CN104498450B - 褶皱假丝酵母脂肪酶1突变体及其基因 - Google Patents

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Abstract

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及从褶皱徦丝酵母脂肪酶1(Candida rugosa lipase1：LIP1)基因出发，选择活性中心414位点进行定点饱和突变，获得一系列突变体。本发明所述提高热稳定性的LIP1突变体能够在高温下发挥有效的催化活力，提高了在工业中的应用潜力；并且突变体在底物选择性偏向短链酰基酯，这样的LIP1突变体，结构上揭示了变化机制。

Description

褶皱假丝酵母脂肪酶1突变体及其基因
技术领域
本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及褶皱假丝酵母脂肪酶1的突变体，具体为热稳定性提高和底物选择性偏向短链酰基酯的脂肪酶LIP1突变体及构建方法。
背景技术
脂肪酶(lipase，EC 3.1.1.3)即三酰基甘油酰基水解酶，可以催化三酰基甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化及酯类的逆向合成反应。它广泛应用于食品行业，造纸行业，皮革行业，饲料行业，医药催化合成，油脂奶酪加工等领域。在工业应用过程中，通常需要高温条件，因为高温不仅能够提高脂肪酶的催化效率和高的收率，同时能够降低副产物的产生和微生物的污染(Mozhaev,V.V.Mechanism-based strategies forprotein thermostabilization.Trends Biotchnol.1993,11(3):88-95.)。而天然脂肪酶的热稳定性普遍都比较低，这严重限制了脂肪酶的工业应用。
褶皱假丝酵母脂肪酶1(LIP1)是一种典型的工业应用酶。目前，已经有六种同工酶(LIP1-LIP5，LIPJ08)进行了性质表征，显示出不同的热稳定性和底物选择性(CHANG,S.W.Codon optimization of Candida rugosa lip1gene for improving expression inPichia pastoris and biochemical characterization of the purified recombinantLIP1Lipase.J.Agric.Food Chem.2006,(54)3:815-822.Xu,L.Cloning of a novellipase gene,lipJ08,from Candida rugosa and expression in Pichia pastoris bycodon optimization.Biotechnol.Lett.32(2):269–276.Lee,L.C.Characterization ofcodon-optimized recombinant Candida rugosa Lipase 5(LIP5).J.Agric.FoodChem.2011,59(19):10693-10698.)。LIP1具有较低的热稳定性，当温度高于40℃时便开始失去活力。而LIP3在70℃热处理10分钟，活力几乎没发生变化。在底物选择性上，LIP1显示出偏爱中长链(C8和C10)对硝基苯酚酰基酯(p-nitrophenyl(pNP)esters)的底物，而LIP2和LIP4则偏向作用于长链(C16～C18)。
尽管当前对脂肪酶的稳定性研究已经是热门领域，但为提高热稳定性而对于LIP1的改造仍未见报道。而对于褶皱假丝酵母脂肪酶的稳定性研究，都是借助不同载体的固定化来实现的，很少有热稳定性提高的突变体见报道。甚至研究发现同工酶LIP4的糖基化能够提高其热稳定性，可LIP1的糖基化对自身的稳定性没有影响。这就使得提高LIP1热稳定性具有更重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供褶皱假丝酵母脂肪酶的突变体，尤其是具有高的热稳定性脂肪酶1(LIP1)突变体以及改变脂肪酶底物选择性的突变体。
本发明的技术方案是：选择脂肪酶1(LIP1)的414位点进行饱和突变，筛选出一系列突变体。
褶皱假丝酵母脂肪酶1突变体以SEQ ID NO.1所示的野生型褶皱假丝酵母脂肪酶LIP1氨基酸序列为参考序列，在第414位发生单突变；第414位的甘氨酸Gly突变为丙氨酸Ala、蛋氨酸Met、组氨酸His、苯丙氨酸Phe、酪氨酸Tyr或色氨酸Trp。
其中热稳定性显著提高，同时底物选择性偏向短链酰基酯的突变体为Gly414Trp(G414W)，具有SEQ ID No:2的氨基酸序列，优选的，其氨基酸序列如SEQ ID No:2；编码该突变体酶的基因具有SEQ ID No:9所示的核苷酸序列，优选的该基因序列为SEQ ID No:9所示的核苷酸序列。
其余热稳定性提高的突变体有Gly414Ala(G414A)、Gly414Met(G414M)、Gly414His(G414H)，分别具有SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5所述的氨基酸序列，优选的，其氨基酸序列分别如SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5所示。编码上述突变体酶的基因分别具有SEQ ID No:10、SEQ ID No:11、SEQ ID No:12所述的核苷酸序列，优选的，基因分别为SEQ ID No:10、SEQ ID No:11、SEQ ID No:12所示的核苷酸序列。
底物选择性偏向短链酰基酯的突变体为Gly414Phe(G414F)、Gly414Tyr(G414Y)；分别具有SEQ ID No:6、SEQ ID No:7所示的氨基酸序列；优选的，其氨基酸序列如SEQ IDNo:6、SEQ ID No:7。编码上述突变体酶的基因分别具有SEQ ID No:13、SEQ ID No:14所示的核苷酸序列；优选的，基因分别为SEQ ID No:13、SEQ ID No:14所示的核苷酸序列。
褶皱假丝酵母野生型LIP1的氨基酸序列为SEQ ID No:1，核苷酸序列为SEQ IDNo:8。
本发明的有益效果在于，通过蛋白质工程技术，成功获得热稳定性显著提高的突变体Gly414Ala、Gly414Met、Gly414His和Gly414Trp；其中Gly414Trp变化最大，该突变体的比野生型提高了14℃。
底物选择性偏向短链酰基酯的突变体有Gly414Phe、Gly414Tyr、Gly414Trp，其中Gly414Phe、Gly414Tyr的pNP-C6/pNP-C8的相对活力分别提高了5.4和4.6倍；突变体Gly414Trp的pNP-C4/pNP-C8的相对活力提高了480多倍。上述突变体底物选择性偏向C8以下短链酰基酯，尤其是C4短链酰基酯。
本发明所筛选的LIP1突变体，能够在高温下发挥有效的催化活力，提高了在工业中的应用潜力；同时，底物选择性偏向短链酰基酯的LIP1突变体，结构上揭示了变化机制。
附图说明
图1野生型LIP1和热稳定性突变体的半衰期曲线图。
图2野生型LIP1和热稳定性突变体的最适反应温度。
图3野生型LIP1和热稳定性突变体的热稳定性曲线。
图4野生型LIP1和底物选择性改变突变体的pNP-C4/pNP-C8相对活力。
图5野生型LIP1和底物选择性改变突变体的结构分析图。
实施具体方式
下面结合附图和具体实施方式对发明做进一步说明：
实施例1野生型褶皱假丝酵母脂肪酶1的克隆
通过设计上下游引物扩增出褶皱假丝酵母脂肪酶1基因，上游引物：
5’-TCTCTCGAGAAAAGACATCATCACCACCATCATGCCCCCACCGCCACGCT-3’；划线部分为Xho Ⅰ位点；下游引物：
5’-CGGTCTAGATAACACAAAGAAAGACGGCGGGTTGGAGA-3’，划线部分为Xba Ⅰ位点。
利用LA Taq聚合酶(TaKaRa公司)，在上下游引物的参与下扩增得到目的基因LIP1；PCR反应条件为：95℃预变性10min，每个循环包括95℃变性25s，60℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；最后72℃衍生5min。反应结束后在1％的琼脂糖凝胶上检测PCR产物。核酸长度与PDB数据库公布的大小一致(1602bp)，其核苷酸序列如SEQ ID No:8。用试剂盒(Axygen公司)纯化产物，将纯化后产物用限制性内切酶XhoⅠ和XbaⅠ(Thermo公司)进行双酶切后与经相同内切酶双酶切的穿梭质粒pGAPZαA进行连接，连接后产物再次纯化后直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃孵育1h后，直接涂布在含有25μg/ml Zeocin抗性的LB平板上，得带重组质粒命名为pGAPZαA-LIP1。
用限制性酶切酶SacⅠ对重组质粒进行线性化，产物用试剂盒纯化后直接电击转入毕赤酵母GS115感受态细胞，在含有25μg/ml Zeocin抗性的YPD平板上筛选到克隆子。
实施例2定点饱和突变构建基因突变库
通过以下定点饱和突变引物：
上游引物，5’-CTCGGCGACCTTNNKTTTACGCTTGCTCGTCGCTAC-3’；
下游引物，5’-CTCGGCGACCTTMNNTTTACGCTTGCTCGTCGCTAC-3’，
下划线部分为饱和突变位点。利用PrimerSTAR max DNA聚合酶(TaKaRa公司)，在上下游饱和突变引物的参与下，全质粒扩增。PCR反应条件：98℃预变性5min，每个循环98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸2.5min，共30个循环；最后72℃延伸5min。将PCR产物纯化后直接转入大肠杆菌DH5α感受态，42℃热击90s，37℃孵育1h。之后将其涂布与含有25μg/mlZeocin抗性的LB平板上，待克隆长出后，直接用无菌水将所有克隆从平板上洗脱下来，收集到一个试管里，用试剂盒提取混合质粒。用限制性酶切酶SacⅠ对提取到的混合质粒进行线性化，产物用试剂盒纯化后直接电击转入毕赤酵母GS115感受态细胞，在含有25μg/mlZeocin抗性的YPD平板上30℃培养3天，得到含有突变基因的菌株。
通过上述方法，分别获得Gly414Tyr、Gly414Ala、Gly414Met、Gly414His、Gly414Trp、Gly414Phe的突变菌株，突变后的基因序列如SEQ ID No.9～NO.14所示。
实施例3褶皱假丝酵母脂肪酶1野生型及突变体的表达和纯化
将整合有LIP1基因的毕赤酵母接种到4mL含有25μg/mL Zeocin的YPD培养基中，30℃培养2天，之后接种到200mLYPD的新鲜培养基中，30℃条件，220rpm培养72h后收获菌体。在8000rpm转速下离心30min收获上清酶液，将酶粗液用0.22μm的滤膜过滤，除去粗酶液中的杂质。之后用截留分子量1万的超滤膜设备，对样品进行浓缩和脱色，在超滤过程中要不断加入50mM Tris-HCL pH7.5的缓冲液稀释酶液，直到超滤膜排出液无色即可停止。
由于表达的蛋白N-端含有组氨酸标签，因此浓缩后的样品可以通过镍亲和柱提纯蛋白。柱子的平衡缓冲液为50mM Tris-HCL pH7.5含有0.5mM NaCL。首先用平衡液10mL处理镍亲和柱，超滤后的样品全部流过平衡后的柱子。洗脱过程中，先用含有20mM咪唑的平衡液10mL洗脱，处理掉杂蛋白。最后用含有200mM的平衡液5ml洗脱下目的蛋白，蛋白的纯度可以通过12％的SDS-PAGE电泳胶检测。洗脱后的目的蛋白要经过两次透析除掉咪唑和NaCL，透析液为50mM Tris-HCL pH7.5的缓冲液。透析后的酶液浓度通过BCA方法测得，然后将纯酶液-80℃保存，方便以后用于动力学及相关性质分析。
用上述方法分别获得褶皱假丝酵母脂肪酶1的Gly414Trp(G414W)、Gly414Ala(G414A)、Gly414Met(G414M)、Gly414His(G414H)、Gly414Phe(G414F)、Gly414Tyr(G414Y)的突变体。并经过测序，上述突变体酶的氨基酸序列分别如SEQ ID No.2～NO.7所示。
实施例4突变库的筛选
用灭菌的牙签挑取平板上的克隆菌株，分别转到无菌的96深孔板中，每孔装800μl含25μg/ml Zeocin的YPD培养基。同时有三个孔转入野生型LIP1，作为阳性对照，三个对照孔选择在平板的两端和中间。30℃培养，400rpm摇床培养72小时，酶蛋白分泌表达进入培养液中。
培养结束后直接在4000rpm下离心30min，取每孔上清酶液100μl加入到300μlTis-HCL缓冲液(50mM,pH7.5)中，上清酶液稀释4倍。为了筛选热稳定性突变菌株，向含有190μl 50mM,pH8.0的Tis-HCL缓冲液(含0.25mM底物对硝基苯酚丁酸酯)的96孔酶标板中加入稀释后的酶液10μl，25℃反应5min。反应结束后立即在酶标仪上测定OD405的读数，并保存数据。热失活酶蛋白：直接将稀释后的酶上清液100μl转入96PCR孔板上，在58℃温度下热失活15min，4℃保持10min。再用底物对硝基苯酚丁酸酯测失活后酶液的OD405读数，将该读数除以没热失活前的读数，得到比值高于三个阳性对照平均值20％的克隆被挑出，最终获得四个热稳定性提高的突变菌株，它们涉及到的氨基酸突变为Gly414Ala、Gly414Met、Gly414His、Gly414Trp，它们的最适温度和热稳定性分析见图3和图4，表1显示出热稳定性提高的突变体的热力学参数。
为了筛选底物选择性的变化，将稀释上清酶液10μl加入到含有190μl 50mM,pH8.0的Tis-HCL缓冲液(含0.25mM底物对硝基苯酚乙酸酯)的96孔酶标板中，25℃反应5min。结束后在酶标仪上读取OD405的值，结果高于三个阳性对照平均值20％的克隆挑出。最后筛选到三个菌株偏向作用于短链对硝基苯酚酰基酯，他们涉及到的氨基酸突变为Gly414Phe(G414F)、Gly414Tyr(G414Y)、Gly414Trp(G414W)，不同链长底物相对于底物对硝基苯酚辛酸酯的活力结果见图4。
实施例5褶皱假丝酵母脂肪酶活力测定
根据WINKLER的测定脂肪酶活力的经典方法，在反应体系中做了细微调整(WINKLER,U.K.Hyaluronate,and some other polysaccharides greatly enhance theformation of exolipase by serratia marcescens.J.Bacteriol.1997,138,663-670.)。具体反应体系为：取溶解在乙腈中10mM的对硝基苯酚辛酸酯20μL加入到970μL的50mMTris-HCL，pH 8.0含有0.2％脱氧胆酸钠的缓冲体系中，在反应的水浴温度40℃中预热5min。取10μL的酶液加入到上述反应体系，在分光光度计下读取2min中内的释放出的对硝基苯酚微摩尔数。
A[U/mg]：酶比活力；ΔE[min-1]：单位时间内的吸光值；vr[L]：反应的体积；ε[M- 1cm-1]：消光系数；ce[mg/L]：酶的浓度；ve[L]：酶的用量；d[cm]：比色皿的直径。
实施例6褶皱假丝酵母脂肪酶1及突变体的热稳定性分析
衡量酶蛋白的热稳定性变化，通常涉及到半衰期t1/2、最适温度Topt和( 当活力损失到初始活力一半时的温度)。本发明利用终浓度0.2mM对硝基苯酚辛酸酯(pNP-辛酸酯)为底物测定了LIP1及热稳定性突变体半衰期、最适温度和变化。测定酶活力的方法如实施例5。
在60℃水浴中，放置多个装有50μL 0.1mg/mL纯酶的EP管，每间隔5min取出一管，冰上冷却，测定残余活力，结果显示突变体Gly414Trp的半衰期比野生型提高了6.5倍(图1)。
测定最适温度在25℃-65℃的温度范围内测定脂肪酶活力，结果显示突变体Gly414Trp的最适温度为60℃，相对于野生型45℃提高了15℃(图2)。而热稳定性的测定是将50μL 0.1mg/mL的纯蛋白放置在PCR仪器上，在温度梯度为40℃-80℃的范围内孵育15min，之后在4℃冷却10min。用UV-2550分光光度计测定不同温度下的残余活力，利用玻尔兹曼方程拟合出值反应出酶蛋白的动力学稳定性。结果显示出突变体Gly414Trp的值比野生型提高了14℃(图3)。
表1野生型与热稳定突变体的热力学参数
实施例7褶皱假丝酵母脂肪酶1及突变体的底物选择性
在测定脂肪酶底物选择性的时候，由于对硝基苯酚酯的快速、方便等因素而被作为首选。本发明利用乙腈分别配制10mM不同碳链长度的一系列对硝基苯酚酯底物(对硝基苯酚乙酸酯～棕榈酸酯，pNP-C2～pNP-C16)，在40℃测定野生型和突变体的水解活力，结果显示出突变体Gly414Phe、Gly414Tyr和Gly414Trp明显偏向于作用短链底物(表2)，而且Gly414Trp的pNP-C4/pNP-C8的相对活力比野生型提高了近480倍(图4)。
表2野生型与突变体的底物选择性
实施例8结构分析底物选择性变化的突变体
以野生型LIP1的晶体结构(1CRL)为模板，利用在线分析软件SWISS-Pdb(http://swissmodel.expasy.org/)进行突变体的同源建模。利用作图软件Pymol分析结果，显示出突变体Gly414Phe、Gly414Tyr和Gly414Trp的疏水口袋都被各自的新突变残基的侧链所封堵(图5)，这阻碍了长链对硝基苯酚酰基酯底物更深的进入疏水口袋，这也是底物选择性偏向短链酰基酯的主要原因。
附：本发明所涉及的Candida rugosa的脂肪酶1的野生型(WT)氨基酸序列为SEQID NO:1所示，其核苷酸序列为SEQ ID NO:8所示；热稳定性提高和底物选择性偏向短链酰基酯的脂肪酶突变体Gly414Trp的氨基酸序列为SED ID NO:2所示，其对应的核苷酸序列为SEQ ID NO:9所示；仅热稳定性提高的脂肪酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5所示，它们对应的核苷酸序列为SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11SEQ IDNO:12；仅底物选择性偏向短链酰基酯的脂肪酶突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7所示，它们对应的核苷酸序列为SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示。

Claims (8)

1.一种褶皱假丝酵母脂肪酶1突变体，其特征在于，以SEQ ID NO.1所示的野生型褶皱假丝酵母脂肪酶1氨基酸序列为参考序列，在第414位发生单突变；第414位的甘氨酸突变为丙氨酸、蛋氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。
2.权利要求1所述褶皱假丝酵母脂肪酶1突变体，其特征在于，SEQ ID NO.1所示的野生型褶皱假丝酵母脂肪酶1氨基酸序列第414位的甘氨酸分别突变为丙氨酸、蛋氨酸、组氨酸或色氨酸。
3.权利要求1所述褶皱假丝酵母脂肪酶1突变体，其特征在于，SEQ ID NO.1所示的野生型褶皱假丝酵母脂肪酶1氨基酸第414位的甘氨酸突变为苯丙氨酸或酪氨酸。
4.权利要求1所述褶皱假丝酵母脂肪酶1突变体，其特征在于，SEQ ID NO.1所示的野生型褶皱假丝酵母脂肪酶1氨基酸序列第414位的甘氨酸突变为色氨酸。
5.权利要求2所述褶皱假丝酵母脂肪酶1突变体，其特征在于，所述的突变体热稳定性提高。
6.权利要求3所述褶皱假丝酵母脂肪酶1突变体，其特征在于，所述的突变体底物选择性比亲本偏向于作用短链的底物。
7.权利要求4所述褶皱假丝酵母脂肪酶1突变体，其特征在于，所述的突变体热稳定性提高，并且底物选择性比亲本偏向于作用短链的底物。
8.编码权利要求1所述褶皱假丝酵母脂肪酶1突变体的基因，其特征在，核苷酸序列如SEQ ID NO.9～14所示。
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