CN104193743A - 一种用于修饰脂肪酶的功能化离子液体、制备方法及修饰得到的脂肪酶 - Google Patents

一种用于修饰脂肪酶的功能化离子液体、制备方法及修饰得到的脂肪酶 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于修饰脂肪酶的功能化离子液体，该功能化离子液体的结构如式(Ⅰ)所示，式(Ⅰ)中，n为1～7，m为1～2，Y为氯离子、溴离子、四氟硼酸根离子、六氟磷酸根离子或者三氟甲基磺酰亚胺离子。将该功能化离子液体用于对游离脂肪酶进行化学修饰，可以提高游离脂肪酶的稳定性、活性及催化选择性。本发明还公开了该功能化离子液体的制备方法及修饰得到的脂肪酶。在修饰后的脂肪酶的表面引入具有多重杂环骨架结构的功能化离子液体，影响了酶活性中心的构型，改善了脂肪酶的催化表现。

Description

一种用于修饰脂肪酶的功能化离子液体、制备方法及修饰得到的脂肪酶
技术领域
本发明属于有机合成与生物催化技术领域，具体涉及一类具有多重杂环骨架结构的功能化离子液体，并用此类功能性离子液共价修饰脂肪酶，制备出高稳定性、催化活性及反应选择性的脂肪酶。
背景技术
脂肪酶作为一类重要的生物催化剂，可被用于催化各类有机反应(如酯化、酯交换、氨解及水解反应)以制备用途广泛的多种化合物(如醇、酯、酸和胺)。化学修饰通过向酶蛋白分子中引入外源性分子结构片段来改善酶自身的催化特性，再结合适当的固定化方法，在不损失酶活性的前提下，提高酶的稳定性及反应选择性(区域或空间)。不仅有助于了解微环境对酶功能的影响，还能有效拓展酶的应用范围。
离子液体因具备对环境友好的特性而被称为“绿色”溶剂，己经在有机合成与生物化学、电化学、分离过程、催化等领域得到广泛的应用(Room-temperature ionic liquids:solvents for synthesis and catalysis.2.ChemRev.2011,111(5):3508-76.)。同时，离子液体又被称为“可设计性”溶剂，通过改变阴、阳离子的结构可调节离子液的物化特性(如极性、疏水性、黏性、熔点、密度等)以完成其在各领域中的应用任务。设计合成能够完成某种特定任务需求(如生物或化学反应、分离等)的离子液体(Task-specificionic liquid)，即功能化离子液体，亦是当今离子液体研究重要趋势，这也是本课题组长期以来的重要研究内容之一(设计并合成结构的功能离子液，考察与评价其在合成化学和生物学等方面的应用)。
目前，对多数生物学研究者而言，离子液体在生物催化领域的应用研究往往就是将结构相对简单的传统型离子液用作催化反应介质或少量添加的反应促进剂(enhancer)，以期改善酶促反应，如提高产物得率或反应选择性(Biocatalysis in Ionic Liquids.Chem Rev.2007,107(6):2757-85.)，但该过程存在诸多局限：1)传统型离子液体作为反应介质，大用量不经济，且使产物后处理较繁琐，自身的高黏度削弱了反应效率；2)分子结构中缺少活性功能基团，对于酶促反应的改善程度有限；3)作为反应促进剂，类型单一，结构缺乏有针对性的设计及有效制备手段，不利于其对生物催化剂的作用机制的问题研究。尽管通过功能型离子液体化学修饰的方法可简便、快速的改善酶的催化行为、改变酶学特性，但该研究方向属交叉学科，熟悉酶学研究的生物学家不一定能有效的利用现代有机合成技术手段实现酶分子修饰剂多样性的结构需求设想，因此发展缓慢，而功能化液体的合成与应用研究为该方向提供了一条有效途径。
2011年，Bastien Doumèche等研究发现含羟基的离子液体在活化剂作用下可实现甲酸脱氢酶的化学修饰(Ionic liquid-inspired cationscovalentlybound to formate dehydrogenase improve its stability and activityin ionicliquids.ChemCatChem.2011,3:875-82.)，但这类常规离子液体不仅修饰作用有限，且酶修饰反应时间长达24h，对酶活影响较大。
发明内容
本发明提供了一种用于修饰脂肪酶的功能化离子液体、制备方法及修饰得到的脂肪酶，该功能化离子液体用于修饰脂肪酶后，可以提高游离脂肪酶的稳定性、活性及催化选择性。
一种用于修饰脂肪酶的功能化离子液体，结构如式(Ⅰ)所示：
式(Ⅰ)中，n为1～7；
m为1～2；
Y为氯离子、溴离子、四氟硼酸根离子、六氟磷酸根离子或者三氟甲基磺酰亚胺离子。
本发明设计合成了一类具有多重杂环骨架结构的功能化离子液体，该功能化离子液体的阴离子是具有不同亲水性或电负性的极性离子，阳离子是含多重杂环骨架结构的离子，且含有机官能团为羧基。该功能化离子液体可用于对游离脂肪酶进行化学修饰，目的在于提高游离脂肪酶的稳定性、活性及催化选择性。本发明不仅突破了传统型离子液体在酶促反应应用中的上述不利限制，又拓展了新型离子液的应用领域。与此同时，操作简化与节约成本的高效脂肪酶修饰方法，具有较高的经济效益。
作为优选，所述的功能化离子液体为6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑溴盐、5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑溴盐、6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑四氟硼酸盐、5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑四氟硼酸盐、6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑六氟磷酸盐、5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑六氟磷酸盐、6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑双三氟甲基磺酰亚胺或5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑双三氟甲基磺酰亚胺；作为进一步的优选，所述的功能化离子液体选自6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-羧乙基咪唑溴盐(即式Ⅰ中n为1，m为1，Y为溴离子)、5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-羧乙基咪唑溴盐(即式Ⅰ中n为1，m为2，Y为溴离子)、6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-羧乙基咪唑四氟硼酸盐(即式Ⅰ中n为1，m为1，Y为四氟硼酸根)、5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-羧乙基咪唑四氟硼酸盐(即式Ⅰ中n为1，m为2，Y为四氟硼酸根)、6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-羧乙基咪唑六氟磷酸盐(即式Ⅰ中n为1，m为1，Y为六氟磷酸根)、5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-羧乙基咪唑六氟磷酸盐(即式Ⅰ中n为1，m为2，Y为六氟磷酸根)、6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-羧乙基咪唑双三氟甲基磺酰亚胺(即式Ⅰ中n为1，m为1，Y为三氟甲基磺酰亚胺离子)或5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-羧乙基咪唑双三氟甲基磺酰亚胺(即式Ⅰ中n为1，m为2，Y为三氟甲基磺酰亚胺离子)。
本发明还提供了一种所述的功能化离子液体的制备方法，包括如下步骤：
(1)向6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]咪唑或5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]咪唑中加入二氯甲烷，搅拌溶解后滴加卤代脂肪酸酯进行取代反应，得到取代中间体；
(2)步骤(1)得到的取代中间体用盐酸调节pH至1～2，进行水解反应得到水解产物，得到的水解产物经过进一步的离子交换或者直接后处理得到所述的功能化离子液体。
反应方程式如下：
所述的功能化离子液体具体可以通过以下步骤得到：
将6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]咪唑或5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]咪唑放入5mL圆底烧瓶中，加入二氯甲烷搅拌均匀，然后缓慢滴加卤代脂肪酸酯。其中6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]咪唑或5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]咪唑与卤代脂肪酸酯的摩尔比为1:1-3。滴加完毕后，在氮气保护条件下，20-30℃反应6-12h，反应结束后用盐酸调节pH到2。反应有白色固体析出，过滤除滤液收取白色固体，用二氯甲烷冲洗白色固体三次，再减压浓缩除溶剂，可得到具有多重杂环结构的功能化离子液体。可继续通过离子交换反应，更换离子液体的阴离子部分，调整离子液体极性，获取目标离子液体。
作为优选，所述的卤代脂肪酸酯为2-卤代乙酸酯、3-卤代丙酸酯、4-卤代丁酸酯、5-卤代戊酸酯、6-卤代己酸酯、7-卤代庚酸酯或者8-卤代辛酸酯。
作为优选，所述的卤代脂肪酸酯为氯代脂肪酸酯或溴代脂肪酸酯。采用氯代脂肪酸酯或溴代脂肪酸酯的成本较低。
作为优选，所述的卤代脂肪酸酯为卤代脂肪酸甲酯、卤代脂肪酸乙酯或卤代脂肪酸丙酯。此时，得到的取代中间体便于进行后续水解，形成羧酸。
作为优选，所述6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]咪唑或5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]咪唑与卤代脂肪酸酯的摩尔比为1:1-3。
作为优选，步骤(1)的反应温度为20-30℃，反应时间为6-12h。步骤(2)中水解的温度与步骤(1)相同即可。
步骤(2)中，所用的盐酸的浓度无特别严格的要求，采用浓盐酸或者稀释后的皆可。
步骤(2)中，得到的水解产物可以经过后处理直接得到所述的功能性离子液体；也可以通过离子交换反应，改变产物中的阴离子，得到不同性质的功能性离子液体；所述的后处理可以直接采用过柱分离。
本发明还提供了一种采用所述的功能化离子液体修饰得到的脂肪酶，所述的修饰方法如下：
将所述的离子液体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺按1:1-3:1的摩尔比溶于吗琳乙磺酸(MES)中活化1-3h，将活化后的离子液体与脂肪酶按摩尔比100-1000：1在0-4℃混合反应2-6h；或者
将所述的离子液体与CDI按摩尔比1:1-3溶于DMSO中活化1-3h，将活化后的功能化离子液与脂肪酶按摩尔比100-1000：1在0-4℃混合反应1-6h。
通过上述方法可以使离子液的活性官能基团与脂肪酶的氨基酸残基通过共价结合得到修饰后的脂肪酶，从而将多重杂环骨架结构引入到脂肪酶的表面。
同现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明提供的功能化离子液体，具有很好的生物相容性与反应活性，拓展了离子液体在生物化学领域的应用。
(2)本发明将具有多重杂环骨架结构的功能性离子液体对脂肪酶实施了有效化学修饰，调整酶活性中心的空间结构，强化了脂肪酶的催化性能。
(3)本发明将功能化离子液体活化后用于修饰脂肪酶，克服了传统型离子液体单纯作为反应介质促进酶促反应的局限，减少离子液体用量，简化操作。
(4)本发明以N,N-碳酰二咪唑(CDI)或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚肢盐酸盐(EDC·HCl)活化功能化离子液，减少酶在修饰过程中的损失，提高了活化效率，且节约了活化时间及成本。
(5)本发明中功能化离子液体与脂肪酶通过共价结合，有效改善脂肪酶催化特性，为后续酶的固定化提供有效保障，开发了一种新颖的脂肪酶修饰方法，方式简单灵活、是一种颇具实用价值的生物工程技术。
附图说明
图1是实施例1制备的离子液体6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-乙酸咪唑三氟甲基磺酰亚胺盐的NMR碳谱；
图2是实施例1的功能化离子液体修饰游离疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶及游离酶的温度与活性关系图；
图3是实施例1的功能化离子液体共价修饰对游离疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶操作稳定性的影响图。
具体实施方式
实施例1
1)6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-羧乙基咪唑溴化盐的合成：将0.203g6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]咪唑(CAS：59646-16-1)与2mL二氯甲烷(DCM)混合均匀，然后加入0.374g溴乙酸甲酯，加热回流反应8h。反应结束后，缓慢滴加3M稀盐酸调节pH到2，收集有机相，减压除溶剂，过柱分离，收率91％。
2)功能化离子液体的活化：将0.30g6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-羧乙基咪唑溴化盐与0.2g CDI溶于5mL DMSO，在室温条件下反应2h，得到活化后的功能化离子液体，未经处理，4℃冷藏备用。
3)酶的共价修饰：功能化离子液体经活化后与游离疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶按摩尔比200:1混合反应，反应温度控制在0～4℃，反应时间4h，离心去除残留修饰剂后得到修饰脂肪酶。
4)酶活测定：
脂肪酶催化合成S-6-a为探针反应。100mg蔗糖，50mg脂肪酶和240μL醋酸乙烯酯溶解于叔丁醇/DMSO(V/V,4:1)，在30℃下反应0.5h。一个酶活活力单位定义为，在30℃下震荡反应0.5h，每分钟产生1μmolS-6-a所需的脂肪酶量，以U表示。结果显示30℃下共价修饰疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(ILs-Lipozyme)的转酯活力为28U/g，而游离疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Lipozyme)的转酯活力为7U/g。
按照本领域考察经功能化离子液体共价修饰对酶温度稳定性的常规方法对比考察了6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-羧乙基咪唑溴化盐共价修饰的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶和游离疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在20～60℃范围内的温度稳定性，结果如图2所示。游离酶的最佳反应温度为30℃，而本发明所制备的功能化离子液体修饰的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的最佳反应温度为35～40℃，且转酯酶活力显著提高，可见由本发明所制备的功能化离子液体修饰的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的温度稳定性较之游离脂肪酶明显提高。
按照本领域考察了酶的操作稳定性的常规方法考察了6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-羧乙基咪唑溴化盐共价修饰的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶和游离疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶，结果如图3。经功能化离子液体修饰的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶操作稳定性明显优于游离疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶，前者使用9次后S-6-a的产率仍有55.41％。
实施例2
1)6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-羧乙基咪唑溴化盐的合成：将0.203g6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]咪唑与2mL DCM混合均匀，然后加入0.374g溴乙酸甲酯，加热回流反应8h，收率91％。
2)功能化离子液体的活化：将0.3g6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-羧乙基咪唑溴化盐与0.2g EDC·HCl及0.12g NHS溶于l0ml MES，在30℃条件下反应1h。
3)酶的修饰：将活化后功能化离子液体与疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶按摩尔比200:1混合反应，反应温度为0～4℃，反应时间8h，超滤离心得浓缩酶。
4)与实施例1的酶活力测定条件相同，测得30℃下共价修饰疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(ILs-Lipozyme)的转酯活力为35U/g，而游离疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Lipozyme)的转酯活力为7U/g。
实施例3
1)5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-羧乙基咪唑溴化盐的合成：将0.215g5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]咪唑(CAS：34167-66-3)与2mL DCM混合均匀，然后加入0.374g溴乙酸甲酯，加热回流反应8h，收率90.3％。
2)功能化离子液体的活化：将0.31g5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-羧乙基咪唑溴化盐与0.28g EDC·HCl及0.115gNHS溶于10ml MES中，在室温条件下反应1.5h。
3)酶的修饰：将活化后功能化离子液体与南极假丝酵母脂肪酶按摩尔比200：1混合反应，反应温度控制在0～4℃，反应时间4h，超滤离心去除多余的修饰剂，浓缩酶。
4)与实施例1的酶活力测定条件相同，测得30℃下共价修饰南极假丝酵母脂肪酶的转酯活力为30.7U/g，而游离南极假丝酵母脂肪酶的转酯活力为6.2U/g。
实施例4
1)5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-羧乙基咪唑三氟甲基磺酰亚胺盐的合成：将0.215g5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]咪唑与2mL DCM混合均匀，然后加入0.374g溴乙酸甲酯，加热回流反应8h，即可得5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-羧乙基咪唑溴化盐(90.3％yield)。继续将0.188g5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-羧乙基咪唑溴化盐与1mL去离子混合均匀，加入0.25g双三氟甲烷磺酰亚胺锂后，室温下反应12h，加入2mL DCM萃取三次，回收有机液，除水及溶剂得到5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-羧乙基咪唑三氟甲基磺酰亚胺(98％Yield)。
2)功能化离子液体的活化：将0.81g5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-羧乙基咪唑溴化盐与0.288g CDI溶于5mL DMSO，在室温条件下反应1.5h。
3)酶的修饰：将活化后功能化离子液体与疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶按摩尔比200:1混合反应，反应温度控制在0～4℃，反应时间8h，超滤离心去除多余的修饰剂，浓缩酶。
4)与实施例1的酶活力测定条件相同，测得30℃下共价修饰疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的转酯活力为40U/g，而游离疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的转酯活力为7U/g。

Claims (10)

1.一种用于修饰脂肪酶的功能化离子液体，其特征在于，结构如式(Ⅰ)所示：
式(Ⅰ)中，n为1～7；
m为1～2；
Y为氯离子、溴离子、四氟硼酸根离子、六氟磷酸根离子或者三氟甲基磺酰亚胺离子。
2.根据权利要求1所述的用于修饰脂肪酶的功能化离子液体，其特征在于，所述的功能化离子液体为6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑溴盐、5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑溴盐、6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑四氟硼酸盐、5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑四氟硼酸盐、6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑六氟磷酸盐、5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑六氟磷酸盐、6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑双三氟甲基磺酰亚胺或5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑双三氟甲基磺酰亚胺。
3.一种如权利要求1或2所述的功能化离子液体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)向6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]咪唑或5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]咪唑中加入二氯甲烷，搅拌溶解后滴加卤代脂肪酸酯进行取代反应，得到取代中间体；
(2)步骤(1)得到的取代中间体用盐酸调节pH至1～2，进行水解反应得到水解产物，得到的水解产物经过进一步的离子交换或者直接后处理得到所述的功能化离子液体。
4.根据权利要求3所述的功能化离子液体的制备方法，其特征在于，所述的卤代脂肪酸酯为2-卤代乙酸酯、3-卤代丙酸酯、4-卤代丁酸酯、5-卤代戊酸酯、6-卤代己酸酯、7-卤代庚酸酯或者8-卤代辛酸酯。
5.根据权利要求3所述的功能化离子液体的制备方法，其特征在于，所述的卤代脂肪酸酯为氯代脂肪酸酯或溴代脂肪酸酯。
6.根据权利要求3所述的功能化离子液体的制备方法，其特征在于，所述的卤代脂肪酸酯为卤代脂肪酸甲酯、卤代脂肪酸乙酯或卤代脂肪酸丙酯。
7.根据权利要求3所述的功能化离子液体的制备方法，其特征在于，所述6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]咪唑或5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]咪唑与卤代脂肪酸酯的摩尔比为1:1-3。
8.根据权利要求3所述的功能化离子液体的制备方法，其特征在于，步骤(1)的反应温度为20-30℃，反应时间为6-12h。
9.一种使用如权利要求1或2所述的功能化离子液体修饰得到的脂肪酶，其特征在于，修饰方法如下：
将权利要求1或2所述的离子液体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺按1:1-3:1的摩尔比溶于吗琳乙磺酸中活化1-3h，将活化后的离子液体与脂肪酶按摩尔比100-1000:1在0-4℃混合反应2-6h；或者
将权利要求1或2所述的离子液体与N,N-碳酰二咪唑按摩尔比1:1-3溶于二甲基亚砜中活化1-3h，将活化后的功能化离子液与脂肪酶按摩尔比100-1000:1在0-4℃混合反应1-6h。
10.根据权利要求9所述的功能化离子液体修饰得到的脂肪酶，其特征在于，所述的脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶、褶皱假丝酵母脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶、猪胰脂肪酶、根霉脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶或洋葱布克氏菌脂肪酶。
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