CN109251943B - 一种超临界co2条件下的酶催化制备opo结构脂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于酶催化领域，具体涉及一种超临界CO2条件下酶催化制备OPO结构脂的方法。本发明固定化酶催化制备OPO结构脂的方法具体为：以卤代羧酸、咪唑类化合物、羰二咪唑、脂肪酶液为原料，反应得到酰化脂肪酶溶液；将硝酸锌加入到去离子水中；将2‑甲基咪唑、酰化脂肪酶溶液与聚乙烯吡咯烷酮溶解于去离子水中；将上述溶液混合，得到固定化脂肪酶；以三棕榈酸甘油酯和油酸为反应底物，加入固定化脂肪酶，置于反应釜，通入介质CO2，反应，分离，得到OPO结构脂。本发明的反应条件温和，操作简单，原料利用率高，转化率高，纯度高，并且酶催化剂可重复利用，选择性高，对环境污染小，降低了生产成本，有望进行工业化生产。

Description

一种超临界CO2条件下的酶催化制备OPO结构脂的方法
技术领域
本发明属于酶催化领域，具体涉及一种超临界CO2条件下酶催化制备OPO结构脂的方法。
背景技术
随着经济的发展，生活水平的提高，人们对于婴幼儿食品的消费量己经越来越高。婴幼儿身体小，生理机能尚未成熟，但为了达到正常的生长发育，每公斤体重的热量需求却是成人的二倍以上，若主要以糖类及蛋白质供应所需能量的话，每克只能供给16KJ的热量，所以食用量必须相当大，对消化功能还不是很完善的婴儿来说是一项不小的负担；而油脂可以供应蛋白质或糖类两倍以上的热量即每克38KJ的热量，因此脂肪在婴幼儿食品中必不可缺的物质。甘油三酯含有酯化在甘油上的饱和、单不饱和、及多不饱和脂肪酸，脂肪酸不是任意分布在这三个立体异构特异性位置，而是有选择性的酯化到某一位置，从而为新生儿和婴儿提供理想的单酰甘油和脂肪酸混合物。棕榈酸酯化在甘油三酯的Sn-2，而Sn-l和Sn-3位被油酸占据时所形成的甘油三酯称为1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯，即油酸-棕榈酸-油酸三酯，称OPO结构脂。
当前OPO结构脂制备工艺中的底物油酸和棕榈酸三酯并不是脂肪酶在自然界中的天然底物，有机溶剂体系也不是脂肪酶催化的天然环境，极大地限制了脂肪酶的选择性及活性表达，导致OPO结构脂收率普遍偏低，并且当前工艺中有机溶剂的大量使用不仅污染环境，同时对于油脂食品有着重大的安全隐患。
母乳中脂肪酸在甘油三酯骨架上有高度特异性的位置分布，分别叫做sn-1、sn-2和sn-3 位，其中sn-2位是中间位，sn-1和sn-3在两端，这种特异性构象对母乳脂肪吸收的高效性起着至关重要的作用。母乳的脂肪在sn-2通常为棕榈酸居多(约70-80％)，sn-1位和sn-3 位为油酸居多。一般的植物油脂却恰恰相反，sn-2位油酸居多，只有约6-12％的棕榈酸酯化在sn-2位，sn-1和sn-3位棕榈酸居多，在这两个位置上的棕榈酸被胰酯酶水解后形成游离棕榈酸，而游离棕榈酸熔点高于人类体温，它在小肠的酸性环境下容易和钙、镁等矿物质发生皂化反应，形成不溶性皂化盐，就会严重降低脂肪酸的吸收率，而被排出体外。如果棕榈酸以sn-2位的单甘脂形式存在，就会很容易被人体吸收，从而提高人体脂肪酸的吸收率。
随着生物技术、酶工程技术和脂肪酶技术的发展，利用特异性生物酶具有定向催化特性，通过酯交换获得sn-2位置富含棕榈酸的OPO结构油脂成为可能。该反应通常是在搅拌釜反应容器中进行，酶的活力、用量、反应底物，水分及溶剂体系等都影响酶促酯交换反应的速度。合成的OPO结构油脂具有可减少婴儿肠道脂肪酸的排泄，促进婴儿对食物中脂肪的吸收；促进婴儿肠道对钙的吸收，增加婴儿的骨矿物质沉淀，并促进婴儿骨骼的生长发育；还可缓解婴儿便秘等等优点。
目前已经有很多有关OPO结构脂方面的专利。例如相关专利涉及一种用于制备油脂的方法，具体地讲，涉及用于制备含有1,3-二不饱和脂肪酰-2-饱和脂肪酰甘油酯的组合物，特别是含有1,3-二油酸-2-棕榈酰甘油酯(OPO)的组合物的方法。该方法以富含饱和脂肪酸残基的酯与富含不饱和脂肪酸残基的酯为反应底物，先对其进行随机酯交换，再将反应混合物与不饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸酯进行酶法定向酯交换，以制备含有1,3-二不饱和脂肪酰-2-饱和脂肪酰甘油酯的组合物，尤其地，含有1,3-二油酰-2-棕榈酰甘油酯(OPO)的组合物方法。该发明还提供了本发明的组合物在制备婴幼儿配方奶粉中的用途、以及在制备婴幼儿配制食品中的用途，以及包含该组合物的婴幼儿配方奶粉和婴幼儿配制食品，该工艺因为采用随机酯交换，最终获得的OPO结构脂产率偏低，副产物油脂偏多，造成作为功能强化剂使用时候作用性较低。
相关专利公开了一种1，3二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(OPO)的化学合成方法，其特征在于包含以下步骤：(a)在碱催化剂下，1，3-二氯异丙醇与十六烷酸甲酯在有机溶剂中加热回流反应减压蒸馏，得到1，3二氯-2-十六烷酸酯；(b)将上步得到的1，3-二氯-2-十六烷酸酯，再加入油酸钠，充入氮气保护，加入到带有回流冷凝装置的反应器中，在50～100℃下反应2～5小时，经弱碱水洗、调pH至中性后干燥，经分子蒸馏或减压蒸馏后可得高纯度OPO。该发明合成路线简便、后处理简单、总收率高(>75％)，可有效的合成OPO，但反应工艺中需要用到碱液进行水洗，极大的造成了环境的污染。
相关专利涉及一种OPO结构油脂粉末的制备方法，其步骤如下步骤：将OPO结构油脂加热，投入乳化剂，搅拌；将酪蛋白加入稀碱液中溶解，加入稳定剂，溶解；将乳化后的OPO油脂和配制的酪蛋白溶液加入到葡萄糖浆和水或溶于水的乳糖或葡萄糖浆、乳糖和水的混合液中，剪切；将上述混合物均质、杀菌、高压喷雾干燥。本发明所制得的油脂粉末的微胶囊包埋率可达到98％以上，也就是粉末油脂的游离脂肪酸不超过2％，并且加工过程中所用到的添加剂均符合相关规定，该工艺相对OPO结构脂作为奶粉功能强化剂，不具备普适性，并且大量引入其它食品添加剂。
一般OPO结构脂可以通过催化制备。酶是一种生物催化剂，其优势在于高效、无毒以及温和的反应条件。本发明着重于利用一种反应条件温和的新型脂肪酶催化剂，并将脂肪酶固定在载体上，其次，用脂肪酶催化OPO结构脂合成的生产过程中不接触有毒物质，且固定化脂肪酶可重复利用，非常适合OPO结构脂的工业生产，是一种绿色低碳的生产方式，具有一定的研究前景及利用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的技术缺陷，如：有机溶剂大量使用，酯交换效率低等，本发明提供了一种超临界CO2条件下酶催化制备OPO结构脂的方法。
具体的，本发明的技术方案为：
(1)对脂肪酶进行修饰：
将卤代羧酸溶于乙腈中，加入咪唑类化合物，第一次磁力搅拌反应，将得到的反应产物用无水乙醚萃取，得到下层油状物质，真空干燥，得到修饰剂；将修饰剂与羰基二咪唑混合，加入到无水二甲亚砜中，第二次磁力搅拌，室温反应，得到活性体；将活性体加入到脂肪酶液中，第三次磁力搅拌反应，透析，得到酰化脂肪酶溶液；
(2)制备固定化脂肪酶：
将硝酸锌加入到去离子水中，得到溶液A；将2-甲基咪唑、酰化脂肪酶溶液与聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶解于去离子水中，得到溶液B；将溶液A与溶液B混合，搅拌，离心、洗涤，得到固定化脂肪酶；
(3)制备OPO结构脂：
以三棕榈酸甘油酯和油酸为反应底物，加入固定化脂肪酶，置于反应釜，通入介质CO2，超临界条件下，反应，分离，得到OPO结构脂。
步骤(1)中，所述卤代羧酸为氯乙酸或溴丙酸；所述咪唑类化合物为1,2-二甲基咪唑或 1,丁基-2-甲基咪唑；
步骤(1)中，所述脂肪酶液中的脂肪酶为1,3-特异性酯交换脂肪酶，具体为米曲霉脂肪酶、黑曲霉脂肪酶、米黑毛霉菌脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶、嗜热栖热菌脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶、皱褶假丝酵母脂肪酶或猪胰脂肪酶；
步骤(1)中，所述卤代羧酸与咪唑类化合物的摩尔比为10:1.1；所述第一次磁力搅拌反应的温度为60-100℃，所述第一次磁力搅拌反应的时间为5-10h；所述修饰剂与羰基二咪唑的摩尔比为1:1；所述室温反应的时间为2-8h；所述活性体与脂肪酶液的体积比为90μL： 5mL，所述脂肪酶液的浓度为150-350μM；所述第三次磁力搅拌反应的温度为0-4℃，所述第三次磁力搅拌反应的时间为8-24h；
步骤(2)中，所述硝酸锌、去离子水与2-甲基咪唑的用量比为10-400mg:1-5mL:410.0mg；所述2-甲基咪唑、酰化脂肪酶溶液与聚乙烯吡咯烷酮的用量比为410.0mg：5mL：50.0mg；所述溶解的温度为42℃；所述搅拌的时间为5-10min；
步骤(3)中，三棕榈酸甘油酯与油酸的摩尔比为1:1-1:8，固定化脂肪酶的用量占反应底物总量的0.5-12wt％；所述反应的温度为20-90℃，所述反应的压力为5-40MPa，所述反应的时间为5-24小时。
与现有技术相比较，本发明的有益效果体现如下：
(1)现有的研究采取的针对性策略通常是利用介质工程、微波辅助等手段增强底物在介质中的溶解性。但其研究结果最终往往停留在底物转化率、产物收率等表观指标的变化上，忽略了底物在固定化酶催化剂结构中的传递，对工艺的核心技术即酶催化剂的设计以及多相态中底物传递对反应的影响机理研究十分有限，该工艺实现了超临界CO2工艺下新型固定化酶绿色高效催化制备OPO结构脂。该反应条件温和，无有机溶剂加入，操作简单，原料利用率高，转化率高，纯度高，并且酶催化剂可重复利用，选择性高，对环境污染小，有利于降低生产成本，相对其它工艺，该工艺因未有有机溶剂的涉入从而产品更加安全。
(2)本发明采用超临界流体工艺，当一种流体处在高于其临界点的温度和压力下，被称之为超临界流体(SCFs)，它既具有与气体相似的密度、粘度、扩散系数等物性，又兼有与液体相近的特性，是处于气态和液态之间的中间状态的物质。超临界状态下流体CO2同时起到溶剂和催化剂的作用，由于CO2是非极性分子，可避免其它方法出现中毒和催化剂失活的现象。
(3)本发明实现了超临界工艺下酶催化制备OPO结构脂，反应条件温和，操作简单，原料利用率高，转化率高，纯度高，并且酶催化剂可重复利用，选择性高，对环境污染小，有利于降低生产成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。所列的实施例仅作阐释之用，并表明本发明的精神和范围并非限于此中的细节及其修改案。
实施例1：
(1)对脂肪酶进行修饰：
取10mmol溴丙酸溶于10mL乙腈后，加入干燥的圆底烧瓶中，待溶解完全后，慢慢滴加1.1mmol的1,2二甲基咪唑，60℃下回流磁力搅拌反应5h，反应结束后，用无水乙醚萃取两次(5*10mL)，取下层黄色油状物质，70℃真空干燥24h，得到黄色稠状液体1，2-甲基3-丙酸基咪唑溴盐(修饰剂)；
取1mmol的1，2-甲基-3-丙酸基咪唑溴盐，加入1mmol羰基二咪唑，在2mL的无水二甲亚砜的作用下磁力搅拌，室温反应2h后停止，反应完毕之后，得到活性体；将90μL的活性体加入到5mL的浓度为150μM皱褶假丝酵母脂肪酶液中，在0℃下，磁力搅拌8h 后停止反应，透析24h，得到甲基咪唑酰化皱褶假丝酵母脂肪酶溶液。
(2)制备固定化脂肪酶：
称取371.3mg硝酸锌加入3.0mL去离子水中，得到溶液A；将410.0mg 2-甲基咪唑(简称为2-mIm)、5mL甲基咪唑酰化皱褶假丝酵母脂肪酶溶液、50.0mg聚乙烯吡咯烷酮PVP在42℃下溶解于25mL去离子水中，得到溶液B；然后将溶液A、溶液B两种溶液进行混合，搅拌5分钟后，4800rpm离心收集固定化酶产物，用过量的去离子水洗涤，得到金属有机骨架材料固定化的皱褶假丝酵母脂肪酶。
(3)制备OPO结构脂：
将1mmol三棕榈酸甘油酯与6mmol油酸混合，得到反应底物，加入占反应底物总重8wt％的金属有机骨架材料固定化的皱褶假丝酵母脂肪酶，置于计量泵，以1mL/min注入固定化酶填充柱。以0.5mL/min通入介质CO2，升温至50℃，控制反应压力为9MPa，使体系处于超临界状态或临界状态，超临界条件下，反应时间5小时。通过降压阀将系统将至常压，将反应液中的脂肪酸与甘油酯分离，得到甘油酯混合产品68g，经HPLC-MS分析，产品中OPO 结构脂含量为86％，各项指标符合国家相关标准，相对现有工艺，因反应过程没有其他有机溶剂的加入，产品更加安全，超临界二氧化碳强化了反应传质，产率相对其它工艺也有较大的提升。
实施例2：
(1)对脂肪酶进行修饰：
取10mmol溴丙酸溶于10mL乙腈后，加入干燥的圆底烧瓶中，待溶解完全后，慢慢滴加1.1mmol的1,丁基-2-甲基咪唑，80℃下回流磁力搅拌反应7h，反应结束后，用无水乙醚萃取两次(5*10mL)，取下层黄色油状物质，70℃真空干燥24h，得到黄色稠状液体1,丁基 -2,甲基3-丙酸基咪唑溴盐(修饰剂)；
取1mmol的1,丁基-2,甲基3-丙酸基咪唑溴盐，加入1mmol羰基二咪唑，在2mL的无水二甲亚砜的作用下磁力搅拌，室温反应6h后停止，反应完毕之后，得到活性体；将90μ L的活性体加入到5mL的浓度为200μM南极假丝酵母脂肪酶液中，在2℃下，磁力搅拌 12h后停止反应，透析24h，得到甲基咪唑酰化南极假丝酵母脂肪酶溶液。
(2)制备固定化脂肪酶：
称取10mg硝酸锌加入1.0mL去离子水中，得到溶液A；将410.0mg 2-甲基咪唑(简称为2-mIm)、5mL甲基咪唑酰化南极假丝酵母脂肪酶溶液、50.0mg聚乙烯吡咯烷酮PVP在42℃下溶解于25mL去离子水中，得到溶液B；然后将溶液A、溶液B两种溶液进行混合，搅拌 7分钟后，4800rpm离心收集固定化酶产物，用过量的去离子水洗涤，得到金属有机骨架材料固定化的南极假丝酵母脂肪酶。
(3)制备OPO结构脂：
将1mmol三棕榈酸甘油酯与8mmol油酸混合，得到反应底物，加入占反应底物总重12 wt％的金属有机骨架材料固定化的南极假丝酵母脂肪酶，置于计量泵，以0.5mL/min注入固定化酶填充柱。以1.5mL/min通入介质CO2，升温至90℃，控制反应压力为40MPa，使体系处于超临界状态或临界状态，超临界条件下，反应时间24小时。通过降压阀将系统将至常压，将反应液中的脂肪酸与甘油酯分离，得到甘油酯混合产品65g，经HPLC-MS分析，产品中OPO结构脂含量为95％，各项指标符合国家相关标准，相对现有工艺，因反应过程没有其他有机溶剂的加入，产品更加安全，超临界二氧化碳强化了反应传质，产率相对其它工艺也有较大的提升。
实施例3：
(1)对脂肪酶进行修饰：
取10mmol氯乙酸溶于10mL乙腈后，加入干燥的圆底烧瓶中，待溶解完全后，慢慢滴加1.1mmol的1,丁基-2甲基咪唑，100℃下回流磁力搅拌反应10h，反应结束后，用无水乙醚萃取两次(5*10mL)，取下层黄色油状物质，70℃真空干燥24h，得到黄色稠状液体1, 丁基-2,甲基3-乙酸基咪唑溴盐(修饰剂)；
取1mmol的1,丁基-2,甲基3-乙酸基咪唑溴盐，加入1mmol羰基二咪唑，在2mL的无水二甲亚砜的作用下磁力搅拌，室温反应8h后停止，反应完毕之后，得到活性体；将90μ L的活性体加入到5mL的浓度为350μM猪胰脂肪酶液中，在4℃下，磁力搅拌24h后停止反应，透析24h，得到甲基咪唑酰化猪胰脂肪酶溶液。
(2)制备固定化脂肪酶：
称取400mg硝酸锌加入5.0mL去离子水中，得到溶液A；将410.0mg 2-甲基咪唑(简称为2-mIm)、5mL甲基咪唑酰化猪胰脂肪酶溶液、50.0mg聚乙烯吡咯烷酮PVP在42℃下溶解于25mL去离子水中，得到溶液B；然后将溶液A、溶液B两种溶液进行混合，搅拌10分钟后，4800rpm离心收集固定化酶产物，用过量的去离子水洗涤，得到金属有机骨架材料固定化的猪胰脂肪酶。
(3)制备OPO结构脂：
将1mmol三棕榈酸甘油酯与1mmol油酸混合，得到反应底物，加入占反应底物总重0.5 wt％的金属有机骨架材料固定化的猪胰脂肪酶，置于计量泵，以0.5mL/min注入固定化酶填充柱。以1.5mL/min通入介质CO2，温度为20℃，控制反应压力为5MPa，使体系处于超临界状态或临界状态，超临界条件下，反应时间12小时。通过降压阀将系统将至常压，将反应液中的脂肪酸与甘油酯分离，得到甘油酯混合产品65g，经HPLC-MS分析，产品中OPO结构脂含量为95％，各项指标符合国家相关标准，相对现有工艺，因反应过程没有其他有机溶剂的加入，产品更加安全，超临界二氧化碳强化了反应传质，产率相对其它工艺也有较大的提升。
此外，本发明使用的脂肪酶为1,3-特异性酯交换脂肪酶；本发明中脂肪酶液中的脂肪酶同样可以为米曲霉脂肪酶、黑曲霉脂肪酶、米黑毛霉菌脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶或者嗜热栖热菌脂肪酶的一种。本发明用到的载体为金属有机骨架材料。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种超临界CO2条件下酶催化制备OPO结构脂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对脂肪酶进行修饰：
将卤代羧酸溶于乙腈中，加入咪唑类化合物，第一次磁力搅拌反应，将得到的反应产物用无水乙醚萃取，得到下层油状物质，真空干燥，得到修饰剂；将修饰剂与羰基二咪唑混合，加入到无水二甲亚砜中，第二次磁力搅拌，室温反应，得到活性体；将活性体加入到脂肪酶液中，第三次磁力搅拌反应，透析，得到酰化脂肪酶溶液；其中，所述脂肪酶液中的脂肪酶为1,3-特异性酯交换脂肪酶；所述卤代羧酸为氯乙酸或溴丙酸；所述咪唑类化合物为1,2-二甲基咪唑或1,丁基-2-甲基咪唑；
(2)制备固定化脂肪酶：
将硝酸锌加入到去离子水中，得到溶液A；将2-甲基咪唑、酰化脂肪酶溶液与聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶解于去离子水中，得到溶液B；将溶液A与溶液B混合，搅拌，离心、洗涤，得到固定化脂肪酶；所述硝酸锌、去离子水与2-甲基咪唑的用量比为10-400mg:1-5mL:
410.0mg；所述2-甲基咪唑、酰化脂肪酶溶液与聚乙烯吡咯烷酮的用量比为410.0mg：
5mL：50.0mg；
(3)制备OPO结构脂：
以三棕榈酸甘油酯和油酸为反应底物，加入固定化脂肪酶，置于反应釜，通入介质CO2，超临界条件下，反应，分离，得到OPO结构脂。
2.根据权利要求1所述的超临界CO2条件下酶催化制备OPO结构脂的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述1,3-特异性酯交换脂肪酶为米曲霉脂肪酶、黑曲霉脂肪酶、米黑毛霉菌脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶、嗜热栖热菌脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶、皱褶假丝酵母脂肪酶或猪胰脂肪酶。
3.根据权利要求1所述的超临界CO2条件下酶催化制备OPO结构脂的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述卤代羧酸与咪唑类化合物的摩尔比为10:1.1；所述修饰剂与羰基二咪唑的摩尔比为1:1。
4.根据权利要求1所述的超临界CO2条件下酶催化制备OPO结构脂的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述活性体与脂肪酶液的体积比为90μL：5mL，所述脂肪酶液的浓度为150-350μM。
5.根据权利要求1所述的超临界CO2条件下酶催化制备OPO结构脂的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述第一次磁力搅拌反应的温度为60-100℃，所述第一次磁力搅拌反应的时间为5-10h；所述室温反应的时间为2-8h；所述第三次磁力搅拌反应的温度为0-4℃，所述第三次磁力搅拌反应的时间为8-24h。
6.根据权利要求1所述的超临界CO2条件下酶催化制备OPO结构脂的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述溶解的温度为42℃；所述搅拌的时间为5-10min。
7.根据权利要求1所述的超临界CO2条件下酶催化制备OPO结构脂的方法，其特征在于，步骤(3)中，三棕榈酸甘油酯与油酸的摩尔比为1:1-1:8，固定化脂肪酶的用量占反应底物总量的0.5-12wt％。
8.根据权利要求1所述的超临界CO2条件下酶催化制备OPO结构脂的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述反应的温度为20-90℃，所述反应的压力为5-40MPa，所述反应的时间为5-24小时。
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