JP2009207492A - 桂皮酸誘導体の酵素合成法 - Google Patents
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Abstract
【課題】桂皮酸誘導体を簡便に安全に収率よく酵素合成する方法を提供する。
【解決手段】桂皮酸類とアルコール類とのエステル交換反応において、桂皮酸類のカルボキシ基をビニル基とアルキル基にエステル交換したものに対して、イオン液体中で酵素によるエステル交換反応を施す。かかる桂皮酸誘導体の酵素合成法によれば、桂皮酸類のビニルエステルから目的とする桂皮酸誘導体を簡便かつ安全に、また高い収率で得ることができる。一段階の反応で目的生成物が得られ収率がよく、また本発明のエステル交換反応は一相系で行われるため多様な基質と酵素を使用でき、また有機溶媒類を用いないので環境に優しく、溶媒および酵素がリサイクル利用できるといった利点を有する。
【選択図】図６
【解決手段】桂皮酸類とアルコール類とのエステル交換反応において、桂皮酸類のカルボキシ基をビニル基とアルキル基にエステル交換したものに対して、イオン液体中で酵素によるエステル交換反応を施す。かかる桂皮酸誘導体の酵素合成法によれば、桂皮酸類のビニルエステルから目的とする桂皮酸誘導体を簡便かつ安全に、また高い収率で得ることができる。一段階の反応で目的生成物が得られ収率がよく、また本発明のエステル交換反応は一相系で行われるため多様な基質と酵素を使用でき、また有機溶媒類を用いないので環境に優しく、溶媒および酵素がリサイクル利用できるといった利点を有する。
【選択図】図６
Description
本発明は、新規な桂皮酸誘導体の酵素合成法に関し、詳しくはイオン液体中でのエステル交換反応により、桂皮酸誘導体の酵素合成を簡便に安全に収率よく行う方法に関するものである。
桂皮酸誘導体は、天然に広く存在し、例えば、桂皮酸誘導体として最も一般的なものとしてカフェ酸誘導体は、抗酸化剤として有用であるほか、強力なインシュリン分泌誘導能があることから、糖尿病治療薬などの医薬品としても有用な物質である。桂皮酸誘導体を得る方法としては、天然物からの抽出方法および化学的合成方法がある。
天然物からの抽出方法の場合、桂皮酸誘導体の天然物中の存在量が微量であることから工業的な生産は困難である。一方、酵素合成方法としては、縮合反応を用いた桂皮酸誘導体の合成法と、エステル交換反応を用いた桂皮酸誘導体の合成法（例えば、特許文献１を参照）が知られている。
天然物からの抽出方法の場合、桂皮酸誘導体の天然物中の存在量が微量であることから工業的な生産は困難である。一方、酵素合成方法としては、縮合反応を用いた桂皮酸誘導体の合成法と、エステル交換反応を用いた桂皮酸誘導体の合成法（例えば、特許文献１を参照）が知られている。
以下に酵素合成方法の具体例として、２−カフェ酸フェネチルエステル（２−ＣＡＰＥ）を合成する場合について説明する。具体例として、縮合反応を用いた２−カフェ酸フェネチルエステルの酵素合成法の化学反応式を下記化学式１に示す。また、エステル交換反応を用いた２−カフェ酸フェネチルエステルの酵素合成法の化学反応式を下記化学式２に示す。
上記化学式１で示される縮合反応を用いた２−カフェ酸フェネチルエステルの酵素合成法は、カフェ酸に２−フェネチルアルコール（２−ＰＡ）を加えて、２−カフェ酸フェネチルエステルを製造するものである。この方法では、原料となるカフェ酸（桂皮酸類）が入手困難である場合が多く、工業的製造に適しているとはいえない。また、この方法では、生成した水が逆反応を触媒して収率が１０％未満と低下するといった問題もある。
一方、上記化学式２で示されるエステル交換反応を用いた２−カフェ酸フェネチルエステルの酵素合成法は、カフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）に２−フェネチルアルコール（２−ＰＡ）を加えて、２−カフェ酸フェネチルエステルおよびキナ酸（ＱＡ）を製造するものである。こちらのエステル交換反応を用いた方法では、水層と有機溶媒層の二相系を用いるのであるが、酵素反応は界面でしか進行しないため、エステル交換反応速度が遅いものの、収率は約５０％と上記縮合反応を用いた場合よりも高いという利点がある。しかし、こちらの方法では、二層の界面でしか反応が進行しないこと、エステル交換反応の溶媒として有機溶媒を使用しており、反応後に有機溶媒の除去が必要となるため、製品の安全性という点ではやはり問題がある。
そこで、発明者らは、上記の現状に鑑み、一相系で反応を行い、多様な基質と酵素を使用可能とすべく、下記化学式３，４で示されるように、カフェ酸ビニルエステル若しくはアルキルエステル（アルキル鎖長１〜４）に変換したカフェ酸アルキルエステルに２−フェネチルアルコール（２−ＰＡ）を加え、リパーゼ酵素を触媒として、２−カフェ酸フェネチルエステルを製造することとした。
上記化学式３で示されるカフェ酸ビニルエステルに２−フェネチルアルコール（２−ＰＡ）を加え、リパーゼ酵素を触媒として、２−カフェ酸フェネチルエステルを製造する方法では、水の生成が無く、アセトンなどの有機溶媒層の一相系を用いて酵素合成が可能であり、カフェオイルキナ酸エステラーゼ（ＣＱＡ ｅｓｔｅｒａｓｅ）や固定化ＣＱＡ ｅｓｔｅｒａｓｅなど多様な酵素が使用できる。通常、酵素を各種固定化方法により固定化したものを使用することで、反応効率を高めることが可能となるのである。
しかし、上記化学式２で示される二相系を用いた酵素合成では、収率が１０％未満（具体的には、カフェオイルキナ酸エステラーゼの場合で収率は０．２％、固定化ＣＱＡ ｅｓｔｅｒａｓｅの場合でも収率は６％であり、効率的な工業的生産が困難な状況である。
しかし、上記化学式２で示される二相系を用いた酵素合成では、収率が１０％未満（具体的には、カフェオイルキナ酸エステラーゼの場合で収率は０．２％、固定化ＣＱＡ ｅｓｔｅｒａｓｅの場合でも収率は６％であり、効率的な工業的生産が困難な状況である。
上述したように、酵素合成方法の具体例として、２−カフェ酸フェネチルエステル（２−ＣＡＰＥ）を合成する場合について説明したが、いずれの方法においても、簡便、かつ安全に、高い収率で効率よく桂皮酸誘導体の製造を行えるといったものではない。
また、上述した酵素合成方法の他に、桂皮酸類とアルコール類を酸触媒存在下で反応させる方法（特許文献２）や、桂皮酸類とキナ酸又は糖類のエステルにアルコール水溶液中で酵素によるエステル交換反応を施すことにより桂皮酸エステル類を製造する方法（特許文献３）が知られている。しかし、これらの方法を用いた場合でも、高い収率で効率よく桂皮酸誘導体の製造を行えるものは見当たらない。
また、上述した酵素合成方法の他に、桂皮酸類とアルコール類を酸触媒存在下で反応させる方法（特許文献２）や、桂皮酸類とキナ酸又は糖類のエステルにアルコール水溶液中で酵素によるエステル交換反応を施すことにより桂皮酸エステル類を製造する方法（特許文献３）が知られている。しかし、これらの方法を用いた場合でも、高い収率で効率よく桂皮酸誘導体の製造を行えるものは見当たらない。
一方で近年、環境に優しい溶媒としてイオン液体が注目されている。イオンのみから構成されるイオン液体は、一般の液体とは異なる特性を有し、不燃性・不揮発性の液体であり、高い熱安定性を備え、広い温度範囲で液状となるものも多い。このためイオン液体は、溶媒抽出や酵素反応の溶媒として広く研究されてきた。
イオン液体はカチオンとアニオンの組み合わせによって物理化学的特性が決定される。イオン液体の中ではイミダゾリウム塩が陽イオンとして一般的に利用されており、適当なアニオン（Ｂｒ−，ＡｌＣｌ４ −，ＢＦ４ −，ＰＦ６ −など）との組み合わせで構成され、組み合わせるアニオンにより性質が大きく変化する。
イオン液体はカチオンとアニオンの組み合わせによって物理化学的特性が決定される。イオン液体の中ではイミダゾリウム塩が陽イオンとして一般的に利用されており、適当なアニオン（Ｂｒ−，ＡｌＣｌ４ −，ＢＦ４ −，ＰＦ６ −など）との組み合わせで構成され、組み合わせるアニオンにより性質が大きく変化する。
例えば、イミダゾリウム環上の置換基が非対称の１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム塩 [ＢＭＩＭ][ＰＦ６]は室温で液体であり、その液体状を示す温度範囲は融点−６１℃，沸点３００℃以上と極めて広い。また[ＢＭＩＭ][ＰＦ６]は、水にもエーテルにも不溶性であるといった溶解特性を有する。
しかしながら、酵素反応には最適温度や至適ｐＨがあり、高濃度の塩の水溶液中ではタンパク質の変性を伴うことが指摘されている。かかる状況下、塩そのものであるイオン液体を酵素合成反応の溶媒として使おうという発想は、一般的には受け入れ難いものである。かかる常識に反して、酵素反応溶液中にイオン液体を添加することで、添加された酵素溶液は、高い安定性，反応性，選択性を有することが知られている（特許文献４）。
しかしながら、酵素反応には最適温度や至適ｐＨがあり、高濃度の塩の水溶液中ではタンパク質の変性を伴うことが指摘されている。かかる状況下、塩そのものであるイオン液体を酵素合成反応の溶媒として使おうという発想は、一般的には受け入れ難いものである。かかる常識に反して、酵素反応溶液中にイオン液体を添加することで、添加された酵素溶液は、高い安定性，反応性，選択性を有することが知られている（特許文献４）。
本発明は、桂皮酸類、特に生理活性が高いカフェ酸を使って、化学的合成方法ではなく、微生物が生産する酵素を用いて、カフェ酸誘導体の内、付加価値の高いものを工業生産レベルに酵素合成することを目的とする。
本発明は、かかる目的を達成すべく、イオン液体中でのエステル交換反応により、桂皮酸誘導体の酵素合成を簡便に効率よく行う方法を提供するものである。
本発明は、かかる目的を達成すべく、イオン液体中でのエステル交換反応により、桂皮酸誘導体の酵素合成を簡便に効率よく行う方法を提供するものである。
本発明者らは、このような事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、桂皮酸類とアルコール類とのエステル交換反応において、桂皮酸類のカルボキシ基をビニル基とアルキル基にエステル交換したものを基質としてイオン液体中で酵素によるエステル交換反応を施すことにより、一工程で桂皮酸誘導体を高い収率で酵素合成できることの知見を得て、本発明に至った。
上記課題を達成すべく、本発明の第１の観点によれば、桂皮酸類とアルコール類とのエステル交換反応において、桂皮酸類のカルボキシ基をビニル基若しくはアルキル基にエステル交換したものに対して、イオン液体中で酵素によるエステル交換反応を施す桂皮酸誘導体の酵素合成法が提供される。
かかる桂皮酸誘導体の酵素合成法によれば、桂皮酸類のビニルエステルまたはアルキルエステルから目的とする桂皮酸誘導体を簡便かつ安全に、また高い収率で得ることができる。一段階の反応で目的生成物が得られ効率がよく、また本発明のエステル交換反応は一相系で行われるため多様な基質と酵素を使用でき、また有機溶媒類を用いないので環境に優しく、イオン液体および酵素がリサイクル利用できるといった利点を有する。イオン液体を用いることにより、上述した従来の酵素合成方法の収率と比べて、遥かに高い収率、目的物によってはほぼ１００％の収率で合成することができるのである。
かかる桂皮酸誘導体の酵素合成法によれば、桂皮酸類のビニルエステルまたはアルキルエステルから目的とする桂皮酸誘導体を簡便かつ安全に、また高い収率で得ることができる。一段階の反応で目的生成物が得られ効率がよく、また本発明のエステル交換反応は一相系で行われるため多様な基質と酵素を使用でき、また有機溶媒類を用いないので環境に優しく、イオン液体および酵素がリサイクル利用できるといった利点を有する。イオン液体を用いることにより、上述した従来の酵素合成方法の収率と比べて、遥かに高い収率、目的物によってはほぼ１００％の収率で合成することができるのである。
ここで、上記のイオン液体は、疎水性のものであることが好適である。親水性のイオン液体よりも、疎水性のイオン液体の方が、エステル交換反応の変換率が極めて高いからである。このことは後述する実施例でデータを示しながら説明する。また、上記のイオン液体は、粘度が低いことが好適であり、具体的には２０００ｃＰ以下であるものが好ましく、より好ましくは３００ｃｐ以下であり、特に好ましくは１００ｃｐ以下である。
また、上記の酵素は、リパーゼ類であることが好適である。更にかかるリパーゼ類は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５とＰＳ−ＣIIであることが好ましい。Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５とＰＳ−ＣIIが、最もエステル交換反応の変換率が極めて高いからである。
また、上記の酵素は、リパーゼ類であることが好適である。更にかかるリパーゼ類は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５とＰＳ−ＣIIであることが好ましい。Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５とＰＳ−ＣIIが、最もエステル交換反応の変換率が極めて高いからである。
また、桂皮酸類は、特に制限はないが、コーヒーなどの植物等の天然物中の成分として存在するものが好ましく、例えば、桂皮酸、カフェ酸、ヒドロキシ桂皮酸、フェルラ酸、ヘスペリチン酸、３，４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、３−フェニルプロピオン酸、およびシナピン酸の群から選択されたものである。
次に、本発明の第２の観点によれば、第１の観点の桂皮酸誘導体の酵素合成法であって、カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）若しくはカフェ酸のカルボキシ基をアルキル基（アルキル鎖長１〜４）にエステル交換したカフェ酸アルキルエステル、および２−フェネチルアルコール（２−ＰＡ）を基質として、疎水性イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応を施すことで、略９０％以上の高い収率で、２−カフェ酸フェネチルエステル（２−ＣＡＰＥ）を酵素合成し得る方法が提供される。
なお、上記の酵素反応に必要な物質は、基質と固定化された酵素、イオン液体だけで、アセトンなどの有機溶媒やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加は行っていない。
なお、上記の酵素反応に必要な物質は、基質と固定化された酵素、イオン液体だけで、アセトンなどの有機溶媒やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加は行っていない。
次に、本発明の第３の観点によれば、第１の観点の桂皮酸誘導体の酵素合成法であって、カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）若しくはカフェ酸のカルボキシ基をアルキル基（アルキル鎖長１〜４）にエステル交換したカフェ酸アルキルエステル、および３−フェニルプロパノール（３−ＰＡ）若しくは４−フェネチルアルコール（４−ＰＡ）を基質として、疎水性イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応を施すことで、略８０％以上の高い収率で、３−カフェ酸フェネチルエステル（３−ＣＡＰＥ）又は４−カフェ酸フェネチルエステル（４−ＣＡＰＥ）を酵素合成し得る方法が提供される。
なお、上記の酵素反応に必要な物質は、基質と固定化された酵素、イオン液体だけで、アセトンなどの有機溶媒やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加は行っていない。
なお、上記の酵素反応に必要な物質は、基質と固定化された酵素、イオン液体だけで、アセトンなどの有機溶媒やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加は行っていない。
次に、本発明の第４の観点によれば、第１の観点の桂皮酸誘導体の酵素合成法であって、カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）若しくはカフェ酸のカルボキシ基をアルキル基（アルキル鎖長１〜４）にエステル交換したカフェ酸アルキルエステル、および２−シクロヘキサンエタノール（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｅｔｈａｎｏｌ）若しくは３−シクロヘキサンエタノール（３−Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｅｔｈａｎｏｌ）を基質として、疎水性イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応を施すことで、略８０％以上の高い収率で、２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）又は３−カフェ酸シクロヘキサエステル（３−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）を酵素合成し得る方法が提供される。
なお、上記の酵素反応に必要な物質は、基質と固定化された酵素、イオン液体だけで、アセトンなどの有機溶媒やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加は行っていない。
なお、上記の酵素反応に必要な物質は、基質と固定化された酵素、イオン液体だけで、アセトンなどの有機溶媒やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加は行っていない。
次に、本発明の第５の観点によれば、第１の観点の桂皮酸誘導体の酵素合成法であって、カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）若しくはカフェ酸のカルボキシ基をアルキル基（アルキル鎖長１〜４）にエステル交換したカフェ酸アルキルエステル、およびカフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）を基質として、イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応を施すことで、ｍｏｎｏＣＱＡからｄｉＣＱＡ（ＤＣＱＡ）、ｄｉＣＱＡからｔｒｉＣＱＡへの酵素合成が行える方法が提供される。
なお、上記の酵素反応に必要な物質は、基質と固定化された酵素、イオン液体だけで、アセトンなどの有機溶媒やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加は行っていない。
なお、上記の酵素反応に必要な物質は、基質と固定化された酵素、イオン液体だけで、アセトンなどの有機溶媒やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加は行っていない。
ここで、第５の観点の桂皮酸誘導体の酵素合成法におけるイオン液体は、疎水性の脂肪族で、及び／または、粘度が２０００ｃＰ以下であることが好ましい。疎水性の脂肪族イオン液体は、具体的にはアンモニウム系、ピロロリデウム系，ピラゾリウム系のものが高い反応性を示すことが確認できている。また、イオン液体におけるアニオンは、[（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｎ]−または[ＣＦ３ＳＯ３]−であることが好ましい。かかるイオン液体が高い反応性を示すことが確認できている。また、上記の固定化リパーゼは、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５若しくはＰＳ−ＣIIであることが好ましい。
次に、本発明の第６の観点によれば、第１の観点の桂皮酸誘導体の酵素合成法であって、カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）若しくはカフェ酸のカルボキシ基をアルキル基（アルキル鎖長１〜４）にエステル交換したカフェ酸アルキルエステル、およびシンナミルアルコール（Ｃｉｎｎａｍｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）を基質として、疎水性イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応を施すことで、シンナミルカフェエート（ＣＩＣＡ：Ｃｉｎｎａｍｙｌ Ｃａｆｆｅａｔｅ）を酵素合成し得る方法が提供される。
なお、上記の酵素反応に必要な物質は、基質と固定化された酵素、イオン液体だけで、アセトンなどの有機溶媒やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加は行っていない。
なお、上記の酵素反応に必要な物質は、基質と固定化された酵素、イオン液体だけで、アセトンなどの有機溶媒やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加は行っていない。
本発明により、イオン液体中でのエステル交換反応により、桂皮酸誘導体の酵素合成を簡便に効率よく行う方法が提供できる。
なお、本発明の桂皮酸誘導体の酵素合成法のように、目的物によっては概ね１００％の高い収率で酵素合成を行えるものは他に例を見ない。
なお、本発明の桂皮酸誘導体の酵素合成法のように、目的物によっては概ね１００％の高い収率で酵素合成を行えるものは他に例を見ない。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明の範囲は、以下の実施例や図示例に限定されるものではない。
実施例１は、イオン液体中でのエステル交換反応による２−カフェ酸フェネチルエステル（２−ＣＡＰＥ）の酵素合成法について具体的に数値データを示しながら説明する。
実施例１の酵素合成は、カフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）４８．５ｍＭ・１０ｍｇ
および２−フェネチルアルコール（２−ＰＡ）２５１ｍＭ・３０μＬを、疎水性のイオン液体[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２]１ｍＬ中に添加し、固定化リパーゼ酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５）２５ｍｇと共に６０℃ でインキュベートし、エステル交換反応を施して２−カフェ酸フェネチルエステル（２−ＣＡＰＥ）を酵素合成した。イオン液体と固定化リパーゼ酵素とのインキュベートは、２６０ｒｐｍ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｔｉｒｒｅｒ）で攪拌しながら７２時間実施した。
実施例１の酵素合成は、カフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）４８．５ｍＭ・１０ｍｇ
および２−フェネチルアルコール（２−ＰＡ）２５１ｍＭ・３０μＬを、疎水性のイオン液体[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２]１ｍＬ中に添加し、固定化リパーゼ酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５）２５ｍｇと共に６０℃ でインキュベートし、エステル交換反応を施して２−カフェ酸フェネチルエステル（２−ＣＡＰＥ）を酵素合成した。イオン液体と固定化リパーゼ酵素とのインキュベートは、２６０ｒｐｍ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｔｉｒｒｅｒ）で攪拌しながら７２時間実施した。
図１に、実施例１のエステル交換反応による２−ＣＡＰＥの酵素合成に関する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；High Performance Liquid Chromatography) の結果を示す。ＨＰＬＣの結果は、７２時間後の経時的に採取した反応液のサンプリング１００μＬの成分を調べたものである。図１の結果から、７２時間後は基質のカフェ酸ビニルエステルの成分ピークと生成物の２−ＣＡＰＥの成分ピークの２つのピークが観察されているが、副産物の生成は確認されず、最終変換率は９０％以上であった。
実施例２は、イオン液体中でのエステル交換反応による３−カフェ酸フェネチルエステル（３−ＣＡＰＥ）の酵素合成法について具体的に数値データを示しながら説明する。
実施例２の酵素合成は、カフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）４４ｍＭ・２０ｍｇおよび３−フェニルプロパノール（３−ＰＡ）１００．３ｍＭ・３０μＬを、疎水性のイオン液体[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２] ２．２ｍＬ中に添加し、固定化リパーゼ酵素（ＰＳ−ＣＩ）１０ｍｇと共に５５℃でインキュベートし、エステル交換反応を施して３−カフェ酸フェネチルエステル（３−ＣＡＰＥ）を酵素合成した。イオン液体と固定化リパーゼ酵素とのインキュベートは、３２０ｒｐｍ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｔｉｒｒｅｒ）で攪拌しながら７２時間実施した。この反応液から経時的に採取した反応液のサンプリングをヘキサン６００μＬと２−プロパノール３００μＬの混合液で抽出し、ＨＰＬＣ分析および核磁気共鳴(ＮＭＲ)分析を行った。
実施例２の化学反応式を下記化学式５に、実施例２の操作フローを図２に示す。
実施例２の酵素合成は、カフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）４４ｍＭ・２０ｍｇおよび３−フェニルプロパノール（３−ＰＡ）１００．３ｍＭ・３０μＬを、疎水性のイオン液体[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２] ２．２ｍＬ中に添加し、固定化リパーゼ酵素（ＰＳ−ＣＩ）１０ｍｇと共に５５℃でインキュベートし、エステル交換反応を施して３−カフェ酸フェネチルエステル（３−ＣＡＰＥ）を酵素合成した。イオン液体と固定化リパーゼ酵素とのインキュベートは、３２０ｒｐｍ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｔｉｒｒｅｒ）で攪拌しながら７２時間実施した。この反応液から経時的に採取した反応液のサンプリングをヘキサン６００μＬと２−プロパノール３００μＬの混合液で抽出し、ＨＰＬＣ分析および核磁気共鳴(ＮＭＲ)分析を行った。
実施例２の化学反応式を下記化学式５に、実施例２の操作フローを図２に示す。
図３に、実施例２のエステル交換反応による３−ＣＡＰＥの酵素合成に関する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ) の結果を示す。ＨＰＬＣの結果は、０時間後と２４時間後と７２時間後の経時的に採取した反応液のサンプリング１００μＬの成分を調べたものである。図３のＨＰＬＣの結果によれば、反応開始後すぐ（０時間後）ではカフェ酸ビニルエステルの成分ピークのみが現れており、２４時間後はカフェ酸ビニルエステルの成分ピークと新規成分のピークの２つのピークが観察され、７２時間後はカフェ酸ビニルエステルの成分ピークが消失し、新規成分のピークのみが観察されている。７２時間後の抽出液を精製したものの成分ピークは、図４に示されるＮＭＲ分析から３−ＣＡＰＥと同定した。以上のことから、３−ＣＡＰＥを酵素合成できたことがわかる。
次に、カフェ酸ビニルエステルおよび３−フェニルプロパノール（３−ＰＡ）を、下記化学式６〜化学式９に示される粘度や親水性／疎水性などの特質が異なる４種類のイオン液体を用いて、３−カフェ酸フェネチルエステル（３−ＣＡＰＥ）を酵素合成した結果を示す。酵素は、固定化リパーゼ酵素（ＰＳ−ＣII）を用いている。また下記表１は、上記４種類のイオン液体の特質をまとめたものである。
図５の操作手順フローを参照しながら、カフェ酸ビニルエステルおよび３−フェニルプロパノール（３−ＰＡ）を、上記表１に示される４種類の各イオン液体を用いて、３−カフェ酸フェネチルエステル（３−ＣＡＰＥ）を酵素合成する操作手順を説明する。
カフェ酸ビニルエステル４８．５ｍＭ・１０ｍｇおよび３−フェネチルアルコール（３−ＰＡ）２２１ｍＭ・３０μＬを、上記表１に示される４種類の各イオン液体１ｍＬ中に添加し、固定化リパーゼ酵素（ＰＳ−ＣII）５．８ｍｇと共に６０℃でインキュベートし、エステル交換反応を施して３−カフェ酸フェネチルエステル（３−ＣＡＰＥ）を酵素合成した。イオン液体と固定化リパーゼ酵素とのインキュベートは、１６０ｒｐｍ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｔｉｒｒｅｒ）で攪拌しながら７２時間実施した。この反応液から経時的に採取した反応液のサンプリングをヘキサン６００μＬと２−プロパノール３００μＬの混合液で抽出し、ＨＰＬＣ分析を行った。なお、３−ＣＡＰＥ抽出に必要な回数は、イオン液体の種類によって異なり、結果は下記表２の通りとなった。
カフェ酸ビニルエステル４８．５ｍＭ・１０ｍｇおよび３−フェネチルアルコール（３−ＰＡ）２２１ｍＭ・３０μＬを、上記表１に示される４種類の各イオン液体１ｍＬ中に添加し、固定化リパーゼ酵素（ＰＳ−ＣII）５．８ｍｇと共に６０℃でインキュベートし、エステル交換反応を施して３−カフェ酸フェネチルエステル（３−ＣＡＰＥ）を酵素合成した。イオン液体と固定化リパーゼ酵素とのインキュベートは、１６０ｒｐｍ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｔｉｒｒｅｒ）で攪拌しながら７２時間実施した。この反応液から経時的に採取した反応液のサンプリングをヘキサン６００μＬと２−プロパノール３００μＬの混合液で抽出し、ＨＰＬＣ分析を行った。なお、３−ＣＡＰＥ抽出に必要な回数は、イオン液体の種類によって異なり、結果は下記表２の通りとなった。
図６は、上記表１に示される４種類のイオン液体をそれぞれ用いた場合における、３−カフェ酸フェネチルエステル（３−ＣＡＰＥ）の酵素合成量について、経時変化をグラフにしたものである。図６から、３−ＣＡＰＥは疎水性イオン液体である[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２] と[ＢＭＩＭ][ＰＦ６] を用いた場合が多量に酵素合成されていることが確認できる。
また、反応７２時間後の３−ＣＡＰＥの変換率は、[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２] が最も高く７９％で、次いで、[ＢＭＩＭ][ＰＦ６] の７６％であった。
また、反応７２時間後の３−ＣＡＰＥの変換率は、[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２] が最も高く７９％で、次いで、[ＢＭＩＭ][ＰＦ６] の７６％であった。
これらの[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２] と[ＢＭＩＭ][ＰＦ６]は、３−ＣＡＰＥの抽出の回数も３回と少なく（上記表２参照）、好適な反応溶媒として機能していることがわかる。３回抽出するとほぼ全量回収できるのである。[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２] と[ＢＭＩＭ][ＰＦ６]は、いずれも疎水性イオン液体である。また、他のイオン液体は親水性イオン液体である。
従って、疎水性イオン液体がエステル交換反応の変換率が極めて高い好適な反応媒体として用いることができることがわかる。
すなわち、カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）および３−フェニルプロパノール（３−ＰＡ）を、疎水性イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応を施すことで、概ね９７％以上の高い収率で、３−カフェ酸フェネチルエステル（３−ＣＡＰＥ）を酵素合成できるのである。
すなわち、カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）および３−フェニルプロパノール（３−ＰＡ）を、疎水性イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応を施すことで、概ね９７％以上の高い収率で、３−カフェ酸フェネチルエステル（３−ＣＡＰＥ）を酵素合成できるのである。
実施例３は、イオン液体中でのエステル交換反応による２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）の酵素合成法について具体的に数値データを示しながら説明する。
実施例３の酵素合成は、カフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）４４ｍＭ・２０ｍｇおよび２−シクロヘキサンエタノール（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｅｔｈａｎｏｌ）３２６ｍＭ・１００μＬを、疎水性のイオン液体[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２] ２．２ｍＬ中に添加し、固定化リパーゼ酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５）２１ｍｇと共に５５℃でインキュベートし、エステル交換反応を施して２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）を酵素合成した。イオン液体と固定化リパーゼ酵素とのインキュベートは、１８０ｒｐｍで攪拌しながら９６時間実施した。この反応液から経時的に採取した反応液のサンプリングをヘキサン６００μＬと２−プロパノール３００μＬの混合液で抽出し、ＨＰＬＣ分析およびＮＭＲ分析を行った。
実施例３の化学反応式を下記化学式１０に、実施例３の操作フローを図７に示す。
実施例３の酵素合成は、カフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）４４ｍＭ・２０ｍｇおよび２−シクロヘキサンエタノール（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｅｔｈａｎｏｌ）３２６ｍＭ・１００μＬを、疎水性のイオン液体[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２] ２．２ｍＬ中に添加し、固定化リパーゼ酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５）２１ｍｇと共に５５℃でインキュベートし、エステル交換反応を施して２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）を酵素合成した。イオン液体と固定化リパーゼ酵素とのインキュベートは、１８０ｒｐｍで攪拌しながら９６時間実施した。この反応液から経時的に採取した反応液のサンプリングをヘキサン６００μＬと２−プロパノール３００μＬの混合液で抽出し、ＨＰＬＣ分析およびＮＭＲ分析を行った。
実施例３の化学反応式を下記化学式１０に、実施例３の操作フローを図７に示す。
図８に、実施例３のエステル交換反応による２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）の酵素合成に関する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ) の結果を示す。ＨＰＬＣの結果は、０時間後と２４時間後と９６時間後の経時的に採取した反応液のサンプリング１００μＬの成分を調べたものである。図８のＨＰＬＣの結果によれば、反応開始後すぐ（０時間後）ではカフェ酸ビニルエステルの成分ピークのみが現れており、２４時間後はカフェ酸ビニルエステルの成分ピークと新規成分のピークの２つのピークが観察され、９６時間後はカフェ酸ビニルエステルの成分ピークが消失し、新規成分のピークのみが観察されている。９６時間後の抽出液を精製したものの成分ピークは、図９に示されるＮＭＲ分析から２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）と同定した。以上のことから、２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅを酵素合成できたことがわかる。
次に、カフェ酸ビニルエステルおよび２−シクロヘキサンエタノール（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｅｔｈａｎｏｌ）を、上述の化学式５〜化学式８および下記化学式１０に示される粘度や親水性／疎水性などの特質が異なる５種類のイオン液体を用いて、２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）を酵素合成した結果を示す。酵素は、固定化リパーゼ酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５）を用いている。また下記表３は、化学式１１のイオン液体の特質をまとめたものである。
図１０の操作手順フローを参照しながら、カフェ酸ビニルエステルおよび２−シクロヘキサンエタノール（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｅｔｈａｎｏｌ）から、５種類のイオン液体を用いて、２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）を酵素合成する操作手順を説明する。
カフェ酸ビニルエステル４８．５ｍＭ・１０ｍｇおよび２−シクロヘキサンエタノール（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｅｔｈａｎｏｌ）３５８．８ｍＭ・５０μＬを、４種類のイオン液体それぞれ１ｍＬ中に添加し、固定化リパーゼ酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５）５．８ｍｇ（＝１５０００Ｕｎｉｔ；但し、１Ｕｎｉｔは１分間に１μｍｏｌの２−Ｐｈｅｎｅｔｈｙｌ
ａｃｅｔａｔｅを生成するのに必要な酵素量と定義する。）と共に６０℃でインキュベートし、エステル交換反応を施して２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）を酵素合成した。イオン液体と固定化リパーゼ酵素とのインキュベートは、１５００ｒｐｍで攪拌しながら７２時間実施した。この反応液から経時的に採取した反応液のサンプリングをヘキサン６００μＬと２−プロパノール３００μＬの混合液で抽出し、ＨＰＬＣ分析を行った。
カフェ酸ビニルエステル４８．５ｍＭ・１０ｍｇおよび２−シクロヘキサンエタノール（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｅｔｈａｎｏｌ）３５８．８ｍＭ・５０μＬを、４種類のイオン液体それぞれ１ｍＬ中に添加し、固定化リパーゼ酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５）５．８ｍｇ（＝１５０００Ｕｎｉｔ；但し、１Ｕｎｉｔは１分間に１μｍｏｌの２−Ｐｈｅｎｅｔｈｙｌ
ａｃｅｔａｔｅを生成するのに必要な酵素量と定義する。）と共に６０℃でインキュベートし、エステル交換反応を施して２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）を酵素合成した。イオン液体と固定化リパーゼ酵素とのインキュベートは、１５００ｒｐｍで攪拌しながら７２時間実施した。この反応液から経時的に採取した反応液のサンプリングをヘキサン６００μＬと２−プロパノール３００μＬの混合液で抽出し、ＨＰＬＣ分析を行った。
図１１は、４種類のイオン液体をそれぞれ用いた場合における、２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）の酵素合成量について、経時変化をグラフにしたものである。図１１から、２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）は疎水性イオン液体である[ＢＭＩＮ][ＮＴｆ２] と[ＢＭＩＭ][ＰＦ６] を用いた場合が多量に酵素合成されていることが確認できる。
また、反応７２時間後の２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）の変換率は、最も反応が進んだ[ＢＭＩＭ][ＮＴＦ２] が７０％であった。[ＢＭＩＭ][ＰＦ６]は、反応４８時間後から急速に反応が進行し、反応７２時間後に変換率４０％に達した。なお、[ＴＤＰＳ][ＣＩ]は、反応がまったく進まなかった。反応が進まなかったのは、粘度が高すぎたことが要因と推定される。
また、反応７２時間後の２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）の変換率は、最も反応が進んだ[ＢＭＩＭ][ＮＴＦ２] が７０％であった。[ＢＭＩＭ][ＰＦ６]は、反応４８時間後から急速に反応が進行し、反応７２時間後に変換率４０％に達した。なお、[ＴＤＰＳ][ＣＩ]は、反応がまったく進まなかった。反応が進まなかったのは、粘度が高すぎたことが要因と推定される。
これらの[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２] と[ＢＭＩＭ][ＰＦ６]は、２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）の抽出の回数も５回と少なく、好適な反応溶媒として機能していることがわかる。５回抽出するとほぼ全量回収できるのである。[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２] と[ＢＭＩＭ][ＰＦ６]は、いずれも疎水性イオン液体である。また、他のイオン液体は親水性イオン液体である。
従って、疎水性イオン液体がエステル交換反応の変換率が極めて高い好適な反応媒体として用いることができることがわかる。
すなわち、カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）および２−シクロヘキサンエタノール（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｅｔｈａｎｏｌ）を、疎水性イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応を施すことで、反応７２時間後で７０％以上の高い収率で、２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）を酵素合成できるのである。
すなわち、カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）および２−シクロヘキサンエタノール（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｅｔｈａｎｏｌ）を、疎水性イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応を施すことで、反応７２時間後で７０％以上の高い収率で、２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）を酵素合成できるのである。
実施例４は、イオン液体中でのエステル交換反応による４，５−ジカフェオイルキナ酸（ＤＣＱＡ；４，５−Ｄｉｃａｆｆｅｏｙｌ Ｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ）の酵素合成法について具体的に数値データを示しながら説明する。
実施例４の酵素合成は、カフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）４８．５ｍＭ・１０ｍｇおよびカフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）１９．８ｍＭ・７ｍｇを基質として、後述する１１種類のイオン液体１．０ｍＬ中に添加し、５種類の中から選択されたリパーゼ酵素Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５と共に６０℃前後でインキュベートし、エステル交換反応を施して４，５−ジカフェオイルキナ酸（ＤＣＱＡ；４，５−Ｄｉｃａｆｆｅｏｙｌ Ｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ）の酵素合成を試みた。イオン液体と各酵素とのインキュベートは、２０００ｒｐｍ（小型恒温振とう培養機）で攪拌しながら９８時間実施した。この反応液から経時的に採取した反応液のサンプリングをヘキサン６００μＬと２−プロパノール３００μＬの混合液で抽出し、ＨＰＬＣ分析を行った。
実施例４の化学反応式を下記化学式１２に示す。
実施例４の酵素合成は、カフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）４８．５ｍＭ・１０ｍｇおよびカフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）１９．８ｍＭ・７ｍｇを基質として、後述する１１種類のイオン液体１．０ｍＬ中に添加し、５種類の中から選択されたリパーゼ酵素Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５と共に６０℃前後でインキュベートし、エステル交換反応を施して４，５−ジカフェオイルキナ酸（ＤＣＱＡ；４，５−Ｄｉｃａｆｆｅｏｙｌ Ｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ）の酵素合成を試みた。イオン液体と各酵素とのインキュベートは、２０００ｒｐｍ（小型恒温振とう培養機）で攪拌しながら９８時間実施した。この反応液から経時的に採取した反応液のサンプリングをヘキサン６００μＬと２−プロパノール３００μＬの混合液で抽出し、ＨＰＬＣ分析を行った。
実施例４の化学反応式を下記化学式１２に示す。
上記化学式１１の化学反応を、有機合成を用いて一段階で行うことは非常に困難である。上記化学反応をサツマイモの葉の酵素を使用して行うことは以前から研究されていたが、本実施例４は、この化学反応を微生物由来の酵素合成を用いて一段階で行うというものである。
上述した実施例１〜実施例３の場合は、基質であるカフェ酸ビニルエステルとアルコール類は共に有機溶媒に溶けやすいといった性質であった。これに対して、本実施例４においては、基質であるカフェ酸ビニルエステルは有機溶媒に溶けやすいといった性質であるが、他方の基質のカフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）は水に溶けやすいといった性質である。この２つの基質の性質が相反することに起因するのであるが、上記化学反応では、特定のイオン液体および特定の酵素を用いた場合に、一相系で高い反応性を示すことが確認された。
なお、カフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）は、動物実験レベルではあるが、アルツハイマー病の治療や予防に効果があることが知られている。
なお、カフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）は、動物実験レベルではあるが、アルツハイマー病の治療や予防に効果があることが知られている。
本反応には、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５が最適酵素であり、高い反応性を示した。
また、本実施例４で用いた１１種類のイオン液体について、下記表５にまとめる。ここで、○は目的物であるＤＣＱＡのピーク近傍にピークが確認されたもので、△はカフェ酸のピーク近傍にピークが確認されたもので、×はピークの変化が反応前後で見られなかったものである。なお、カフェ酸のピーク近傍にピークが確認されたものは、カフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）が酵素あるいは化学的にカフェ酸（ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ）に加水分解されたた可能性が高い。
また図１２−１〜図１２−３は、実験結果から３つのグルーピングを行い、１１種類のイオン液体の化学式、性質を整理したものである。
なお、酵素反応に必要な物質は、基質と固定化された酵素、イオン液体だけで、アセトンなどの有機溶媒やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加は行っていない。
また、本実施例４で用いた１１種類のイオン液体について、下記表５にまとめる。ここで、○は目的物であるＤＣＱＡのピーク近傍にピークが確認されたもので、△はカフェ酸のピーク近傍にピークが確認されたもので、×はピークの変化が反応前後で見られなかったものである。なお、カフェ酸のピーク近傍にピークが確認されたものは、カフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）が酵素あるいは化学的にカフェ酸（ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ）に加水分解されたた可能性が高い。
また図１２−１〜図１２−３は、実験結果から３つのグルーピングを行い、１１種類のイオン液体の化学式、性質を整理したものである。
なお、酵素反応に必要な物質は、基質と固定化された酵素、イオン液体だけで、アセトンなどの有機溶媒やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加は行っていない。
上記表５の結果から、基質にカフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）とカフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）を、酵素にリパーゼ Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５を用いて、１３種類のイオン液体中で酵素合成を行ったところ、４種類のイオン液体反応液から、ＤＣＱＡ類と同じＲｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｔｉｍｅに新規ピークが出現することが確認できた。新規ピークが確認できた４種類のイオン液体は、３種類は疎水性、１種類が親水性イオン液体であった。
また、新規ピークが確認できた４種類のイオン液体は、図１２のイオン液体の性質を参照すると、粘度の低いイオン液体が操作性、反応性で優れていたことが確認できる。
また、新規ピークが確認できた４種類のイオン液体は、図１２のイオン液体の性質を参照すると、粘度の低いイオン液体が操作性、反応性で優れていたことが確認できる。
図１３は、上記表５に示した１１種類のイオン液体の内、ＤＣＱＡのピーク近傍にピークが確認されたN-Methyl-N-propylpyrrolidinum bis
(trifluorometansulfonyl) imideの反応液について、経時的（０時間後、４８時間後、７２時間後）にＨＰＬＣ分析したものである。新規ピークはＤＣＱＡ類と同じＲｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｔｉｍｅに出現していることが確認できる。
(trifluorometansulfonyl) imideの反応液について、経時的（０時間後、４８時間後、７２時間後）にＨＰＬＣ分析したものである。新規ピークはＤＣＱＡ類と同じＲｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｔｉｍｅに出現していることが確認できる。
ここで、本実施例４の酵素合成反応の基質として用いたカフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）は、下記化学式１３で示されるように、５−ＣＱＡを使用している。５−ＣＱＡを基質に用いているので、酵素合成されたＤＣＱＡは、３，５−ＤＣＱＡ若しくは４，５−ＤＣＱＡのどちらかである。
図１４に示されるように、反応液にコーヒー生豆抽出物から精製した標準３，５−ＤＣＱＡと標準４，５−ＤＣＱＡを加えてＨＰＬＣ分析すると、新規ピークは４，５−ＤＣＱＡと同じ位置にピークが重なって出現したことから、新規ピークは４，５−ＤＣＱＡと示唆された。すなわち、新規ピークは、４，５−ＤＣＱＡと混合するとピーク先端が割れず、ピークの高さが高くなったことから、新規ピークは４，５−ＤＣＱＡである可能性が高いといえる。
実施例５は、イオン液体中でのエステル交換反応による２−カフェ酸フェネチルエステル（２−ＣＡＰＥ）の酵素合成法について具体的に数値データを示しながら説明する。
実施例５の酵素合成は、カフェ酸メチルエステル（Ｍｅｔｈｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）４８．５ｍＭ・２０ｍｇ
および２−フェネチルアルコール（２−ＰＡ）２０７ｍＭ・６０μＬを、疎水性のイオン液体[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２]２ｍＬ中に添加し、固定化リパーゼ酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５）２５ｍｇと共に６０℃ でインキュベートし、エステル交換反応を施して２−カフェ酸フェネチルエステル（２−ＣＡＰＥ）を酵素合成した。イオン液体と固定化リパーゼ酵素とのインキュベートは、２６０ｒｐｍ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｔｉｒｒｅｒ）で攪拌しながら１６８時間実施した。
実施例５の酵素合成は、カフェ酸メチルエステル（Ｍｅｔｈｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）４８．５ｍＭ・２０ｍｇ
および２−フェネチルアルコール（２−ＰＡ）２０７ｍＭ・６０μＬを、疎水性のイオン液体[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２]２ｍＬ中に添加し、固定化リパーゼ酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５）２５ｍｇと共に６０℃ でインキュベートし、エステル交換反応を施して２−カフェ酸フェネチルエステル（２−ＣＡＰＥ）を酵素合成した。イオン液体と固定化リパーゼ酵素とのインキュベートは、２６０ｒｐｍ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｔｉｒｒｅｒ）で攪拌しながら１６８時間実施した。
実施例６は、イオン液体中でのエステル交換反応による３−カフェ酸フェネチルエステル（３−ＣＡＰＥ）の酵素合成法について具体的に数値データを示しながら説明する。
実施例６の酵素合成は、カフェ酸メチルエステル（Ｍｅｔｈｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）５０ｍＭ・９７ｍｇおよび３−フェニルプロパノール（３−ＰＡ）３００ｍＭ・４１μＬを、疎水性のイオン液体[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２]９６０μＬ中に添加し、固定化リパーゼ酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５）６．７ｍｇと共に８０℃でインキュベートし、エステル交換反応を施して３−カフェ酸フェネチルエステル（３−ＣＡＰＥ）を酵素合成した。イオン液体と固定化リパーゼ酵素とのインキュベートは、８０℃，２００ｒｐｍで攪拌しながら９６時間実施した。この反応液から経時的に採取した反応液のサンプリングをヘキサン６００μＬと２−プロパノール３００μＬの混合液で抽出し、ＨＰＬＣ分析を行った。
実施例６の化学反応式を下記化学式１４に、実施例６の操作フローを図１５に示す。
実施例６の酵素合成は、カフェ酸メチルエステル（Ｍｅｔｈｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）５０ｍＭ・９７ｍｇおよび３−フェニルプロパノール（３−ＰＡ）３００ｍＭ・４１μＬを、疎水性のイオン液体[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２]９６０μＬ中に添加し、固定化リパーゼ酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５）６．７ｍｇと共に８０℃でインキュベートし、エステル交換反応を施して３−カフェ酸フェネチルエステル（３−ＣＡＰＥ）を酵素合成した。イオン液体と固定化リパーゼ酵素とのインキュベートは、８０℃，２００ｒｐｍで攪拌しながら９６時間実施した。この反応液から経時的に採取した反応液のサンプリングをヘキサン６００μＬと２−プロパノール３００μＬの混合液で抽出し、ＨＰＬＣ分析を行った。
実施例６の化学反応式を下記化学式１４に、実施例６の操作フローを図１５に示す。
図１６に、実施例６のエステル交換反応による３−ＣＡＰＥの酵素合成に関する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ) の結果を示す。ＨＰＬＣの結果は、９６時間後の経時的に採取した反応液のサンプリング１５μＬの成分を調べたものである。図１６のＨＰＬＣの結果によれば、９６時間後はカフェ酸メチルエステルの成分ピークと３−ＣＡＰＥのピークの２つのピークが観察されている。なお、３−ＣＡＰＥの同定は実施例２と同様にＮＭＲ分析により特定した。反応９６時間後の３−ＣＡＰＥの変換率は９７％であった。また、生成量は４８．５ｍＭであった。
実施例７は、イオン液体中でのエステル交換反応による４−カフェ酸フェネチルエステル（４−ＣＡＰＥ）の酵素合成法について具体的に数値データを示しながら説明する。
実施例７の酵素合成は、カフェ酸メチルエステル（Ｍｅｔｈｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）５０ｍＭ・９．７ｍｇおよび４−フェニルプロパノール（４−ＰＡ）３００ｍＭ・４６．７μＬを、疎水性のイオン液体[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２]９５３μＬ中に添加し、固定化リパーゼ酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５）１３．４ｍｇと共に８０℃でインキュベートし、エステル交換反応を施して４−カフェ酸フェネチルエステル（４−ＣＡＰＥ）を酵素合成した。イオン液体と固定化リパーゼ酵素とのインキュベートは、８０℃で２００ｒｐｍで攪拌しながら９６時間実施した。この反応液から経時的に採取した反応液のサンプリングをヘキサン６００μＬと２−プロパノール３００μＬの混合液で抽出し、ＨＰＬＣ分析を行った。
実施例７の化学反応式を下記化学式１５に、実施例７の操作フローを図１７に示す。
実施例７の酵素合成は、カフェ酸メチルエステル（Ｍｅｔｈｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）５０ｍＭ・９．７ｍｇおよび４−フェニルプロパノール（４−ＰＡ）３００ｍＭ・４６．７μＬを、疎水性のイオン液体[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２]９５３μＬ中に添加し、固定化リパーゼ酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５）１３．４ｍｇと共に８０℃でインキュベートし、エステル交換反応を施して４−カフェ酸フェネチルエステル（４−ＣＡＰＥ）を酵素合成した。イオン液体と固定化リパーゼ酵素とのインキュベートは、８０℃で２００ｒｐｍで攪拌しながら９６時間実施した。この反応液から経時的に採取した反応液のサンプリングをヘキサン６００μＬと２−プロパノール３００μＬの混合液で抽出し、ＨＰＬＣ分析を行った。
実施例７の化学反応式を下記化学式１５に、実施例７の操作フローを図１７に示す。
図１８に、実施例４のエステル交換反応による４−ＣＡＰＥの酵素合成に関する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ) の結果を示す。ＨＰＬＣの結果は、９６時間後の経時的に採取した反応液のサンプリング１５μＬの成分を調べたものである。図１８のＨＰＬＣの結果によれば、９６時間後はカフェ酸メチルエステルの成分ピークと４−ＣＡＰＥのピークの２つのピークが観察されている。なお、４−ＣＡＰＥの同定は実施例２と同様にＮＭＲ分析により特定した。反応９６時間後の４−ＣＡＰＥの変換率は９７％であった。また、生成量は４８．５ｍＭであった。
実施例８は、イオン液体中でのエステル交換反応による２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）の酵素合成法について具体的に数値データを示しながら説明する。
実施例８の酵素合成は、カフェ酸メチルエステル（Ｍｅｔｈｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）４４ｍＭ・２０ｍｇおよび２−シクロヘキサンエタノール（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｅｔｈａｎｏｌ）３２６ｍＭ・１００μＬを、疎水性のイオン液体[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２] ２．２ｍＬ中に添加し、固定化リパーゼ酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５）２１ｍｇと共に５５℃でインキュベートし、エステル交換反応を施して２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）を酵素合成した。イオン液体と固定化リパーゼ酵素とのインキュベートは、７０℃，２００ｒｐｍ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｔｉｒｒｅｒ）で攪拌しながら９６時間実施した。この反応液から経時的に採取した反応液のサンプリングをヘキサン６００μＬと２−プロパノール３００μＬの混合液で抽出し、ＨＰＬＣ分析を行った。
実施例８の化学反応式を下記化学式１６に、実施例８の操作フローを図１９に示す。
実施例８の酵素合成は、カフェ酸メチルエステル（Ｍｅｔｈｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）４４ｍＭ・２０ｍｇおよび２−シクロヘキサンエタノール（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｅｔｈａｎｏｌ）３２６ｍＭ・１００μＬを、疎水性のイオン液体[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２] ２．２ｍＬ中に添加し、固定化リパーゼ酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５）２１ｍｇと共に５５℃でインキュベートし、エステル交換反応を施して２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）を酵素合成した。イオン液体と固定化リパーゼ酵素とのインキュベートは、７０℃，２００ｒｐｍ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｔｉｒｒｅｒ）で攪拌しながら９６時間実施した。この反応液から経時的に採取した反応液のサンプリングをヘキサン６００μＬと２−プロパノール３００μＬの混合液で抽出し、ＨＰＬＣ分析を行った。
実施例８の化学反応式を下記化学式１６に、実施例８の操作フローを図１９に示す。
図２０に、実施例８のエステル交換反応による２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）の酵素合成に関する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ) の結果を示す。ＨＰＬＣの結果は、９６時間後の経時的に採取した反応液のサンプリング１５μＬの成分を調べたものである。図２０のＨＰＬＣの結果によれば、９６時間後はカフェ酸メチルエステルの成分ピークと２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）のピークの２つのピークが観察されている。なお、２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）の同定は実施例２と同様にＮＭＲ分析により特定した。反応９６時間後の２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）の変換率は９８％であった。また、生成量は４９ｍＭであった。
実施例９は、イオン液体中でのエステル交換反応による３−カフェ酸シクロヘキサエステル（３−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）の酵素合成法について具体的に数値データを示しながら説明する。
実施例９の酵素合成は、カフェ酸メチルエステル（Ｍｅｔｈｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）５０ｍＭ・９．７ｍｇおよび３−シクロヘキサンエタノール（３−Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｅｔｈａｎｏｌ）４００ｍＭ・６１μＬを、疎水性のイオン液体[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２] ０．９３９ｍＬ中に添加し、固定化リパーゼ酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５）２６．８ｍｇと共に５５℃でインキュベートし、エステル交換反応を施して３−カフェ酸シクロヘキサエステル（３−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）を酵素合成した。イオン液体と固定化リパーゼ酵素とのインキュベートは、８０℃，２００ｒｐｍで攪拌しながら９６時間実施した。この反応液から経時的に採取した反応液のサンプリングをヘキサン６００μＬと２−プロパノール３００μＬの混合液で抽出し、ＨＰＬＣ分析を行った。
実施例９の化学反応式を下記化学式１７に、実施例９の操作フローを図２１に示す。
実施例９の酵素合成は、カフェ酸メチルエステル（Ｍｅｔｈｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）５０ｍＭ・９．７ｍｇおよび３−シクロヘキサンエタノール（３−Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｅｔｈａｎｏｌ）４００ｍＭ・６１μＬを、疎水性のイオン液体[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２] ０．９３９ｍＬ中に添加し、固定化リパーゼ酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５）２６．８ｍｇと共に５５℃でインキュベートし、エステル交換反応を施して３−カフェ酸シクロヘキサエステル（３−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）を酵素合成した。イオン液体と固定化リパーゼ酵素とのインキュベートは、８０℃，２００ｒｐｍで攪拌しながら９６時間実施した。この反応液から経時的に採取した反応液のサンプリングをヘキサン６００μＬと２−プロパノール３００μＬの混合液で抽出し、ＨＰＬＣ分析を行った。
実施例９の化学反応式を下記化学式１７に、実施例９の操作フローを図２１に示す。
図２２に、実施例９のエステル交換反応による３−カフェ酸シクロヘキサエステル（３−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）の酵素合成に関する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ) の結果を示す。ＨＰＬＣの結果は、９６時間後の経時的に採取した反応液のサンプリング１５μＬの成分を調べたものである。図２２のＨＰＬＣの結果によれば、９６時間後はカフェ酸メチルエステルの成分ピークと３−カフェ酸シクロヘキサエステル（３−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）のピークの２つのピークが観察されている。なお、３−カフェ酸シクロヘキサエステル（３−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）の同定は実施例２と同様にＮＭＲ分析により特定した。反応９６時間後の３−カフェ酸シクロヘキサエステル（３−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）の変換率は９３．８％であった。また、生成量は４６．９ｍＭであった。
実施例１０は、イオン液体中でのエステル交換反応によるシンナミルカフェエート（ＣＩＣＡ：Ｃｉｎｎａｍｙｌ Ｃａｆｆｅａｔｅ）の酵素合成法について具体的に数値データを示しながら説明する。
実施例１０の酵素合成は、図２３の操作フロー図に示されるように、カフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）４８．５ｍＭ・１０ｍｇ
およびシンナミルアルコール（Ｃｉｎｎａｍｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）２３３．４ｍＭ・３０μＬを、疎水性の４種類のイオン液体１ｍＬ中に添加し、４種類の固定化リパーゼ酵素２５ｍｇと共に６０℃ でインキュベートし、エステル交換反応を施してシンナミルカフェエート（ＣＩＣＡ：Ｃｉｎｎａｍｙｌ Ｃａｆｆｅａｔｅ）を酵素合成した。イオン液体と固定化リパーゼ酵素とのインキュベートは、２６０ｒｐｍ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｔｉｒｒｅｒ）で攪拌しながら７２時間実施した。この反応液から経時的に採取した反応液のサンプリングをヘキサン６００μＬと２−プロパノール３００μＬの混合液で抽出し、ＨＰＬＣ分析を行った。
下記化学式１８に、シンナミルカフェエート（ＣＩＣＡ：Ｃｉｎｎａｍｙｌ Ｃａｆｆｅａｔｅ）の酵素合成反応式を示す。
実施例１０の酵素合成は、図２３の操作フロー図に示されるように、カフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）４８．５ｍＭ・１０ｍｇ
およびシンナミルアルコール（Ｃｉｎｎａｍｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）２３３．４ｍＭ・３０μＬを、疎水性の４種類のイオン液体１ｍＬ中に添加し、４種類の固定化リパーゼ酵素２５ｍｇと共に６０℃ でインキュベートし、エステル交換反応を施してシンナミルカフェエート（ＣＩＣＡ：Ｃｉｎｎａｍｙｌ Ｃａｆｆｅａｔｅ）を酵素合成した。イオン液体と固定化リパーゼ酵素とのインキュベートは、２６０ｒｐｍ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｔｉｒｒｅｒ）で攪拌しながら７２時間実施した。この反応液から経時的に採取した反応液のサンプリングをヘキサン６００μＬと２−プロパノール３００μＬの混合液で抽出し、ＨＰＬＣ分析を行った。
下記化学式１８に、シンナミルカフェエート（ＣＩＣＡ：Ｃｉｎｎａｍｙｌ Ｃａｆｆｅａｔｅ）の酵素合成反応式を示す。
また、図２４に４種類のイオン液体と４種類の酵素をそれぞれ用いて７２ｈ反応させた場合におけるシンナミルカフェエート（ＣＩＣＡ：Ｃｉｎｎａｍｙｌ Ｃａｆｆｅａｔｅ）の酵素合成量についてのグラフを示す。図２４に示されるように、シンナミルカフェエート（ＣＩＣＡ：Ｃｉｎｎａｍｙｌ Ｃａｆｆｅａｔｅ）は、イオン液体[ＢＭＩＭ][ＮＴｆ２]を添加し、固定化リパーゼ酵素（ＰＳ−II）でインキュベートしたものが、変換率７５％であり、最も効率よく変換されている。
なお、反応で得られたものが、シンナミルカフェエート（ＣＩＣＡ：Ｃｉｎｎａｍｙｌ Ｃａｆｆｅａｔｅ）であることの確認は、ＨＰＬＣ分析および１Ｈ−ＮＭＲ分析で行った。図２５に反応液についてのＨＰＬＣ分析の結果を示す。図２５に示すように、反応させた直後（０時間後）は、カフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）とシンナミルアルコール（Ｃｉｎｎａｍｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）の２つの成分ピークが現れているが、反応後９６時間後は、２つの成分以外の新規ピークの存在が確認できる。この新規ピークを１Ｈ−ＮＭＲ分析した結果を図２６に示す。図２６の分析結果から、新規ピークは、シンナミルカフェエート（ＣＩＣＡ：Ｃｉｎｎａｍｙｌ Ｃａｆｆｅａｔｅ）の成分ピークであることを同定した。
本発明は、桂皮酸誘導体を簡便かつ安全に高い収率で酵素合成できる方法として有用である。
Claims (17)
- 桂皮酸類とアルコール類とのエステル交換反応において、桂皮酸類のカルボキシ基をビニル基若しくはアルキル基にエステル交換したものを基質としてイオン液体中で酵素によるエステル交換反応を施すことを特徴とする桂皮酸誘導体の酵素合成法。
- 前記イオン液体は、疎水性のものであることを特徴とする請求項１に記載の桂皮酸誘導体の酵素合成法。
- 前記イオン液体は、粘度が２０００ｃＰ以下であることを特徴とする請求項１又は２に記載の桂皮酸誘導体の酵素合成法。
- 前記酵素は、リパーゼ類であることを特徴とする請求項１に記載の桂皮酸誘導体の酵素合成法。
- 前記リパーゼ類は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５とＰＳ−ＣIIであることを特徴とする請求項４に記載の桂皮酸誘導体の酵素合成法。
- 前記桂皮酸類は、桂皮酸、カフェ酸、ヒドロキシ桂皮酸、フェルラ酸、ヘスペリチン酸、３，４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、３−フェニルプロピオン酸、およびシナピン酸の群から選択されたものであることを特徴とする請求項１に記載の桂皮酸誘導体の酵素合成法。
- カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル若しくはカフェ酸のカルボキシ基をアルキル基（アルキル鎖長１〜４）にエステル交換したカフェ酸アルキルエステル、および２−フェネチルアルコール（２−ＰＡ）を基質として、疎水性イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応を施すことで、略９０％以上の高い収率で、２−カフェ酸フェネチルエステル（２−ＣＡＰＥ）を酵素合成し得ることを特徴とする請求項１に記載の桂皮酸誘導体の酵素合成法。
- カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル若しくはアルキルエステル（アルキル鎖長１〜４）に変換したカフェ酸アルキルエステル、および３−フェネチルアルコール（３−ＰＡ）を基質として、疎水性イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応を施すことで、略８０％以上の高い収率で、３−カフェ酸フェネチルエステル（３−ＣＡＰＥ）を酵素合成し得ることを特徴とする請求項１に記載の桂皮酸誘導体の酵素合成法。
- カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル若しくはアルキルエステル（アルキル鎖長１〜４）に変換したカフェ酸アルキルエステル、および４−フェネチルアルコール（４−ＰＡ）を基質として、疎水性イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応を施すことで、略８０％以上の高い収率で、４−カフェ酸フェネチルエステル（４−ＣＡＰＥ）を酵素合成し得ることを特徴とする請求項１に記載の桂皮酸誘導体の酵素合成法。
- カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル若しくはアルキルエステル（アルキル鎖長１〜４）に変換したカフェ酸アルキルエステル、および２−シクロヘキサンエタノール（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｅｔｈａｎｏｌ）を基質として、疎水性イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応を施すことで、略８０％以上の高い収率で、２−カフェ酸シクロヘキサエステル（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）を酵素合成し得ることを特徴とする請求項１に記載の桂皮酸誘導体の酵素合成法。
- カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル若しくはアルキルエステル（アルキル鎖長１〜４）に変換したカフェ酸アルキルエステル、および３−シクロヘキサンエタノール（３−Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｅｔｈａｎｏｌ）を基質として、疎水性イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応を施すことで、略８０％以上の高い収率で、３−カフェ酸シクロヘキサエステル（３−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）を酵素合成し得ることを特徴とする請求項１に記載の桂皮酸誘導体の酵素合成法。
- カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル若しくはカフェ酸のカルボキシ基をアルキル基（アルキル鎖長１〜４）にエステル交換したカフェ酸アルキルエステル、およびカフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）を基質として、イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応を施すことで、４，５−ジカフェオイルキナ酸（ＤＣＱＡ；４，５−Ｄｉｃａｆｆｅｏｙｌ Ｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ）を酵素合成し得ることを特徴とする請求項１に記載の桂皮酸誘導体の酵素合成法。
- カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル若しくはカフェ酸のカルボキシ基をアルキル基（アルキル鎖長１〜４）にエステル交換したカフェ酸アルキルエステル、およびシンナミルアルコール（Ｃｉｎｎａｍｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）を基質として、イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応を施すことで、シンナミルカフェエート（ＣＩＣＡ：Ｃｉｎｎａｍｙｌ Ｃａｆｆｅａｔｅ）を酵素合成し得ることを特徴とする請求項１に記載の桂皮酸誘導体の酵素合成法。
- 前記イオン液体は、疎水性のイミダゾリウム系および脂肪族であることを特徴とする請求項７乃至１３のいずれかに記載の桂皮酸誘導体の酵素合成法。
- 前記イオン液体は、粘度が２０００ｃＰ以下であることを特徴とする請求項７乃至１３のいずれかに記載の桂皮酸誘導体の酵素合成法。
- 前記イオン液体におけるアニオンは、[（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｎ]−または[ＣＦ３ＳＯ３]−であることを特徴とする請求項１２に記載の桂皮酸誘導体の酵素合成法。
- 前記固定化リパーゼは、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５とＰＳ−ＣIIであることを特徴とする請求項７乃至１３のいずれかに記載の桂皮酸誘導体の酵素合成法。
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| CN103044260A (zh) * | 2013-01-18 | 2013-04-17 | 武汉大学 | 一种制备碳酸甲基烷基酯的方法 |
| CN109251943A (zh) * | 2018-08-28 | 2019-01-22 | 江苏大学 | 一种超临界co2条件下的酶催化制备opo结构脂的方法 |
-
2009
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