CN101437955B - 利用卤代醇脱卤酶从外消旋环氧化物和氰酸盐制备光学活性的5-取代的2-*唑烷酮的方法 - Google Patents
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Abstract
一种通过将式(1)的环氧化物与氰酸盐在卤代醇脱卤酶的存在下进行反应来制备高光学活性的式(2a)或(2b)的噁唑烷酮的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于制备高光学活性的噁唑烷酮的方法。
背景技术
Nakamura等人(Biochem.Biophys.Res.Comm.1991,180,1,124-130)描述了卤代醇氢卤裂解酶用于合成β-羟基腈的新的催化功能。
Spelberg等人(Tetrahedron Asymmetry2002,13,1083-1089)分析了来自放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)的卤代醇脱卤酶的生物催化潜能。
WO2005/017141公开了改良的卤代醇脱卤酶及相关的多核苷酸。
US2003/0124693A1公开了环氧化物的酶促转化。
WO01/90397公开了环氧化物与不同的亲核试剂经酶促转化为相应的醇。
发明详述
本发明提供了一种通过将式(1)的环氧化物与氰酸盐在卤代醇脱卤酶的存在下进行反应并且回收高光学活性的噁唑烷酮,以制备高光学活性的式(2a)或(2b)的噁唑烷酮的方法。
其中,R1和R2相互独立地选自氢、任选取代的烷基、芳基、芳烷基、链烯基、环烷基,条件是R1≠R2。
所用的酶是一种卤代醇脱卤酶。非常适合的卤代醇脱卤酶是具有如序列表(SEQ ED NO:1)所示的氨基酸序列的多肽或其同源物或其功能性衍生物。本发明中,术语“同源物”是指与和其同源的序列具有至少90%同源性的序列,优选至少90%相同的序列。功能性衍生物是经过了较小的衍生或修饰而总体上没有对其酶促和催化特性造成不利影响的多肽。可采用的酶的适当的例子是来自放射形土壤杆菌(CBS750.97)、分支杆菌菌株GP1(Poelarends等人,J.Bacteriol.1999,181,2050)或节杆菌菌株AD2(van den Wijngaard等人,J.Bacteriol.1991,124)的卤代醇脱卤酶。
采用提取自1997年5月7日保藏于皇家荷兰生物科技研究所培养物保藏中心(Centraal Bureau voor de Schimmelcultures)的保藏号为CBS750.97的放射形土壤杆菌菌株AD1(HheC)的卤代醇脱卤酶的得到了特别好的结果。在国际专利申请WO98/53081中对另一种从该微生物中得到的酶的环氧化物水解酶活性进行了大量的描述。
需要指出的是,根据本发明所使用的酶(卤代醇脱卤酶)应区别于环氧化物水解酶。在Archer发表于Tetrahedron1997,53,15617-15662的论文中,对后者进行了大量的描述。两种类型的酶所共有的唯一特点就是它们均能从放射形土壤杆菌菌株AD1中分离得到。Lutje Spelberg等发表的论文(Tetrahedron:Asymmetry1998,9,459-466)和欧洲专利申请EP0879890也涉及到环氧化物水解酶的应用。
通过本领域已知的方法,包括位点定向诱变以除去易变基团和改良对映体选择性、利用基因改组定向进化、点饱和突变、结构启发的随机诱变或易错聚合酶链反应可以改善卤代醇脱卤酶在操作条件下的活性、稳定性和对映体选择性。这些方法是在本领域已知的(Powell等人,ACIE2001,40,3948;Otten和Quax,Biomol.Eng.2005,22,1;Williams等人,Cell Mol.Life Sci.2004,61,3034)。正如近期通过构建增强了活性和对映体选择性的突变体(Tang等人,Biochemistry2005,44,6609;Tang等人,Biochemistry2003,42,14057)和改善了稳定性的突变体(Tang等人,Enz Microb Techn.2002,30,251)所显示的,这些诱变的方法适用于改进卤代醇脱卤酶的性能。
例如在WO2005/018579A2和WO2005/017141A1中公开了改进的卤代醇脱卤酶。引入的突变包括以Ser替代Cys。通过在SEQ ID NO:1的134位(Thr)引起突变,尤其是置换,如以Ala替代Thr,可以产生进一步改良的卤代醇脱卤酶。
此酶可以作为整个细胞、冻干的粗提物或纯化酶的形式加入。此酶可被固定于肉眼可见的载体如纤维素、葡聚糖凝胶或葡聚糖上。此酶也可作为交联酶晶体(CLEC′s)或包载于反胶束来应用。在典型的实验中,酶溶液是与含有亲核试剂和环氧化物的缓冲溶液混合在一起。可任选地将添加剂如巯基乙醇或甘油加入反应混合物中以稳定酶。
式(1)的环氧化物可由相应的酮采用硫内鎓盐处理而制备(Mosset,P.;Gree,R.,Syn.Comm.1985,15,749-757),或由过氧化羧酸如m-CPBA(间氯过苯甲酸)氧化烯而制备(Schwartz,N.N.;Blumbergs,J.H.,J.Org.Chem.1964,29,1976-1979)。
R1和R2基团相互独立地是氢、任选取代的芳香族或脂肪族基团,所述基团优选含有1至20个碳原子,更优选含有1至10个碳原子。优选地,R1和R2选自氢、任选取代的烷基、芳基、芳烷基、链烯基、环烷基和烷氧基。只有当R1与R2的化学结构不同时,通过本发明的方法可以制备高光学活性的式(2a)或(2b)叔噁唑烷酮。
优选的由R1或R2代表的烷基的实例包括含有1至15个碳原子的直链或支链烷基,如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基、己基、庚基或十二烷基。
更优选的基团是其中的R1和R2选自H、-(CH2)n-CH3(n=0至8)、-C6H5(苯基)、-(CH2)n-(C6H)5(芳烷基)、-C6H11(环己基)和CH2CO2R3,R3选自-CH3(甲基)、-C2H5(乙基)和-C(CH3)3(叔丁基)。
烷基可带有取代基如卤原子。烷基可带有取代基如羟基,例如缩水甘油。烷基可带有未取代或取代的氨基取代基,如氨基、甲基氨基或二甲氨基。由R1或R2代表的芳基的实例包括苯基和萘基。苯基的实例是在芳环上带有一个或多个取代基的氧化苯乙烯衍生物。环氧化物的典型实例是氧化苯乙烯、4-硝基氧化苯乙烯、2-硝基氧化苯乙烯、3-硝基氧化苯乙烯、3-氯氧化苯乙烯、4-氯氧化苯乙烯或2,3--二氯氧化苯乙烯。由R1或R2代表的芳烷基的实例包括苄基、2-苯乙基和1-萘基甲基。由R1或R2代表的链烯基的实例包括乙烯基、烯丙基和5-己烯基。由R1或R2代表的环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。由R1或R2代表的烷氧基的实例包括苯氧基、4-硝基苯氧基、萘氧基、甲氧基、己氧基和乙烯氧基。
在反应介质中,环氧化物(1)可以溶解了的形式存在,浓度为1至300mM,或以第二固相或液相的形式存在,浓度达到300mM。环氧化物本身可以是第二相或也可溶解在第二有机相中。这可以通过将环氧化物溶解于与水不混溶的有机溶剂如己烷或辛烷中实现。然后将得到的溶液与含酶的水相接触并将两相充分混合。采用第二相的优点是能够使在反应后分离环氧化物和醇简单化。通常,预期醇仍然溶解于水相中,环氧化物一般能从有机相中回收。优选地,将环氧化物在转化前先加入含水介质中,基于含水介质和环氧化物的组合重量,其优选以0.01至20wt.%的量存在。
反应优选在环氧化物(1)溶解于其中或作为第二固相或液相加入其中的缓冲含水介质中进行。适合的缓冲剂如Tris-缓冲剂(用H2SO4调至需要的pH值的2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇)、甘氨酸-缓冲剂(用NaOH调至需要pH值的甘氨酸)和磷酸盐缓冲剂或MOPS缓冲剂(用NaOH调至需要pH值的4-吗啉基丙磺酸)。优选采用的浓度是50至250mM。
根据需要可加入助溶剂以增加环氧化物(1)的溶解度,如二甲亚砜、四氢呋喃或乙腈。助溶剂可以5vol.%到50vol.%的量加入。增加助溶剂的百分比有利于环氧化物(1)的溶解。然而不利的是在较高助溶剂浓度时可能造成酶的失活。
介质优选的pH在3到12之间,更优选在6.5到8之间。反应进行的温度优选在0到60℃之间,更优选在20到30℃之间。
在本发明的方法中参加反应的氰酸盐优选以碱金属氰酸盐的形式加入,如氰酸钠或氰酸钾。
反应结束后,可采用有机溶剂萃取全部反应混合液,如乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷或甲苯。随后,通过如结晶(在固体物质的情况下)、分馏或快速色谱[如用硅胶60H,庚烷/乙酸乙酯(7:3)作为洗脱液]或本领域技术人员熟知的其他分离技术将不反应或反应很慢的环氧化物对映异构体与高光学活性的式(2a)或(2b)的噁唑烷酮分离。
环氧化物和噁唑烷酮(2a)或(2b)的对映体组成可通过手性气相色谱或手性HPLC确定。
分离得到的高旋光活性的环氧化物可用于进一步的合成步骤中,尤其是应用于与亲核试剂的开环反应,由此能够制备光学纯的取代叔醇。
通过下述非限制性实施例进一步阐明本发明。
实施例
实施例I
将250mMol外消旋2-乙基环氧乙烷(式1,R1=H;R2=Et)溶于500mMol Tris-SO4缓冲液(pH7.5)中,然后加入纯化的酶(1wt%卤代醇脱卤酶HheC在Tris缓冲液中的溶液)和125mMol NaOCN。将反应混合液在室温(24℃)下搅拌并通过气相色谱(GC)监测。24h后停止反应,加入乙酸乙酯萃取3次。合并得到的有机相,用Na2SO4干燥并蒸发。所得粗品经硅胶60H色谱分离,以戊烷/CH2Cl2(4:6)作为洗脱液,得到了5R-5-乙基噁烷烷-2-酮(产率35%,e.e.82%)。通过使用Chiraldex G-TA柱(30m×0.25mm×0.25μm)的GC确定其光学纯度。其NMR数据与合成的外消旋的参比物相同。
实施例II
将250mMol外消旋的2-乙基-2-甲基环氧乙烷(式1,R1=Me;R2=Et)溶于500mMol Tris-SO4缓冲液(pH7.5)中,然后加入纯化的酶(1wt%卤代醇脱卤酶HheC在Tris缓冲液中的溶液)和125mMol NaOCN。将反应混合液在室温(24℃)下搅拌并通过气相色谱监测。7h后停止反应,加入乙酸乙酯萃取3次。合并得到的有机相,用Na2SO4干燥并蒸发。所得粗品经硅胶60H色谱分离,以戊烷/CH2Cl2(4:6)作为洗脱液,得到了5R-5-乙基5-甲基噁唑烷-2-酮(产率40%,e.e.97%)。通过使用Chiraldex G-TA柱(30m×0.25mm×0.25μm)的GC确定其光学纯度。其NMR数据与合成的外消旋的参比物相同。
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