KR20180098386A - 트라이아실글리세롤의 부분 효소적 가수 분해 - Google Patents

트라이아실글리세롤의 부분 효소적 가수 분해 Download PDF

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모니카 뮐러
마르틴 슈르만
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디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
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Abstract

본원은, 하나 이상의 장쇄 다중 불포화 지방산을 포함하는 오일 중의 트라이아실글리세롤의 에스테르 결합을 가수 분해하는 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포, 이러한 숙주 세포를 사용하는 방법, 및 이러한 숙주 세포를 사용하여 리파아제를 생산하는 방법을 개시한다.

Description

트라이아실글리세롤의 부분 효소적 가수 분해
본원은 2015년 12 월 30 일자로 출원된 미국 가출원 제 62/272,829 호(이는 전체가 본원에 참고로 인용됨)를 우선권 주장한다.
본 발명은, 하나 이상의 장쇄 다중 불포화 지방산을 포함하는 오일 중의 트라이아실글리세롤의 에스테르 결합을 가수 분해하는 능력을 부여하는 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포, 및 하나 이상의 장쇄 다중 불포화 지방산을 포함하는 오일 중의 트라이아실글리세롤의 에스테르 결합을 가수 분해하는 능력을 부여하는 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 사용하는 방법에 관한 것이다. 상기 숙주 세포는, 장쇄 다중 불포화 지방산이 풍부한 오일 조성물의 상업적 제조에 유용하도록 충분한 양의 상기 폴리펩티드를 생성하는데 사용된다.
오메가-3 지방산과 같은 장쇄 다중 불포화 지방산(LC-PUFA)은 일상 생활과 기능에 필수적이다. 예를 들어, cis-5,8,11,14,17-에이코사펜타엔산(EPA)와 cis-4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산(DHA)와 같은 오메가-3 지방산의 혈청 트라이글리세리드를 낮추는 유익한 효과가 현재 잘 수립되어 있다. 이 화합물은 다른 심장 보호 효과로도 알려져 있다. 실제로, 미국 심장 협회(American Heart Association) 또한 오메가-3 지방산이 심혈관 및 심장 질환 위험을 감소시킬 수 있다고 보고했다. LC-PUFA의 다른 이점은 염증, 신경 퇴행성 질환 및 인지 발달의 예방 및/또는 치료에 관한 것이다. 오메가-3 지방산과 같은 LC-PUFA가 풍부한 식이 요법은 심장 질환, 암, 관절염, 알레르기 및 기타 만성 질환에 유익한 효과가 있는 것으로 나타났다.
예를 들어, 오메가-3 지방산과 같은 LC-PUFA는 종종 해양 오일, 미생물 및/또는 조류 오일로부터 유래된다. 이러한 공급원은 일반적으로 트라이아실글리세롤 형태의 LC-PUFA를 함유하며, 트라이아실글리세롤 분자 중에는 바람직한 LC-PUFA(s)와 함께 다른 바람직하지 않은 지방산(예를 들어, 포화 지방산)이 존재한다. 따라서, 오일 중의 LC-PUFA의 정제 및 농축이 일반적으로 요망된다.
해양, 미생물 및/또는 조류 오일과 같은 오일로부터 LC-PUFA 농축물을 생산하는 다양한 방법이 공지되어 있다. 예를 들어, 리파아제는 트라이아실글리세롤의 포화 지방산을 에틸 에스테르로 에스테르 교환하는데 사용되어왔다. 이어서, 증류에 의해 상기 포화 지방산이 혼합물로부터 제거되고, 불포화 에스테르는 때로는 트라이아실글리세롤으로 다시 에스테르 교환된다. 다른 방법은, 리파아제로 포화 지방산을 트라이아실글리세롤로부터 선택적으로 가수 분해하고, 생성된 유리 포화 지방산을 우레아와 복합체를 형성시킴으로써 제거한다. 이들 방법에 의해 얻어진 오일에 함유된 LC-PUFA의 양은 일반적으로, 지방산의 양에 대해 60 중량% 이상, 또는 70 중량% 이상이다.
현존하는 상업용 리파아제가 가수 분해 반응에서 사용될 때, 특히 조질 및 정제 피쉬 오일(fish oil)에 사용될 때, 다양한 정도의 효과를 가짐이 확인되었다. 리파아제의 선택성 및 반응 속도를 개선하면 보다 높은 수율의 오일 및 보다 효율적인 공정을 제공할 수 있다. 예를 들어, 일부 리파아제는 가능한 모든 지방산을 글리세라이드로부터 무차별적으로 가수 분해한다. 다른 리파아제는 글리세라이드로부터의 지방산의 가수 분해에 대해 바람직하지 않은 선택성을 나타낼 것이다. 이후의 공정 단계에서 이들 LC-PUFA의 농축을 더 효율적이고 효과적으로 가능하게 하기 위해, 글리세라이드 상에 EPA 및 DHA와 같은 목적하는 LC-PUFA를 남기는 것이 유리할 것이다. 따라서, 그러한 선택성 및/또는 개선된 반응 속도를 가능하게 하는 리파아제를 동정하고 분리하는 것이 매우 유용할 것이다. 본 발명자들은, EPA 및 DHA와 같은 목적하는 LC-PUFA에 대해 더 선택적이고 더 높은 반응 속도를 갖는 리파아제의 동형체(isoform)를 확인하였다.
본원은, 오일 중의 트라이아실글리세롤의 에스테르 결합을 가수 분해하는 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포, 이러한 숙주 세포를 사용하는 방법 및 이러한 숙주 세포를 사용하여 리파아제인 폴리펩티드를 생산하는 방법을 개시한다.
일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 2의 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는다. 더 바람직한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 리파아제이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 리파아제 유전자의 동형체이다. 더 바람직한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 칸디다 루고사(Candida rugosa) 또는 지오트리쿰 칸디둠(Geotrichum candidum)으로부터 유래하는 리파아제의 동형체이다.
일부 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 이스트이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)이다.
일부 실시양태에서, 트라이아실글리세롤은 하나 이상의 장쇄 다중 불포화 지방산(LC-PUFA)을 포함한다. 일부 실시양태에서, LC-PUFA는 도코사헥사엔산(DHA), 에이코사펜타엔산(EPA) 및 이들의 혼합물을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, LC-PUFA는 DHA이다. 추가의 실시양태에서, LC-PUFA는 EPA이다.
동반된 서열 목록에 열거된 핵산 서열 및 유추된 아미노산 번역 서열은 37 C.F.R. §1.822에 정의된 뉴클레오티드 염기 및 아미노산에 대한 표준 문자 약어를 사용하여 나타낸다. 동반된 서열 목록은 다음을 열거한다:
서열 번호 1은, 피치아 파스토리스로부터의 칸디다 루고사 동형체 리파아제 1의 아미노산 서열(알파 매칭 인자 없음)을 나타낸다:
1 APTATLANGD TITGLNAIIN EAFLGIPFAE PPVGNLRFKD PVPYSGSLDG 51 QKFTSYGPSC MQQNPEGTYE ENLPKAALDL VMQSKVFEAV SPSSEDCLTI 101 NVVRPPGTKA GANLPVMLWI FGGGFEVGGT STFPPAQMIT KSIAMGKPII 151 HVSVNYRVSS WGFLAGDEIK AEGSANAGLK DQRLGMQWVA DNIAAFGGDP 201 TKVTIFGESA GSMSVMCHIL WNDGDNTYKG KPLFRAGIMQ SGAMVPSDAV 251 DGIYGNEIFD LLASNAGCGS ASDKLACLRG VSSDTLEDAT NNTPGFLAYS 301 SLRLSYLPRP DGVNITDDMY ALVREGKYAN IPVIIGDQND EGTFFGTSSL 351 NVTTDAQARE YFKQSFVHAS DAEIDTLMTA YPGDITQGSP FDTGILNALT 401 PQFKRISAVL GDLGFTLARR YFLNHYTGGT KYSFLSKQLS GLPVLGTFHS 451 NDIVFQDYLL GSGSLIYNNA FIAFATDLDP NTAGLLVKWP EYTSSSQSGN 501 NLMMINALGL YTGKDNFRTA GYDALFSNPP SFFV
서열 번호 2는, 피치아 파스토리스로부터의 칸디다 루고사 동형체 리파아제 3의 아미노산 서열(알파 매칭 인자 없음)을 나타낸다:
1 APTAKLANGD TITGLNAIIN EAFLGIPFAE PPVGNLRFKD PVPYSGSLNG 51 QKFTSYGPSC MQQNPEGTFE ENLGKTALDL VMQSKVFQAV LPQSEDCLTI 101 NVVRPPGTKA GANLPVMLWI FGGGFEIGSP TIFPPAQMVT KSVLMGKPII 151 HVAVNYRVAS WGFLAGDDIK AEGSGNAGLK DQRLGMQWVA DNIAGFGGDP 201 SKVTIFGESA GSMSVLCHLI WNDGDNTYKG KPLFRAGIMQ SGAMVPSDPV 251 DGTYGNEIYD LFVSSAGCGS ASDKLACLRS ASSDTLLDAT NNTPGFLAYS 301 SLRLSYLPRP DGKNITDDMY KLVRDGKYAS VPVIIGDQND EGTIFGLSSL 351 NVTTNAQARA YFKQSFIHAS DAEIDTLMAA YPQDITQGSP FDTGIFNAIT 401 PQFKRISAVL GDLAFIHARR YFLNHFQGGT KYSFLSKQLS GLPIMGTFHA 451 NDIVWQDYLL GSGSVIYNNA FIAFATDLDP NTAGLLVNWP KYTSSSQSGN 501 NLMMINALGL YTGKDNFRTA GYDALMTNPS SFFV
서열 번호 3은, 피치아 파스토리스로부터의 지오트리쿰 칸디둠 동형체 리파아제 2의 아미노산 서열(알파 인자 신호 펩티드 또는 8x히스타민 태그 없음)을 나타낸다:
1 QAPTAVLNGN EVISGVLEGK VDTFKGIPFA DPPLNDLRFK HPQPFTGSYQ 51 GLKANDFSPA CMQLDPGNSL TLLDKALGLA KVIPEEFRGP LYDMAKGTVS 101 MNEDCLYLNV FRPAGTKPDA KLPVMVWIYG GAFVYGSSAA YPGNSYVKES 151 INMGQPVVFV SINYRTGPFG FLGGDAITAE GNTNAGLHDQ RKGLEWVSDN 201 IANFGGDPDK VMIFGESAGA MSVAHQLIAY GGDNTYNGKK LFHSAILQSG 251 GPLPYHDSSS VGPDISYNRF AQYAGCDTSA SANDTLECLR SKSSSVLHDA 301 QNSYDLKDLF GLLPQFLGFG PRPDGNIIPD AAYELFRSGR YAKVPYISGN 351 QEDEGTAFAP VALNATTTPH VKKWLQYIFY DASEASIDRV LSLYPQTLSV 401 GSPFRTGILN ALTPQFKRVA AILSDMLFQS PRRVMLSATK DVNRWTYLST 451 HLHNLVPFLG TFHGNELIFQ FNVNIGPANS YLRYFISFAN HHDPNVGTNL 501 LQWDQYTDEG KEMLEIHMTD NVMRTDDYRI EGISNFETDV NLYG
이하 본 발명을 실시하기 위한 설명을 읽음으로써, 당분야의 숙련자들은 본 발명의 특징 및 이점을 용이하게 이해할 것이다. 명료함을 위해, 개별 실시양태들의 문맥에서 상기 및 하기에 기술된 본 발명의 특정한 특징들을 결합하여 그 하위-조합을 형성할 수 있다는 것을 이해할 수 있다.
본원에서 예시적으로 특정된 실시양태들은 예시적인 것일 뿐 제한적으로 의도한 것은 아니다.
본 명세서 및 이하의 청구범위에서, 다음의 의미를 갖는 것으로 정의되는 다수의 용어가 참조될 것이다:
본 발명을 설명하는 문맥에서(특히 이하의 청구범위에서), 본원에 달리 지시되거나 문맥에 의해 명확히 모순되지 않는 한, 단수형의 사용은 단수형 및 복수형을 모두를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"포함하는", "갖는", "비롯한", 및 "함유하는"의 용어는, 달리 언급되지 않는 한, 개방형 용어로(즉, "이로서 한정하는 것은 아니지만, 포함한다"로) 해석된다. 본원의 수치 범위의 인용은, 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 상기 범주에 속하는 각각의 개별적인 값을 개별적으로 인용하는 약칭 방법으로서 작용하고자 하고, 각각의 개별적인 값들은 이들이 본원에서 개별적으로 인용되는 경우에서와 같이 본 명세서에 도입된다.
"선택적" 또는 "선택적으로"는 후속하여 설명되는 사건 또는 상황이 발생할 수 있거나 발생할 수 없음을 의미하며, 상기 설명은 상기 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함한다.
용어 "트라이아실글리세롤" 또는 "TAG"는 지방산의 글리세롤 에스테르를 포함하는 분자를 지칭하는데 사용된다. 이 용어는 또한 "트라이글리세라이드"(TG)와 동의어로 사용된다. "글리세라이드"는 문맥에 따라 모노-, 다이- 및/또는 트라이글리세라이드를 지칭하는데 사용된다.
다중 불포화 지방산(PUFA)은 지방산의 메틸 말단으로부터의 첫 번째 이중 결합의 위치에 기초하여 분류된다; 오메가-3(n-3) 지방산은 세 번째 탄소가 첫 번째 이중 결합을 함유하는 반면, 오메가-6(n-6) 지방산은 여섯 번째 탄소가 첫 번째 이중 결합을 함유한다. 예를 들어, 도코사헥사엔산(DHA)은 탄소 22 개의 쇄 및 이중 결합 6 개를 갖는 오메가-3 장쇄 다중 불포화 지방산(LC PUFA)으로, 종종 "22:6n-3"으로 지칭된다. 장쇄 다중 불포화 지방산(LC-PUFA)은 20 내지 24 개의 탄소 원자 수 및 4 또는 5의 불포화의 수를 갖는다. PUFA 및 LC-PUFA는 유리 형태, 에스테르 또는 글리세라이드 형태일 수 있다.
서열 동일성 및 유사성
본원에서 서열 동일성은, 서열을 비교하여 결정된 바와 같이, 2 개 이상의 아미노산(폴리펩티드 또는 단백질) 서열 또는 2 개 이상의 핵산(폴리뉴클레오티드) 서열 사이의 관계로서 정의된다. 당해 분야에서, "동일성"은 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 뜻하며, 경우에 따라 그러한 서열의 스트링(string) 간의 매치(match)에 의해 결정된다. 2 개의 아미노산 서열 사이의 "유사성"은, 제 1 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 그의 보존된 아미노산 치환체를 제 2 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 결정된다. "동일성" 및 "유사성"은, 비제한적으로, 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988]; 문헌[Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993]; 문헌[Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994]; 문헌[Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987]; 및 문헌[Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991]; 및 문헌[Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073(1988)]을 포함하는 공지된 방법으로 쉽게 계산될 수 있다.
동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험된 서열 간의 가장 큰 매치를 제공하도록 설계된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 사용 가능한 컴퓨터 프로그램으로 코딩된다. 두 서열 간의 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은, 예를 들어, GCG 프로그램 패키지(문헌[Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387(1984)] 참조), BestFit, BLASTP, BLASTN 및 FASTA(문헌[Altschul, SF et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410(1990)] 참조)이다. BLAST X 프로그램은, NCBI 및 다른 출처(문헌[BLAST Manual], 문헌[Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894]; 문헌[Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)])로부터 공개적으로 입수가능하다. 잘 알려진 스미스 워터맨(Smith Waterman) 알고리즘 또한 동일성을 결정하는데 사용될 수 있다.
폴리펩티드 서열 비교를 위한 바람직한 매개 변수는 다음을 포함한다: 알고리즘: 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453(1970)]; 비교 매트릭스: 문헌[Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)]; 갭 페널티: 12; 및 갭 길이 페널티: 4. 이들 매개 변수와 함께 유용한 프로그램은, 위스콘신 매디슨에 위치한 유전학 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 "Ogap" 프로그램으로서 공개적으로 사용할 수 있다. 상술한 매개 변수는 (엔드 갭에 대한 페널티는 존재하지 않음과 더불어) 아미노산 비교의 기본 매개 변수이다.
핵산 비교를 위한 바람직한 매개 변수는 다음을 포함한다: 알고리즘: 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453(1970)]; 비교 매트릭스: 매치=+10, 미스매치(mismatch)=0; 갭 페널티: 50; 갭 길이 페널티: 3. 위스콘신 매디슨에 위치한 유전학 컴퓨터 그룹의 갭 프로그램으로 사용할 수 있고, 위에 주어진 것은 핵산 비교를 위한 기본 매개 변수이다. 선택적으로, 아미노산 유사성의 정도를 결정함에 있어서, 당업자는 소위 "보존적" 아미노산 치환을 고려할 수 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호 교환 가능성을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-하이드록시 측쇄를 갖는 아미노산 군은 세린 및 트레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산 군은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 군은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 군은, 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라긴-글루타민이다. 본원에 개시된 아미노산 서열의 치환 변이체는, 그 개시된 서열의 하나 이상의 잔기가 제거되고 그 자리에 다른 잔기가 삽입된 것이다. 바람직하게는, 아미노산 변화는 보존적이다. 자연적으로 발생하는 아미노산 각각에 대한 바람직한 보존적 치환은 다음과 같다: Ala은 Ser으로; Arg은 Lys으로; Asn은 Gln 또는 His으로; Asp은 Glu으로; Cys은 Ser 또는 Ala으로; Gln은 Asn으로; Glu은 Asp으로; Gly은 Pro으로; His은 Asn 또는 Gln으로; Ile은 Leu 또는 Val으로; Leu은 Ile 또는 Val으로; Lys은 Arg으로; Gln은 Glu으로; Met은 Leu 또는 Ile으로; Phe은 Met, Leu 또는 Tyr으로; Ser은 Thr으로; Thr은 Ser으로; Trp은 Tyr으로; Tyr은 Trp 또는 Phe으로; 및, Val은 Ile 또는 Leu으로 치환된다.
본원은, 하나 이상의 장쇄 다중 불포화 지방산을 포함하는 오일 중의 트라이아실글리세롤의 에스테르 결합을 가수 분해하는 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포, 이러한 숙주 세포를 사용하는 방법, 및 이러한 숙주 세포를 사용하여 리파아제인 폴리펩티드를 생산하는 방법을 개시한다.
한 실시양태에서, 숙주 세포는 높은 수율로 트라이글리세라이드-가수 분해 폴리펩티드를 생산하는 능력을 갖는다. 이러한 폴리펩티드를 생산하는 능력은, 목적하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체로 숙주 세포를 형질 전환시킴으로써 숙주 세포에 부여된다. 상기 형질 전환된 숙주 세포의 이러한 리파아제를 생산하는 능력은, 칸디다 루고사 또는 지오트리쿰 칸디둠과 같은 발현 숙주로부터의 리파아제-암호화 서열 및 AOX 또는 GAP와 같은 프로모터 유전자의 트랜스벡션(transvection)의 조합이다. 상기 리파아제는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)의 알파 매칭 인자(alpha mating factor)에 융합되어 재조합 리파아제가 배양 상등액으로 분비되게 한다. 상기 알파 매칭 인자는 천연(native) 단백질의 방출 시 절단된다. 이는 또한 숙주 세포를 파괴시키지 않으면서 리파아제가 수확되게 한다.
아미노산 서열은 바람직하게는, 형질 전환된 숙주 세포에서 방출 가능한 형태로 발현되고 이어서 숙주 세포로부터 활성 형태로 방출되는 리파아제이다. 따라서, 숙주 세포로부터 수송되는 경우에 숙주 세포 중의 상기 아미노산 서열의 발현은, 28℃에서 1 U/세포 배양액 mL 이상, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 10, 20, 40, 60 또는 80 U/mL 이상의 발현 수준이다. 1 활성(activity) 단위(U)는, 표준 조건(100 mM MOPS 완충액 pH 7.5, 0.24 mM p-니트로페닐 에스테르, 37℃) 하에서, 분당 1 μmol의 p-니트로페놀을 생산하는 효소의 양으로 정의된다. 리파아제 활성, 세포 배양액의 양, 및 무-세포 리파아제의 생성은 파라-니트로페닐 부티레이트(p-NPD)를 기질로 사용하여 상응하는 시험 방법 부분에 기재된 분광 광도 활성 분석법으로 측정했다.
하나 이상의 장쇄 다중 불포화 지방산을 포함하는 오일 중의 트라이아실글리세롤의 에스테르 결합을 가수 분해하는 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포는 바람직하게는, 호기성 발효가 가능한 숙주이다. 상기 숙주 세포는 바람직하게는, 에탄올 및 유기산, 예컨대 젖산, 아세트산 또는 포름산, 및 당 분해 산물, 예컨대 푸르푸랄 및 하이드록시-메틸푸르푸랄에 대한 높은 내성을 추가적으로 갖는다. 상기 숙주 세포의 이들 특징 또는 활성 중 임의의 것이 숙주 세포에 자연적으로 존재할 수 있거나 유전 변형에 의해 도입되거나 변형될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 박테리아 또는 균류와 같은 미생물이지만, 숙주 세포로서 가장 적합한 것은 이스트 또는 사상 균류(filamentous fungi)이다. 본원에서 이스트는 진핵 세포 미생물로 정의되며, 주로 단세포 형태로 자라는 세분된 유미코티나(Eumycotina)(문헌[Alexopoulos, C. J., 1962, In: Introductory Mycology, John Wiley & Sons, Inc., New York)] 참조)의 모든 종을 포함한다. 이스트는 단세포성 엽상체(thallus)의 출아(budding)에 의해 성장할 수 있거나, 또는 상기 생물의 분열(fission)에 의해 성장할 수 있다. 숙주 세포로서 바람직한 이스트는 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 피치아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 한세눌라(Hansenula), 클로에케라(Kloeckera), 슈반니오마이세스(Schwanniomyces), 지오트리키아(Geotrichia) 및 야로위아(Yarrowia) 속에 속한다.
바람직한 실시양태에서, 핵산 구조체는 리파아제 효소와 같은 폴리펩티드를 생성하고 이를 세포로부터 방출하는 능력을 숙주 세포에 부여한다. 상기 형질 전환된 숙주 세포는 이스트 배양을 위해 고안된 다양한 배양액에서 자랄 수 있다. 따라서, 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포는 플라스미드 설계 및 배양 조건에 따라 특정 활성 수준의 리파아제를 세포 외로 발현한다.
본 발명의 핵산 구조체로 숙주 세포를 형질 전환시키고, 숙주 세포, 바람직하게는 이스트를 추가적으로 유전자 변형시키는 것은, 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 그러한 방법은. 예를 들어 표준 문헌, 예컨대 문헌[Sambrook and Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press], 또는 문헌[F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]에 공지되어 있다. 균류 숙주 세포의 형질 전환 및 유전자 변형 방법은, 예를 들어 유럽 특허 출원 제 0 635 574 호, PCT 공개 WO 98/46772, WO 99/60102 및 WO 00/37671에 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 구조체가 리파아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 숙주 세포의 형질 전환을 위해 사용된다. 상기 핵산 구조체에서, 리파아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 바람직하게는, 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드 서열의 전사의 제어 및 개시를 위한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 상기 프로모터는 바람직하게는 숙주 세포 중에 리파아제를 충분히 발현시켜, 숙주 세포에 리파아제를 생성하고 이를 세포로부터 방출하는 능력을 부여할 수 있다. 바람직하게는, 상기 프로모터는 숙주 세포 중의 리파아제 생산을 최대화한다. 본 발명의 핵산 구조체 중의 유용한 프로모터는 구성적(constitutive) 프로모터 및 유도성(inducible) 천연 프로모터 모두를 포함한다. 이러한 특성을 갖는 프로모터는 당업자에게 널리 이용 가능하고 공지되어 있다. 이러한 프로모터의 적합한 예는 예를 들어, 해당과정 유전자의 이스트 프로모터, 예컨대 포스포프룩토키나아제(PPK), 트라이오스 포스페이트 이소머라아제(TPI), 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제(GPD, TDH3 또는 GAPDH), 피루브산 키나아제(PYK), 포스포글리세린산 키나아제(PGK) 프로모터, TEF1-α 유전자 프로모터, PHO90, TH11 및 AOD 프로모터를 포함하고; 이러한 프로모터에 대한 보다 상세한 내용은 WO 93/03159에서 찾을 수 있다. 다른 유용한 프로모터는 리보솜 단백질을 암호화하는 유전자 프로모터, 락타아제 유전자 프로모터(LAC4), 알코올 디하이드로게나제 프로모터(ADH1, ADH4 등) 및 에놀라아제 프로모터(ENO)이다. 가장 바람직한 것은 피치아 발현 벡터 pD912(강한 메탄올 유도성 AOX 프로모터) 및 피치아 발현 벡터 pD915(중간 강한 구성적 GAP 프로모터)로부터의 프로모터이다. 구성적 및 유도성 둘 다의 다른 프로모터, 및 인핸서 또는 상류 활성화 서열은 당업자에게 공지될 것이다. 본 발명의 핵산 구조체에 사용되는 프로모터는, 원한다면, 그의 제어 특성에 영향을 주도록 변형될 수 있다. 바람직하게는, 리파아제의 발현을 위해 핵산 구조체에 사용되는 상기 프로모터는 리파아제 이소머라아제가 발현되는 숙주 세포에 상동적이다.
핵산 구조체에서, 리파아제를 암호화하는 핵산 서열의 3'-말단은 바람직하게는, 재조합 리파아제를 배양 상등액으로 분비시키고, 이어서 리파아제의 방출 시 절단을 가능하게 하는 분비 인자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 바람직하게는, 상기 분비 인자 서열은 선택된 숙주 세포, 예를 들어, 선택된 이스트 종에서 작동할 수 있다. 어느 경우에도, 상기 인자의 선택은 중요하지 않으며, 예를 들어 비-이스트, 진핵 생물 유전자로부터 유래하는 경우에도 때때로 분비 인자가 작용할 수 있더라도, 임의의 이스트 유전자로부터 유래할 수 있다. 상기 분비 인자 서열은 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지아에의 알파 매칭 인자를 추가로 포함한다.
선택적으로, 상기 핵산 구조체에 선별 마커가 존재할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "마커"는 마커를 함유하는 숙주 세포의 선택 또는 스크리닝을 허용하는 형질 또는 표현형을 암호화하는 유전자를 지칭한다. 상기 마커 유전자는 항생제 내성 유전자일 수 있고, 이때 적절한 항생제가 형질 전환되지 않은 세포 중에서 형질 전환 세포를 선택하는데 사용될 수 있다. 적합한 항생제 내성 마커의 예는, 예를 들어 다이하이드로폴레이트 리덕타아제, 하이그로마이신-B-포스포트랜스퍼라아제, 제오신, 3'-O-포스포트랜스퍼라아제 II(카나마이신, 네오마이신 및 G418 내성)를 포함한다. 배수체(polyploid) 숙주 세포의 형질 전환을 위해 항생제 내성 마커의 사용이 가장 편리할 수 있지만, 바람직하게는, 비-항생제 내성 마커(예를 들어, 영양요구성 마커(URA3, TRP1, Leu2) 또는 S. pombe TPI 유전자(문헌[Russell P R, 1985, Gene 40: 125-130]에 개시됨)가 사용된다. 핵산 구성체로 형질 전환된 숙주 세포는 마커 유전자를 갖지 않을 수 있다. 재조합 무-마커 유전자 미생물 숙주 세포를 구성하는 방법은, 유럽 특허 출원 제 0 635 574 호에 개시되어 있고, 양방향 마커, 예를 들어 A. nidulans amdS (아세트아미다아제) 유전자 또는 이스트 URA3 및 LYS2 유전자의 사용에 기초한다. 대안적으로, 본 발명의 핵산 구조체에 녹색 형광 단백질, lacZ, 루시퍼라아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제, 베타-글루쿠로니다아제와 같은 스크리닝성(screenable) 마커가 도입되어 형질 전환 세포를 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 핵산 구조체에 존재할 수 있는 임의의 추가 요소는, 비제한적으로, 하나 이상의 리더 서열, 인핸서, 통합(integration) 인자 및/또는 리포터 유전자, 인트론 서열, 센트로미어, 텔로미어 및/또는 기질 부착(MAR) 서열을 포함한다. 본 발명의 핵산 구조체는 자율 증식을 위한 서열, 예컨대 ARS 서열을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 에피솜(episomal) 핵산 구조체는 예를 들어, 이스트 2.mu. 또는 pKD1(문헌[Fleer et al., 1991, Biotechnology 9: 968-975] 참조) 플라스미드에 기초할 수 있다. 대안적으로, 핵산 구조체는, 바람직하게는 상동성 재조합에 의해, 통합을 위한 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 따라서 숙주 세포의 게놈 내의 통합을 위한 표적 부위와 상동인 서열일 수 있다. 본 발명의 핵산 구조체는 그 자체로 공지된 방식으로 제공될 수 있으며, 일반적으로 표준 문헌, 예컨대 문헌[Sambrook and Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press] 또는 문헌[F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]을 참조로 한다.
한 실시양태에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포에 관한 것으로, 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 장쇄 다중 불포화 지방산을 포함하는 오일 중의 트라이아실글리세롤의 에스테르 결합을 가수 분해한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 사용하는 방법에 관한 것으로, 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 장쇄 다중 불포화 지방산을 포함하는 오일 중의 트라이아실글리세롤의 에스테르 결합을 가수 분해한다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대해 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 발현하고, 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 장쇄 다중 불포화 지방산을 포함하는 오일 중의 트라이아실글리세롤의 에스테르 결합을 가수 분해한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대해 90% 내지 99%, 91% 내지 99%, 92% 내지 99%, 93% 내지 99%, 94% 내지 99%, 95% 내지 99%, 96% 내지 99%, 97% 내지 99%, 또는 98% 내지 99%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 발현하고, 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 장쇄 다중 불포화 지방산을 포함하는 오일 중의 트라이아실글리세롤의 에스테르 결합을 가수 분해한다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 서열 번호 2의 아미노산 서열에 대해 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 발현하고, 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 장쇄 다중 불포화 지방산을 포함하는 오일 중의 트라이아실글리세롤의 에스테르 결합을 가수 분해한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 서열 번호 2의 아미노산 서열에 대해 90% 내지 99%, 91% 내지 99%, 92% 내지 99%, 93% 내지 99%, 94% 내지 99%, 95% 내지 99%, 96% 내지 99%, 97% 내지 99%, 또는 98% 내지 99%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 발현하고, 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 장쇄 다중 불포화 지방산을 포함하는 오일 중의 트라이아실글리세롤의 에스테르 결합을 가수 분해한다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 서열 번호 3의 아미노산 서열에 대해 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 발현하고, 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 장쇄 다중 불포화 지방산을 포함하는 오일 중의 트라이아실글리세롤의 에스테르 결합을 가수 분해한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 서열 번호 3의 아미노산 서열에 대해 90% 내지 99%, 91% 내지 99%, 92% 내지 99%, 93% 내지 99%, 94% 내지 99%, 95% 내지 99%, 96% 내지 99%, 97% 내지 99%, 또는 98% 내지 99%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 발현하고, 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 장쇄 다중 불포화 지방산을 포함하는 오일 중의 트라이아실글리세롤의 에스테르 결합을 가수 분해한다.
일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 리파아제이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 리파아제의 동형체이다. 더 바람직한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 칸디다 루고사 또는 지오트리쿰으로부터 유래하는 리파아제의 동형체이다.
일부 실시양태에서, 오일 중의 트라이아실글리세롤의 에스테르 결합을 가수 분해하는 폴리펩티드는 리파아제이다. 바람직한 실시양태에서, 오일 중의 트라이아실글리세롤의 에스테르 결합을 가수 분해하는 폴리펩티드는 리파아제의 동형체이다. 더 바람직한 실시양태에서, 오일 중의 트라이아실글리세롤의 에스테르 결합을 가수 분해하는 폴리펩티드는 칸디다 루고사 또는 지오트리쿰 칸디둠으로부터 유래하는 리파아제의 동형체이다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 이스트이다. 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 피치아 파스토리스이다.
한 실시양태에서, 리파아제는 칸디다 루고사로부터 유래하는 동형체의 혼합물이다. 바람직한 실시양태에서, 리파아제는 칸디다 루고사로부터 유래하는 동형체이다. 더 바람직한 실시양태에서, 리파아제는 칸디다 루고사 리파아제 1, 칸디다 루고사 리파아제 3 및 이들의 혼합물이다. 한 실시양태에서, 칸디다 루고사 리파아제 1은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는다. 한 실시양태에서, 칸디다 루고사 리파아제 3은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는다.
한 실시양태에서, 리파아제는 지오트리쿰 칸디둠으로부터 유래하는 동형체의 혼합물이다. 바람직한 실시양태에서, 리파아제는 지오트리쿰 칸디둠으로부터 유래하는 동형체이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 리파아제는 지오트리쿰 칸디둠 리파아제 2이다. 한 실시양태에서, 지오트리쿰 칸디둠 리파아제 2는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 트라이아실글리세롤은 하나 이상의 장쇄 다중 불포화 지방산(LC-PUFA)을 포함한다. 일부 실시양태에서, LC-PUFA는 오메가-3 지방산, 오메가-6 지방산 및 이들의 혼합물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, LC-PUFA는 도코사헥사엔산(DHA), 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사펜타엔산(DPA), 아라키돈산(ARA), 감마-리놀렌산(GLA), 다이호모감마-리놀렌산(DGLA), 스테아리돈산(SDA) 및 이들의 혼합물을 포함한다. 더 바람직한 실시양태에서, LC-PUFA는 DHA, EPA 및 이들의 혼합물을 포함한다. 추가의 실시양태에서, LC-PUFA는 DHA이다. 또 다른 실시양태에서, LC-PUFA는 EPA이다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 이스트이다. 바람직하게는, 상기 이스트는 호기성 발효가 가능하다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 피치아 파스토리스이다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 대장균(Escherichia coli)이다.
일부 실시양태에서, 오일은 해양 오일, 예컨대 피쉬 오일로부터 유도될 수 있다. 이러한 오일은 일반적으로 포화 및 불포화 지방산, 이들의 에스테르 및 글리세리드의 혼합물을 함유하지만, 지방산의 특정 혼합물(예를 들어, 모두 포화된 것, 모두 불포화된 것, 둘 모두의 혼합물 또는 특정 쇄 길이 또는 쇄 길이의 범위의 지방산의 혼합물을 함유함)가 되도록 공정처리될 수 있다. 임의의 피쉬 오일이 개시된 화합물 및 방법에 사용될 수 있다. 적합한 피쉬 오일의 예는, 비제한적으로, 이들의 혼합물 및 조합을 비롯한, 대서양 피쉬 오일, 태평양 피쉬 오일, 지중해 피쉬 오일, 경압 피쉬 오일, 알칼리 처리 피쉬 오일, 열처리 피쉬 오일, 경질 및 중질 갈색 피쉬 오일, 보니토(bonito) 오일, 정어리 오일, 참치 오일, 농어 오일, 할리부(halibut) 오일, 스피어피쉬(spearfish) 오일, 바라쿠다(barracuda) 오일, 대구 오일, 멘하덴(menhaden) 오일, 사르딘(sardine) 오일, 앤초비 오일, 캐펠린(capelin) 오일, 청어 오일, 고등어 오일, 연어 오일, 상어 오일을 포함한다. 비-알칼리 처리 피쉬 오일 또한 적합하다. 본원에서 사용되는 적합한 다른 해양 오일은, 비제한적으로, 이들의 혼합물 및 조합을 비롯한, 스퀴드 오일, 커틀 피쉬 오일, 문어 오일, 크릴 오일, 물범 오일, 고래 오일 등을 포함한다. 임의의 해양 오일 및 해양 오일의 조합이 상기 개시된 조성물 및 이를 제조하기 위한 상기 개시된 방법에 사용될 수 있다. 추가의 오일은, 이들의 혼합물 및 조합을 비롯한, 조류 오일인 미생물 오일(예를 들어, 와편모충류, 예컨대 크립테코디늄 코니이(Crypthecodinium cohnii), 피시움(Phythium)으로부터 수득가능한 오일) 또는 균류 오일인 미생물 오일(예를 들어, 트라우스토키트리움(Thraustochytrium), 스키조키트리움(Schizochytrium), 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)로부터 수득가능한 오일 또는 이들의 혼합물), 및/또는 식물 오일을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 오일은 조질 오일 또는 비정제 오일이다.
한 실시양태에서, 리파아제인 폴리펩티드의 생산 방법은, a) 본원에서 정의된, 리파아제인 폴리펩티드를 생성하고 방출하도록 형질 전환된 숙주 세포를 함유하는 배양액을 발효시켜, 상기 숙주 세포가 발효하며, 동시에 리파아제인 상기 폴리펩티드를 생성하고 방출하는 단계, 및 선택적으로, b) 리파아제인 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다. 상기 발효 공정은 바람직하게는 형질 전환된 숙주 세포를 위한 최적의 온도에서 수행된다. 따라서, 대부분의 이스트 또는 균류 숙주 세포의 경우, 상기 발효 공정은 38℃ 미만의 온도에서 수행된다. 이스트 또는 사상 균류 숙주 세포의 경우, 상기 발효 공정은 바람직하게는 35, 33, 30℃ 또는 28℃ 미만의 온도, 및 20, 22 또는 25℃ 초과의 온도에서 수행된다. 상기 발효 배양액은, 이들 공정 단계를 향상시키도록 당업계의 숙련자에게 공지된 임의의 다양한 배양액 조성에 의해 추가로 최적화될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 리파아제인 상기 폴리펩티드는 칸디다 루고사 리파아제 1, 칸디다 루고사 리파아제 3 및 지오트리쿰 칸디다 리파아제 2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시예
시험 방법
분광 광도 활성 분석법: 리파아제의 활성을 결정하기 위해 p-니트로페닐에스테르가 가수 분해되는 37℃에서 분광 광도 분석법을 사용했다. 생성된 p-니트로페놀에 의해 410 nm에서의 흡광도의 증가가 측정될 수 있고, 이는 효소 활성과 상관 관계가 있다. 1 활성 단위(U)는, 사용된 조건 하에서 분당 1 μmol의 p-니트로페놀을 생산하는 효소의 양으로 정의되었다. 따라서, 100 mM MOPS 완충액 pH 7.5, 0.24 mM p-니트로페닐에스테르 및 38 μl/ml CFE를 함유하는 적절하게 희석된 반응 혼합물, 및 CFE 대신 완충액을 함유하는 블랭크를 사용하여 흡광도 변화를 5 분 동안 기록했다. 이 Δabs/min에 기초하여, 체적 활성(U/ml, 방정식 1 참조) 및 단백질 비활성(specific activity)(U/총 단백질 mg, 방정식 2 참조)을 계산할 수 있었다. 가용성 단백질 분획을 함유하는 CFE(가용성) 및 총 단백질을 함유하는 CFE(총)를 측정했다. 첫 번째 경우, p-니트로페닐부티레이트(pNPB)가 기질로서 사용되었다.
Figure pct00001
(1)
상기 식에서,
Df는 CFE의 희석 계수이고,
ε는 12.643(μmol/ml)-1 * cm-1이고,
d는 큐벳 경로 길이이다.
Figure pct00002
(2)
유리 지방산의 결정: 유리 지방산의 백분율(% FFA)을 결정하기 위해 타이트리노(Titrino) 718으로 종말점 적정을 수행했다. 50 ml의 용매(톨루엔/이소프로판올/물 = 500/500/10)를 페놀프탈레인(이소프로판올 중의 0.8%(w/w)) 2 적(drop)과 혼합하고, 이 용액의 색이 10 내지 15 초 동안 분홍색을 유지할 때까지 0.15 M KOH(50 ml 물 중에 용해된 10.0 g의 KOH을 950ml의 에탄올로 채움) 용액으로 적정했다. 타이터를 결정하기 위해, 아는 양의 벤조산을 이 용액에 첨가하고 적정했다. 상기 타이터는 방정식 3에서 기술된 바와 같이 계산되었고, 추가 계산을 위해 3 개의 독립적인 타이터의 평균이 사용되었다. 샘플을 측정하기 위해, 샘플의 오일 층의 아는 양을 상기 분홍색 용매에 첨가하고, 잘 혼합하고, 분홍색으로 다시 적정했다. 방정식 4에서 설명된 바와 같이 FFA의 백분율을 계산했다.
Figure pct00003
(3)
상기 식에서,
타이터는 mol/l 단위이고,
m은 사용된 벤조산의 질량(g)이고,
Mw(Ba)는 벤조산의 분자량(122.12 g/mol)이고,
V(KOH)는 사용된 0.15 M KOH의 부피이다.
Figure pct00004
(4)
상기 식에서,
타이터는 mol/l 단위이고,
m은 사용된 샘플의 질량(g)이고,
Mw(KOH)는 KOH의 분자량(56.1 g/mol)이고,
V(KOH)는 사용된 0.15 M KOH의 부피이다.
LC-MS에 의한 오일 상태(글리세롤 상)의 EPA 및 DHA 농도 측정: EPA 및 DHA 농도의 분석을 위해, 오일 층의 약 40 mg을 테트라하이드로푸란 25 ml에 용해시키고 추가적으로 1:4로 희석시켰다. 이 샘플은 LC-MS에 의해 이러한 장비에 대한 일반적인 프로토콜에 따라 분석되었다. 사용된 칼럼은 VanGuard 사전 칼럼을 갖는 워터스 액퀴티(Waters Acquity) UPLC BEH C18 50 x 2.1 mm ID 1.8 ㎛이었다. 이 시스템을 DHA 및 EPA에 대해 교정했다. 두 화합물에 대한 교정 곡선을 그렸다. 결과는 EPA와 DHA가 잘 분리되어 각각에 대한 유리 지방산의 정확한 계산이 가능함을 나타냈다.
실시예 1-피치아 파스토리스 내에서의 칸디다 루고사 리파아제 동형체의 발현
2 개의 상업적으로 입수가능한 칸디다 루고사 리파아제의 동형체인, 아마노(Amano) AY 및 바이오카탈리스츠 리포모드(Biocatalysts Lipomod) 034을 단백질-MS 시퀀싱으로 측정했다. 5 개의 CR 동형체가 발견되었고, 두 리파아제 모두에서 확인된 2 개의 주요 동형체는 CR Lip1 및 CR Lip3이었다. 피치아 파스토리스 내에서의 발현을 위해, DNA 2.0(캘리포니아주 멘로 파크)로 모든 5 가지 동형체에 대한 유전자를 제작하고 코돈을 최적화시켰다. 리파아제 유전자는 사카로마이세스 세레비지아에의 알파 매칭 인자 유전자에 융합되어 재조합 리파아제를 배양 상등액으로 분비하게 한다. 상기 알파 매칭 인자는 천연 단백질의 방출 시 절단되었다. 각각 AOX 프로모터(pD912) 및 GAP 프로모터(pD915)를 갖는 두 개의 발현 벡터를 제조하고, 각각을 피치아 파스토리스 내로 개별적으로 클로닝했다. pD912에서, 관심 유전자는, 하류에 클로닝되며 알파 인자와 융합되고 강한 메탄올 유도성 AOX 프로모터의 제어를 받는다. pD915에서, 관심 유전자는, 하류에 클로닝되며 알파 인자와 융합되고 중간 강한 구성적 GAP 프로모터의 제어를 받는다. pD912 및 pD915 모두에 있어서, 제오신은 선별 마커이고, 피치아 게놈 내로 통합 시에, 대장균 내에서의 증식에 필요한 pUC 오리진(origin)은 제거되었다. DNA2.0(캘리포니아주 멘로 파크)으로 10 개의 DNA 구조체를 제작했고, DNA2.0으로 제작한 각각의 2 개의 벡터 내에서 사용했다. 양성 대조군(DNA2.0으로부터 얻은 pJ912_큐티나아제(cutinase)) 또한 사용했다.
칸디다 루고사 리파아제 동종 단백질 유전자를 함유하는 피치아 발현 벡터 pD912 및 pD915를 사용한 대장균의 형질 전환
P. pastoris의 형질 전환을 위해 다량의 플라스미드 DNA가 필요하다. DNA2.0으로 제작한 플라스미드 DNA를 E. coli에서 증식시켰다. 컴피턴트 세포를 생성했다. 생성한 스톡(stock)을 글리세롤 스톡으로 전환시키고 남은 배양액을 사용하여 플라스미드 DNA를 추출했다.
E. coli 으로부터의 플라스미드-DNA의 추출
Qiagen의 표준 프로토콜("Qiagen 플라스미드 미디 키트를 사용한 플라스미드 DNA 정제")를 사용하여 잔류 배양액으로부터 플라스미드-DNA를 추출했다. 수득한 플라스미드 DNA를 0.8% 아가로스 겔에서 분석하고 DNA 농도를 측정했다. 표 1에 그 결과를 나타냈다.
[표 1] 미디프렙(Midiprep) 샘플 중의 DNA 농도
Figure pct00005
칸디다 루고사 리파아제 동형체 유전자를 함유하는 pD912 및 pD915를 갖는 피치아 파스토리스 PPS9010의 형질 전환
플라스미드 선형화: 증식되어 더 많은 양으로 이용 가능한 플라스미드는 선형화시켜야 했다(피치아 파스토리스의 형질 전환에 선형 DNA가 필요함). 선형화를 위해 다음과 같은 제한 효소를 사용했다: pD912-구조체에 대해 SacI(배양 온도 37℃) 및 pD915 구조체 SwaI(배양 온도 25℃)를 사용했다.
20 μg의 DNA(미디프렙으로부터 수득됨)에 10 μl의 10x완충액 및 2.5 μl의 제한 효소를 첨가했다. 상기 혼합물을 물 100 μl로 채웠다. 상기 제한 효소를 위한 적절한 온도에서 2 시간 동안 배양을 수행했다. 이어서, 상기 혼합물을 65℃에서 20 분 동안 노출시킴으로써 상기 효소를 비활성화시켰다. 1 μl의 혼합물을 0.8% 아가로스 겔에서 분석하여 상기 제한이 성공적임을 확인했다. 공급자 매뉴얼에 따라 Quiagen PCR 정제 키트를 사용하여 수득된 선형화시킨 DNA를 정제했다. 정제 이후, DNA 농도를 측정했다. 표 2에 그 결과를 나타냈다.
[표 2] 정제된 선형화시킨 플라스미드 DNA의 DNA 농도
Figure pct00006
컴피턴트 피치아 파스토리스 세포의 생성
접종 루프를 사용하여 상기 글리세롤 스톡으로부터 피치아 파스토리스 PPS9010 세포를 5 ml YPD 배양액에 접종하고, 밤새 30℃ 및 180 rpm으로 배양했다. 이 배양액을 100 ml의 신선한 YPD 배양액에 OD600이 0.15 내지 0.2가 되도록 접종하고, 이를 30℃에서 120 rpm으로 배양했다. OD600이 1.3 내지 1.5에 도달했을 때, 상기 배양액을 두 개의 50 ml 팔콘(Falcon) 튜브에 채우고 4℃에서 10 분간 500 * g로 원심 분리시켰다. 상등액을 디캔트하고 버렸다. 펠릿을 50 ml의 얼음 냉각된, 멸균된 초순수한 물에 재현탁시키고, 4℃에서 5 분간 500 * g로 원심 분리시켰다. 이 상등액을 또 디캔트하고 버렸다. 펠릿을 50 ml의 얼음 냉각된, 멸균된 초순수한 물에 재현탁시키고, 4℃에서 5 분간 500 * g로 원심 분리시켰다. 이 상등액을 또 디캔트하고 버렸다. 그 후 세포를 20 ml의 얼음 냉각된, 멸균된 1 M 소르비톨에 재현탁시키고, 4℃에서 5 분간 500 * g로 원심 분리시켰다. 상등액을 다시 디캔트하고 버렸다. 이어서, 세포를 마침내 250 μl의 1M 소르비톨에 재현탁시켰다.
컴피턴트 피치아 파스토리스의 형질 전환
생성된 컴피턴트 피치아 세포를 선형화시킨 플라스미드로 형질 전환시키고, 상기 플라스미드는 전술한 바와 같이 E. coli를 사용하여 대량으로 증폭시켰다. 100 μl의 컴피턴트 피치아 세포에 10 μl의 선형화시킨 플라스미드(2 내지 4 μg)를 첨가하고 이 현탁액을 2 mm의 갭의 일렉트로포레이션(electroporation) 큐벳으로 옮겼다. 상기 세포를 얼음 위에서 5 분간 배양한 후, 1500 V, 200 Ω, 25 μF에서 일렉트로포레이션시켰다. 이 혼합물에 1 ml의 얼음 냉각된 1 M 소르비톨을 첨가하고, 이 혼합물을 30℃에서 1 시간 동안 배양했다. 이어서, 상기 혼합물을 21℃에서 5 분간 1000 * g로 원심 분리시키고 상등액을 디캔트했다. 잔류하는 상등액 액적에 펠릿을 재현탁시켰다. 접종 루프로 각 콜로니를 200 μg/ml 제오신을 포함하는 5 ml YPD 배양액에 옮기고, 밤새 28℃에서 180 rpm으로 배양했다. 장기 보관을 위해 1 ml의 배양액을 50% 글리세롤 0.5 ml와 혼합하고, 실온에서 15 분간 진탕하고, -80℃에서 보관했다.
클론 발현 및 활성 확인
모든 시험된 클론이 트라이부티린에 대한 활성을 나타내며 예상 리파아제 밴드가 관찰되는지를 확인하기 위해, 모든 샘플에 대해 트라이부티린 아가(agar) 플레이트 분석 및 SDS-PAGE 분석을 수행했다. 분광 광도 활성 분석법으로 p-NPD를 기질로 사용하여 배양액의 활성을 측정했다. 표준 절차에 따라 브래드포드(Bradford) 시약으로 샘플의 단백질 함량을 분석했다. 그 결과, CR Lip1 클론이 리파아제의 높은 수준의 발현을 보였다. CR Lip5 클론 중 어느 것에 대해서도 활성이 검출되지 않았고, 몇몇 CR Lip3 및 CR Lip4 클론에 대해서는 중간 활성이 측정되었다. CR Lip2 클론의 활성은 일반적으로 매우 낮았다. 더 일정한 성장 조건 및 따라서 더 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해 진탕 플라스크(shake flask) 발현을 수행해야 했다.
AOX 및 GAP 구조체의 진탕 플라스크 발현
AOX-구조체의 진탕 플라스크 발현을 위해, 글리세롤 스톡을 사용하여 25 ml의 BMGY 배양액을 배플(baffle)을 갖는 300 ml 플라스크에 접종했다. 이 예비 배양액을 28℃에서 110 rpm으로 24 시간 동안 배양했다. 세포를, 원심 분리(3000 * g, 5 분, 실온)에 의해 수확하고, 50 ml BMMY 배양액에 재현탁시키고, 배플 및 폼 플러그(foam plug)를 갖는 1000 ml 플라스크에 채웠다. 발현을 위해, 상기 배양액을 28℃에서 110 rpm으로 96 시간 동안 배양했다. 유도를 유지하기 위해, 250 μl의 메탄올을 1 일 1 회 첨가했다. 96 시간 후, 상기 배양액을 원심 분리(3000 * g, 5 분, 4℃)하고 상등액을 별도의 튜브에 옮겨 -20℃에서 보관했다.
GAP-구조체의 진탕 플라스크 발현을 위해, 상기 글리세롤 스톡을 사용하여 배플을 갖는 300 ml 플라스크 내의 25 ml YPD 배양액을 접종했다. 이 예비 배양액을 28℃에서 110 rpm으로 밤새 배양했다. 세포를 원심 분리(3000 * g, 5 분, 실온)에 의해 수확하고, 100 ml YPD 배양액에 재현탁시키고, 배플 및 폼 플러그를 갖는 1000 ml 플라스크에 채웠다. 발현을 위해, 상기 배양액을 28℃에서 110 rpm으로 96 시간 동안 배양했다. 96 시간 후, 성가 배양액을 원심 분리(5000 * g, 10 분, 4℃)하고 상등액을 별도의 튜브에 옮겨 -20℃에서 보관했다.
분광 광도 활성 분석법
상술한 분광 광도 분석법으로 배양 상등액의 활성을 측정했다. 기질로서, p-NPD(p-니트로페닐 데카노에이트)를 사용했다.
표준 절차에 따라 브래드 포드 시약으로 샘플의 단백질 함량을 분석했다. U/총 단백질의 샘플 mg의 비활성을, 알칼리그네스 종(Alcaligness sp.)의 다른 4 가지 상업용 리파아제(Al-1, Al-2, Al-3 및 Al-4) 및 상업용 CRL 제제 L11의 활성과 비교했다. 표 3에 그 결과를 나타냈다.
[표 3] 피치아 파스토리스 진탕 플라스크 발현의 활성 및 단백질 함량
Figure pct00007
실시예 2-P. pastoris 및 E. coli 내에서의 발현 수준의 비교
비교를 위해, 또한 대장균 내에서 리파아제 동형체를 발현시켰다. 유전자 구조체는 DNA2.0으로부터 합성 DNA로서 주문했고 네오마이신 내성 유전자가 있는 발현 벡터에 클로닝시켰다. 관심 유전자는 pBAD 프로모터를 통해 L-아라비노스에 의해 유도된다. 표 4에 그 결과를 나타냈다.
[표 4] P. pastoris 및 E. coli의 달성된 발현 수준의 비교
Figure pct00008
실시예 3-칸디다 루고사 리파아제 가수 분해 실험
실시예 1에 따라 생성된 칸디다 루고사 리파아제 동형체를 피쉬 오일의 가수 분해에 대해 시험하기 위해, 적정 없이, 40 ml 스케일의 pH-고정 장비에서 35℃에서의 반응을 설정했다. 상업적으로 입수가능한 아마노의 칸디다 루고사 리파아제 AY-30(CRL11이라 지칭함)을 비교용 리파아제로 사용했다. CR Lip 2 및 CR Lip 5의 약한 활성으로 인해, 오직 CR Lip 1, CR Lip 3 및 CR Lip 4만 사용했다. 피쉬 오일 농도는 50%(v/v)이었다. CR Lip1 및 CR Lip4의 경우, 상업용 리파아제에 대해 0.1%(w/w) E/S에 해당하는 피쉬 오일 1 g 당 8.6 U(p-NPD 활성 기준)를 사용했다. 완충액으로서, 50 mM KPi pH 7.5를 사용했다. 효소량이 낮기 때문에 CR Lip3의 효소 농도를 피쉬 오일 1g 당 6.8 U로 제한했고, CR Lip2의 경우 0.9 U(상업용 리파아제의 0.01%(w/w) E/S에 해당함)로 제한했다.
가능한 경우, pH를 모니터링하면서, 효소를 첨가하기 전에 pH-고정기에서 약 30 분 동안 완충액과 함께 피쉬 오일를 2000 rpm으로 교반했다. 효소를 첨가하여 반응을 개시시킨 후, 0 시간, 1 시간, 4 시간, 18 시간 및 24 시간의 상이한 시점에서 2 ml의 샘플을 채취했다. 유리 지방산(FFA)의 농도 및 EPA와 DHA 농도에 대하여 이 샘플들을 분석했다. 오일 층 중의 모든 유리 지방산을 얻기 위해, 에멀젼을 3 M HCl으로 산성화시키고, 잘 혼합하고, 원심 분리하여 층을 분리시켰다. 필요한 경우, 샘플을 60℃에서 오븐에서 수 분 동안 가열하여 액화시켰다.
표 5 및 6에 가수 분해 결과를 나타냈고, 이는 반응의 전환 및 선택성을 보여준다. 비교를 위해, 반응이 100% 전환까지 실행되면 모든 선택성이 모든 효소에 의해 상실될 것이므로, CR Lip1, CR Lip3 및 CR Lip4에 대한 상업용 비교용 실시예 CRL11 샘플의 선택성의 비교를 위해 전환의 정도를 사용했다. 따라서, 반응 시간보다는 전환의 범위를 비교의 잣대로 사용하는 것이 유용하다. 반응 시간은 상이한 효소의 동형체에 따라 다양할 것으로 예상되며, 반응 시간은 많은 다른 조건에 의해 최적화될 수 있기 때문에, 반응 시간이 관찰됨을 합리적으로 확인하기 위해 반응 시간이 기록되더라도 비교를 위한 잣대로는 사용되지 않는다.
[표 5] 칸디다 루고사 리파아제의 FFA 중의 EPA에 대한 효과
Figure pct00009
1 오일은 THF로 희석시킨 후에 측정된 EPA 및 DHA의 농도이다.
2 EPA 상실 %은 유리 지방산 EPA의 백분율, 즉 (오일 중의 EPA/오일) X 100이다.
3 FFA 중의 EPA 상실 %은 FFA의 총 상실에 대한 유리 EPA의 백분율, 즉 (% EPA 상실/% 총 FFA 상실) X 100이다.
[표 6] 칸디다 루고사 리파아제의 FFA 중의 DHA에 대한 효과
Figure pct00010
1 오일은 THF로 희석시킨 후에 측정된 EPA 및 DHA의 농도이다.
2 DHA 상실 %은 유리 지방산 DHA의 백분율, 즉 (오일 중의 DHA/오일) X 100이다.
3 FFA 중의 DHA 상실 %은 FFA의 총 상실에 대한 유리 DHA의 백분율, 즉 (% DHA 상실/% 총 FFA 상실) X 100이다.
실시예 4-지오트리쿰 칸디둠 리파아제 가수 분해 실험
이들 실시예에서, 지오트리쿰 칸디둠으로부터의 리파아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 피치아 파스토리스에서 동정하고 발현시켰다. 상업적으로 입수가능한 아마노의 칸디다 루고사 리파아제 AY-30(CRL11이라 지칭함)을 비교용 리파아제로 사용했다.
각각의 샘플(GC Lip1, GC Lip2 및 CRL11)에 대해, 약 20 g의 피쉬 오일, 3 ml의 0.95 mg/ml 리파아제 용액 및 12.0 ml의 BES 완충액(50 mM, pH 7.0)를 100 mL 플라스크에 넣고 37℃에서 360 rpm으로 N2 가스 하에서 교반했다. 상술한 방법 <유리 지방산의 결정>으로 산가를 모니터링함으로써 반응 진행을 모니터링했다. 85℃에서 10 분간 가열함으로써 반응을 정지시켰다. 상기 혼합물을 25 mL의 염수(brine) 및 25 mL의 물로 세척하고, 진공(1 torr)하에 오일을 건조시켰다. 글리세라이드 및 지방산을 다음과 같이 분리했다: 오일 10 g을 헥산 75 mL 및 에틸 아세테이트 25 mL에 첨가했다. 이어서, 유기층을 0.5 M 수산화 나트륨 40 mL 및 에탄올 40 mL의 용액으로 2 회 추출했다. 이어서, 상부 유기층을 물로 세척하고; 용매를 감압 하에 제거하고 높은 진공 하에 건조시켜 글리세리드를 수득했다. 그리고 나서, 하부의 알칼리 층을 3 M HCl로 pH 1로 산성화시키고, 75 mL의 헥산 및 75 mL의 클로로포름으로 추출하고, 조합된 유기물을 증발시켜 지방산 층을 수득했다. EP2.4.29 방법에 의해 분리된 글리세라이드와 지방산의 지방산 프로파일을 결정했다. 표 7 및 표 8에 그 결과를 나타냈다.
GC Lip2 및 약 22% EPA 및 10% DHA를 함유하는 오일 조성물을 사용하여 실험을 반복했다. 표 9 및 표 10에 그 결과를 나타냈다.
[표 7] 18:15 오일 상의 FFA 중의 EPA에 대한 지오트리쿰 칸디둠 리파아제의 효과
Figure pct00011
[표 8] 18:15 오일 상의 FFA 중의 DHA에 대한 지오트리쿰 칸디둠 리파아제의 효과
Figure pct00012
[표 9] 20:10 오일 상의 FFA 중의 EPA에 대한 지오트리쿰 칸디둠 리파아제의 효과
Figure pct00013
[표 10] 20:10 오일 상의 FFA 중의 DHA에 대한 지오트리쿰 칸디둠 리파아제의 효과
Figure pct00014
SEQUENCE LISTING <110> DSM IP ASSETS B.V. <120> PARTIAL ENZYMATIC HYDROLYSIS OF TRIACYLGLYCEROLS <130> 31165-US-PSP <140> PCT/IB2016/058086 <141> 2016-12-29 <150> US 62/272,829 <151> 2015-12-30 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 534 <212> PRT <213> Candida rugosa <400> 1 Ala Pro Thr Ala Thr Leu Ala Asn Gly Asp Thr Ile Thr Gly Leu Asn 1 5 10 15 Ala Ile Ile Asn Glu Ala Phe Leu Gly Ile Pro Phe Ala Glu Pro Pro 20 25 30 Val Gly Asn Leu Arg Phe Lys Asp Pro Val Pro Tyr Ser Gly Ser Leu 35 40 45 Asp Gly Gln Lys Phe Thr Ser Tyr Gly Pro Ser Cys Met Gln Gln Asn 50 55 60 Pro Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Asn Leu Pro Lys Ala Ala Leu Asp Leu 65 70 75 80 Val Met Gln Ser Lys Val Phe Glu Ala Val Ser Pro Ser Ser Glu Asp 85 90 95 Cys Leu Thr Ile Asn Val Val Arg Pro Pro Gly Thr Lys Ala Gly Ala 100 105 110 Asn Leu Pro Val Met Leu Trp Ile Phe Gly Gly Gly Phe Glu Val Gly 115 120 125 Gly Thr Ser Thr Phe Pro Pro Ala Gln Met Ile Thr Lys Ser Ile Ala 130 135 140 Met Gly Lys Pro Ile Ile His Val Ser Val Asn Tyr Arg Val Ser Ser 145 150 155 160 Trp Gly Phe Leu Ala Gly Asp Glu Ile Lys Ala Glu Gly Ser Ala Asn 165 170 175 Ala Gly Leu Lys Asp Gln Arg Leu Gly Met Gln Trp Val Ala Asp Asn 180 185 190 Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Thr Lys Val Thr Ile Phe Gly Glu 195 200 205 Ser Ala Gly Ser Met Ser Val Met Cys His Ile Leu Trp Asn Asp Gly 210 215 220 Asp Asn Thr Tyr Lys Gly Lys Pro Leu Phe Arg Ala Gly Ile Met Gln 225 230 235 240 Ser Gly Ala Met Val Pro Ser Asp Ala Val Asp Gly Ile Tyr Gly Asn 245 250 255 Glu Ile Phe Asp Leu Leu Ala Ser Asn Ala Gly Cys Gly Ser Ala Ser 260 265 270 Asp Lys Leu Ala Cys Leu Arg Gly Val Ser Ser Asp Thr Leu Glu Asp 275 280 285 Ala Thr Asn Asn Thr Pro Gly Phe Leu Ala Tyr Ser Ser Leu Arg Leu 290 295 300 Ser Tyr Leu Pro Arg Pro Asp Gly Val Asn Ile Thr Asp Asp Met Tyr 305 310 315 320 Ala Leu Val Arg Glu Gly Lys Tyr Ala Asn Ile Pro Val Ile Ile Gly 325 330 335 Asp Gln Asn Asp Glu Gly Thr Phe Phe Gly Thr Ser Ser Leu Asn Val 340 345 350 Thr Thr Asp Ala Gln Ala Arg Glu Tyr Phe Lys Gln Ser Phe Val His 355 360 365 Ala Ser Asp Ala Glu Ile Asp Thr Leu Met Thr Ala Tyr Pro Gly Asp 370 375 380 Ile Thr Gln Gly Ser Pro Phe Asp Thr Gly Ile Leu Asn Ala Leu Thr 385 390 395 400 Pro Gln Phe Lys Arg Ile Ser Ala Val Leu Gly Asp Leu Gly Phe Thr 405 410 415 Leu Ala Arg Arg Tyr Phe Leu Asn His Tyr Thr Gly Gly Thr Lys Tyr 420 425 430 Ser Phe Leu Ser Lys Gln Leu Ser Gly Leu Pro Val Leu Gly Thr Phe 435 440 445 His Ser Asn Asp Ile Val Phe Gln Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Gly Ser 450 455 460 Leu Ile Tyr Asn Asn Ala Phe Ile Ala Phe Ala Thr Asp Leu Asp Pro 465 470 475 480 Asn Thr Ala Gly Leu Leu Val Lys Trp Pro Glu Tyr Thr Ser Ser Ser 485 490 495 Gln Ser Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Asn Ala Leu Gly Leu Tyr Thr 500 505 510 Gly Lys Asp Asn Phe Arg Thr Ala Gly Tyr Asp Ala Leu Phe Ser Asn 515 520 525 Pro Pro Ser Phe Phe Val 530 <210> 2 <211> 534 <212> PRT <213> Candida rugosa <400> 2 Ala Pro Thr Ala Lys Leu Ala Asn Gly Asp Thr Ile Thr Gly Leu Asn 1 5 10 15 Ala Ile Ile Asn Glu Ala Phe Leu Gly Ile Pro Phe Ala Glu Pro Pro 20 25 30 Val Gly Asn Leu Arg Phe Lys Asp Pro Val Pro Tyr Ser Gly Ser Leu 35 40 45 Asn Gly Gln Lys Phe Thr Ser Tyr Gly Pro Ser Cys Met Gln Gln Asn 50 55 60 Pro Glu Gly Thr Phe Glu Glu Asn Leu Gly Lys Thr Ala Leu Asp Leu 65 70 75 80 Val Met Gln Ser Lys Val Phe Gln Ala Val Leu Pro Gln Ser Glu Asp 85 90 95 Cys Leu Thr Ile Asn Val Val Arg Pro Pro Gly Thr Lys Ala Gly Ala 100 105 110 Asn Leu Pro Val Met Leu Trp Ile Phe Gly Gly Gly Phe Glu Ile Gly 115 120 125 Ser Pro Thr Ile Phe Pro Pro Ala Gln Met Val Thr Lys Ser Val Leu 130 135 140 Met Gly Lys Pro Ile Ile His Val Ala Val Asn Tyr Arg Val Ala Ser 145 150 155 160 Trp Gly Phe Leu Ala Gly Asp Asp Ile Lys Ala Glu Gly Ser Gly Asn 165 170 175 Ala Gly Leu Lys Asp Gln Arg Leu Gly Met Gln Trp Val Ala Asp Asn 180 185 190 Ile Ala Gly Phe Gly Gly Asp Pro Ser Lys Val Thr Ile Phe Gly Glu 195 200 205 Ser Ala Gly Ser Met Ser Val Leu Cys His Leu Ile Trp Asn Asp Gly 210 215 220 Asp Asn Thr Tyr Lys Gly Lys Pro Leu Phe Arg Ala Gly Ile Met Gln 225 230 235 240 Ser Gly Ala Met Val Pro Ser Asp Pro Val Asp Gly Thr Tyr Gly Asn 245 250 255 Glu Ile Tyr Asp Leu Phe Val Ser Ser Ala Gly Cys Gly Ser Ala Ser 260 265 270 Asp Lys Leu Ala Cys Leu Arg Ser Ala Ser Ser Asp Thr Leu Leu Asp 275 280 285 Ala Thr Asn Asn Thr Pro Gly Phe Leu Ala Tyr Ser Ser Leu Arg Leu 290 295 300 Ser Tyr Leu Pro Arg Pro Asp Gly Lys Asn Ile Thr Asp Asp Met Tyr 305 310 315 320 Lys Leu Val Arg Asp Gly Lys Tyr Ala Ser Val Pro Val Ile Ile Gly 325 330 335 Asp Gln Asn Asp Glu Gly Thr Ile Phe Gly Leu Ser Ser Leu Asn Val 340 345 350 Thr Thr Asn Ala Gln Ala Arg Ala Tyr Phe Lys Gln Ser Phe Ile His 355 360 365 Ala Ser Asp Ala Glu Ile Asp Thr Leu Met Ala Ala Tyr Pro Gln Asp 370 375 380 Ile Thr Gln Gly Ser Pro Phe Asp Thr Gly Ile Phe Asn Ala Ile Thr 385 390 395 400 Pro Gln Phe Lys Arg Ile Ser Ala Val Leu Gly Asp Leu Ala Phe Ile 405 410 415 His Ala Arg Arg Tyr Phe Leu Asn His Phe Gln Gly Gly Thr Lys Tyr 420 425 430 Ser Phe Leu Ser Lys Gln Leu Ser Gly Leu Pro Ile Met Gly Thr Phe 435 440 445 His Ala Asn Asp Ile Val Trp Gln Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Gly Ser 450 455 460 Val Ile Tyr Asn Asn Ala Phe Ile Ala Phe Ala Thr Asp Leu Asp Pro 465 470 475 480 Asn Thr Ala Gly Leu Leu Val Asn Trp Pro Lys Tyr Thr Ser Ser Ser 485 490 495 Gln Ser Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Asn Ala Leu Gly Leu Tyr Thr 500 505 510 Gly Lys Asp Asn Phe Arg Thr Ala Gly Tyr Asp Ala Leu Met Thr Asn 515 520 525 Pro Ser Ser Phe Phe Val 530 <210> 3 <211> 544 <212> PRT <213> Geotrichum Candida <400> 3 Gln Ala Pro Thr Ala Val Leu Asn Gly Asn Glu Val Ile Ser Gly Val 1 5 10 15 Leu Glu Gly Lys Val Asp Thr Phe Lys Gly Ile Pro Phe Ala Asp Pro 20 25 30 Pro Leu Asn Asp Leu Arg Phe Lys His Pro Gln Pro Phe Thr Gly Ser 35 40 45 Tyr Gln Gly Leu Lys Ala Asn Asp Phe Ser Pro Ala Cys Met Gln Leu 50 55 60 Asp Pro Gly Asn Ser Leu Thr Leu Leu Asp Lys Ala Leu Gly Leu Ala 65 70 75 80 Lys Val Ile Pro Glu Glu Phe Arg Gly Pro Leu Tyr Asp Met Ala Lys 85 90 95 Gly Thr Val Ser Met Asn Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Val Phe Arg 100 105 110 Pro Ala Gly Thr Lys Pro Asp Ala Lys Leu Pro Val Met Val Trp Ile 115 120 125 Tyr Gly Gly Ala Phe Val Tyr Gly Ser Ser Ala Ala Tyr Pro Gly Asn 130 135 140 Ser Tyr Val Lys Glu Ser Ile Asn Met Gly Gln Pro Val Val Phe Val 145 150 155 160 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Gly Pro Phe Gly Phe Leu Gly Gly Asp Ala 165 170 175 Ile Thr Ala Glu Gly Asn Thr Asn Ala Gly Leu His Asp Gln Arg Lys 180 185 190 Gly Leu Glu Trp Val Ser Asp Asn Ile Ala Asn Phe Gly Gly Asp Pro 195 200 205 Asp Lys Val Met Ile Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met Ser Val Ala 210 215 220 His Gln Leu Ile Ala Tyr Gly Gly Asp Asn Thr Tyr Asn Gly Lys Lys 225 230 235 240 Leu Phe His Ser Ala Ile Leu Gln Ser Gly Gly Pro Leu Pro Tyr His 245 250 255 Asp Ser Ser Ser Val Gly Pro Asp Ile Ser Tyr Asn Arg Phe Ala Gln 260 265 270 Tyr Ala Gly Cys Asp Thr Ser Ala Ser Ala Asn Asp Thr Leu Glu Cys 275 280 285 Leu Arg Ser Lys Ser Ser Ser Val Leu His Asp Ala Gln Asn Ser Tyr 290 295 300 Asp Leu Lys Asp Leu Phe Gly Leu Leu Pro Gln Phe Leu Gly Phe Gly 305 310 315 320 Pro Arg Pro Asp Gly Asn Ile Ile Pro Asp Ala Ala Tyr Glu Leu Phe 325 330 335 Arg Ser Gly Arg Tyr Ala Lys Val Pro Tyr Ile Ser Gly Asn Gln Glu 340 345 350 Asp Glu Gly Thr Ala Phe Ala Pro Val Ala Leu Asn Ala Thr Thr Thr 355 360 365 Pro His Val Lys Lys Trp Leu Gln Tyr Ile Phe Tyr Asp Ala Ser Glu 370 375 380 Ala Ser Ile Asp Arg Val Leu Ser Leu Tyr Pro Gln Thr Leu Ser Val 385 390 395 400 Gly Ser Pro Phe Arg Thr Gly Ile Leu Asn Ala Leu Thr Pro Gln Phe 405 410 415 Lys Arg Val Ala Ala Ile Leu Ser Asp Met Leu Phe Gln Ser Pro Arg 420 425 430 Arg Val Met Leu Ser Ala Thr Lys Asp Val Asn Arg Trp Thr Tyr Leu 435 440 445 Ser Thr His Leu His Asn Leu Val Pro Phe Leu Gly Thr Phe His Gly 450 455 460 Asn Glu Leu Ile Phe Gln Phe Asn Val Asn Ile Gly Pro Ala Asn Ser 465 470 475 480 Tyr Leu Arg Tyr Phe Ile Ser Phe Ala Asn His His Asp Pro Asn Val 485 490 495 Gly Thr Asn Leu Leu Gln Trp Asp Gln Tyr Thr Asp Glu Gly Lys Glu 500 505 510 Met Leu Glu Ile His Met Thr Asp Asn Val Met Arg Thr Asp Asp Tyr 515 520 525 Arg Ile Glu Gly Ile Ser Asn Phe Glu Thr Asp Val Asn Leu Tyr Gly 530 535 540

Claims (26)

  1. 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포로서,
    상기 폴리펩티드는 하나 이상의 장쇄 다중 불포화 지방산(LC-PUFA)을 포함하는 오일 중의 트라이아실글리세롤의 에스테르 결합을 가수 분해하는, 숙주 세포.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)인, 숙주 세포.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열에 대해 90% 내지 99%의 동일성을 갖는, 숙주 세포.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 리파아제인, 숙주 세포.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 칸디다 루고사(Candida rugosa) 동형체 리파아제 1인, 숙주 세포.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는, 숙주 세포.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드 서열은 칸디다 루고사(Candida rugosa) 동형체 리파아제 3인, 숙주 세포.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는, 숙주 세포.
  9. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드 서열은 지오트리쿰 칸디둠(Geotrichum candidum) 동형체 리파아제 2인, 숙주 세포.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는, 숙주 세포.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 장쇄 다중 불포화 지방산은 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사헥사엔산(DHA) 및 이들의 조합을 포함하는, 숙주 세포.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 오일은 조질 오일 또는 비정제 오일인, 숙주 세포.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 오일은 해양 오일인, 숙주 세포.
  14. 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 사용하는 방법으로서,
    상기 폴리펩티드는 하나 이상의 장쇄 다중 불포화 지방산을 포함하는 오일 중의 트라이아실글리세롤의 에스테르 결합을 가수 분해하는, 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)인, 숙주 세포.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열에 대해 90% 내지 99%의 동일성을 갖는, 숙주 세포.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 리파아제인, 숙주 세포.
  18. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 칸디다 루고사(Candida rugosa) 동형체 리파아제 1인, 숙주 세포.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는, 숙주 세포.
  20. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 칸디다 루고사(Candida rugosa) 동형체 리파아제 3인, 숙주 세포.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는, 숙주 세포.
  22. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 지오트리쿰 칸디둠(Geotrichum candidum) 동형체 리파아제 2인, 숙주 세포.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는, 숙주 세포.
  24. 제 14 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 장쇄 다중 불포화 지방산은 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사헥사엔산(DHA) 및 이들의 조합을 포함하는, 숙주 세포.
  25. 제 14 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 오일은 조질 오일 또는 비정제 오일인, 숙주 세포.
  26. 제 14 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 오일은 해양 오일인, 숙주 세포.
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