JP2007000010A

JP2007000010A - 酵素法によるフェルラ酸エステル類化合物の製造方法

Info

Publication number: JP2007000010A
Application number: JP2005180132A
Authority: JP
Inventors: Haruhiko Kawasaki; 東彦川崎; Ryuji Sakamoto; 龍司阪本; Shuichi Murata; 修市村田; Moriyasu Tsuchiyama; 守安土山
Original assignee: Okumoto Flour Milling Co Ltd; Osaka University NUC; Osaka Prefecture University PUC
Current assignee: Okumoto Flour Milling Co Ltd; Osaka University NUC; Osaka Prefecture University PUC
Priority date: 2005-06-21
Filing date: 2005-06-21
Publication date: 2007-01-11

Abstract

【課題】フェルラ酸エステル類化合物を酵素法により効率よく製造する方法を提供する。
【解決手段】一般式（ＩＩ）：

（ただし、環Ａは置換基を有していてもよいフェニル基を表す。）で示されるフェルラ酸類化合物および一般式（ＩＩＩ）：

（ただし、Ｒは一価もしくは多価アルコールまたは糖類から１つの水酸基を除いた残基を表す。）で示されるヒドロキシ化合物にフェルラ酸エステラーゼを作用させることを特徴とする一般式（Ｉ）：

で示されるフェルラ酸エステル類化合物の製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、酵素法によるフェルラ酸エステル類化合物の製造方法に関する。

フェルラ酸エステルは、抗酸化作用、紫外線吸収作用等を有する物質であり、化粧品に配合することにより、紫外線防御効果、美白効果などを発揮することが知られている（特許文献１、２）。また、フェルラ酸エステルなどの桂皮酸エステル類には抗炎症作用、抗ガン作用を有することも知られている（特許文献３）。

フェルラ酸エステルの製造方法としては、従来、化学的合成法と酵素的製法が知られている。化学的合成法としては、桂皮酸類とアルコール類を酸触媒存在下で反応させる方法（特許文献４）や桂皮酸類を塩化チオニルなどにより塩素化した後、アルコール類と反応させる方法（特許文献５）が知られている。一方、酵素的製法としては、桂皮酸類と糖類とのエステル（例えば、クロロゲン酸）をアルコール水溶液中酵素（例えば、クロロゲン酸エステラーゼ）によるエステル交換反応させて桂皮酸エステル類とする方法（特許文献３）が知られている。

しかしながら、フェルラ酸類化合物とヒドロキシ化合物とから酵素法により対応するフェルラ酸エステル類化合物を製造する方法は知られていない。
特表２００２−５０７９７０号公報特開平９−４０６１３号公報特開２００３−３３１９６号公報特許第３１５５３２５号明細書特表平１０−５０１２１６号公報

本発明の目的は、酵素法によるフェルラ酸エステル類化合物の新規製造方法を提供することである。また、本発明の他の目的は、フェルラ酸類化合物とヒドロキシ化合物（アルコール類または糖類）とから酵素法によりフェルラ酸エステル類化合物を製造する方法を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、フェルラ酸類化合物（例えば、フェルラ酸）とヒドロキシ化合物（グリセロールなど）とにフェルラ酸エステラーゼを作用させることにより対応するフェルラ酸エステル類化合物が得られることを見い出し、さらに検討を重ねることにより本発明を完成するに到った。すなわち、本発明は、

（１）一般式（ＩＩ）：

（ただし、環Ａは置換基を有していてもよいフェニル基を表す。）
で示されるフェルラ酸類化合物および一般式（ＩＩＩ）：

（ただし、Ｒは一価もしくは多価アルコールまたは糖類から１つの水酸基を除いた残基を表す。）
で示されるヒドロキシ化合物にフェルラ酸エステラーゼを作用させることを特徴とする一般式（Ｉ）：

（ただし、環ＡおよびＲは前記と同一意味を有する。）
で示されるフェルラ酸エステル類化合物の製造方法、

（２）環Ａが低級アルコキシ基、低級アルキル基および水酸基から選ばれる置換基１〜３個を有していてもよいフェニル基である前記（１）記載の製造方法、
（３）低級アルキル基がメチル基である前記（２）記載の製造方法、
（４）環Ａが３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル基、３，４−ジメトキシフェニル基または３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル基である前記（１）記載の製造方法、
（５）化合物［ＩＩ］がフェルラ酸、シナピン酸またはジメトキシ桂皮酸である前記（１）記載の製造方法、
（６）ヒドロキシ化合物（ＩＩＩ）が、一価もしくは多価アルコールまたは糖類である前記（１）記載の製造方法、
（７）ヒドロキシ化合物（ＩＩＩ）がグリセロール、単糖類またはオリゴ糖である前記（６）記載の製造方法、
（８）単糖類がフルクトース、グルコース、キシロース、ガラクトースまたはアラビノースである前記（７）記載の製造方法、
（９）フェルラ酸類化合物（ＩＩ）がフェルラ酸であり、ヒドロキシ化合物（ＩＩＩ）がグリセロールである前記（１）記載の製造方法、
（１０）フェルラ酸エステラーゼがアスペルギルス・ニガー起源である前記（１）記載の製造方法、および
（１１）フェルラ酸エステラーゼが、アスペルギルス・ニガーより得られるペクチナーゼ剤をさらに精製して得られる酵素であって、該酵素のＮ−末端のアミノ酸配列が配列番号１の配列である前記（１）記載の製造方法、
に関する。

本発明によれば、フェルラ酸類化合物とヒドロキシ化合物とよりフェルラ酸エステル類化合物を効率よく製造することができる。

本発明は、一般式（ＩＩ）：

（ただし、環Ａは前記と同一意味を有する。）
で示されるフェルラ酸類化合物と一般式（ＩＩＩ）：

（ただし、Ｒは前記と同一意味を有する。）
で示されるヒドロキシ化合物にフェルラ酸エステラーゼを作用させて一般式（Ｉ）：

（ただし、環Ａは前記と同一意味を有する。）
で示されるフェルラ酸エステル類化合物を製造することを特徴とする。

フェルラ酸類化合物［ＩＩ］において、環Ａは置換基を有していてもよいフェニル基であり、ここで置換基としては、例えば、低級アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソピル基などの炭素数１〜５個のアルキル基）、低級アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基などの炭素数１〜５個のアルコキシ基）、水酸基から選ばれる基があげられ、これらの置換基は同一または異なってベンゼン環上に１〜３個置換していてもよい。これらの置換基がベンゼン環上に置換した環Ａを含む基の具体例としては、例えば、３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル基、３，４−ジメトキシフェニル基、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル基などがあげられ、これらのうち、３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル基が好ましい。

フェルラ酸類化合物［ＩＩ］の例としては、例えば、桂皮酸、フェルラ酸（＝３−メトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸）、シナピン酸（＝３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸）、ジメトキシ桂皮酸（＝３，４−ジメトキシ桂皮酸）などがあげられる。これらのうち、とりわけフェルラ酸が好ましい。

ヒドロキシ化合物［ＩＩＩ］の例としては、炭素数１〜２０のアルカノール、炭素数２〜２０のアルコキシアルカノール、トコフェロールなどの一価アルコール、グリセロールなどの多価アルコール、フラクトース、グルコース、キシロース、ガラクトース、アラビノースなどの単糖類またはこれら単糖類を構成糖とする重合度２〜１０のオリゴ糖を含む糖類があげられる。したがって、一般式［ＩＩＩ］におけるＲは、これらヒドロキシ化合物（一価もしくは多価アルコールまたは糖類）から１個の水酸基を除いた残基、すなわち炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数２〜２０のアルコキシアルキル基、グリセロイル基、糖残基などである。

フェルラ酸エステラーゼは、フェルラ酸と植物細胞膜に存在する糖との間のエステル結合を加水分解してフェルラ酸を遊離させる酵素である。本発明で使用されるフェルラ酸エステラーゼもかかる酵素であり、公知のフェルラ酸エステラーゼを使用できる。また、本発明で使用されるフェルラ酸エステラーゼの起源は特に限定されない。例えば、アスペルギルス属に属する微生物（例えば、アスペルギルス・ニガー）、ペニシリニウム属に属する微生物（例えば、ペニシリニウム・クリソゲナム）などに由来するフェルラ酸エステラーゼが使用できる。

例えば、アスペルギルス・ニガーに由来するフェルラ酸エステラーゼは、アスペルギルス・ニガーの培養により得られるペクチナーゼ剤（ペクチナーゼＰＬ「アマノ」の商品名で市販されている。）を限外ろ過、疎水クロマトグラフィー、遠心濃縮、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製することにより純品として得られる。もちろん、純品でなくても、部分精製のものでも差し支えない。精製に際しては、フェルラ酸とグリセロールとを基質としてグリセリルフェルラ酸の生成量を測定することにより酵素力価を求め、これを指標として活性画分を集めることができる。

かくして得られるフェルラ酸エステラーゼは、分子量が約３６０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）であり、プロテインシーケンサー解析により得られる該酵素のＮ−末端アミノ酸配列は次の通りである。
Ala-Ser-Thr-Gln-Gly-Ile-Ser-Glu-Asp-Leu （配列番号１）
上記で得られたフェルラ酸エステラーゼのＮ−末端アミノ酸配列は、ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．１２，ｐ．４６３８−４６４４（１９９７）に記載されている公知のフェルラ酸エステラーゼのＮ−末端アミノ酸配列と同一である。
なお、本発明で使用されるフェルラ酸エステラーゼは遺伝子組み換え技術を用いて製造されたものでもよく、さらにはポリエチレングリコール等で界面活性化した修飾フェルラ酸エステラーゼや固定化されたフェルラ酸エステラーゼなどであってもよい。

本発明の酵素反応は、適当な溶媒中にフェルラ酸類化合物［ＩＩ］とヒドロキシ化合物［ＩＩＩ］とを加え、さらにフェルラ酸エステラーゼを加えることにより実施できる。
反応溶媒は水と有機溶媒との混合溶媒が使用されるが、水の量はできるだけ少ない方が望ましい。
フェルラ酸類化合物［ＩＩ］の濃度（添加濃度）は特に限定されないが、通常、０．００１〜４０ｗ／ｖ％が好ましく、０．０１〜３０ｗ／ｖ％がより好ましい。一方、ヒドロキシ化合物［ＩＩＩ］の濃度（添加濃度）は、通常、１ｗ／ｖ％以上が好ましく、１０ｗ／ｖ％以上がより好ましい。
酵素量は特に限定されず、酵素の種類、精製度合い、力価などにより適宜選択すればよい。
反応温度は、加温下で行うのが好ましく、通常、３０〜７５℃が好ましく、３５〜７０℃がより好ましい。反応時間は、通常、５分〜１５０時間であるのが好ましく、１０分〜１３０時間であるのがより好ましい。

酵素反応後、反応液中に生成したフェルラ酸エステル類化合物［Ｉ］は、常法（たとえば、抽出、濃縮、遠心分離、シリカゲルクロマトグラフィー、イオン交換樹脂処理など）により、単離・精製することができる。
以下、実施例をあげて本発明を説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

１．酵素の調製
ペクチナーゼ剤（商品名：ペクチナーゼＰＬ「アマノ」、天野エンザイム株式会社製）５００ｍｌを限外ろ過装置（分子量１万カット）にて脱塩したのち、硫安を３０％飽和濃度になるまで加え、４℃、３日間、わずかに撹拌しながら、放置した。その後、遠心分離し、沈殿と上澄に分け、上澄を回収した。
次に、この上澄を、予め２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に硫安３０％飽和濃度になるようにして硫安を加えた緩衝液にて平衡化したＢｕｔｙｌ−ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東洋曹達工業株式会社製）に流し、その後、平衡化した緩衝液と２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）のリニアーグラジエントによって（全量：６００ｍｌ）、タンパク質を溶出させ、活性画分を回収した。

その後の酵素の精製は、ＦＰＬＣシステム（ファルマシア社製）を用いた。
Ｂｕｔｙｌ−ｔｏｙｏｐｅａｒｌ後の溶液（活性画分）に硫安３０％飽和濃度になるように硫安を加え、ＲＥＳＯＵＲＣＥＰＨＥ（アマシャムバイオサイエンス社製）６ｍｌに供した。タンパク質の溶出は硫安飽和濃度３０％〜０％のリニアーグラジエントにより行った。活性画分を回収した。
ついで、ＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐＹＭ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用い、遠心分離機にて酵素液（活性画分）を遠心濃縮した。
濃縮した酵素液をゲルろ過カラムクロマトグラフィーであるＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５（アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、活性画分を回収した。
その後、活性画分をｍｏｎｏＱ（アマシャムバイオサイエンス社）に吸着させ、ついで２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）と、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に塩化ナトリウムを０．３Ｍになるように溶解させた緩衝液とのリニアーグラジエントによってタンパク質の溶出を行った。活性画分を回収し、充分量の２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて透析した。

透析した酵素液を再度ｍｏｎｏＱに供し、ついで２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）と２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に塩化ナトリウムを０．３Ｍになるように溶解させた緩衝液とのリニアーグラジエントによってタンパク質の溶出を行った。活性画分を回収し、次のステップに進んだ。
酵素液に硫安を２０％飽和濃度になうように加え、ＲＥＳＯＵＲＣＥＰＨＥ（アマシャムバイオサイエンス社製）に供した。硫安飽和濃度２０％〜０％のリニアーグラジエントによってたんぱく質の溶出を行った。得られた酵素液を２０ｍＭ酢酸緩衝液にて充分透析することによって、精製酵素液（蛋白質量：０．４３ｍｇ／ｍｌ；全蛋白質：１０．４ｍｇ）を得た。

２．精製酵素の純度確認
Ｌａｅｍｍｌｉ法（Ｎａｔｕｒｅ２２７（１９７０）６８０−６８５）に従い、１０％のアクリルアミドを作成し、前項１で得た精製酵素およびタンパク質の分子量マーカーであるｂｅｎｃｈｍａｒｋｐｒｏｔｅｉｎｌａｄｄｅｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を同時に電気泳動した。その結果、単一のピークを認めた。また分子量マーカータンパク質との移動距離から、精製酵素の分子量は約３６０００であった。なお、プロテインシーケンサー解析により、本精製酵素のＮ−末端アミノ酸配列を調べたところ、次の通りであった。
Ala-Ser-Thr-Gln-Gly-Ile-Ser-Glu-Asp-Leu （配列番号１）

３．酵素活性の測定
１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）５０μｌに、グリセロール４３９μｌおよびフェルラ酸溶液（フェルラ酸を１ｗ／ｖ％濃度となるようにジメチルスルホキシドに溶解して調製）１０μｌを加え、これに精製酵素液（蛋白質量：０．４３ｍｇ／ｍｌ）１μｌを添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。その後、１００℃で５分間インキュベートすることにより酵素反応を停止させ、生成した１−グリセリルフェルラ酸をＨＰＬＣ［カラム：ＭｉｇｈｔｙｓｉｌＲＰ−１８ＧＰ２５０−４．６（５μｍ）（関東化学株式会社製）；展開溶媒：メタノール：０．２％酢酸溶液＝７．３］により定量した。
１Ｕは１分間に１μｍｏｌのグリセリルフェルラ酸を生成する酵素量とした。
その結果、前記１で調製された精製酵素液１μｌ当たり６ｍＵの活性を示した。

１．酵素反応
１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）５ｍｌにグリセロール４２．５ｍｌ、１０％フェルラ酸溶液（フェルラ酸をジメチルスルホキシドに溶解して調製）２．５ｍｌを入れ、フェルラ酸エステラーゼ溶液（実施例１で得た精製酵素液）５０μｌを加え、３７℃で１１４時間反応させた。
ついで、反応液を１００℃で５分間煮沸して反応を停止させた。

２．グリセリルフェルラ酸の精製
反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層を回収した。有機層をエバポレーターにてある程度蒸発させ、十分に乾燥させたシリカゲルカラムを添加し、エバポレーターで減圧しながら、吸着させた。その後、ヘキサンにて充填したシリカゲルカラムの上部に、有機層を吸着させたシリカゲルカラムを充填し、ヘキサン：酢酸エチル＝１：１の展開溶媒にて溶出させた。薄層クロマトにて、未反応のフェルラ酸が完全に溶出したことを確認した後、酢酸エチルにて残りを溶出させ、回収した。
回収画分をエバポレーター、濃縮乾固により酢酸エチルを蒸発させ、薄黄色の粘状質の１−グリセリルフェルラ酸を約２３０ｍｇ得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）：δ_Ｈ（ｉｎｔｅｇｒａｌ，ｍｕｌｔ．，ＪＨｚ）：３．５８（１Ｈ，ｄｄ，５．６，１１．２）、３．６２（１Ｈ，ｄｄ、５．４，１１．２）、３．８９（１Ｈ，ｍ）、３．８９（３Ｈ，ｓ）、４．１６（１Ｈ，ｄｄ，６．３，１１．５）、４．２６（１Ｈ，ｄｄ，４．４，１１．５）、６．３９（１Ｈ，ｄ，１５．９）、６．８０（１Ｈ，ｄ，８．１）、７．０７（１Ｈ，ｄｄ，２．０，８．１）、７．１９（１Ｈ，ｄ，２．０）、７．６５（１Ｈ，ｄ，１５．９）

１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を５０℃にインキュベートし、これにフルクトース、グルコース、キシロース、ガラクトース、またはアラビノースを飽和になるまで添加した。この溶液４８９μｌに１％フェルラ酸溶液（フェルラ酸をジメチルスルホキシドに溶解して調製）１０μｌおよびフェルラ酸エステラーゼ溶液（実施例１で得た精製酵素液）１μｌを添加し、５０℃で２０分間インキュベートした。反応液を１００℃５分間インキュベートして反応を停止させた。反応液をＨＰＬＣにて調べた結果、それぞれ対応するフェルラ酸配当体（フェルラ酸と糖類とのエステル）のピークを認めた。

１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）５０μｌにグリセロール４４９μｌを添加し、これに１％シナピン酸溶液（シナピン酸をジメチルスルホキシドに溶解して調製）１０μｌおよびフェルラ酸エステラーゼ溶液（実施例１で得た精製酵素液）１μｌを添加し、５０℃で１５分間インキュベートした。
反応液を１００℃で５分間インキュベートして反応を停止させ、反応液をＨＰＬＣに付した。その結果、グリセリルシナピン酸のピークを認めた（図１）。

シナピン酸の代わりにジメトキシ桂皮酸を用いる以外は、実施例４と同様に酵素反応を行った。反応液をＨＰＬＣに付すことにより、グリセリルジメトキシ桂皮酸のピークを認めた。

本発明は、医薬品や化粧品などの産業分野で利用される。

実施例４で得られた反応液のＨＰＬＣのチャートであり、保持時間４．６５６のピークがグリセリルシナピン酸のピークである。

Claims

一般式（ＩＩ）：

（ただし、環Ａは置換基を有していてもよいフェニル基を表す。）
で示されるフェルラ酸類化合物および一般式（ＩＩＩ）：

（ただし、Ｒは一価もしくは多価アルコールまたは糖類から１つの水酸基を除いた残基を表す。）
で示されるヒドロキシ化合物にフェルラ酸エステラーゼを作用させることを特徴とする一般式（Ｉ）：

（ただし、環ＡおよびＲは前記と同一意味を有する。）
で示されるフェルラ酸エステル類化合物の製造方法。
環Ａが低級アルコキシ基、低級アルキル基および水酸基から選ばれる置換基１〜３個を有していてもよいフェニル基である請求項１記載の製造方法。
低級アルキル基がメチル基である請求項２記載の製造方法。
環Ａが３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル基、３，４−ジメトキシフェニル基または３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル基である請求項１記載の製造方法。
化合物［ＩＩ］がフェルラ酸、シナピン酸またはジメトキシ桂皮酸である請求項１記載の製造方法。
ヒドロキシ化合物（ＩＩＩ）が、一価もしくは多価アルコールまたは糖類である請求項１記載の製造方法。
ヒドロキシ化合物（ＩＩＩ）がグリセロール、単糖類またはオリゴ糖である請求項６記載の製造方法、
単糖類がフルクトース、グルコース、キシロース、ガラクトースまたはアラビノースである請求項７記載の製造方法。
フェルラ酸類化合物（ＩＩ）がフェルラ酸であり、ヒドロキシ化合物（ＩＩＩ）がグリセロールである請求項１記載の製造方法。
フェルラ酸エステラーゼがアスペルギルス・ニガー起源である請求項１記載の製造方法。
フェルラ酸エステラーゼが、アスペルギルス・ニガーより得られるペクチナーゼ剤をさらに精製して得られる酵素であって、該酵素のＮ−末端アミノ酸配列が配列番号１の配列である請求項１記載の製造方法。