を６５℃で５分間加熱し、次にオリゴ（ｄＴ）セルロ
ースカラムに加えた。１０mMトリスＨＣｌｐＨ7.４、0.
５％ＳＤＳ及び0.５M ＮａＣｌを含有する溶液で数回洗
浄した後、ポリＡ⁺ＲＮＡを１０mMトリスＨＣｌｐＨ7.
４及び0.５％ＳＤＳで溶離して集め、エタノールで沈降
した。約５μg のポリＡ⁺ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）プ
ライマーで開始される逆転写の鋳型として用いた。反応
混合液（５０mMトリスＨＣｌｐＨ7.６、１０mMＤＴＴ、
６mMＭｇＣｌ₂、８０mMＫＣｌ、0.２mM各ｄＮＴＰ及び
0.１mgＢＳＡ/ml)を５００単位のマウスＭＬＶ逆転写酵
素（ＢＲＬ）及び７５単位のＴＮａｓｅインヒビター(P
romega)と１００μl 量で３７℃で３０分間インキュベ
ートした。

【００４４】別の２００単位の逆転写酵素を加え、この
反応を３０分間続けた。この混合液をクロロホルムで抽
出し、0.２５M 酢酸アンモニウムの存在下にエタノール
で沈降した。この第一鎖ｃＤＮＡの混合物を次のポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の鋳型として用いてａｍｄＳ
ｃＤＮＡを増幅した。このゲノムａｍｄＳ配列を用いて
２合成オリゴヌクレオチドを設計し、このＰＣＲのプラ
イマーとして用いた： AB3100 (配列番号１）： 5′- CTAATCTAGAATGCCTCAATCCTGAA - 3′（ＸｂａＩ部
位が前にあるヌクレオチド−３〜＋１６及び他の４ヌク
レオチドのａｍｄＳ特異的配列）。 AB3101 (配列番号２）： 5′- GACAGTCGACAGCTATGGAGTCACCACA - 3′（別のＳａ
ｌＩ部位が隣接したヌクレオチド１９１１〜１８８４の
ａｍｄＳ停止コドンの下流に位置したａｍｄＳ特異的配
列）。

【００４５】ＰＣＲ反応は、鋳型として１０％のｃＤＮ
Ａ混合液及びプライマーとして各々0.１μg のオリゴ A
B3100(配列番号１）及び AB3101(配列番号２）を用いて
行った。変性（１００℃で７分）及び1.３単位Ｔａｑポ
リメラーゼを加えた後、反応混合液を２５増幅サイクル
（各サイクル：９４℃で２分、５５℃で２分及び７２℃
で３分）に供した。最後のサイクルでは、伸長段階が長
く（７分）全長フラグメントを合成した。得られたＤＮ
ＡフラグメントをＸｂａＩ及びＳａｌＩで消化し、ｐＵ
Ｃ１８のＸｂａＩ／ＳａｌＩ部位にサブクローン化し
た。得られたプラスミドをｐａｍｄＳ−１と称した（図
１参照）。プラスミドｐａｍｄＳ−１を制限分析する
と、ａｍｄＳｃＤＮＡにおいてイントロンの不在及びエ
キソンの正しい融合が確認された。

【００４６】

【実施例１】ａｍｄＳ遺伝子を用いることによるA.ニガー遺伝子のマ
ーカー遺伝子を含まない欠失本実施例においては、二重交差相同的組換えによりA.ニ
ガーゲノムに組込む置換ベクターでA.ニガーを形質転換
することにより、A.ニガーにおけるゲノム標的遺伝子を
置換する。置換ベクターは、ＤＮＡ反復が隣接した選択
可能なマーカー遺伝子によって分断された標的遺伝子座
に相同なＤＮＡ領域を含んでいる。本実施例において、
プラスミドｐＧＢＤＥＬ４ＬはｇｌａＡコーディング領
域及びｇｌａＡプロモーター領域の一部を欠失するため
に用いられる。本ベクターはA.ニガーｇｌａＡゲノム遺
伝子座の一部を含んでおり、ここでｇｌａＡコーディン
グ配列及びｇｌａＡプロモーター配列の一部は直列反復
として３′非翻訳ｇｌａＡ配列が隣接した選択マーカー
としてA.ニドゥランスｇｐｄＡプロモーターの調節によ
ってA.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子に置換される。A.ニ
ガーを本ベクターで形質転換すると、ｇｌａＡ遺伝子が
ａｍｄＳマーカー遺伝子に置き換えられる。実験法で記
載されているようにこれらの形質転換細胞でフルオロア
セタミド逆選択を行うことにより、ａｍｄＳマーカー遺
伝子は３′ｇｌａＡＤＮＡ反復間の内部組換え結果によ
り適切に欠失され、マーカー遺伝子を含まないΔｇｌａ
Ａ組換え体株を生じ、最後には外来ＤＮＡ配列を全く有
しない（模式図として図２参照）。

【００４７】ｇｌａＡ遺伝子置換ベクターｐＧＢＤＥＬ
４Ｌの簡単な説明遺伝子置換ベクターｐＧＢＤＥＬ４Ｌは、５′部分のA.
ニガーアミログルコシダーゼ（ｇｌａＡ）プロモーター
領域、全部で３種類の読み枠内に停止コドンを生じる１
６ｂｐの合成ＤＮＡ配列、A.ニドゥランスグリセルアル
デヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ
Ａ）プロモーターの調節によるA.ニドゥランスアセトア
ミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子を含み、両側に３′ｇｌａ
Ａ非コーディング配列が隣接する。

【００４８】ｐＧＢＤＥＬ４Ｌの構築経路最終欠失ベクターｐＧＢＤＥＬ４Ｌを得るために、まず
ｇｌａＡ遺伝子座のサブクローンを誘導した。模式図は
図３及び４に示されている。A.ニガーのｇｌａＡ遺伝子
座は分子クローン化されており、以前に記載されている
（欧州特許第0463 706 A1号）。プラスミドｐＡＢ６−
１は、ｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ部位でクローン化さ
れた１5.５kbのＨｉｎｄＩＩＩフラグメント上にA.ニガ
ー由来の全ｇｌａＡ遺伝子座を含んでいる (Yanisch-Pe
rronら, Gene 33 (1985) 103-119及び例えばBoehringer
Mannheim, Germanyから入手できる）。ｐＡＢ６−１を
ＥｃｏＲＩで消化し、ｇｌａＡ遺伝子のすぐ上流の1.８
kbのＥｃｏＲＩＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電
気泳動で単離し、ＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ１９に連
結し、次にE.コリに移して分子クローン化した。得られ
たプラスミドはｐＡＢ６−３と称した（図３）。ｐＡＢ
６−１の別のサブクローンであるプラスミドｐＡＢ６−
４を構築するために、ｐＡＢ６−１をＨｉｎｄＩＩＩ及
びＢｇｌＩＩで消化した。ｇｌａＡプロモーター及びｇ
ｌａＡコーディング配列の一部を含む4.６kbサイズのＤ
ＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、
ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩで前に消化したｐＵＣ１
９に連結した（図４）。結果としてｐＡＢ６−４内のＢ
ａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩ部位は本クローニング操作で適
切に破壊された。

【００４９】引き続き、プラスミドｐＡＢ６−４をＨｉ
ｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化しかつE.コリＤＮＡポ
リメラーゼを用いて５′付着末端を挿入した後、1.８kb
のｇｌａＡプロモーターＤＮＡフラグメントをアガロー
スゲル電気泳動で単離し、ＥｃｏＲＩで部分的に消化し
かつE.コリＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を作
成したｐＡＢ６−３に連結し、その連結混合物を分子ク
ローニングのためにE.コリに移した。誘導プラスミド
（ｐＡＢ６−３１と称する）は、中間のＥｃｏＲＩ部位
が破壊された3.６kbのｇｌａＡプロモーターフラグメン
トを含むが、ｇｌａＡＡＴＧ開始部位のすぐ上流になお
（本ＤＮＡフラグメントにおいてユニークな）ＥｃｏＲ
Ｉ部位を有する（図５）。本明細書で用いられるA.ニド
ゥランスａｍｄＳ遺伝子は、プラスミドｐＧＷ３２５内
の約４kbサイズのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩフラグメント上
に位置する(Wernarsら, thesis (1986) Agricultural U
niversity, Wageningen, The Netherlands) 。ａｍｄＳ
遺伝子を含みそれ自体の調節配列が隣接したこのＥｃｏ
ＲＩ−ＫｐｎＩＤＮＡフラグメントを Verdoesら(Trans
genic Res. 2 pp 84-92, 1993)に記載されているｐＵＣ
１９の適切な部位に分子クローン化して、ｐＡＮ４−１
を得る。ｐＡＮ４−１をＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化
し、ａｍｄＳ遺伝子を含む４kbサイズのＤＮＡフラグメ
ントをアガロースゲル電気泳動で単離し、ＥｃｏＲＩ及
びＫｐｎＩで消化したｐＡＢ６−３１に連結し、連結混
合物を分子クローニングのためにE.コリに移した。得ら
れたプラスミドをｐＡＢ６Ｓと称し（図６）、3.８kbｇ
ｌａＡプロモーターＤＮＡフラグメント及び４kbａｍｄ
Ｓフラグメントを含んでいる。

【００５０】プラスミドｐＡＢ６ＳをまずＳａｌＩで部
分的に消化し、下記配列を有する合成誘導オリゴヌクレ
オチド TN0001(配列番号３）に連結し、次いでＥｃｏＲ
Ｉで消化した。 TN0001 (配列番号３）: 5′TCGATTAACTAGTTAA 3′ ｐＵＣ１９、ｇｌａＡプロモーター及びａｍｄＳ遺伝子
配列を含むＤＮＡフラグメントを精製し、アガロースゲ
ル電気泳動で単離した。ＳａｌＩで消化したプラスミド
ｐＡＢ６−１から2.２kb３′隣接ｇｌａＡＤＮＡフラグ
メントをアガロースゲル電気泳動で同様に単離し、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼで処理し、次にＥｃｏＲＩで
消化し、ｐＡＢ６Ｓの上記単離ＤＮＡフラグメントに連
結した上記合成オリゴヌクレオチドに連結した。ＤＮＡ
連結混合物をE.コリに移し、分子クローン化した。この
誘導プラスミドをｐＧＢＤＥＬ１と称し、図７に示され
ている。この手順によって同時にＳａｌＩ制限部位が破
壊され、全読み枠に停止コドンが導入された。

【００５１】ｇｌａＡ遺伝子の停止コドンのすぐ下流に
位置した３′ｇｌａＡ非コーディングＤＮＡ配列を含み
適切な制限部位が隣接した約１kbの大きなＤＮＡフラグ
メントを得るために、ＰＣＲ増幅を行った。本ＰＣＲ増
幅においては、プラスミドｐＡＢ６−１を鋳型として、
下記の２種類の合成誘導オリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして用いた：オリゴ AB2154 （配列番号４）： 5′AACCATAGGGTCGACTAGACAATCAATCCATTTCG 3′ (停止コドンのすぐ下流に３′ｇｌａＡ非コーディング
配列）及びオリゴ AB2155 （配列番号５）： 5′GCTATTCGAAAGCTTATTCATCCGGAGATCCTGAT 3′ (停止コドンの約１kb下流ＥｃｏＲＩ部位の前後に３′
ｇｌａＡ非コーディング配列）。

【００５２】Saikiら(Science 239,487-491, 1988) に
記載され、ＴＡＱポリメラーゼ(Cetus) の製造業者に従
ってＰＣＲを行った。ＤＮＡアンプリファイア(Perkin-
Elmer/Cetus)で２５増幅サイクル（各々５５℃で２分；
７２℃で３分及び９４℃で２分）を行った。１kb増幅Ｄ
ＮＡフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩで消化
し、アガロースゲル電気泳動で精製し、エタノール沈降
し、次にｐＧＢＤＥＬ１のＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩ
制限部位にクローン化した。このようにして得られたプ
ラスミドをｐＧＢＤＥＬ２と称した（図８及び９）。

【００５３】最終ｇｌａＡ遺伝子置換ベクターｐＧＢＤ
ＥＬ４Ｌを得るために、ｐＧＢＤＥＬ２のａｍｄＳプロ
モーター領域を強力なA.ニドゥランスｇｐｄＡプロモー
ターで交換した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法に
より、ｇｐｄＡプロモーター配列をａｍｄＳ遺伝子のコ
ーディング配列に融合した。本ＰＣＲ融合の場合、２種
類の鋳型を用いた：A.ニドゥランスｇｐｄＡプロモータ
ー及びA.ニドゥランスｔｒｐＣターミネーターの調節に
よってE.コリｈｐｈ遺伝子を含むプラスミドｐＡＮ７−
１ (Puntら, Gene 56, 117-124, 1987) 及びそれ自体の
調節配列の調節によってA.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子
を含むプラスミドｐＡＮ４−１。プライマーとして４種
の合成オリゴヌクレオチドを用い、下記配列を有した：オリゴ AB2977 （配列番号６）： 5′TATCAGGAATTCGAGCTCTGTACAGTGACC 3′ (E.コリｈｐｈ遺伝子のＡＴＧ開始コドンの下流約８８
０bpに位置した５′ｇｐｄＡプロモーター特定オリゴヌ
クレオチド）オリゴ AB2992 （配列番号７）： 5′GCTTGAGCAGACATCACCATGCCTCAATCCTGGGAA 3′ オリゴ AB2993 （配列番号８）： 5′TTCCCAGGATTGAGGCATGGTGATGTCTGCTCAAGC 3′ (両配列は相互に相補的であり、１８bpの３′端のｇｐ
ｄＡプロモーター及び１８bpの５′部分のａｍｄＳコー
ディング領域を含む）オリゴ AB2994 （配列番号９）： 5′CTGATAGAATTCAGATCTGCAGCGGAGGCCTCTGTG 3′ (ＡＴＧ開始コドンの約１７５bp下流のＢｇｌＩＩ部位
にａｍｄＳ特定配列）

【００５４】８８０bpｇｐｄＡプロモーター領域にａｍ
ｄＳコーディング配列に融合するために、２つの別個の
ＰＣＲを行った：鋳型としてｐＡＮ７−１及びプライマ
ーとしてオリゴヌクレオチド AB2977(配列番号６）及び
AB2993(配列番号８）を用いた５′端のａｍｄＳ遺伝子
に相補的な１８ヌクレオチドが３′周辺に隣接したｇｐ
ｄＡプロモーターを含む８８０bpＤＮＡフラグメントを
増幅する第１増幅及び鋳型としてｐＡＮ４−１及びプラ
イマーとしてオリゴヌクレオチド AB2992(配列番号７）
及び AB2994(配列番号９）を用いた３′端のｇｐｄＡプ
ロモーターに相補的な１８ヌクレオチドが５′周辺に隣
接した５′部分のａｍｄＳ遺伝子を含む２００bpサイズ
のＤＮＡフラグメントを増幅する第２ＰＣＲ反応。これ
らの増幅の模式図は図１０に示されている。引き続き作
成した２フラグメントをアガロースゲル電気泳動で精製
し、エタノール沈降し、プライマーとしてオリゴヌクレ
オチド AB2977(配列番号６）及び AB2994(配列番号９）
を用いた第３ＰＣＲ反応における鋳型として用いた。得
られたＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲＩで消化し、アガ
ロースゲル電気泳動で精製し、エタノール沈降し、ｐＴ
Ｚ１８Ｒ(United States Biochemicals)のＥｃｏＲＩ部
位にクローン化した。得られたプラスミドをｐＧＢＧＬ
Ａ２４と称した（図１１）。ｐＧＢＤＥＬ２のａｍｄＳ
プロモーターをｇｐｄＡプロモーター配列に交換するた
めに、適切な制限酵素で消化した後ｐＧＢＧＬＡ２４の
約１kbサイズのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩＤＮＡフラグメ
ントをアガロースゲル電気泳動で単離し、ｐＧＢＤＥＬ
２のＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩ部位に連結した。得られ
たｇｌａＡ遺伝子置換ベクターをｐＧＢＤＥＬ４Ｌと称
した（図１２）。

【００５５】A.ニガーにおけるｇｌａＡプロモーター及
びコーディング配列の欠失 A.ニガーをｐＧＢＤＥＬ４Ｌで形質転換する前に、E.コ
リ配列をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ消化及びアガロー
スゲル電気泳動で除去した。A.ニガー株 CBS 513.88(19
88年10月10日寄託）を選択プレートにおいて単独のＮ源
としてアセトアミドを用いる実験法で記載した手順で2.
５、５又は１０μg ＤＮＡフラグメントで形質転換し
た。A.ニガー単一形質転換細胞をアセトアミド含有選択
最少プレート上で数回精製した。個々の形質転換細胞を
0.４％ジャガイモデキストロース(Oxoid, England)上３
０℃で約５日間発育させることにより胞子を集めた。切
断型ｇｌａＡ遺伝子座の存在を証明するためにサザン分
析を行った。数個の形質転換細胞の高分子量ＤＮＡを単
離し、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化し、次に0.７％ア
ガロースゲル電気泳動で分別した。ニトロセルロースフ
ィルターに移した後、ハイブリッド形成を２種の³²Ｐ標
識プローブ：プラスミドｐＡＢ６−４（上記図３）から
単離したＸｈｏＩ／ＳａｌＩｇｌａＡプロモーターフラ
グメント及びキシラナーゼ内在配列（欧州特許出願第 0
463 706 A号) を認識するプローブを用いて標準手順に
従って行った。４種の形質転換細胞(#19、#23 、#24 、
#41)及び対照株A.ニガー CBS 531.88 の結果が例として
図１３及び１４に示されている。このオートラジオグラ
フィーを更に良く理解するために、模式図が図１７に示
され、自然型及び切断型ｇｌａＡ遺伝子座におけるハイ
ブリッド形成フラグメントのサイズが示されている。

【００５６】自然型ｇｌａＡ遺伝子座の特徴はＢａｍＨ
Ｉ消化物中3.５kbのハイブリッド形成フラグメント及び
ＫｐｎＩ消化物中4.５kbのハイブリッド形成フラグメン
トである（図１５参照）。切断型ｇｌａＡ遺伝子座にお
いては、3.５kbのＢａｍＨＩハイブリッド形成フラグメ
ント及び4.５kbのＫｐｎＩハイブリッド形成フラグメン
トが存在せず、5.５kbのＢａｍＨＩハイブリッド形成フ
ラグメント及び6.３kbのＫｐｎＩハイブリッド形成フラ
グメントに置き換えられる。図１３及び１４でわかるよ
うに本実施例においては、形質転換細胞 #19が切断型ｇ
ｌａＡ遺伝子座の予想されたパターンを示している（図
１６）。本形質転換細胞をＧＢＡ−１０２と称した。ｇ
ｌａＡ遺伝子の置換は他の形質転換細胞では起きなかっ
た。不十分なハイブリッド形成バンド：ＫｐｎＩ消化物
中４、８及び１５kb及びＢａｍＨＩ消化物中７及び１２
kbは、内部対照としてのキシラナーゼ配列を意味する。

【００５７】フルオロアセトアミド含有プレート上逆選
択によるA.ニガーＧＢＡ−１０２からａｍｄＳ遺伝子の
除去形質転換細胞A.ニガーＧＢＡ−１０２内ａｍｄＳ遺伝子
を実験の項で記載されているように除去した。染色体Ｄ
ＮＡのサザン分析により、２生存組換え体株にのみａｍ
ｄＳ選択マーカー遺伝子の除去が証明された。高分子量
ＤＮＡを単離し、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化し、次
に0.７％アガロースゲル電気泳動で分離した。ニトロセ
ルロースに移した後、前項で記載したプローブを用いて
標準手順に従ってハイブリッド形成した。ハイブリッド
形成フラグメントの模式図は図１７に示されている。サ
ザン分析の結果は、図１６に示されている。5.２kbのハ
イブリッド形成ＢａｍＨＩフラグメント及び3.４kbのハ
イブリッド形成ＫｐｎＩフラグメントの存在及び5.５kb
のＢａｍＨＩフラグメント及び6.３kbのハイブリッド形
成ＫｐｎＩフラグメントのロスは、ａｍｄＳ選択マーカ
ーが存在しないことに特異的である。ハイブリッド形成
の弱いＢａｍＨＩ消化物中７及び１２kbフラグメント及
び４、８及び１５kbＫｐｎＩはキシラナーゼ内在遺伝子
座を意味する。両株は予想されたパターンを示してい
る。ＧＢＡ−１０７及びＧＢＡ−１０８と称されるこれ
らの組換え体株においては、好ましいｇｌａＡ配列が正
しく除去され、最後に選択マーカー遺伝子を全く有しな
い。同種のベクターを用いることにより他の遺伝子又は
ＤＮＡ要素を欠失又は挿入するために両株を用いること
もできる。

【００５８】

【実施例２】A.ニガーＧＢＡ−１０７における切断型ｇｌａＡ遺伝子
座の３′ｇｌａＡ非コーディング領域で標的にしたｇｌ
ａＡ遺伝子のマーカー遺伝子を含まない導入本実施例においては、A.ニガーのゲノムへの遺伝子の導
入は、上記実施例で記載されたほぼ同様の方法及び手順
を用いて記載される。所望の遺伝子又はＤＮＡ要素の他
に、ベクターは単一交差結果によって宿主の予め特定さ
れたゲノム遺伝子座のベクターを標的にする宿主ゲノム
に相同なＤＮＡ配列を含んでいる。この種類のベクター
は、同様にＤＮＡ反復が隣接した選択マーカー遺伝子を
含んでいる。本ベクターで誘導された形質転換細胞内選
択マーカー遺伝子は、抵抗選択法を用いることによって
も適切に除去することができる。例としてｇｌａＡ遺伝
子コピーの導入が記載され、実施例１で誘導した組換え
体ΔｇｌａＡA.ニガーＧＢＡ−１０７株における切断型
ｇｌａＡ遺伝子座に組込まれる（模式図として図１８及
び１９参照）。

【００５９】ｇｌａＡ組込みベクター：ｐＧＢＧＬＡ３
０の説明組込みベクターｐＧＢＧＬＡ３０は、３′ｇｌａＡ非コ
ーディング配列が隣接した未変性プロモーターの調節に
よるA.ニガーアミログルコシダーゼ（ｇｌａＡ）遺伝子
及びA.ニドゥランスｇｐｄＡプロモーターの調節による
A.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子からなり、３′ｇｌａＡ
非コーディング領域に組込みかつ逆選択によりａｍｄＳ
選択マーカー遺伝子を除去する。組込みベクターの構築ｐＡＢ６−１由来の1.８kbＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩｇｌａ
Ａプロモーターフラグメント（図２０）をｐＴＺ１９Ｒ
(United States Biochemicals)のＳｍａＩ及びＥｃｏＲ
Ｉ部位にサブクローン化した。ｇｌａＡプロモーターフ
ラグメントのＸｈｏＩ部位の突出５′端をE.コリＤＮＡ
ポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて挿入し
た後、ｐＴＺ１９Ｒでクローン化した。このクローニン
グ操作によってＳｍａＩ部位が破壊され、ＸｈｏＩ部位
が回復する。このようにして得られたプラスミドをｐＧ
ＢＧＬＡ５と称した（図２０）。

【００６０】適切な制限部位（ＡａｔＩＩ、ＳｎａＢ
Ｉ、ＡｓｎＩ及びＮｏｔＩ）を導入しかつｇｌａＡプロ
モーターのＸｈｏＩ部位を破壊するために、下記の２種
のオリゴヌクレオチド AB3657(配列番号１０）及び AB3
658(配列番号１１）からなる合成フラグメントをｐＧＢ
ＧＬＡ５のＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ部位に挿入し
た： 5′AGCTTGACGTCTACGTATTAATGCGGCCGCT 3′AB3657 3′ ACTGCAGATGCATAATTACGCCGGCGAAGCT 5′AB3658 このようにして得られたプラスミドをｐＧＢＧＬＡ２６
と称した（図２１）。

【００６１】次いで、ｇｌａＡプロモーターの残りの
３′部分、ｇｌａＡコーディング配列及び３′ｇｌａＡ
非コーディング配列の一部を含むｐＡＢ６−１由来の3.
４kbのＥｃｏＲＩフラグメントをｐＧＢＧＬＡ２６のＥ
ｃｏＲＩ部位にクローン化した。この新しいプラスミド
をｐＧＢＧＬＡ２７と称した（図１５）。このプラスミ
ドをＥｃｏＲＩで消化し、下記オリゴヌクレオチド AB3
779(配列番号１２）及びAB3780(配列番号１３）からな
る合成フラグメントをｇｌａＡ遺伝子の３′ｇｌａＡ非
コーディング配列の端のＥｃｏＲＩ部位に挿入した： 5′AATTGGGGCCCATTAACTCGAGC 3′AB3779 3′ CCCCGGGTAATTGAGCTCGTTAA 5′AB3780 本クローニング段階により、ＥｃｏＲＩ部位が破壊さ
れ、ＡｐａＩ及びＸｈｏＩ制限部位が導入された。得ら
れたプラスミドをｐＧＢＧＬＡ４２と称した（図１
６）。2.２kbの３′ｇｌａＡ非コーディング配列の増幅
及び適切な制限部位の付随した調整をポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）法によって行った。

【００６２】これらのＰＣＲ反応においては、鋳型とし
て全ｇｌａＡ遺伝子座を含むプラスミドｐＡＢ６−１を
用い、プライマーとして下記配列を有する４種の合成オ
リゴヌクレオチドが設計された：オリゴ AB3448 （配列番号１４）： 5′GTGCGAGGTACCACAATCAATCCATTTCGC 3′ (ｇｌａＡ遺伝子の停止コドンのすぐ下流に３′ｇｌａ
Ａ非コーディング特定配列）オリゴ AB3449 （配列番号１５）： 5′ATGGTTCAAGAACTCGGTAGCCTTTTCCTTGATTCT 3′ (停止コドンの約１kb下流のＫｐｎＩ部位に３′ｇｌａ
Ａ非コーディング特定配列）オリゴ AB3450 （配列番号１６）： 5′AGAATCAAGGAAAAGGCTACCGAGTTCTTGAACCAT 3′ (停止コドンの約１kb下流のＫｐｎＩ部位に３′ｇｌａ
Ａ非コーディング特定配列）オリゴ AB3520 （配列番号１７）： 5′ATCAATCAGAAGCTTTCTCTCGAGACGGGCATCGGAGTCCCG 3′ (停止コドンの約2.２kb下流に３′ｇｌａＡ非コーディ
ング特定配列）

【００６３】ｇｌａＡ遺伝子の停止コドンの約１kb下流
のＫｐｎＩ部位を破壊しかつｇｌａＡ遺伝子の停止コド
ンの約2.２kb下流のＳａｌＩ部位をＸｈｏＩ部位に変え
るために、２つの別個のポリメラーゼ連鎖反応を行っ
た：プライマーとしてオリゴヌクレオチド AB3448 （配
列番号１４）及び AB3449 （配列番号１５）を用いてｇ
ｌａＡ遺伝子の停止コドンのすぐ下流に約１kbのＤＮＡ
フラグメントを増幅する第１反応及びプライマーとして
オリゴヌクレオチド AB3450 （配列番号１６）及び AB3
520 （配列番号１７）を用いて鋳型としてｐＡＢ６−１
を共に用いて３′ｇｌａＡ非コーディング領域のＫｐｎ
Ｉ部位のすぐ下流に約1.２kbのＤＮＡフラグメントを増
幅する第２反応。これらの増幅の模式図は図２４に示さ
れている。ＰＣＲは実施例１に記載されているように行
った。２５増幅サイクル（各々５５℃で１分；７２℃で
1.５分及び９４℃で１分）を行った。

【００６４】２つの作成したＰＣＲＤＮＡフラグメント
をアガロースゲル電気泳動で精製し、エタノール沈降
し、引き続きプライマーとしてオリゴヌクレオチド AB3
448 （配列番号１４）及び AB3520 （配列番号１７）を
用いる第３ＰＣＲの鋳型として用い融合フラグメントを
作成した。ＤＮＡアンプリファイア(Perkin-Elmer/Cetu
s)において２５増幅サイクル（各々５５℃で２分；７２
℃で３分及び９４℃で２分）を行った。増幅したＤＮＡ
フラグメントをアガロースゲル電気泳動で精製し、エタ
ノール沈降し、引き続きｐＴＺ１８ＲのＳｍａＩ部位で
サブクローン化した。得られたプラスミドをｐＧＢＧＴ
ＬＡ１７と称した（図２５）。この調整した３′ｇｌａ
Ａ非コーディング領域をａｍｄＳ遺伝子に融合するため
に、ａｍｄＳ遺伝子の一部をｐＧＢＤＥＬ４ＬからｐＳ
Ｐ７３ (Promega)にサブクローン化した。この構築の場
合、ｐＧＢＤＥＬ４ＬをＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ
で消化し、3.４kbのａｍｄＳ／３′ｇｌａＡ非コーディ
ングフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、
ｐＳＰ７３ (Promega)の適切な部位にサブクローン化し
た。得られたプラスミドをｐＧＢＧＬＡ２１と称した
（図２６）。

【００６５】このプラスミドの約１kbサイズの３′ｇｌ
ａＡ非コーディング領域をｐＧＢＧＬＡ２１の2.２kbの
３′ｇｌａＡ非コーディング領域に交換した。ｐＧＢＧ
ＬＡ１７及びｐＧＢＧＬＡ２１をＫｐｎＩ及びＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化した。ｐＧＢＧＬＡ１７の2.２kbの３′ｇ
ｌａＡ非コーディング領域ＤＮＡフラグメント及びｐＧ
ＢＧＬＡ２１の4.９kbのＤＮＡフラグメントをアガロー
スゲル電気泳動で単離し、連結し、引き続き連結混合物
をE.コリに移すことにより分子クローン化した。このよ
うにして誘導されたプラスミドをｐＧＢＧＬＡ２２と称
した（図２７）。伸長した３′ｇｌａＡ非コーディング
領域を有するａｍｄＳ遺伝子をｇｐｄＡプロモーターで
完了し、ａｍｄＳ遺伝子の残りの部分に融合した。ｐＧ
ＢＧＬＡ２２をＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化
し、4.４kbのａｍｄＳ／３′ｇｌａＡ非コーディング領
域ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離
し、引き続きＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した
プラスミドｐＧＢＧＬＡ２４で消化し、E.コリに移し
た。このようにして誘導されたプラスミドをｐＧＢＧＬ
Ａ２５と称した（図２８）。

【００６６】ｐＧＢＧＬＡ２５をＥｃｏＲＩで部分的に
消化し、ｇｐｄＡプロモーターのＥｃｏＲＩ部位におい
て下記の２種のオリゴヌクレオチド AB3781 （配列番号
１８）及び AB3782 （配列番号１９）からなる合成フラ
グメントを挿入した： 5′AATTGGGGCCCAGCGTCC 3 ′AB3781 3′ CCCCGGGTCGCAGGTTAA 5 ′AB3782 この新しいプラスミドをｐＧＢＧＴＬＡ４３と称した
（図２９）。このクローニング段階のために、ｇｐｄＡ
プロモーターのすぐ前のＥｃｏＲＩ制限部位がＡｐａＩ
制限部位の導入によって破壊された。プラスミドｐＧＢ
ＧＬＡ４３をＡｐａＩ及びＸｈｏＩで消化し、ｇｐｄＡ
プロモーター／ａｍｄＳ遺伝子／３′ｇｌａＡ非コーデ
ィング領域を含む5.３kbのＤＮＡフラグメントをアガロ
ースゲル電気泳動で単離し、引き続きＡｐａＩ及びＸｈ
ｏＩで消化したｐＧＢＧＬＡ４２と連結し、E.コリに移
した。この誘導プラスミドをｐＧＢＧＬＡ２８と称した
（図３０）。

【００６７】クローニングの前に、３′ｇｌａＡ非コー
ディング領域ＤＮＡフラグメント（ｇｌａＡ遺伝子の停
止コドンの約2.２kb下流に位置し、３″ｇｌａＡ非コー
ディング領域を示す）を増幅し、ＰＣＲ法を用いて適切
な制限部位を設けた。このＰＣＲ反応の場合、鋳型とし
てプラスミドｐＡＢ６−１を用い、プライマーとして下
記配列を有する２種のオリゴヌクレオチドを設計した：オリゴ AB3746 （配列番号２０）： 5′TGACCAATAAAGCTTCTCGAGTAGCAAGAAGACCCAGTCAATC 3 ′ (ｇｌａＡ遺伝子の停止コドンの約2.２kb下流に位置し
たＳａｌＩ部位に部分的３″ｇｌａＡ非コーディング特
定配列）オリゴ AB3747 （配列番号２１）： 5′CTACAAACGGCCACGCTGGAGATCCGCCGGCGTTCGAAATAACCAGT3′ (ｇｌａＡ遺伝子の停止コドンの約4.４kb下流に位置し
たＸｈｏＩ部位に部分的３″ｇｌａＡ非コーディング特
定配列）

【００６８】ＤＮＡアンプリファイア(Perkin-Elmer/Ce
tus)において２５増幅サイクル（各々５５℃１分；７２
℃1.５分；９４℃１分）を行った。この増幅の模式図
は、図３１に示されている。このようにして得られたＤ
ＮＡフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロー
スゲル電気泳動で精製し、エタノール沈降し、ｐＴＺ１
９ＲのＨｉｎｄＩＩＩ部位に両方向でサブクローン化し
た。得られたプラスミドをｐＧＢＧＬＡ２９Ａ及びｐＧ
ＢＧＬＡ２９Ｂと称した（図３１及び３２）。最終段階
は、ｐＧＢＧＬＡ２９Ａの３″ｇｌａＡ非コーディング
配列をプラスミドｐＧＢＧＬＡ２８に挿入することを含
んでいる。これを達成するために、ｐＧＢＧＬＡ２９Ａ
をＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化した。2.２kbサイ
ズの３′ｇｌａＡ非コーディング領域フラグメントをア
ガロースゲル電気泳動で単離し、引き続きＨｉｎｄＩＩ
Ｉ及びＮｏｔＩで消化したｐＧＢＧＬＡ２８に連結し、
E.コリに移した。この誘導組込みベクターをｐＧＢＧＬ
Ａ３０と称した（図３３）。

【００６９】組込みベクターｐＧＢＧＬＡ３０によるA.
ニガー GBA-107の形質転換形質転換の前に、ＸｈｏＩ消化及びアガロースゲル電気
泳動により組込みベクターｐＧＢＧＬＡ３０からE.コリ
配列を除去した。A.ニガー株 GBA-107を実験の項で記載
された手順により５又は１０μg ＤＮＡフラグメントで
形質転換した。A.ニガー単一形質転換細胞をアセトアミ
ド含有選択プレートで数回精製した。個々の形質転換細
胞を0.４％ジャガイモデキストロース(Oxoid, England)
上３０℃で約５日間発育させることにより胞子を集め
た。内在切断型ｇｌａＡ遺伝子座の３′ｇｌａＡ非コー
ディング領域への組込みが生じたかを証明するためにサ
ザン分析を行った。数個の形質転換細胞の高分子量ＤＮ
Ａを単離し、ＫｐｎＩ又はＢｇｌＩＩで消化し、引き続
き0.７％アガロースゲル電気泳動で分別した。ニトロセ
ルロースフィルターに移した後、標準法に従ってハイブ
リッド形成した。プローブとしてプラスミドｐＡＢ６−
４（上記実施例１）から単離した³²Ｐ標識約0.７kbのＸ
ｈｏＩ／ＳａｌＩｇｌａＡプロモーターフラグメントを
用いた。３種の形質転換細胞(#107-5 、#107-9及び#107
-7) 及び対照菌株A.ニガーGBA107及びその祖先A.ニガー
CBS 531.88の結果が例として図３４に示されている。こ
のオートラジオグラフィーを更に良く理解するために、
模式図が図３５、３６及び３７に示され、自然型ｇｌａ
Ａ遺伝子座、切断型ｇｌａＡ遺伝子座及び単一ｐＧＢＧ
ＬＡ３０コピーが予め特定された３′ｇｌａＡ非コーデ
ィング領域に組込まれた切断型ｇｌａＡ遺伝子座のハイ
ブリッド形成フラグメントのサイズが示されている。

【００７０】自然型ｇｌａＡ遺伝子座の特徴はＫｐｎＩ
消化物中4.５kbのハイブリッド形成フラグメント及びＢ
ｇｌＩＩ消化物中１０kbのハイブリッド形成フラグメン
トである。A.ニガー GBA-107の切断型ｇｌａＡ遺伝子座
の特徴は、ＫｐｎＩ消化物中3.４kbのハイブリッド形成
フラグメント及びＢｇｌＩＩ消化物中１３kbのハイブリ
ッド形成フラグメントである。ｐＧＢＧＬＡ３０ベクタ
ーを切断型ｇｌａＡ遺伝子座の３′領域に組込む場合に
は、ＫｐｎＩ消化物中3.４kbのハイブリッド形成フラグ
メントの他に6.７kbのハイブリッド形成フラグメントが
予想され、ＢｇｌＩＩ消化物中１３kbのハイブリッド形
成フラグメントが存在せず、１4.５kbのハイブリッド形
成フラグメントに置き換えられる。図３４でわかるよう
に、形質転換細胞 #107-5 及び #107-9 が切断型ｇｌａ
Ａ遺伝子座の予め特定された３′非コーディング領域に
組込まれた単一ｐＧＢＧＬＡ３０コピーの予想されたハ
イブリッド形成パターンを示している。形質転換細胞 #
107-7 のハイブリッド形成パターンは、ｐＧＢＧＬＡ３
０コピーを別のA.ニガー GBA-107のゲノムに組込むこと
を示している。ｐＧＢＧＬＡ３０コピーが正しく組込ま
れた形質転換細胞をGBA-119及び GBA-122と称し、ａｍ
ｄＳ選択マーカー遺伝子を引き続き適切に除去するため
に用いた。

【００７１】フルオロアセトアミド含有プレート上の逆
選択によるA.ニガー GBA-119及び GBA-122由来ａｍｄＳ
遺伝子の除去形質転換細胞A.ニガー GBA-119及び GBA-122内ａｍｄＳ
選択マーカー遺伝子を実験の項で記載されているように
除去した。染色体ＤＮＡのサザン分析により、若干の生
存組換え体菌株にａｍｄＳ選択マーカー遺伝子の除去が
証明された。高分子量ＤＮＡを単離し、ＫｐｎＩ及びＢ
ｇｌＩＩで消化し、引き続き0.７％アガロースゲル電気
泳動で分離した。ニトロセルロースに移した後、標準手
順に従ってハイブリッド形成した。プローブとしてプラ
スミドｐＧＢＧＬＡ２９Ａ（上記図３３）から単離した
³²Ｐ標識2.２kbのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ３″ｇｌａ
Ａ非コーディングフラグメントを用いた。

【００７２】ハイブリッド形成フラグメントの模式図は
図３５〜３８に示されている。A.ニガー GBA-119 (#AG5
-5、#AG5-6及び#AG5-7) 由来の３生存組換え体菌株及び
A.ニガー GBA-122 (#AG9-1、#AG9-2及び#AG9-4) 由来の
３生存組換え体菌株及び対照菌株A.ニガー CBS 531.88
及びA.ニガー GBA-107の結果が図３９及び４０に示され
ている。菌株A.ニガー CBS 531.88 においては、Ｋｐｎ
Ｉ消化物中に6.９kbのハイブリッド形成フラグメントが
存在し、ＢｇｌＩＩ消化物中に6.９kbのハイブリッド形
成フラグメントが存在する。A.ニガー GBA-107株におい
ては、ＫｐｎＩ消化物中に6.９kbのハイブリッド形成フ
ラグメントが存在し、ＢｇｌＩＩ消化物中に１３kbのハ
イブリッド形成フラグメントが存在する。３′ｇｌａＡ
非コーディング領域に組込まれたｐＧＢＧＬＡ３０単コ
ピーを有するA.ニガー株 GBA-119及び GBA-122において
は、ＫｐｎＩ消化物中に８kb及び6.７kbのハイブリッド
形成バンドが存在し、ＢｇｌＩＩ消化物中には、１4.５
kb及び7.６kbのハイブリッド形成バンドが存在する。

【００７３】ＫｐｎＩ消化物中6.７kb及び8.５kbのハイ
ブリッド形成フラグメントの存在及び８kbのハイブリッ
ド形成フラグメントの付随したロスはａｍｄＳ選択マー
カー遺伝子の正しい除去に特異的である。ＢｇｌＩＩ消
化物中、１4.５kb及び6.７kbのハイブリッド形成フラグ
メント及び7.６kbのハイブリッド形成フラグメントの付
随したロスはａｍｄＳ選択マーカー遺伝子が存在しない
ことに特異的である。図３９及び４０でわかるように、
#AG5-7、#AG5-5、#AG9-1及び#AG9-4は、正しく除去され
たａｍｄＳ選択マーカー遺伝子の予想されたハイブリッ
ド形成パターンを示している。これらの菌株を各々 GBA
-120、 GBA-121、 GBA-123及び GBA-124と称した。#AG5
-6及び#AG9-2株のハイブリッド形成パターンは全ｐＧＢ
ＧＬＡ３０コピーのロスを示し、切断型ｇｌａＡ遺伝子
座のみ有するA.ニガー GBA-107親株を生じる。振盪フラ
スコ発酵においてA.ニガー GBA-120、 GBA-121、 GBA-1
23及び GBA-124株のグルコアミラーゼ生産能を試験し
た。対照株としてA.ニガー CBS 531.88、GBA-107 、GBA
-119 及び GBA-122を試験した。振盪フラスコ発酵及び
グルコアミラーゼアッセイを実験の項で記載されている
ように行った。 GBA-119〜 GBA-124株においては、１５
０−２００U/mlで変動するレベルが測定された。これら
のグルコアミラーゼレベルは予想され、形質転換されな
い野生型親株A.ニガー CBS531.88 で得られたレベルに
匹敵するものであった。

【００７４】

【実施例３】A.ニガー GBA-107における切断型ｇｌａＡ遺伝子座の
３′ｇｌａＡ非コーディング領域で標的にしたフィター
ゼ遺伝子のマーカー遺伝子を含まない導入本実施例においては、A.ニガーゲノムへの遺伝子の導入
が上記実施例で記載されたほぼ同様の方法及び手順を用
いて記載される。主な違いは、問題の遺伝子及び選択マ
ーカー遺伝子が２種類のベクター上に位置しかつこれら
のベクターがA.ニガーに同時形質転換することである。
問題の遺伝子あるいはマーカー遺伝子の他に、ベクター
は単一交差結果によって宿主の予め特定されたゲノム遺
伝子座でベクターを標的にする宿主ゲノムに相同なＤＮ
Ａ配列を含んでいる。これらの（同時）形質転換細胞で
フルオロアセトアミド逆選択を行うことにより（実験手
順に記載されているように）、ａｍｄＳマーカー遺伝子
は単一交差結果による組込みで生じるＤＮＡ反復間の内
部組換え結果により適切に欠失される。

【００７５】同時形質転換に用いられるベクターの説明問題の遺伝子を有するｐＧＢＧＬＡ５３は、３′ｇｌａ
Ａ非コーディング配列が隣接したA.ニガーグルコアミラ
ーゼ（ｇｌａＡ）プロモーターの調節によるA.ficuumフ
ィタ遺伝子からなり、３′ｇｌａＡ非コーディング領域
に組込まれる。選択マーカー遺伝子を有するベクターｐ
ＧＢＧＬＡ５０は、３′ｇｌａＡ非コーディング配列が
隣接したA.ニドゥランスｇｐｄＡプロモーターの調節に
よるA.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子からなり、３′ｇｌ
ａＡ非コーディング領域に組込まれる。ｐＧＢＧＴＬＡ５０の構築経路ｐＧＢＧＬＡ５０の構築は、１クローニング段階を含ん
でいる。プラスミドｐＧＢＧＬＡ２９ＡをＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化し、付着端をE.コリＤＮＡポリメラーゼＩのク
レノウフラグメントを用いて挿入した。次いで、2.２kb
の３″ｇｌａＡ非コーディング領域フラグメントをアガ
ロースゲル電気泳動で単離し、次にＡｐａＩで消化しか
つＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を作成し
たｐＧＢＧＬＡ４３に連結し、E.コリに移した。正しい
方向の３″ｇｌａＡ非コーディング領域ＤＮＡフラグメ
ントを有するこの誘導プラスミドをｐＧＢＧＬＡ５０と
称した（図４１）。

【００７６】ｐＧＢＧＬＡ５３の構築経路ｐＧＢＧＬＡ５３の構築経路における第１段階は、A.fi
cuumフィターゼE.coliのほぼ全コーディング配列に融合
したｇｌａＡプロモーターを含む２フラグメントのサブ
クローニングである。これを達成するために、プラスミ
ドｐＧＢＧＬＡ４２をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで
消化し、1.８kbのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ５′ｇｌ
ａＡプロモーターフラグメントをアガロースゲル電気泳
動で単離した。プラスミドｐＦＹＴ３（欧州特許第0 42
0 358 A1号) をＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、フ
ィターゼ遺伝子の５′部分に融合したｇｌａＡプロモー
ターの３′部分を含む1.６kbのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ
フラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、ｐＧ
ＢＧＬＡ４２から単離した1.８kbのＨｉｎｄＩＩＩ／Ｅ
ｃｏＲＩ５′ｇｌａＡプロモーターフラグメントと共に
ｐＳｐ７３(Promega) のＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩ
部位に連結した。得られたプラスミドをｐＧＢＧＬＡ４
９と称した（図４２）。

【００７７】次の段階は、ｐＧＢＧＬＡ４９への３′ｇ
ｌａＡ非コーディング領域ＤＮＡフラグメントのクロー
ニングである。クローニングの前に、本３′ｇｌａＡ非
コーディング領域ＤＮＡフラグメント（ｇｌａＡ遺伝子
の停止コドンの約2.２kb下流に位置する）を増幅し、Ｐ
ＣＲ法を用いる適切な制限部位を設けた。これらのＰＣ
Ｒ反応の場合、鋳型としてプラスミドｐＡＢ６−１を用
い、プライマーとして下記配列を有する２種の合成オリ
ゴヌクレオチドが設計された：オリゴ AB4234 （配列番号２２）： 5′GAAGACCCAGTCAAGCTTGCATGAGC 3′ (ｇｌａＡ遺伝子の停止コドンの約2.２kb下流に位置し
た３′ｇｌａＡ非コーディング配列）オリゴ AB4235 （配列番号２３）： 5′TGACCAATTAAGCTTGCGGCCGCTCGAGGTCGCACCGGCAAAC 3′ (ｇｌａＡ遺伝子の停止コドンの約4.４kb下流に位置し
た３′ｇｌａＡ非コーディング配列）

【００７８】ＤＮＡアンプリファイア(Perkin-Elmer)に
おいて２５増幅サイクル（各々９４℃１分；５５℃１
分；７２℃1.５分）を行った。この増幅の模式図は、図
４３に示されている。このようにして得られたＤＮＡフ
ラグメントをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル
電気泳動で精製し、ｐＴＺ１９ＲのＨｉｎｄＩＩＩ部位
にサブクローン化した。得られたプラスミドをｐＧＢＧ
ＬＡ４７と称した（図４４）。プラスミドｐＧＢＧＬＡ
４７をＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、2.２kbの
３′ｇｌａＡ非コーディングＤＮＡフラグメントをアガ
ロースゲル電気泳動で単離し、ｐＧＢＧＬＡ４７のＨｉ
ｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩ部位にクローン化した。得られ
たプラスミドをｐＧＢＧＬＡ５１と称した（図４５）。

【００７９】ｐＧＢＧＬＡ５３の構築経路の最終段階
は、ｇｌａＡ遺伝子の停止コドンのすぐ下流に位置する
３′ｇｌａＡ非コーディングＤＮＡフラグメントに融合
したフィターゼコーディング配列の残りの部分を含むＤ
ＮＡフラグメントのクローニングである。クローニング
の前に、フィターゼ遺伝子の残りの部分とｇｌａＡ遺伝
子の停止コドンのすぐ下流に位置する３′ｇｌａＡ非コ
ーディングＤＮＡフラグメントを融合し、ＰＣＲ法に用
いる適切な制限部位を設けた。ＰＣＲ反応においては、
鋳型としてプラスミドｐＡＢ６−１を用い、プライマー
として下記配列を有する２種の合成オリゴヌクレオチド
を用いた：オリゴ AB4235 （配列番号２４）： 5′TGACCAATAAAGCTTAGATCTGGGGGTGATTGGGCGGAGTGTTTTGCTT AGACAATCAATCCATTTCGC 3′ （ＢｇｌＩＩ部位で開始するフィターゼコーディング配
列からｇｌａＡ遺伝子の停止コドンのすぐ下流で開始す
る３′ｇｌａＡ非コーディング領域に融合した停止コド
ンまでの３６bp）オリゴ AB4233 （配列番号２５）： 5′TGACCAATAGATCTAAGCTTGACTGGGTCTTCTTGC 3′ (ｇｌａＡ遺伝子の停止コドンの約2.２kb下流に位置し
た３′ｇｌａＡ非コーディング配列）

【００８０】ＤＮＡアンプリファイア(Perkin-Elmer)に
おいて２５増幅サイクル（各々９４℃１分；５５℃１
分；７２℃1.５分）を行った。この増幅の模式図は、図
４６に示されている。このようにして得られたＤＮＡフ
ラグメントをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル
電気泳動で精製し、ｐＴＺ１９ＲのＨｉｎｄＩＩＩ部位
に両方向でサブクローン化した。得られたプラスミドを
ｐＧＢＧＬＡ４８及びｐＧＢＧＬＡ５２と称した（図４
４）。プラスミドｐＧＢＧＬＡ５２をＢｇｌＩＩで消化
し、ＢａｍＨＩで部分的に消化し、2.２kbのフィターゼ
／３′ｇｌａＡ非コーディングＤＮＡフラグメントをア
ガロースゲル電気泳動で単離し、ｐＧＢＧＬＡ５１のＢ
ｇｌＩＩ部位にクローン化した。この正しい方向に2.２
kbのフィターゼ／３′ｇｌａＡ非コーディングＤＮＡフ
ラグメントを有する誘導プラスミドをｐＧＢＧＬＡ５３
と称した（図４８）。

【００８１】ベクターｐＧＢＧＬＡ５０及びｐＧＢＧＬ
Ａ５３によるA.ニガー GBA-107の形質転換形質転換の前に、ＸｈｏＩ又はＨｉｎｄＩＩＩ消化及び
アガロースゲル電気泳動によりベクターｐＧＢＧＬＡ５
０及びｐＧＢＧＬＡ５３からE.コリ配列を除去した。A.
ニガー GBA-107株を実験の項で記載された形質転換手順
を用いて１μgｐＧＢＧＬＡ５０フラグメント及び１μg
ｐＧＢＧＬＡ５３フラグメント、１μg ｐＧＢＧＬＡ
５０フラグメント及び５μg ｐＧＢＧＬＡ５３フラグメ
ント又は１μg ｐＧＢＧＬＡ５０フラグメント及び１０
μg ｐＧＢＧＬＡ５３フラグメントで形質転換した。

【００８２】実施例２と同様の消化物及びプローブを用
いて、単一形質転換細胞を単離、精製し、サザン分析を
行ってｐＧＢＧＬＡ５０及びｐＧＢＧＬＡ５３の両組込
みを証明した。分析した形質転換細胞の約１０−２０％
で両ｐＧＢＧＬＡ５０及びｐＧＢＧＬＡ５３がA.ニガー
GBA-107宿主株のゲノムに組込まれた。切断型ｇｌａＡ
遺伝子座の予め特定された３′ｇｌａＡ非コーディング
領域に共に組込まれた単コピーｐＧＢＧＬＡ５０及び単
コピーｐＧＢＧＬＡ５３の正しい組込みパターンを示す
形質転換細胞を用いて、ａｍｄＳ選択マーカー遺伝子を
除去した。フルオロアセトアミド含有プレート上の逆選択によるａ
ｍｄＳマーカー遺伝子の除去フルオロアセトアミド逆選択を行うことにより（実験手
順に記載されるように）、単一交差結果による組込みに
よって生じるＤＮＡ反復間の内部組換え結果によってａ
ｍｄＳマーカー遺伝子を欠失した（即ち３′ｇｌａＡ非
コーディング配列）。実施例２と同様の消化物及びプロ
ーブを用いたサザン分析により、ａｍｄＳマーカー遺伝
子のみの適切な除去を証明した。

【００８３】

【実施例４】 A.オリゼにおけるｇｌａＡ遺伝子及びフィターゼ遺伝子
のマーカー遺伝子を含まない導入本実施例は、A.オリゼ NRRL3485 におけるｇｌａＡ遺伝
子又はフィターゼ遺伝子のマーカー遺伝子を含まない導
入を記載するものである。実施例２及び３と同様のベク
ター及び方法を用いて実験の項で記載されているよう
に、A.オリゼ NRRL3485 を形質転換した。単一形質転換
細胞を単離、精製し、数種の形質転換細胞の染色体ＤＮ
Ａのサザン分析を行ってｐＧＢＧＬＡ３０ベクター又は
ｐＧＢＧＬＡ５０及びｐＧＢＧＬＡ５３ベクターの各々
の組込みを証明した。サザン分析においては、実施例２
と同様の消化物及びプローブを用いた。

【００８４】フルオロアセトアミド含有プレート上の逆
選択によるａｍｄＳ遺伝子の除去ｐＧＢＧＬＡ３０ベクターの組込みの場合、宿主株A.オ
リゼ NRRL3485 のゲノムに組込まれたｐＧＢＧＬＡ３０
の単コピーを有する形質転換細胞を用いてａｍｄＳ遺伝
子を適切に除去した。フルオロアセトアミド含有プレー
ト上の逆選択を実験の項で記載されているように行っ
た。数種のフルオロアセトアミド耐性株の染色体ＤＮＡ
のサザン分析により、ａｍｄＳ遺伝子の正しい除去を証
明した。実施例２と同様の消化物及びプローブを用い
た。ｐＧＢＧＬＡ５０及びｐＧＢＧＬＡ５３ベクターの
組込みの場合、宿主ゲノムに組込まれたｐＧＢＧＬＡ５
０及びｐＧＢＧＬＡ５３の双方の単コピーを有する形質
転換細胞を用いてａｍｄＳマーカー遺伝子を適切に除去
した。フルオロアセトアミドプレートを用いた逆選択を
実験の項で記載されているように行った。実施例２と同
様の消化物及びプローブを用いた数種のフルオロアセト
アミド耐性株の染色体ＤＮＡのサザン分析により、ａｍ
ｄＳマーカー遺伝子（例えばｐＧＢＧＬＡ５０ベクタ
ー）の正しい除去を証明した。。

【００８５】

【実施例５】T.リーサイにおけるｇｌａＡ遺伝子及びフィターゼ遺伝
子のマーカー遺伝子を含まない導入本実施例は、T.リーサイ株 QM9414 (ATCC 26921)におけ
るｇｌａＡ遺伝子又はフィターゼ遺伝子のマーカー遺伝
子を含まない導入を記載するものである。実施例２及び
３と同様のベクター及び方法を用いて実験の項で記載さ
れているように、T.リーサイ QM9414 を形質転換した。
単一形質転換細胞を単離、精製し、形質転換細胞の染色
体ＤＮＡのサザン分析を行ってｐＧＢＧＬＡ３０ベクタ
ー又はｐＧＢＧＬＡ５０及びｐＧＢＧＬＡ５３ベクター
が各々組込まれるかを証明した。サザン分析において
は、実施例２と同様の消化物及びプローブを用いた。

【００８６】フルオロアセトアミド含有プレート上の逆
選択によるａｍｄＳ遺伝子の除去ｐＧＢＧＬＡ３０ベクターの組込みの場合、宿主株T.リ
ーサイ QM9414 のゲノムに組込まれたｐＧＢＧＬＡ３０
の単コピーを有する形質転換細胞を用いてａｍｄＳ遺伝
子を適切に除去した。フルオロアセトアミド含有プレー
ト上の逆選択を実験の項で記載されているように行っ
た。フルオロアセトアミド耐性株の染色体ＤＮＡのサザ
ン分析により、ａｍｄＳ遺伝子の正しい除去を証明し
た。実施例２と同様の消化物及びプローブを用いた。ｐ
ＧＢＧＬＡ５０及びｐＧＢＧＬＡ５３ベクターの組込み
の場合、宿主ゲノムに組込まれたｐＧＢＧＬＡ５０及び
ｐＧＢＧＬＡ５３の双方の単コピーを有する形質転換細
胞を用いてａｍｄＳマーカー遺伝子を適切に除去した。
フルオロアセトアミドプレートを用いた逆選択を実験の
項で記載されているように行った。実施例２と同様の消
化物及びプローブを用いた数種のフルオロアセトアミド
耐性株の染色体ＤＮＡのサザン分析により、ａｍｄＳマ
ーカー遺伝子（例えばｐＧＢＧＬＡ５０ベクター）の正
しい除去を証明した。。

【００８７】

【実施例６】選択マーカーとしてａｍｄＳ遺伝子を用いた同時形質転
換によるP.クリストゲナム(P.chrysogenum) 遺伝子のP.
クリストゲナムへのマーカー遺伝子を含まない導入本実施例には、同時形質転換によりP.クリストゲナムの
ゲノムへ遺伝子をマーカー遺伝子を含まずに導入するこ
とが記載される。同時形質転換法においては、２種類の
ＤＮＡがプロトプラストに与えられ、１つが実験の項で
記載されているようにその存在で第１形質転換細胞選択
が起こるａｍｄＳ選択マーカーであり、１つは問題の具
体的な酵素をコードする別の種類の問題のＤＮＡであ
る。多数の形質転換細胞においては、両種のＤＮＡが染
色体に組込み、安定に維持され、発現される。次いで、
実験の項で記載されているように逆選択手順を用いるこ
とによりａｍｄＳ選択マーカー遺伝子を精製形質転換細
胞から選択的に除去することができ、もう１つのＤＮＡ
は形質転換細胞の染色体に安定に組込まれたままであ
る。この方法の一般応用性を説明する例として、ｎｉａ
Ｄ遺伝子のマーカー遺伝子を含まない導入が記載され、
単独窒素源として硝酸塩上でｎｉａＤ宿主を発育させる
ことが可能である。

【００８８】この同時形質転換用宿主は、硝酸塩レダク
ターゼがなく従って単独の窒素源として硝酸塩を含有す
るプレート上で発育させることができないP.クリストゲ
ナムｎｉａＤ株である。これらの菌株は、周知の方法に
より容易に得ることができる(Goukaら, Journal of Bio
technology 20(1991), 189-200及びその中の参考文献)
。同時形質転換（実験の項で記載されている手順）
で、２種類のＤＮＡが同時にプロトプラストに与えられ
る：ａｍｄＳ選択マーカー遺伝子を含むｐＧＢＧＬＡ２
８の7.６kbのＥｃｏＲＩ制限フラグメント及びP.クリス
トゲナムｎｉａＤ遺伝子を含むｐＰＣ１−１の6.５kbの
ＥｃｏＲＩ制限フラグメント。形質転換前に、両フラグ
メントはアガアロースゲル電気泳動でE.コリベクター配
列から分離されており、電子溶離によりアガロースゲル
から精製されている。実験の項で記載されているよう
に、単独の窒素源としてアセトアミドを含有する選択プ
レート上で形質転換細胞の第１選択が起こる。形質転換
細胞の中で、同時形質転換細胞は単独の窒素源として硝
酸塩を含有するプレートで精製形質転換細胞の胞子をレ
プリカ培養することにより見出される。典型的にはレプ
リカ培養形質転換細胞の約２０−６０％がこの培地上で
発育させることができ、これらの形質転換細胞において
ａｍｄＳ選択マーカー遺伝子だけでなくｎｉａＤ遺伝子
もゲノムに組込まれており、発現される。

【００８９】フルオロアセトアミド含有プレート上での
逆選択によるａｍｄＳ遺伝子の除去引き続きフルオロアセトアミドの逆選択により同時形質
転換細胞からａｍｄＳ選択マーカー遺伝子を除去する。
ａｍｄＳ^-／ｎｉａＤ⁺表現型の直接選択の場合、用い
られる培地は１０mMフルオロアセトアミドを含有した。
１プレートにつき１０⁴胞子の濃度で胞子を塗布した。
２５℃で５−７日間インキュベートした後、フルオロア
セトアミド耐性コロニーがぼんやりした背景と明らかに
異なる固形コロニーとして確認することができた。組換
え体のｎｉａＤ⁺表現型は単独の窒素源として硝酸塩を
含有するフルオロアセトアミド培地上で発育することに
より証明される。組換え体のａｍｄＳ表現型は、単独の
窒素源としてアセトアミドを含有するプレート上で組換
え体の発育がないことで確認された。典型的には、塗布
した胞子の最初の数の0.１−２％が所望の表現型を示し
た。フルオロアセトアミド耐性株由来の染色体ＤＮＡの
サザン分析により、ａｍｄＳ選択マーカー遺伝子がP.ク
リソゲナムゲノムから除去されたことを確認した。

【００９０】

【実施例７】酵母クルイベロミセスラクチスのａｍｄＳマイナス表現
型の試験 K.ラクチスにおけるａｍｄＳ選択系使用の必要条件は、
本酵母がアセトアミダーゼ活性を含まないことである。
これを試験するために、下記の３種類の固形培地にK.ラ
クチス株 CBS 683及び CBS 2360 を塗布した：Ｉ窒素源を除くすべての必須栄養分及びビタミン
を含む酵母炭素ベース（ＹＣＢ, Difco)。ＩＩ５mMアセトアミドで補足したＹＣＢ。ＩＩＩ 0.１％(w/v) ＮＨ₄(ＳＯ₄)₂で補足したＹＣ
Ｂ。３培地はすべて1.２％(w/v) Oxoid 寒天(Agar No.1) 及
びｐＨ7.０の３０mMリン酸ナトリウムバッファーを含有
した。Difco ＹＣＢは1.１７％(w/v) で用いた。十分に
増殖したK.ラクチスコロニーは窒素源としてアンモニウ
ムを含有する培地にのみ認められた。窒素源なし又は単
独の窒素源としてアセトアミドを含むプレートでは、増
殖が全く見られないかあるいは時にわずかなバックグラ
ウンド増殖が見られ、これは微量の窒素が混入している
寒天又は他の培地成分に起因すると思われる。K.ラクチ
ス株は共に単独の窒素源としてのアセトアミド上で発育
を維持する十分なアセトアミド活性がないことが結論さ
れる。

【００９１】

【実施例８】ａｍｄＳ遺伝子を酵母において使用するためのプラスミ
ドの構築ｐＧＢａｍｄＳ１の構築以前には、K.ラクチスにおけるヒト血清アルブミン（Ｈ
ＳＡ）の発現にｐＧＢＨＳＡ２０が用いられている (Sw
inkelsら 1993, Antonie van Leeuwenhoek 64,187-201)
。ｐＧＢＨＳＡ２０において、ＨＳＡｃＤＮＡはK.ラ
クチスＬＡＣ４プロモーターから誘導される（プラスミ
ドｐＧＢＨＳＡ２０の物理的地図として図４９）。ＨＳ
ＡｃＤＮＡは３′端にＬＡＣ４ターミネーターが隣接さ
れる。形質転換細胞の選択の場合、ｐＧＢＨＳＡ２０は
S.セレビシエＡＤＨ１プロモーター(Bennetzen, Hall
(1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025)で誘導された
抗生物質Ｇ４１８(Geneticin, BRL)(Reissら (1984) EM
BO J. 3, 3317-3322) に対する耐性を付与するＴｎ５ホ
スホトランスフェラーゼ遺伝子を含んでいる。ＬＡＣ４
プロモーターのユニークなＳｓｔＩＩ部位においては、
ｐＧＢＨＳＡ２０はE.コリでの増幅に用いられるE.コリ
ベクターｐＴＺ１９Ｒを含んでいる。K.ラクチスに形質
転換する前に、ＳｓｔＩＩ消化及びアガロースゲル精製
によりｐＧＢＨＳＡ２０からｐＴＺ１９Ｒを除去する。
ＬＡＣ４プロモーターのＳｓｔＩＩ部位で線状のｐＧＢ
ＨＳＡ２０をK.ラクチスに形質転換すると、相同的組換
えによりゲノムＬＡＣ４プロモーターに組込まれること
になる。ｐＧＢａｍｄＳ１は、ＨＳＡｃＤＮＡをｐａｍ
ｄＳ１のａｍｄＳｃＤＮＡに置き換えることによりｐＧ
ＢＨＳＡ２０誘導される。ＰＣＲを用いて、ａｍｄＳｃ
ＤＮＡの５′及び３′端にＳａｌＩ部位を導入した。こ
のＰＣＲにおいては、鋳型としてｐａｍｄＳ１を用い、
プライマーとしてオリゴ AB3514 （配列番号２６）及び
AB3515 （配列番号２７）を用いた。

【００９２】オリゴ AB3514 （配列番号２６）： 5′CTGCGAATTCGTCGACATGCCTCAATCCTGGG 3 ′ （導入したＳａｌＩ部位を有する５′端ａｍｄＳ特定配
列）オリゴ AB3515 （配列番号２７）： 5′ GGCAGTCTAGAGTCGACCTATGGAGTCACCACATTTC 3′ （導入したＳａｌＩ部位を有する３′端ａｍｄＳ特定配
列）このようにして得られたＰＣＲフラグメントをＳａｌＩ
で消化し、ｐＧＢＨＳＡ２０のＳａｌＩ／ＸｈｏＩ部位
にクローン化した。制限分析で判定される２方向のいず
れかのａｍｄＳｃＤＮＡを含む数種のクローンを得た。
正しい向きのａｍｄＳｃＤＮＡを有するクローンの１種
がｐＧＢａｍｄＳ１であり、その物理的地図が図４９に
示されている。

【００９３】ｐＧＢａｍｄＳ３の構築 S.セレビシエ延長因子１−α遺伝子（ＥＦ１−α；Naga
taら (1984) EMBO J.3, 1825-1830) から誘導されたプ
ローブを用いて異種ハイブリッド形成することにより、
Ｋ１ＥＦ１と呼ばれるＥＦ１−α遺伝子のK.ラクチス相
同染色体を含むゲノムクローンを単離した。本実施例に
おいては、Ｋ１ＥＦ１プロモーターを含む８１３bpフラ
グメントを用いてａｍｄＳｃＤＮＡをK.ラクチスで発現
した。オリゴヌクレオチド AB3701 （配列番号２８）及
び AB3700 （配列番号２９）を用いて、鋳型としてK.ラ
クチス株 CBS 683由来のゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲに
おいて本フラグメントを増幅した。 AB3700 （配列番号
２９）は、Ｋ１ＥＦプロモーターの２１ヌクレオチド及
びａｍｄＳ遺伝子のＡＴＧ開始コドンの上流に３８ヌク
レオチドを含むように設計される。 AB3701 （配列番号
２８）及び AB3700（配列番号２９）の配列を示す：オリゴ AB3701 （配列番号２８）： 5′CTGCGAATTCGTCGACACTAGTGGTACCATTATAGCCATAGGACAGCAAG 3′ (プロモーターの５′端に他の制限部位ＥｃｏＲＩ、Ｓ
ａｌＩ、ＳｐｅＩ及びＫｐｎＩを有する５′Ｋ１ＥＦ１
特定プロモーター配列）オリゴ AB3700 （配列番号２９）： 5′GCTCTAGAGCGCGCTTATCAGCTTCCAGTTCTTCCCAGGATT- GAGGCATTTTTAATGTTACTTCTCTTGC 3′ (制限部位ＢｓｓＨ２及び他の部位ＸｂａＩを有するａ
ｍｄＳｃＤＮＡの５′配列に融合した３′Ｋ１ＥＦ１特
定プロモーター配列）。

【００９４】標準条件を用いてＰＣＲを行い、得られた
ＰＣＲフラグメントをＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化
し、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ消化ｐＴＺ１９Ｒにサブクロ
ーン化した。得られたプラスミドｐＴＺＫ１ＥＦ１の物
理的地図は図５０に示されている。ａｍｄＳｃＤＮＡの
残りの部分及びＬＡＣ４ターミネーター配列の部分をｐ
ＧＢａｍｄＳ１からＢｓｓＨ２及びＳｐｈＩで消化する
ことにより得た。本ＢｓｓＨ２−ＳｐｈＩフラグメント
をＢｓｓＨ２及びＳｐｈＩ消化ｐＴＺＫ１ＥＦ１にクロ
ーン化し、得られたプラスミドをｐＧＢａｍｄＳ２と称
した（図５０）。最終段階のｐＧＢａｍｄＳ３の構築に
おいて、ｐＧＢａｍｄＳ２及びｐＴＹ７５ＬＡＣ４(Da
s, Hollenberg (1982) Current Genetics 6, 123-128)
を共にＳｐｈＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。残りの
ＬＡＣ４ターミネーター配列を含むｐＧＢａｍｄＳ２の
5.７kbＤＮＡフラグメント及びｐＴＹ７５ＬＡＣ４の1.
２kbＤＮＡフラグメントをアガロースゲルで精製した
後、分別し、次に連結し、E.コリを形質転換するために
用いた。ａｍｄＳｃＤＮＡがK.ラクチスＫ１ＥＦ１プロ
モーターから誘導された得られた発現ベクターをｐＧＢ
ａｍｄＳ３と称した（図５１）。

【００９５】ｐＧＢａｍｄＳ５の構築鋳型としてｐＧＢＨＳＡ２０を用いるＰＣＲにおいて、
S.セレビシエアルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＡＤＨ
１）プロモーターをａｍｄＳｃＤＮＡに融合した。プラ
イマーの１つ（AB3703; 配列番号３１）は、ａｍｄＳｃ
ＤＮＡの配列に融合される３′端のＡＤＨ１−プロモー
ター配列に相補的な配列を含んでいる。もう１つのプラ
イマー（AB3702; 配列番号３０）は、５′端のＡＤＨ１
プロモーターを含んでいる：オリゴ AB3702 (配列番号３０）： 5′CTGCGAATTCGTCGACACTAGTGGTACCATCCTTTTGTTGTTTCCGGGTG 3′ (プロモーターの５′端に他の制限部位ＥｃｏＲＩ、Ｓ
ａｌＩ、ＳｐｅＩ及びＫｐｎＩを有する５′ＡＤＨ１特
定プロモーター配列）オリゴ AB3703 （配列番号３１）： 5′GCTCTAGAGCGCGCTTATCAGCGGCCAGTTCTTCCCAGGAT- TGAGGCATTGTATATGAGATAGTTGATTG 3′ (他の制限部位ＢｓｓＨ２及びＸｂａＩを有する５′ａ
ｍｄＳ配列に融合した３′ＡＤＨ１特定プロモーター配
列）。

【００９６】『タッチダウン』プロトコール(Donら, (1
991) Nucleic Acids Res. 19, 4008) を用いてＰＣＲ反
応を行った。反応混合物を３０増幅サイクルに供し、ア
ニーリング温度を２サイクル毎に２℃下げ、５５℃を４
０℃の『タッチダウン』まで下げ、この温度で１０サイ
クル以上を行った（サイクル：９４℃で２′、アニーリ
ング２′、７２℃で３′）。得られたＰＣＲフラグメン
トをＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化し、ｐＴＺ１９Ｒに
サブクローンした。得られたプラスミドｐＴＺs.c.ＡＤ
Ｈ１は図５２に示されている。ｐＴＺs.c.ＡＤＨ１及び
ｐＧＢａｍｄＳ３をＫｐｎＩ及びＢｓｓＨ２で消化し
た。ｐＧＢａｍｄＳ３の6.８kbフラグメント及びｐＴＺ
s.c.ＡＤＨ１の７５０bpフラグメントをゲル電気泳動で
精製し、連結し、E.コリ JM109を形質転換するために用
いた。得られた発現ベクターをｐＧＢａｍｄＳ５と称し
た（図３７）。

【００９７】ｐＧＢａｍｄＳ５の構築プラスミドｐＧＢａｍｄＳ３は、Ｋ１ＥＦ１プロモータ
ーの調節による３′端に1.５kbのＬＡＣ４ターミネータ
ー配列が隣接したａｍｄＳｃＤＮＡを含んでいる（図５
１）。ｐＧＢａｍｄＳ６は、ＬＡＣ４プロモーターとｐ
ＧＢａｍｄＳ３のａｍｄＳ発現カセットの上流のターミ
ネーター配列の融合を含むフラグメントをクローン化す
ることにより構築される（図５３）。ＬＡＣ４プロモー
ターとターミネーター配列を融合するために、まずｐＰ
ＴＬＡＣ４を構築した（図５４）。ＰＣＲを用いて、更
に６００bpのＬＡＣ４ターミネーターフラグメントの
５′及び３′端に導入する。ＰＣＲにおいては、K.ラク
チス CBS 683染色体ＤＮＡを用い、プライマーとしてオ
リゴヌクレオチド AB3704 （配列番号３２）及び AB370
5 （配列番号３３）を用いた：オリゴ AB3704 （配列番号３２）： 5′GCTCTAGAAGTCGAC ACTAGTCTGCTACGTACTCGAGAATTTATACTTAGA- TAAG 3′ (他の制限部位ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＳｐｅＩ、Ｓｎａ
ＢＩ及びＸｈｏＩを有するＬＡＣ４停止コドンで開始す
るＬＡＣ４ターミネーター特定配列）オリゴ AB3705 （配列番号３３）： 5′ TGCTCTAGATCTCAAGCCACAATTC 3 ′ (他の制限部位ＸｂａＩを有する３′ＬＡＣ４ターミネ
ーター特定配列）。

【００９８】標準条件を用いてＰＣＲを行い、得られた
ＰＣＲフラグメントをＸｂａＩで消化し、ｐＴＺ１９Ｒ
のＸｂａＩ部位にサブクローン化してｐＴＬＡＣ４を得
た（図５４）。ＬＡＣ４プロモーター配列は、ｐＫＳ１
０５ (van den Bergら (1990) Bio/Technology 8, 135-
139)をＸｂａＩ及びＳｎａＢＩで消化することにより得
られる。ＸｂａＩ−ＳｎａＢＩＬＡＣ４プロモーターフ
ラグメントをｐＲＬＡＣ４のＳｐｅＩ／ＳｎａＢＩ部位
にクローン化し、ｐＰＴＬＡＣ４と称した（図５４）。
最終段階のｐＧＢａｍｄＳ６の構築において、ｐＧＢａ
ｍｄＳ４をＸｂａＩで消化した。ｐＰＴＬＡＣ４の4.１
kbのＤＮＡフラグメントをアガロースゲルで精製し、ｐ
ＧＢａｍｄＳ３のＳｐｅＩ部位にクローン化した。得ら
れた遺伝子置換ベクターをｐＧＢａｍｄＳ６と称した
（図５３）。

【００９９】ｐＧＢａｍｄＳ８の構築プラスミドｐＧＢａｍｄＳ７は、ＬＡＣ４プロモーター
の一部及びキモシン発現カセットを含むフラグメントを
ＬＡＣ４プロモーターとｐＧＢａｍｄＳ６との間にクロ
ーン化することにより構築した（図５５）。プラスミド
ｐＫＳ１０５は、ＬＡＣ４プロモーター (van den Berg
ら (1990) Bio/Technology 8, 135-139)の調節によるS.
セレビシエα因子のプレプロ領域に融合したプロキモシ
ンｃＤＮＡを含んでいる。ＰＣＲを用いて、更に制限部
位を融合ＬＡＣ４プロモーターとキモシン発現カセット
の５′及び３′端に導入した。ＰＣＲにおいては、鋳型
としてｐＫＳ１０５ＤＮＡを用い、プライマーとしてオ
リゴヌクレオチド AB3965（配列番号３４）及び AB3966
（配列番号３５）を用いた：オリゴ AB3965 （配列番号３４）： 5′CTGCTACGTAATGTTTTCATTGCTGTTTTAC 3′ (制限部位ＳｎａＢＩで開始するＬＡＣ４プロモーター
特定配列）オリゴ AB3966 （配列番号３５）： 5′ CCGCCCAGTCTCGAGTCAGATGGCTTTGGCCAGCCCC 3′ (他の制限部位ＸｈｏＩを有するキモシン特定配列）。

【０１００】標準条件を用いてＰＣＲを行い、得られた
ＰＣＲフラグメントをＳｎａＢ１及びＸｈｏＩで消化し
た。プラスミドｐＧＢａｍｄＳ６をＸｈｏＩで消化し、
次にＳｎａＢＩで消化し、１0.９kbのＤＮＡフラグメン
トを単離し、ゲル電気泳動で精製した。ＳｎａＢＩ−Ｘ
ｈｏＩ融合フラグメントＬＡＣ４プロモーター／キモシ
ン発現カセットをｐＧＢａｍｄＳ６のＳｎａＢＩ／Ｘｈ
ｏＩ部位にクローン化した。得られたプラスミドをｐＧ
ＢａｍｄＳ７と称した（図５５）。キモシン遺伝子から
開始コドンの約６６bp上流のＨｉｎｄＩＩＩ部位を破壊
するために、ｐＧＢａｍｄＳ７をＨｉｎｄＩＩＩで部分
的に消化し、E.コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフ
ラグメントで処理して平滑末端を作成し、引き続き連結
し、分子クローニングのためにE.コリに移した。この誘
導プラスミドをｐＧＢａｍｄＳ８と称し、破壊されたＨ
ｉｎｄＩＩＩ部位を有するＬＡＣ４プロモーターフラグ
メントを含んでいる。

【０１０１】

【実施例９】酵母K.ラクチスにおけるＬＡＣ４プロモーターからａｍ
ｄＳｃＤＮＡの発現発現ベクターｐＧＢａｍｄＳ１は、ａｍｄＳｃＤＮＡと
は別に抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する第２選
択マーカーを含んでいる。これにより十分に確立された
方法であるＧ４１８耐性を用いて形質転換細胞をまず選
択することができる(Sreekrishnaら (1984) Gene 28, 7
3-81) 。このようにして得られた形質転換細胞は引き続
きａｍｄＳｃＤＮＡの発現を証明しかつK.ラクチスのａ
ｍｄＳ⁺選択の条件を最適化するために用いることがで
きる。これらの条件が確立されると、ａｍｄＳ⁺形質転
換細胞が例えば発現カセットを用いて選択マーカーなし
に直接選択することができる。

【０１０２】ｐＧＢａｍｄＳ１（図４９）をＳｓｔＩＩ
消化によりＬＡＣ４プロモーターで線状にした。分別及
びアガロースゲルでの精製によりｐＴＺ１９Ｒ配列を除
去した。本ＤＮＡフラグメントの１５μg を用いてIto
H.ら (1983) J. Bacteriol.153, 163-168を実験の項で
記載された変更をしてK.ラクチス株 CBS 2360 及び CBS
683に形質転換した。形質転換プレートを３０℃で３日
間インキュベートした。引き続き両菌株の数個の独立形
質転換細胞及び野生型菌株を別の固形培地を含むプレー
トに線状に塗布した（表１参照）。ＹＥＰＤ及びＹＥＰ
Ｄ／Ｇ４１８は実験の項で記載されている。ＹＣＢ、Ｙ
ＣＢ／ＮＨ₄及びＹＣＢ／アセトアミドは各々培地Ｉ、
ＩＩ及びＩＩＩとして実施例７に記載されている。ＹＣ
Ｂ／ＮＨ ₄及びＹＣＢ−ｌａｃ／アセトアミドは各々１
％(w/v) ラクトース、ｐＨ7.０の３０mMリン酸ナトリウ
ムバッファー及び0.１％(w/v) ＮＨ₄(ＳＯ₄)₂あるいは
５mMアセトアミドで補足した0.１７％(w/v) 酵母窒素ベ
ース w/oアミノ酸及び硫酸アンモニウム(Difco) を含ん
でいる。

【０１０３】CBS 683/ｐＧＢａｍｄＳ１形質転換細胞の
ａｍｄＳ⁺表現型はＹＣＢ／アセトアミド上で明瞭であ
った（表１参照）。しかしながら、同様の発現ベクター
を含む CBS 2360 形質転換細胞は、ＹＣＢ／アセトアミ
ド上で増殖を示さなかった。種々のK.ラクチス株間のＬ
ＡＣ４プロモーターの調節における炭素源依存差が記載
されている(Breunig (1989) Mol.Gen. Genet. 216, 422
-427) ので、これはラクトース又はガラクトースが存在
しないときのａｍｄＳｃＤＮＡを進めるＬＡＣ４プロモ
ーターの誘導の欠如によるものであると推論された。表
１は、実際に単独の炭素源としてラクトース及び単独の
窒素源としてアセトアミドを含有する培地上で CBS 236
0 形質転換細胞が増殖することができることを示すもの
である。従って、用いられる炭素源に依存してこれらの
形質転換細胞は単独の窒素源としてアセトアミド上で酵
母K.ラクチスの増殖を維持するためにA.ニドゥランスａ
ｍｄＳｃＤＮＡを十分に発現することが結論される。

【０１０４】ＬＡＣ４プロモーターに組込まれたかを証
明するためにサザン分析を行った。CBS 2360及び CBS 6
83形質転換細胞の高分子量ＤＮＡを単離し、ＨｉｎｄＩ
ＩＩで消化し、次に0.７％アガロースゲルの電気泳動で
分別した。ニトロセルロースに移した後、標準手順に従
ってハイブリッド形成を行った。プローブとして、プラ
スミドｐＧＢＨＳＡ２０（図４９）から単離した³²Ｐ標
識約1.５kbＳａｃＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩＬＡＣ４プロモ
ーターフラグメントを用いた。ＬＡＣ４遺伝子座に組込
まれた単一ｐＧＢａｍｄＳ１発現カセットを含む CBS 6
83及び CBS 2360 形質転換細胞が確認され、各例が図５
６に示されており、各々をＫＡＭ−一１及びＫＡＭ−２
と称する。ｐＧＢａｍｄＳ１をＬＡＣ４プロモーターに
単コピーを組込むと4.２及び8.６kbの２つの新しいＨｉ
ｎｄＩＩＩフラグメントを作製し、共に形質転換細胞Ｋ
ＡＭ−１及びＫＡＭ−２内に存在する。 CBS 683が２Ｌ
ＡＣ４遺伝子座を含みかつｐＧＢａｍｄＳ１がＫＡＭ−
１でそれらの１つだけに組込まれているので、ＫＡＭ−
１の消化物は第２の妨害されないＬＡＣ４遺伝子座から
誘導された5.６kbのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントも示し
ている。

【０１０５】

【表１】表１種々の窒素及び／又は炭素源を含む固形培地上のK.ラクチス CBS 683及びCBS 23 60野生型及びｐＧＢａｍｄＳ形質転換細胞の増殖 ──────────────────────────────────── 菌株 CBS 683 CBS 2360 形質転換 DNA 無 pGBamdS1 無 pGBamdS1 ──────────────────────────────────── YEPD + + + + YEPD-G418 - + - + YCB - - - - YCB / NH₄ + + + + YCB / アセトアミド - + - - YNB-lac / NH₄ + + + + YNB-lac / アセトアミド - + - + ────────────────────────────────────

【０１０６】

【実施例１０】単独の窒素源としてアセトアミドを用いるK.ラクチス C
BS 683及び CBS 2360 形質転換細胞の直接選択ＳｓｔＩＩ線状ｐＧＢａｍｄＳ１（１５μg ）をIto H.
ら((1983) J. Bact. 153, 163-168)に記載されている標
準手順を次のように変更してK.ラクチス CBS 683及び C
BS 2360 に形質転換した。 − K.ラクチス培養物をＯＤ₆₁₀＝0.５−1.０で形質転
換用に収集した。 − ＤＮＡ細胞懸濁液を５分間熱ショック処理した後、
平板培養前に３０℃で１５０−１８０分１ml量で表現型
発現を行った。種々の培地を両株に用いた。 CBS683の
場合、ＹＥＰＤ／ＹＮＢ液（１＊ＹＮＢ（酵母窒素ベー
ス，Difco)、１％バクトペプトン、１％酵母エキス及び
２％グルコース）又はＹＮＢ−ｇｌｕ（１％(w/v) グル
コース及びｐＨ7.０の３０mMリン酸ナトリウムバッファ
ーで補足した１＊ＹＮＢ（酵母窒素ベース w/oアミノ酸
及び硫酸アンモニウム，Difco)) を用いた。このインキ
ュベーション後、細胞を２０００ｇ、室温で５分間遠心
し、次にＹＣＢ／アセトアミドに塗布した（実施例７参
照）。 CBS 2360 の場合、ＹＮＢ−ｌａｃ（１％(w/v)
ラクトース及びｐＨ7.０の３０mMリン酸ナトリウムバッ
ファーで補足した１＊ＹＮＢ（酵母窒素ベース w/oアミ
ノ酸及び硫酸アンモニウム，Difco)) を用いた。このイ
ンキュベーション後、細胞を２０００ｇ、室温で５分間
遠心し、次にＹＣＢ−ｌａｃ／アセトアミドに塗布した
（実施例９参照）。

【０１０７】３０℃で３日間発育させた。両株にａｍｄ
Ｓ⁺形質転換細胞が得られた。見られる形質転換頻度
は、Ｇ４１８選択を用いる場合に見られるものに匹敵し
た。形質転換細胞の正しい同定は、次のＧ４１８を含む
ＹＥＰＤプレートの平板培養及びサザン分析により確認
された。ａｍｄＳｃＤＮＡがＫ１ＥＦ１プロモーターか
ら進むｐＧＢａｍｄＳ３（図５１）をＸｈｏＩによる消
化でＬＡＣ４ターミネーターで線状とし、次に１５μg
のゲル単離フラグメントを上記ｐＧＢａｍｄＳ１の CBS
683への形質転換で記載したＹＣＢ／アセトアミドプレ
ートの直接選択を用いてK.ラクチス株 CBS 683に形質転
換した。得られた形質転換細胞の若干をサザンブロッテ
ィングで分析した。高分子量ＤＮＡを単離し、ＢａｍＨ
Ｉで消化し、次に0.７％アガロースゲルの電気泳動で分
離した。ニトロセルロースに移した後、標準手順に従っ
てハイブリッド形成した。プローブとしてプラスミドｐ
ＴＹ７５ＬＡＣ４ターミネーター（実施例８に記載され
ている）から単離した³²Ｐ標識1.２kbＳｐｈＩ／Ｈｉｎ
ｄＩＩＩＬＡＣ４ターミネーターフラグメントを用い
た。ｐＧＢａｍｄＳ３プラスミドを含む CBS 683形質転
換細胞及びｐＧＢａｍｄＳ３プラスミドを含む形質転換
細胞の結果は各々図５７及び５８に示されている。対照
株 CBS 683は図５８に示されている。 CBS 683形質転換
細胞においては、自然型ＬＡＣ４ターミネーターの3.７
kbハイブリッド形成フラグメントの他に6.８kbサイズの
ハイブリッド形成フラグメントが存在する。これは、Ｌ
ＡＣ４ターミネーター領域へのプラスミドの正しい組込
みを意味する。

【０１０８】これらの形質転換細胞のすべてにおいて、
ＬＡＣ４ターミネーターに１コピー以上で組込まれた
（6.８kbのハイブリッド形成フラグメントの強さはベク
ターの組込まれたコピー数に示される）。構成的Ｋ１Ｅ
Ｆ１プロモーターが選択マーカーとして有用なａｍｄＳ
ｃＤＮＡを進めることができることも結論される。同様
の結果がｐＧＢａｍｄＳ５（図５２）で得られ、ａｍｄ
ＳｃＤＮＡがS.セレビシエＡＤＨ１プロモーターから進
められる。

【０１０９】

【実施例１１】アセトアミド直接選択によるS.セレビシエのｐＧＢａｍ
ｄＳ５による形質転換本実施例においては、ａｍｄＳｃＤＮＡが他の酵母、例
えばS.セレビシエ内で選択マーカーとして用いることが
できるかを試験した。まず、実施例７のK.ラクチスと同
様の培地及び手順を用いて、S.セレビシエ株 D237-10B
のａｍｄＳ^-表現型及び単独の窒素源としてアンモニウ
ムの使用能が確立された。K.ラクチスの場合に認められ
たように、窒素源としてアンモニウムを含むプレートに
のみ十分に増殖されたS.セレビシエが見られた。窒素源
なし又は単独の窒素源としてアセトアミドを含むプレー
トにおいては、全く発育しないか又はときどきわずかな
バックグラウンド増殖が見られた。ＳｐｈＩで部分的に
消化することによりＡＤＨ１プロモーターでプラスミド
ｐＧＢａｍｄＳ５を線状にした。ｐＧＢａｍｄＳ１をK.
ラクチスに形質転換した実施例１０の形質転換手順を用
いて、S.セレビシエ株 D273-10B(ATCC 25657) を１５μ
g のゲル単離線状ｐＧＢａｍｄＳ５フラグメントで形質
転換した。形質転換後、この細胞をＹＣＢ／アセトアミ
ドプレート（実施例９参照）に塗布し、３０℃で３日間
発育させた。この形質転換でａｍｄＳ ⁺形質転換細胞が
得られた。引き続きａｍｄＳ形質転換細胞のサザン分析
により、ａｍｄＳｃＤＮＡがS.セレビシエゲノムに安定
に組込まれたことが確認された。

【０１１０】高分子量ＤＮＡを単離し、ＢａｍＨＩで消
化し、次に0.７％アガロースゲル電気泳動で分離し、ニ
トロセルロースでブロットした。プローブとしてｐＧＢ
ａｍｄＳ１から単離した³²Ｐ標識７５０bpＥｃｏＲＶａ
ｍｄＳフラグメントを用いた。D273-10B／ｐＧＢａｍｄ
Ｓ５形質転換細胞及び対照株D273-10B(ATCC 25657)の結
果は図５９に示されている。２ハイブリッド形成フラグ
メント、各々多コピーフラグメントを表す6.６kbフラグ
メント及びフランキングを表す不明サイズのハイブリッ
ド形成フラグメントは、D273-10B形質転換細胞内に存在
する。予想されるように対照株D273-10B(ATCC 25657)は
ハイブリッド形成フラグメントを示さない。

【０１１１】

【実施例１２】フルオロアセタミド逆選択を用いるK.ラクチス及びS.セ
レビシエａｍｄＳ⁺形質転換細胞からａｍｄＳマーカー
の除去上記実施例においては、単一交差相同的組換えによりａ
ｍｄＳ含有発現カセットがK.ラクチス及びS.セレビシエ
ゲノムに組込まれる。これは、これらのａｍｄＳ酵母形
質転換細胞のゲノムの直列反復がａｍｄＳｃＤＮＡに隣
接することを意味する。従って、ａｍｄＳｃＤＮＡは、
ｃＤＮＡを隣接する直列反復間に低頻度で生じる染色体
内有糸分裂組換え結果により形質転換細胞集団の小部分
で欠失する。A.ニドゥランスについてHynes, Pateman
((1970) Mol. Gen. Genet. 108, 107-116)によって示さ
れているように、ａｍｄＳ⁺細胞に有毒でありａｍｄＳ
^-に有毒でない化合物、フルオロアセトアミドを含む培
地を用いてこれらの結果を選択することが可能でなけれ
ばならない。ａｍｄＳ⁺細胞においては、フルオロアセ
トアミドがアンモニア及びフルオロアセテートに変換さ
れ、後者は酵素アセチル−ＣｏＡ−シンテターゼによっ
て活性化される。従って、ａｍｄＳ⁺酵母にも作用する
フルオロアセタミド逆選択の必要条件は、１）フルオロ
アセタミドはａｍｄＳ^-に有毒であってはならない、
２）酵母細胞壁及び原形質膜がフルオロアセタミドに対
して透過性でなければならない及び３）酵素アセチル−
ＣｏＡ−シンテターゼが活性でなければならないであ
る。

【０１１２】これを試験するために、ＫＡＭ−１と称す
るＬＡＣ４プロモーターに組込まれたｐＧＢａｍｄＳ１
の単コピーを含むK.ラクチス CBS 683形質転換細胞及び
ＫＡＭ−２と称するＡＤＨ１プロモーターに組込まれた
ｐＧＢａｍｄＳ５の単コピーを含むS.セレビシエ D273-
10B 形質転換細胞を用いた。ＫＡＭ−１及びＫＡＭ−２
双方を選択培地（ＹＣＢ／アセトアミド）で少なくとも
３回遺伝的精製に供し、ａｍｄＳ^-親株による混入を排
除した。ＫＡＭ−１及びＳＡＭ−１を各々１０mMフルオ
ロアセトアミドで補足したＹＣＢ／ＮＨ₄に１プレート
当たり約１０³CFU の濃度で塗布した。両ＫＡＭ−１及
びＳＡＭ−１の場合、３０℃で３〜６日後にフルオロア
セトアミド耐性コロニーが現れた。独立したＫＡＭ−１
及びＳＡＭ−１誘導ａｍｄＳ^-コロニーの染色体ＤＮＡ
によるサザン分析から、フランキング直列反復間で相同
的組換えによりK.ラクチス及びS.セレビシエゲノムから
ａｍｄＳｃＤＮＡが正しく除去されたことが確認され
た。事実、ＫＡＭ−１ａｍｄＳ ^-組換え体の１種には組
換えの交差点が多型性ＨｉｎｄＩＩＩ部位及びａｍｄＳ
ｃＤＮＡ間に位置した。

【０１１３】この多型性ＨｉｎｄＩＩＩはｐＧＢａｍｄ
Ｓ１のＬＡＣ４プロモーターのＬＡＣ４読み枠の９２bp
上流に存在するが、この部位はCBS 683 ＬＡＣ４プロモ
ーターに存在しない。組換え結果は、この具体的なＫＡ
Ｍ−１組換え体のゲノムにＨｉｎｄＩＩＩ部位が残り、
親株 CBS 683と区別することができなかった（図５６、
レーン６の4.２kbの余分なフラグメント参照）。従っ
て、このＫＡＭ−１組換え体は、ＫＡＭ−１ａｍｄＳ^-
組換え体の代わりにCBS 683 混入物を単離する可能性を
排除する。上記のことから、フルオロアセトアミド逆選
択を用いて並列反復が隣接した場合の酵母ゲノムからａ
ｍｄＳｃＤＮＡを除去することができることが結論され
る。本実施例においては、ａｍｄＳ^-K.ラクチス及びS.
セレビシエ組換え体が約0.１％の頻度で生じる。若干の
酵母株の場合、おそらくアセチルＣｏＡ−シンテターゼ
の強力な炭素カタボライト抑制のために、ＹＣＢ／ＮＨ
₄でフルオロアセタミドによる効率のよい逆選択を行う
ことができないことは特に言及される。これらの場合に
は、逆選択用に１０mMフルオロアセトアミドで補足した
ＹＣＢ−ガラクトース／ＮＨ₄(この培地は１％ラクトー
スの代わりに１％ガラクトースを含む以外は実施例９に
記載されるＹＣＢ−ｌａｃ／ＮＨ₄と同じものである）
が巧く用いられる。

【０１１４】

【実施例１３】ａｍｄＳマーカーを用いるK.ラクチス遺伝子のマーカー
遺伝子を含まない欠失酵母ゲノムの操作にしばしば用いられる手法は「一段遺
伝子破壊」であり、この方法は単一形質転換段階で遺伝
子を破壊（又は修飾）することができる(Rothsteinら
(1983) Methods Enzymol. 101, 202-211)。本方法にお
いては、酵母選択性マーカーによって破壊された標的遺
伝子のコピーを有する形質転換プラスミドが二重交差相
同的組換えにより酵母ゲノムに組込み、野生型標的遺伝
子が破壊コピーに置き換えられる。実施例１２に記載さ
れている『一段遺伝子破壊』とフルオロアセトアミド逆
選択の組合わせは、選択性マーカーを残さずに酵母ゲノ
ムから遺伝子を欠失させなければならない。本実施例に
おいては、K.ラクチス CBS 2360 ゲノムからＬＡＣ４遺
伝子を欠失させるためにこの組合わせが用いられる。K.
ラクチスＬＡＣ４遺伝子の一段遺伝子交換の場合、ｐＧ
ＢａｍｄＳ６（図５３）が構築され、ＬＡＣ４プロモー
ター及びターミネーター配列が隣接したａｍｄＳ発現カ
セットを含んでいる。更にａｍｄＳ発現カセットに並列
反復が隣接し、これらの並列反復間の染色体内組換えに
よりK.ラクチスゲノムからａｍｄＳ配列が除去されるよ
うに、ＬＡＣ４ターミネーターフラグメントがａｍｄＳ
発現カセットのすぐ上流に存在する。プラスミドｐＧＢ
ａｍｄＳ６をＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ゲ
ル電気泳動後6.６kbのＤＮＡフラグメントを単離した。
実施例１０に記載されている形質転換手順を用いてK.ラ
クチス CBS 2360 を形質転換するために、遺伝子置換ベ
クターを含むこのＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメン
トを用いた。交換されたＬＡＣ４遺伝子を有する形質転
換細胞をスクリーンするために、ａｍｄＳ⁺形質転換細
胞を0.００８％Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含むＹ
ＥＰＤプレートに塗布した。

【０１１５】ａｍｄＳ⁺形質転換細胞をサザンブロット
で分析した。高分子量ＤＮＡを単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ
で消化し、次に0.７％アガロースゲルによる電気泳動で
分離し、ニトロセルロースにブロットした。プローブと
してプラスミドｐＰＴＬＡＣ４（実施例８）から単離し
た³²Ｐ標識６００bpＸｂａＩＬＡＣ４ターミネーターフ
ラグメントを用いた。交換したＬＡＣ４遺伝子及び対照
株 CBS 2360 を有するａｍｄＳ⁺CBS 2360形質転換細胞
の結果は図４４に示されている。ａｍｄＳ⁺CBS 2360形
質転換細胞の場合には、正しく交換されたＬＡＣ４遺伝
子を意味する7.４kbハイブリド形成フラグメントが存在
する。対照株CBS 2360は2.０kbハイブリッドフラグメン
トを示し、これは自然型ＬＡＣ４遺伝子座を表してい
る。

【０１１６】引き続き、これらのａｍｄＳ⁺形質転換細
胞のフルオロアセトアミド逆選択によりａｍｄＳ^-表現
型を有する組換え体を得た。ａｍｄＳ^-組換え体の染色
体ＤＮＡでサザン分析を行った。高分子量ＤＮＡを単離
し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次に0.７％アガロースゲ
ルで分離し、ニトロセルロースにブロットした。上記と
同じ³²Ｐ標識プローブを用いた。ａｍｄＳ^-CBS 2360組
換え体の結果は、図６０に示されている。ａｍｄＳ^-組
換え体の場合には、5.４kbのハイブリッド形成フラグメ
ントが存在し、ＬＡＣ４遺伝子が存在しないこと及びａ
ｍｄＳマーカーの酵母ゲノムからの除去が確認された。
これらのK.ラクチスＬＡＣ４ ^-からａｍｄＳマーカーを
なくすと、更に遺伝子の欠失及び／又は修飾にａｍｄＳ
マーカーを再使用する可能性を与える。

【０１１７】

【実施例１４】ａｍｄＳマーカーを用いるK.ラクチスゲノムへの遺伝子
のマーカー遺伝子を含まない挿入遺伝子を酵母ゲノムにマーカー遺伝子含まずに挿入する
ために、モデル遺伝子としてキモシンｃＤＮＡを用い
た。本実施例においては、ＬＡＣ４遺伝子を置き換えか
つ選択マーカーを残さずにK.ラクチスＬＡＣ４遺伝子座
にキモシンｃＤＮＡを挿入した。マーカーのない遺伝子
挿入の原理は、この場合には交換ベクターｐＧＢａｍｄ
Ｓ８が問題の遺伝子、キモシンｃＤＮＡを含んでいるこ
とを除いて実施例１３に記載されている遺伝子のマーカ
ーを含まない欠失と同様である（図５５）。プラスミド
ｐＧＢａｍｄＳ８をＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化
し、8.０kbＤＮＡフラグメントをゲル単離した。１０μ
g のこのフラグメントを実施例１０に記載されているよ
うにK.ラクチス CBS 2360 に形質転換した。交換したＬ
ＡＣ４遺伝子及びキモシン活性を有するａｍｄＳ⁺形質
転換細胞が得られた。

【０１１８】キモシン活性を (van den Bergら (1990)
Bio/technology 8, 135-139)に記載されているように測
定した。これらの形質転換細胞の実施例１２に記載され
ている次のフルオロアセトアミド逆選択により、なおキ
モシンを生産するａｍｄＳ^-表現型と組換え体を単離し
た。ａｍｄＳ^-の染色体ＤＮＡのサザン分析により、キ
モシン⁺組換え体からＬＡＣ４遺伝子がキモシンに置換
されかつK.ラクチスゲノムからａｍｄＳマーカーが正し
く除去されていることが確認された。これらの組換え体
のａｍｄＳ^-／キモシン⁺表現型もＹＣＢ／アセトアミ
ドプレート上で発育しないこと及びキモシン活性の存在
（上記参照）によって確認された。これらの組換え体の
ａｍｄＳ^-表現型は、更にこれらの菌株のａｍｄＳマー
カーを用いる操作、例えばキモシン発現カセットの別の
コピーの組込み及び／又は実施例１３に記載されている
K.ラクチス遺伝子の欠失が可能である。

【０１１９】

【実施例１５】バシラス及びE.コリのａｍｄＳマイナス表現型の試験バシラスにおけるａｍｄＳ選択系の使用の必要条件は、
これらのグラム陽性菌がアセトアミダーゼ活性を有しな
いことである。これを試験するために、窒素源を除く必
須栄養分及びビタミンすべてを含むバシラス最少培地に
B.サチリス株 BS-154(CBS 363.94) を塗布した（２8.７
mMＫ₂ＨＰＯ₄、２２mMＫＨ₂ＰＯ₄、1.７mMクエン酸
ナトリウム、0.４mMＭｇＳＯ₄、0.７５μM ＭｎＳ
Ｏ₄、0.５％(w/v) グルコース及び1.５％寒天）。この
培地のままあるいは窒素源として２０mMアセトアミドで
補足した場合増殖は全く見られなかった。最少培地を窒
素源として２０mM（ＮＨ₄)₂ＳＯ₄あるいは２０mMＫＮ
Ｏ₃で補足した場合にのみ増殖が見られた。バシラス B
S-154(CBS 363.94) は、単独の窒素源としてアセトアミ
ド上で発育を維持するのに十分なアセトアミダーゼ活性
がないと結論される。この現象から、A.ニドゥランスａ
ｍｄＳ遺伝子はグラム陽性菌において選択マーカーとし
て使用しなければならない。

【０１２０】同様に、グラム陰性菌、この場合E.コリに
アセトアミダーゼ活性のないことを試験して、A.ニドゥ
ランスａｍｄＳ遺伝子がこれらの微生物にも選択マーカ
ーとして用いることができるかを確立した。この場合に
は、0.０２μg(w/v)チアミンで補足したＭ９最少培地
(Sambrookら (1989) “Molecular Cloning: a laborato
ry manual”, Cold Spring Harbour Laboratories, Col
d Spring Harbour, NewYork)を用いた。Ｍ９プレートに
塗布した場合にE.コリ JM109の十分発育されたコロニー
が見られた。しかしながら、Ｍ９プレートからＮＨ₄Ｃ
ｌが除かれたり２０mMアセトアミドに置き換えられた場
合には、全く発育しないかあるいはわずかなバックグラ
ウンド増殖のみ見られた。E.コリ JM109株は、単独の窒
素源としてアセトアミド上で増殖を維持するだけの十分
なアセトアミダーゼ活性がないと結論される。これによ
り、A.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子はグラム陰性菌にお
いて選択マーカーとして使用しなければならない。

【０１２１】

【実施例１６】細菌に有用なａｍｄＳ発現ベクターの構築ｐＧＢａｍｄＳ２２の構築種々のバシラス種においてA.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝
子を発現させるために、ｐａｍｄＳ−１のａｍｄＳｃＤ
ＮＡを基礎的なバシラス発現ベクターｐＢＨＡ−１（欧
州特許出願第 89201173.5 号; 物理的地図として図６
１）にクローン化した。ａｍｄＳｃＤＮＡ遺伝子のＡＴ
Ｇ開始コドンで、下記配列を有するオリゴヌクレオチド
AB3825 （配列番号３６）及び AB3826 （配列番号３
７）を用いてｐａｍｄＳ−１にＮｄｅＩ部位を導入し
た：オリゴ AB3825 （配列番号３６）： 5′CGCGCTTATCAGCGGCCAGTTCTTCCCAGGATTGAGGCATATGT 3′ オリゴ AB3826 （配列番号３７）： 5′CTAGACATATGCCTCAATCCTGGGAAGAACTGGCCGCTGATAAG 3′

【０１２２】これらのオリゴヌクレオチドのアニーリン
グは、標準法を用いて行った。得られた二本鎖ＤＮＡフ
ラグメントをＢｓｓＨＩＩ／ＸｂａＩ消化ｐａｍｄＳ−
１に連結し、E.コリに移した。形質転換細胞の１つから
ｐＧＢａｍｄＳ２１を単離し、制限酵素分析によって確
認した（図６３）。ｐＧＢａｍｄＳ２１をＫｐｎＩ及び
ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ａｍｄＳｃＤＮＡ含有フラグ
メントをＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＢＨ
Ａ−１にクローン化した。得られたプラスミドをｐＧＢ
ａｍｄＳ２２と称した（図６４）。ｐＧＢａｍｄＳ２５の構築選択マーカーとしてａｍｄＳを用いて所望のＤＮＡ配列
のB.リケニホルミスゲノムへの部位特異的組込みを証明
するために、ａｍｄＳｃＤＮＡを発現／組込みベクター
ｐＬＮＦでクローン化した（図６２）。B.リケニホルミ
スアミラーゼE.coliの５′及び３′非コーディング配列
を含むこのベクターは、対応する染色体アミラーゼ遺伝
子座において部位特異的組込みを可能にする。ｐＧＢａ
ｍｄＳ２１（上記、図６３）をＮｄｅＩ及びＰｖｕＩＩ
で消化し、ａｍｄＳｃＤＮＡ含有フラグメントをＮｄｅ
Ｉ及びＳｃａＩで消化したｐＬＮＦと連結した。連結混
合物をB.サチリス BS-154 (CBS 363.94)に形質転換し
た。２０μg/mlネオマイシンで補足した最少培地で選択
した。形質転換細胞の１つからプラスミドｐＧＢａｍｄ
Ｓ２５（図６６）を単離し、ＢＡＡ−１０１と称した。

【０１２３】ｐＧＢａｍｄＳ４１の構築 A.ニドゥランスａｍｄＳｃＤＮＡをE.コリで発現させる
ために、欧州特許第 0340 878 A1 号に記載されている
ｐＴＺ１８Ｒの誘導体、ｐＴＺ１８Ｒ／Ｎを用いた。ｐ
ＴＺ１８Ｒ／Ｎは、ＮｄｅＩ部位が試験管内部位特定突
然変異誘発を用いてｐＴＺ１８ＲのｌａｃＺ読み枠のＡ
ＴＧ開始コドンで作られる点でｐＴＺ１８Ｒと異なるも
のである。ｐＧＢａｍｄＳ２１をＮｄｅＩ及びＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化し、ａｍｄＳｃＤＮＡを含むゲル単離フラ
グメントをＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴ
Ｚ１８Ｒ／Ｎに連結した。この連結混合物を用いて、E.
コリ JM109を形質転換し、形質転換細胞の１つからｐＧ
ＢａｍｄＳ４１（図６７）を単離した。

【０１２４】

【実施例１７】選択マーカーとしてａｍｄＳ遺伝子を用いるバシラスの
形質転換 E.コリ配列をｐＧＢａｍｄＳ２２から欠失させかつａｍ
ｄＳｃＤＮＡのすぐ上流に“ｈｐａ２”プロモーターを
配置するために、ｐＧＢａｍｄＳ２２をＮｄｅＩで消化
し、連結により再び環状にし、B.サチリス BS-154 (CBS
363.94)を形質転換するために用いた。形質転換細胞を
アセタミド最少プレートで選択し、ネオマイシン耐性を
チェックした。これらの形質転換細胞の１つから発現ベ
クターｐＧＢａｍｄＳ２３（図６５）を単離し、制限酵
素分析により確認した。これらの結果は、１）バシラス
プロモーター配列の調節によってA.ニドゥランスａｍｄ
ＳｃＤＮＡが十分に発現される及び２）ａｍｄＳ遺伝子
がバシラスの形質転換において選択マーカーとして用い
ることができることを示している。

【０１２５】B.リケニホルミス T5 (CBS 470.83)をベク
ターｐＧＢａｍｄＳ２５で形質転換した。実験の項で記
載されているように形質転換を行い、単独の窒素源とし
て２０mMアセトアミドで補足した修飾プロトプラスト再
生プレート上で直接選択することによりａｍｄＳ⁺形質
転換細胞が得られた（実験に記載されている）。形質転
換細胞内のｐＧＢａｍｄＳ２５の存在は、ネオマイシン
耐性表現型及びプラスミドが形質転換細胞から再単離す
ることができる事実により確認した。ＢＡＡ−１０３と
称するこれらの形質転換細胞の１つを用いて、ｐＧＢａ
ｍｄＳ２５をアミラーゼ遺伝子座を標的にしたB.リケニ
ホルミスゲルムに組込ませた。プラスミド組込みは、単
独の窒素源としてアセトアミドを含む最少培地寒天上で
形質転換細胞を発育させることにより行った。若干のコ
ロニーを新しいプレートに繰り返し（２〜３回）移した
後、５０℃でインキュベートした。単離したコロニーを
単独の窒素源としてアセトアミド上での増殖能及び１μ
g/mlのネオマイシンに対する耐性について試験した。自
律複製プラスミドＤＮＡが存在しないことは、組込み体
から単離されたＤＮＡを宿主株に再び形質転換すること
により確立された。ネオマイシン耐性コロニーは得るこ
とができなかった。この結果から、ａｍｄＳ遺伝子単コ
ピーを含むバシラス種を選択するのにａｍｄＳ遺伝子が
適切なマーカーであることは明らかである。

【０１２６】

【実施例１８】選択マーカーとしてａｍｄＳ遺伝子を用いるE.コリの形
質転換標準手順を用いてE.コリ JM109をベクターｐＧＢａｍｄ
Ｓ４１で形質転換した。0.０２μg/mlチアミン及び５０
μg/mlアンピシリンで補足したＭ９プレートあるいは２
０mMアセトアミド、0.０２μg/mlチアミン及び0.０５mM
ＩＰＴＧで補足したアンモニウムを含まないＭ９プレー
トで選択した。ａｍｄＳ⁺／アンピシリン耐性形質転換
細胞を得、それからｐＧＢａｍｄＳ４１を再単離した。
アンピシリン又はアセトアミド上の選択を用いる形質転
換頻度は匹敵しうるものであった。これは、A.ニドゥラ
ンスａｍｄＳ遺伝子がグラム陰性菌の形質転換に選択マ
ーカーとして同様に機能することを証明するものであ
る。

【０１２７】

【実施例１９】ａｍｄＳ⁺細菌形質転換細胞のフルオロアセトアミド逆
選択フルオロアセトアミドを用いる細菌ａｍｄＳ⁺形質転換
細胞の逆選択には、フルオロアセテートをフルオロアセ
チル−ＣｏＡに変換する酵素アセチルＣｏＡシンテター
ゼの活性が必要である。E.コリで見られた(Brownら 197
7)アセチルＣｏＡシンテターゼのカタボライト抑制を避
けるために、細菌ａｍｄＳ⁺形質転換細胞又は単コピー
組込み体を窒素源としてＮＨ₄Ｃｌ並びに炭素及びエネ
ルギー源として酢酸塩を含む特定培地上で発育させた。

【０１２８】B.サチリス(Freese,E., Fortnagel,P. (19
69) J. Bcteriol 90, 745-756)のような多くの生物はグ
リオキシル酸塩機能分路がなく、従って培地がグルタミ
ン酸塩又はコハク酸塩のようなＴＣＡサイクル中間体源
で補足される場合にのみ酢酸塩を代謝する。バシラスａ
ｍｄＳ⁺株をGrundy, F.J.ら (1993) Molecular Microb
iology 10, 259-271に記載されている0.０１％グルタミ
ン酸塩及び５０mM酢酸塩を含むＴＳＳ培地で発育させ
た。寒天で固化したこの培地にフルオロアセトアミドを
１〜５０mMの濃度で加えた。B.サチリス BAA-101又はB.
リケニホルミス BAA-103（単コピー組込み体）を１プレ
ート当たり１０²細胞濃度で塗布した。あるフルオロア
セトアミド濃度ではわずかなコロニーしか出現しなかっ
た。これらのコロニーにｐＧＢａｍｄＳ２５が存在しな
いことは、プラスミド及び染色体ＤＮＡ分析、ネオマイ
シンに対する感受性及び単独の窒素源としてアセトアミ
ド上での増殖不能により証明された。ＢＡＡ−１０３の
逆選択の場合には、活性アッセイ及びサザンブロットに
よって示されるアミラーゼ遺伝子のロスをもたらした。
これは、フルオロアセトアミド逆選択を用いて多数のａ
ｍｄＳ⁺バシラス細胞及び特定標的遺伝子の同時欠失を
含む集団からａｍｄＳ^-細胞を選択することができるこ
とを示している。

【０１２９】同様に、１〜５０mMの濃度のフルオロアセ
トアミド及び0.０５mMのＩＰＴＧで補足したVanderwink
el E., De Vlieghere M, European J. Biochem, 5 (196
8) 81-90に記載されている最少培地 #132 を用いてｐＧ
ＢａｍｄＳ４１形質転換細胞の集団からａｍｄＳ^-E.コ
リ JM109細胞を選択した。細胞を１プレート当たり１０
²細胞の濃度で塗布した。あるフルオロアセトアミド濃
度ではわずかなコロニーしか出現しなかった。フルオロ
アセトアミド選択コロニーからｐＧＢａｍｄＳ４１が存
在しないことは、ＤＮＡ単離、アンピシリンに対する感
受性及び単独の窒素源としてアセトアミド上での発育不
能により確認された。これは、フルオロアセトアミド逆
選択を用いて多数のａｍｄＳ⁺E.コリ細胞を含む集団か
らａｍｄＳ^-を選択することができることを証明するも
のである。

【０１３０】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２６塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：AB3100 配列 CTAATCTAGA ATGCCTCAAT CCTGAA 26

【０１３１】配列番号：２配列の長さ：２８塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 直接の起源クローン名：AB3101 配列 GACAGTCGAC AGCTATGGAG TCACCACA 28

【０１３２】配列番号：３配列の長さ：１６塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：TN0001 配列 TCGATTAACT AGTTAA 16

【０１３３】配列番号：４配列の長さ：３５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO 直接の起源クローン名：AB2154 配列 AACCATAGGG TCGACTAGAC AATCAATCCA TTTCG 35

【０１３４】配列番号：５配列の長さ：３５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 直接の起源クローン名：AB2155 配列 GCTATTCGAA AGCTTATTCA TCCGGAGATC CTGAT 35

【０１３５】配列番号：６配列の長さ：３０塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：AB2977 配列 TATCAGGAAT TCGAGCTCTG TACAGTGACC 30

【０１３６】配列番号：７配列の長さ：３６塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 直接の起源クローン名：AB2992 配列 GCTTGAGCAG ACATCACCAT GCCTCAATCC TGGGAA 36

【０１３７】配列番号：８配列の長さ：３６塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：AB2993 配列 TTCCCAGGAT TGAGGCATGG TGATGTCTGC TCAAGC 36

【０１３８】配列番号：９配列の長さ：３６塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 直接の起源クローン名：AB2994 配列 CTGATAGAAT TCAGATCTGC AGCGGAGGCC TCTGTG 36

【０１３９】配列番号：１０配列の長さ：３１塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：AB3657 配列 AGCTTGACGT CTACGTATTA ATGCGGCCGC T 31

【０１４０】配列番号：１１配列の長さ：３１塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 直接の起源クローン名：AB3658 配列 TCGAAGCGGC CGCATTAATA CGTAGACGTC A 31

【０１４１】配列番号：１２配列の長さ：２３塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：AB3779 配列 AATTGGGGCC CATTAACTCG AGC 23

【０１４２】配列番号：１３配列の長さ：２３塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 直接の起源クローン名：AB3780 配列 AATTGCTCGA GTTAATGGGC CCC 23

【０１４３】配列番号：１４配列の長さ：３０塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：AB3448 配列 GTGCGAGGTA CCACAATCAA TCCATTTCGC 30

【０１４４】配列番号：１５配列の長さ：３６塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 直接の起源クローン名：AB3449 配列 ATGGTTCAAG AACTCGGTAG CCTTTTCCTT GATTCT 36

【０１４５】配列番号：１６配列の長さ：３６塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：AB3450 配列 AGAATCAAGG AAAAGGCTAC CGAGTTCTTG AACCAT 36

【０１４６】配列番号：１７配列の長さ：４２塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 直接の起源クローン名：AB3520 配列 ATCAATCAGA AGCTTTCTCT CGAGACGGGC ATCGGAGTCC CG 42

【０１４７】配列番号：１８配列の長さ：１８塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：AB3781 配列 AATTGGGGCC CAGCGTCC 18

【０１４８】配列番号：１９配列の長さ：１８塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 直接の起源クローン名：AB3782 配列 AATTGGACGC TGGGCCCC 18

【０１４９】配列番号：２０配列の長さ：４３塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：AB3746 配列 TGACCAATAA AGCTTCTCGA GTAGCAAGAA GACCCAGTCA ATC 43

【０１５０】配列番号：２１配列の長さ：４７塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 直接の起源クローン名：AB3747 配列 CTACAAACGG CCACGCTGGA GATCCGCCGG CGTTCGAAAT AACCAGT 47

【０１５１】配列番号：２２配列の長さ：２６塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：AB4234 配列 GAAGACCCAG TCAAGCTTGC ATGAGC 26

【０１５２】配列番号：２３配列の長さ：４３塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 直接の起源クローン名：AB4235 配列 TGACCAATTA AGCTTGCGGC CGCTCGAGGT CGCACCGGCA AAC 43

【０１５３】配列番号：２４配列の長さ：６９塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：AB4236 配列 TGACCAATAA AGCTTAGATC TGGGGGTGAT TGGGCGGAGT GTTTTGCTTA GACAATCAAT 60 CCATTTCGC 69

【０１５４】配列番号：２５配列の長さ：３６塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 直接の起源クローン名：AB4233 配列 TGACCAATAG ATCTAAGCTT GACTGGGTCT TCTTGC 36

【０１５５】配列番号：２６配列の長さ：３２塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：AB3514 配列 CTGCGAATTC GTCGACATGC CTCAATCCTG GG 32

【０１５６】配列番号：２７配列の長さ：３７塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 直接の起源クローン名：AB3515 配列 GGCAGTCTAG AGTCGTACCTA TGGAGTCACC ACATTTC 37

【０１５７】配列番号：２８配列の長さ：５０塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：AB3701 配列 CTGCGAATTC GTCGACACTA GTGGTACCAT TATAGCCATA GGACAGCAAG 50

【０１５８】配列番号：２９配列の長さ：７０塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 直接の起源クローン名：AB3700 配列 GCTCTAGAGC GCGCTTATCA GCTTCCAGTT CTTCCCAGGA TTGAGGCATT TTTAATGTTA 60 CTTCTCTTGC 70

【０１５９】配列番号：３０配列の長さ：５０塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：AB3702 配列 CTGCGAATTC GTCGACACTA GTGGTACCAT CCTTTTGTTG TTTCCGGGTG 50

【０１６０】配列番号：３１配列の長さ：７０塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 直接の起源クローン名：AB3703 配列 GCTCTAGAGC GCGCTTATCA GCGGCCAGTT CTTCCCAGGA TTGAGGCATT GTATATGAGA 60 TAGTTGATTG 70

【０１６１】配列番号：３２配列の長さ：５５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：AB3704 配列 GCTCTAGAAG TCGACACTAG TCTGCTACGT ACTCGAGAAT TTATACTTAG ATAAG 55

【０１６２】配列番号：３３配列の長さ：２５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 直接の起源クローン名：AB3705 配列 TGCTCTAGAT CTCAAGCCAC AATTC 25

【０１６３】配列番号：３４配列の長さ：３１塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：AB3965 配列 CTGCTACGTA ATGTTTTCAT TGCTGTTTTA C 31

【０１６４】配列番号：３５配列の長さ：３７塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 直接の起源クローン名：AB3966 配列 CCGCCCAGTC TCGAGTCAGA TGGCTTTGGC CAGCCCC 37

【０１６５】配列番号：３６配列の長さ：４４塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：AB3825 配列 CGCGCTTATC AGCGGCCAGT TCTTCCCAGG ATTGAGGCAT ATGT 44

【０１６６】配列番号：３７配列の長さ：４４塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA （ゲノム）ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 直接の起源クローン名：AB3826 配列 CTAGACATAT GCCTCAATCC TGGGAAGAAC TGGCCGCTGA TAAG 44

【図面の簡単な説明】図面で用いられる略語：制限酵素及び制限部位：Ａ＝ＡｐａＩ；Ｂａ＝ＢａｍＨＩ；Ｂ＝ＢｇｌＩＩ；Ｂ
ｓ＝ＢｓｓＨＩＩ；Ｅ＝ＥｃｏＲＩ；Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ；Ｋ＝ＫｐｎＩ；Ｎ＝ＮｄｅＩ；Ｎ＝ＮｏｔＩ；Ｐｓ
＝ＰｓｔＩ；Ｐ＝ＰｖｕＩＩ；Ｓａ＝ＳａｌＩ；Ｓｃ＝
ＳｃａＩ；Ｓ＝ＳｍａＩ；Ｓｎ＝ＳｎａＢＩ；Ｓｐｅ＝
ＳｐｅＩ；Ｓｐ＝ＳｐｈＩ；Ｓｓ＝ＳｓｔＩＩ；Ｘｂ＝
ＸｂａＩ；Ｘ＝ＸｈｏＩ。その他：Ｔ．＝ＬＡＣ４ターミネーター配列

【図１】プラスミドＰａｍｄＳ−１の制限地図である。
本プラスミドは、A.ニデュランス (A.nidulans) 由来の
ａｍｄＳのｃＤＮＡを含んでいる。

【図２】遺伝子置換ベクターｐＧＢＤＥＬ４Ｌを用いた
A.ニガー由来のｇｌａＡ遺伝子座のマーカー遺伝子を含
まない欠失の模式図である。遺伝子置換ベクターｐＧＢ
ＤＥＬ４Ｌの実質部分は、反復（ｇｌａＡ遺伝子の３′
非コーディング領域）間にクローン化ｇｐｄＡプロモー
ターの調節によってａｍｄＳ遺伝子を含んでいる。

【図３】実施例１に示されるｐＧＢＤＥＬ４Ｌの構築経
路の模式図である。

【図４】実施例１に示されるｐＧＢＤＥＬ４Ｌの構築経
路の模式図である。

【図５】実施例１に示されるｐＧＢＤＥＬ４Ｌの構築経
路の模式図である。

【図６】実施例１に示されるｐＧＢＤＥＬ４Ｌの構築経
路の模式図である。

【図７】実施例１に示されるｐＧＢＤＥＬ４Ｌの構築経
路の模式図である。

【図８】実施例１に示されるｐＧＢＤＥＬ４Ｌの構築経
路の模式図である。

【図９】実施例１に示されるｐＧＢＤＥＬ４Ｌの構築経
路の模式図である。

【図１０】実施例１に示されるｐＧＢＤＥＬ４Ｌの構築
経路の模式図である。

【図１１】実施例１に示されるｐＧＢＤＥＬ４Ｌの構築
経路の模式図である。

【図１２】実施例１に示されるｐＧＢＤＥＬ４Ｌの構築
経路の模式図である。

【図１３】³²Ｐ標識ｇｌａＡプロモーターフラグメント
及びキシラノーゼプローブでプローブされたｐＧＢＤＥ
Ｌ４Ｌ形質転換細胞 #41（レーン１）、 #24（レーン
２）、 #23（レーン３）及び #19（レーン４）及び宿主
株 A. ニガー CBS 513.88 （レーン５）のＫｐｎＩ消化
物並びにｐＧＢＤＥＬ４Ｌ形質転換細胞 #41（レーン
６）、 #24（レーン７）、 #23（レーン８）及び #19
（レーン９）及び宿主株 A. ニガー CBS 513.88 （レー
ン１０）のＢａｍＨＩ消化物のオートラジオグラフであ
る。

【図１４】GBA-102 （レーン１）及びフルオロアセトア
ミド選択後の GBA-102株： GBA-107（レーン２）及び G
BA-108（レーン３）のＫｐｎＩ消化物並びに GBA-102
（レーン４）及びフルオロアセトアミド選択後の GBA-1
02株： GBA-107（レーン５）及び GBA-108（レーン６）
のＢａｍＨＩ消化物のオートラジオグラフである。

【図１５】アスペルギルスニガー CBS 513.88 における
野生型ｇｌａＡ遺伝子座のＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩフラ
グメント長の模式図である。

【図１６】形質転換細胞 #19(= GBA-102) における切断
型ｇｌａＡ遺伝子座のＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩフラグメ
ント長の模式図である。

【図１７】GBA-102 形質転換細胞におけるａｍｄＳ遺伝
子(= GBA-107及び GBA-108）除去後の切断型ｇｌａＡ遺
伝子座のＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩフラグメント長の模式
図である。

【図１８】A.ニガーの切断型ｇｌａＡ遺伝子座の３′非
コーディング領域にｇｌａＡ遺伝子を組込む模式図であ
る。

【図１９】ａｍｄＳ遺伝子に隣接する３′ｇｌａＡ反復
間の内部組換えの結果である。

【図２０】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧ
ＬＡ３０の構築経路の模式図である。

【図２１】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧ
ＬＡ３０の構築経路の模式図である。

【図２２】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧ
ＬＡ３０の構築経路の模式図である。

【図２３】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧ
ＬＡ３０の構築経路の模式図である。

【図２４】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧ
ＬＡ３０の構築経路の模式図である。

【図２５】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧ
ＬＡ３０の構築経路の模式図である。

【図２６】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧ
ＬＡ３０の構築経路の模式図である。

【図２７】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧ
ＬＡ３０の構築経路の模式図である。

【図２８】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧ
ＬＡ３０の構築経路の模式図である。

【図２９】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧ
ＬＡ３０の構築経路の模式図である。

【図３０】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧ
ＬＡ３０の構築経路の模式図である。

【図３１】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧ
ＬＡ３０の構築経路の模式図である。

【図３２】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧ
ＬＡ３０の構築経路の模式図である。

【図３３】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧ
ＬＡ３０の構築経路の模式図である。

【図３４】³²Ｐ標識ｇｌａＡプロモーターフラグメント
でプローブされたｐＧＢＧＬＡ３０形質転換細胞 #107-
9 （レーン１）、 #107-7 （レーン２）及び #107-5
（レーン３）、宿主株 A. ニガー GBA-107（レーン４）
及び親株 A. ニガー CBS 513.88 （レーン５）のＢｇｌ
ＩＩ消化物並びにｐＧＢＧＬＡ３０形質転換細胞 #107-
9 （レーン６）、 #107-7 （レーン７）及び #107-5
（レーン８）、宿主株 A. ニガー GBA-107（レーン９）
及び親株 A. ニガー CBS 513.88 （レーン１０）のＫｐ
ｎＩ消化物のオートラジオグラフである。

【図３５】アスペルギルスニガー CBS 513.88 における
野生型ｇｌａＡ遺伝子座のＫｐｎＩ及びＢｇｌＩＩフラ
グメント長の模式図である。

【図３６】アスペルギルスニガー GBA-107における切断
型ｇｌａＡ遺伝子座のＫｐｎＩ及びＢｇｌＩＩフラグメ
ント長の模式図である。

【図３７】形質転換細胞 #107-5(= GBA-119)及び #107-
9(= GBA-122)のようにｇｌａＡ３′非コーディング領域
に組込まれた単コピーを含む切断型ｇｌａＡ遺伝子座の
ＫｐｎＩ及びＢｇｌＩＩフラグメント長の模式図であ
る。

【図３８】GBA-119 及び GBA-122形質転換細胞における
ａｍｄＳ遺伝子(= GBA-120、GBA-121 、GBA-123 及びGB
A-124)除去後の切断型ｇｌａＡ遺伝子座のＫｐｎＩ及び
ＢｇｌＩＩフラグメント長の模式図である。

【図３９】³²Ｐ標識３″ｇｌａＡ非コーディングフラグ
メントでプローブされたA.ニガーCBS 513.88 （レーン
１０）、GBA-107 （レーン９）、GBA-119 （レーン８）
及びフルオロアセトアミド選択後の GBA-119株： #AG5-
7 (= GBA-120)(レーン５）、 #AG5-5 (= GBA-121)(レー
ン６）及び #AG5-6 （レーン７）；GBA-122 （レーン
４）及びフルオロアセトアミド選択後の GBA-122株： #
AG9-1 (= GBA-123)(レーン３）、 #AG9-2 （レーン２）
及び #AG9-4 (= GBA-124)(レーン１）のＢｇｌＩＩ消化
物のオートラジオグラフである。

【図４０】³²Ｐ標識３″ｇｌａＡ非コーディングフラグ
メントでプローブされたA.ニガーCBS 513.88 （レーン
１０）、GBA-107 （レーン９）、GBA-119 （レーン８）
及びフルオロアセトアミド選択後の GBA-119株： #AG5-
7 (= GBA-120)(レーン５）、 #AG5-5 (= GBA-121)(レー
ン６）及び #AG5-6 （レーン６); GBA-122（レーン４）
及びフルオロアセトアミド選択後の GBA-122株： #AG9-
1 (= GBA-123)(レーン３）、 #AG9-2 （レーン２）及び
#AG9-4 (= GBA-124)(レーン１）のＫｐｎＩ消化物のオ
ートラジオグラフである。

【図４１】ｐＧＢＧＬＡ５０の構築経路の模式図であ
る。

【図４２】ｐＧＢＧＬＡ５３の構築経路の模式図であ
る。

【図４３】ｐＧＢＧＬＡ５３の構築経路の模式図であ
る。

【図４４】ｐＧＢＧＬＡ５３の構築経路の模式図であ
る。

【図４５】ｐＧＢＧＬＡ５３の構築経路の模式図であ
る。

【図４６】ｐＧＢＧＬＡ５３の構築経路の模式図であ
る。

【図４７】ｐＧＢＧＬＡ５３の構築経路の模式図であ
る。

【図４８】ｐＧＢＧＬＡ５３の構築経路の模式図であ
る。

【図４９】ｐＧＢａｍｄＳ１の構築経路の模式図であ
る。

【図５０】ｐＧＢａｍｄＳ２の構築経路の模式図であ
る。

【図５１】ｐＧＢａｍｄＳ３の構築経路の模式図であ
る。

【図５２】ｐＧＢａｍｄＳ５の構築経路の模式図であ
る。

【図５３】ｐＧＢａｍｄＳ６の構築経路の模式図であ
る。

【図５４】ｐＧＢａｍｄＳ６構築で用いたｐＰＴＬＡＣ
４構築の模式図である。

【図５５】ｐＧＢａｍｄＳ７構築の模式図である。

【図５６】³²Ｐ標識ＬＡＣ４プロモーターフラグメント
でプローブされたK.ラクチス(K.lactis) CBS 683（レー
ン１）、K.ラクチス CBS 2360 （レーン２）、K.ラクチ
スCBS 683／ｐＧＢａｍｄＳ１形質転換細胞 KAM-1（レ
ーン３）、K.ラクチス CBS2360 ／ｐＧＢａｍｄＳ１形
質転換細胞 KAM-2（レーン４）及びフルオロアセトアミ
ド選択後の KAM-1株（レーン５、６）のＨｉｎｄＩＩＩ
消化物のオートラジオグラフである。

【図５７】³²Ｐ標識ＬＡＣ４ターミネーターフラグメン
トでプローブされたK.ラクチス CBS 683／ｐＧＢａｍｄ
Ｓ３形質転換細胞（レーン１−３）のＢａｍＨＩ消化物
のオートラジオグラフである。

【図５８】³²Ｐ標識ＬＡＣ４ターミネーターフラグメン
トでプローブされたK.ラクチス CBS 683／ｐＧＢａｍｄ
Ｓ５形質転換細胞（レーン１−５）及び宿主株K.ラクチ
スCBS 683（レーン６）のＢａｍＨＩ消化物のオートラ
ジオグラフである。

【図５９】³²Ｐ標識ａｍｄＳフラグメントでプローブさ
れたS.セレビシエ(S.cerevisiae) D273-10B （レーン
１）及びS.セレビシエ D273-10B ／ｐＧＢａｍｄＳ５形
質転換細胞（レーン２−８）のＢａｍＨＩ消化物のオー
トラジオグラフである。

【図６０】³²Ｐ標識ＬＡＣ４ターミネーターフラグメン
トでプローブされたK.ラクチス CBS 2360 （レーン
１）、K.ラクチス CBS 2360 ／ｐＧＢａｍｄＳ６形質転
換細胞（レーン６）及びフルオロアセトアミド選択後の
K.ラクチス CBS 2360 ／ｐＧＢａｍｄＳ６形質転換細胞
由来株のＢａｍＨＩ消化物のオートラジオグラフであ
る。

【図６１】バシラス(Bacillus)プラスミドｐＢＨＡ１の
制限地図である。

【図６２】バシラスプラスミドｐＬＮＦの制限地図であ
る。

【図６３】ｐＧＢａｍｄＳ２１構築の模式図である。

【図６４】ｐＧＢａｍｄＳ２２構築の模式図である。

【図６５】ｐＧＢａｍｄＳ２３構築の模式図である。

【図６６】ｐＧＢａｍｄＳ２５構築の模式図である。

【図６７】ｐＧＢａｍｄＳ４１構築の模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:885） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:80） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:66）Ｃ１２Ｒ 1:66） (72)発明者バートウィーレムスウィンケルスオランダ国 2611エムイックスデルフトシュッテルストラート５ (72)発明者ロベルテュスフランシスクスマリアファンホルコムオランダ国 2622デーエーデルフトリーベリアストラート 76

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】所望のＤＮＡフラグメント及び選択マー
カー遺伝子を含むベクターで形質転換された糸状菌であ
って、選択マーカー遺伝子が欠失していることを特徴と
する上記糸状菌。
【請求項２】所望のＤＮＡフラグメント及び選択マー
カー遺伝子が少なくとも２種類の異なるベクター上に存
在する請求項１記載の糸状菌。
【請求項３】前記所望のＤＮＡフラグメントが部位特
異的相同的組換えにより該糸状菌のゲノムに組込まれる
請求項１又は２記載の糸状菌。
【請求項４】該選択マーカー遺伝子がアセトアミダー
ゼ遺伝子である請求項１、２又は３記載の糸状菌。
【請求項５】該アセトアミダーゼ遺伝子が真菌由来、
好ましくはアスペルギルス種由来である請求項４記載の
糸状菌。
【請求項６】所望のＤＮＡフラグメントが次の遺伝要
素：遺伝子、ｃＤＮＡ、プロモーター、ターミネータ
ー、調節要素、イントロン、ＤＮＡ結合タンパク質の認
識配列、翻訳開始部位又は制限部位、その一部、修飾型
又は組合わせのいずれか１種を含む請求項１〜５のいず
れか１項に記載の糸状菌。
【請求項７】糸状菌がアスペルギルス、トリコデルマ
又はペニシリウム種である請求項１〜６記載のいずれか
１項に記載の糸状菌。
【請求項８】糸状菌以外の組換え体株であって、その
組換え体株がアセトアミダーゼ遺伝子で形質転換されて
いることを特徴とする上記組換え体株。
【請求項９】糸状菌以外の組換え体株であって、その
組換え体株がアセトアミダーゼ遺伝子及び所望のＤＮＡ
フラグメントで形質転換されていることを特徴とする上
記組換え体株。
【請求項１０】糸状菌以外の組換え体株であって、所
望のＤＮＡフラグメントが選択マーカー遺伝子としてア
セトアミダーゼ遺伝子を用いて菌株内に導入されている
ことを特徴とする上記組換え体株。
【請求項１１】アセトアミダーゼ選択マーカー遺伝子
が欠失していることを特徴とする請求項１０記載の組換
え体株。
【請求項１２】アセトアミダーゼ遺伝子が真菌、好ま
しくはアスペルギルス種由来であることを特徴とする請
求項８〜１１のいずれか１項に記載の組換え体株。
【請求項１３】組換え体株が酵母又は細菌である請求
項８〜１２記載のいずれか１項に記載の組換え体株。
【請求項１４】組換え体株がクルイベロミセス又はサ
ッカロミセス酵母である請求項１３記載の組換え体株。
【請求項１５】組換え体株がグラム陽性菌である請求
項１３記載の組換え体株。
【請求項１６】組換え体株がバシラスである請求項１
３記載の組換え体株。
【請求項１７】組換え体株がバシラスリケニホルミス
又はバシラスサチリス株である請求項１３記載の組換え
体株。
【請求項１８】組換え体株がグラム陰性菌である請求
項１３記載の組換え体株。
【請求項１９】組換え体株がエシェリキアコリ株であ
る請求項１３記載の組換え体株。
【請求項２０】少なくとも２つの独立遺伝的修飾を含
む組換え体株であって、少なくとも２つの遺伝的修飾が
少なくとも２つの独立形質転換で導入されており、各々
が選択マーカー遺伝子としてアセトアミダーゼ遺伝子を
用いることを特徴とする上記組換え体株。
【請求項２１】ゲノムに欠失を有する組換え体株であ
って、欠失が所望のＤＮＡフラグメントの導入の結果で
ありかつ組換え体株が外来ＤＮＡを含まないことを特徴
とする上記組換え体株。
【請求項２２】所望のＤＮＡフラグメントがキモシ
ン、フィターゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、アミラー
ゼ、プロテアーゼ又はβ−ガラクトシダーゼをコードす
る配列を含む請求項１〜３及び９〜１１のいずれか１項
に記載の組換え体株。
【請求項２３】選択マーカーを含まない組換え体株の
作製方法であって、下記段階を含む上記方法：ａ）菌株のゲノムに所望のＤＮＡフラグメント並びに優
性及び二方向選択マーカー遺伝子を組込む、ｂ）形質転換細胞を選択する、ｃ）選択マーカー遺伝子に隣接する反復間の組換えによ
り選択マーカー遺伝子を欠失する、ｄ）選択マーカー遺伝子が存在しないことに基いて逆選
択する。
【請求項２４】ゲノムから欠失されるべき３′又は
５′配列である配列で反復を形成する選択マーカー遺伝
子配列の５′又は３′配列をクローン化することを特徴
とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】所望のＤＮＡフラグメントが次の遺伝
要素：遺伝子、ｃＤＮＡ、プロモーター、ターミネータ
ー、調節要素、イントロン、ＤＮＡ結合タンパク質の認
識配列、翻訳開始部位又は制限部位、その一部、修飾型
又は組合わせのいずれか１種を含む請求項２３又は２４
記載の方法。
【請求項２６】段階ａ）〜ｄ）が請求項２５記載の同
一か又は異なる所望のＤＮＡフラグメントを用いて得ら
れた組換え体株上で反復される請求項２３又は２４記載
の方法。
【請求項２７】選択マーカー遺伝子がアセトアミダー
ゼ遺伝子である請求項２３〜２６のいずれか１項に記載
の方法。
【請求項２８】選択マーカー遺伝子が真菌由来、好ま
しくはアスペルギルス種由来のアセトアミダーゼ遺伝子
である請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】ＤＮＡ反復が隣接する優性及び二方向
選択マーカー遺伝子を含むベクター。
【請求項３０】所望のＤＮＡフラグメントも含む請求
項２９記載のベクター。
【請求項３１】選択マーカー遺伝子がアセトアミダー
ゼ遺伝子である請求項２９又は３０記載のベクター。
【請求項３２】アセトアミダーゼ遺伝子が真菌由来、
好ましくはアスペルギルス種由来である請求項３１記載
のベクター。
【請求項３３】糸状菌由来のアセトアミダーゼ遺伝子
を含むベクターであって、アセトアミダーゼ遺伝子が糸
状菌以外の生物由来のプロモーターの転写調節を受ける
ことを特徴とする上記ベクター。