JP4843812B2 - 酵素を使用するラセミα−置換ヘテロ環式カルボン酸の光学分割方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、ラセミα−置換ヘテロ環式カルボン酸（以下、“α−ＨＣＣＡ”と称する。）を光学的分割する方法に関する。より特に、本発明は、エナンチオマー選択性の酵素触媒を使用してラセミα−ＨＣＣＡを光学的に分割する方法に関する。
【０００２】
２．従来技術の説明
光学異性体、Ｒ体およびＳ体に分類される、α−ＨＣＣＡの一種であるのテトラヒドロ−２−フル酸（以下、“ＴＨＦＡ”と称する。）は、化学における様々な用途を有する重要なキラルビルディングブロックである。光学異性体のなかで、Ｒ−（＋）−ＴＨＦＡはペネム型抗生物質の合成のための側鎖中間体として用いられ、一方、Ｓ−（−）−ＴＨＦＡは有機合成のためのキラル中間体として有用である。従って、ＴＨＦＡは、そのＲ体およびＳ体において使用用途が異なる。しかしながら、ＴＨＦＡは、化学的合成されたとき、ラセミ化合物の形態で得られるので、ＴＨＦＡをそのエナンチオマー、つまりＲおよびＳ体に分離する、さらなる作業が必要とされる。
【０００３】
光学分割が、ラセミＴＨＦＡをそのＲ体およびＳ体に分割するために通常使用されている。１９８３年に、ベランジャー（Belanger）は、分割剤としてのブルシンおよびエフェドリンの使用により、ＴＨＦＡラセミ体をそのエナンチオマーに首尾良く分割した（Can. J. Chem., 61, 1383 (1983)）。しかしながら、該分割剤は、それが非常に高価であるため、経済的でない。この方法の他の問題は、その生成物がエナンチオマー過剰値において低いことである。
【０００４】
日本国特開平１−２１６９８３号公報は、分割剤としてのキラルアミン（１−（４−ハロゲノフェニル）エチルアミン）の使用を開示し、ジアステレオマー塩が、Ｒ，Ｓ−ＴＨＦＡから生成され、そして光学分割される。この方法もまたキラルアミンの高価により経済的に好ましくない。さらに、初期反応において添加されるＲ，Ｓ−ＴＨＦＡの量が低くとも４ｍｍｏｌの量に限定されているので、低い生成収率のみが得られる。さらに、最終的に得られるキラルＴＨＦＡはエナンチオマー過剰値において乏しい。
【０００５】
光学分割方法とは異なる方法は、日本国特開平８−７１５７６号公報に見出され、これはＲ−またはＳ−ＴＨＦＡ塩をハロゲン化水素で処理することによりＲ−またはＳ−ＴＨＦＡを合成することに関する。
【０００６】
酵素が存在する二つのエナンチオマーの一方をエナンチオマー選択的に加水分解するのを触媒するので、ラセミ体の光学分割が、エステラーゼ、リパーゼおよびプロテアーゼのような酵素の使用により達成されることが時々良く知られている。例えば、米国特許第５，９２８，９３３号は、プロテアーゼ、リパーゼおよびエステラーゼを含む４４種の酵素の反応特異性についての膨大な実験の結果として、９５％のエナンチオマー過剰を有する１種の酵素を開示している。この酵素触媒は、エナンチオマーラセミ体の分離について非常に有用であるが、エナンチオマーについての選択性および生成物の光学純度が酵素の選択およびその基材の化学構造に依存して変化し得るので、基材に適した酵素の組み合わせ見出すために集中的な努力が要求される。特に、酵素を使用するα−ＨＣＣＡの光学分割方法はどこにも見出せなかった。
【０００７】
従って、ラセミα−ＨＣＣＡをＲ−およびＳ体に経済的かつ容易に分割できる酵素的光学分割についての要望が残っている。
【０００８】
発明の要約
本発明を導くために、経済的な方法により高い光学純度のα−ＨＣＣＡを得る目的で、本発明者等により行われたα−ＨＣＣＡの光学分割についての集中的かつ全体にわたる調査は、ある種の微生物または動物由来の加水分解酵素が、α−ＨＣＣＡの特定の光学異性体のエステル官能基を高効率でエナンチオマー選択的に加水分解し得る発見を生み出した。
【０００９】
従って、本発明の目的は、従来技術で遭遇した上記問題点を解決し、そして酵素を使用して、ラセミα−ＨＣＣＡを光学分割する、経済的に好ましい方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の一つの観点において、ラセミα−ＨＣＣＡの光学分割方法であって、
ラセミα−ＨＣＣＡをアルコールと反応させて、下記化学式１
【化３】
［式中、Ｒ1は、１ないし６個の炭素原子を含む置換または未置換のアルキル基またはアルケニル基、ベンジル基、３ないし６個の炭素原子を含むシクロアルキル基、置換または未置換のアリールアルキル基、および置換または未置換のヘテロアリールアルキル基からなる群より選択され、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮを表し、そしてｎは、１ないし３の整数を表す。］で表されるラセミα−ＨＣＣＡエステルを得る工程と、
式１で表されるラセミ体を、エナンチオマー選択性を有する酵素の使用により光学分割して、該エステルラセミ体のＲ体またはＳ体のいずれかを加水分解し、それにより、α−ＨＣＣＡのＲ体またはＳ体およびα−ＨＣＣＡエステルの反対のエナンチオマー形態を生成する工程であって、該酵素は粉末または水溶液として存在する工程と、
加水分解されていないα−ＨＣＣＡを有機溶媒で抽出する工程と、
抽出されたα−置換ヘテロ環式カルボン酸エステルに、有機溶媒中、一定水素分圧下、一定温度にて、炭素上のパラジウム触媒（Ｐｄ／Ｃ）の存在下での水素化を受けさせる工程
からなる方法を提供する。
【００１１】
本発明の他の観点において、ラセミα−ＨＣＣＡの光学分割方法であって、
ラセミα−ＨＣＣＡをアルコールと反応させて、化学式１で表されるラセミα−ＨＣＣＡエステルを得る工程と、
式１で表されるラセミ体を、エナンチオマー選択性を有する酵素の使用により光学分割して、該エステルラセミ体のＲ体またはＳ体のいずれかを加水分解し、それにより、α−ＨＣＣＡのＲ体またはＳ体およびα−ＨＣＣＡエステルの反対のエナンチオマー形態を生成する工程であって、該酵素は粉末または水溶液として存在する工程と、
加水分解されていないα−ＨＣＣＡエステルを有機溶媒で抽出する工程と、
抽出されたα−ＨＣＣＡエステルを、非エナンチオマー選択的酵素を用いて、水溶液中で、一定のｐＨおよび温度で処理する工程であって、該酵素は粉末または水溶液として存在する工程
からなる方法を提供する。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、酵素によるラセミα−ＨＣＣＡのエステルのエナンチオマー選択的加水分解により、α−ＨＣＣＡのあるエナンチオマー形態およびα−ＨＣＣＡのエステルの反対のエナンチオマー形態を同時に生成することにより特徴付けられる。加水分解されたα−ＨＣＣＡおよびα−ＨＣＣＡの残存エステルの分離は、有機溶媒の使用により達成されることができる。加水分解されていないα−ＨＣＣＡエステルのエナンチオマー形態は、非エナンチオマー選択的酵素の存在下で加水分解されるか、または炭素上のパラジウム触媒（Ｐｄ／Ｃ）の存在下で水素化されて、それに対応するα−ＨＣＣＡを得ることができる。
【００１３】
詳細には、α−ＨＣＣＡのラセミ混合物は、同量でアルコールと反応させられて、α−ＨＣＣＡエステルのラセミ混合物を生成し、その後、一定の温度およびｐＨ、水溶液中、エナンチオマー選択性を有する酵素の存在下で、エナンチオマー選択的に加水分解される。結果として、反応は、α−ＨＣＣＡのＲ−またはＳ体を、加水分解されたα−ＨＣＣＡのものとは反対のエナンチオマー形態を有するα−ＨＣＣＡのエステルと共に生成する。エナンチオマー選択的加水分解の完了後、有機溶媒の添加は、その中にα−ＨＣＣＡのエステルを抽出し、α−ＨＣＣＡのみが水溶液中に残留する。該有機相の除去は、光学的に純粋なα−ＨＣＣＡエステルのＳ−またはＲ体を獲得となる。水溶液中に残存する光学活性に乏しいα−ＨＣＣＡは、例えばカラムを使用する精製作業を通して純度が増加されるか、または本発明の開始材料として再使用され得る。
【００１４】
本発明の好ましい実施例に従うと、α−ＨＣＣＡに属するＴＨＦＡが開始材料として使用され、そして光学分割後、ＴＨＦＡのＲ−またはＳ−体が高いエナンチオマー過剰で得られることができる。ＴＨＦＡ以外に、α−ＨＣＣＡの範囲に属する全ての材料、例えばプロリンおよびテトラヒドロチオペン−２−カルボン酸は、本発明にしたがって光学分割されることができる。
【００１５】
本発明に有用なのは、線状または分岐した炭素原子数１ないし６のアルコール、芳香族アルコール、炭素原子数３ないし６のシクロアルキルアルコール、置換または未置換のアリールアルキルアルコール、および置換または未置換のヘテロアリールアルキルアルコールである。好ましいのは、反応時間および光学純度を考慮したとき、４個またはそれ以上の炭素原子を含む線状アルコールまたは芳香族アルコールである。
【００１６】
ラセミα−ＨＣＣＡエステルの光学分割にける使用のために、酵素はラセミ体の特定の異性体のエステル官能基をエナンチオマー選択的に加水分解しなければならない。好ましくは、該酵素は、微生物または動物から誘導されたリパーゼ、プロテアーゼおよびエステラーゼからなる群より選択される。酵素および基材の化学構造に依存して、加水分解されたα−ＨＣＣＡの立体配置が決定される。同様に、エナンチオマーの選択性および生成物のエナンチオマー過剰値も、酵素および基材に依存する。使用されるとき、そのようなエナンチオマー選択的酵素は、粉末または水溶液の形態で使用され得る。酵素は好ましくは、α−ＨＣＣＡエステル１００重量部に基いて０．１ないし１００重量部の量で使用される。例えば、酵素が０．１重量部より少ない量で使用される場合、加水分解は、完了するのに膨大な時間を要するかもしれない。他方、１００重量部を超える酵素量は生成費用を増加する。
【００１７】
酵素反応は最適には、０ないし６０℃およびｐＨ４ないし１２で行われる。残存するエナンチオマー性α−ＨＣＣＡエステルを抽出する有機溶媒については、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、トルエンおよびそれらの混合物からなる群より選択されることが好ましい。
【００１８】
生成されたエナンチオマー性α−ＨＣＣＡエステルの、α−ＨＣＣＡの対応する立体配置への還元については、本発明に従い、α−ＨＣＣＡエステルの光学的に純粋なＳ−またはＲ体を、高いエナンチオマー過剰（＞９９％）を有するα−ＨＣＣＡの対応する立体配置に変換する二つの方法が与えられる。
【００１９】
第一に、有機溶媒中の回収されたＳ−またはＲ体のα−ＨＣＣＡの溶液に、炭素上のパラジウム触媒（Ｐｄ／Ｃ）の存在下、一定水素分圧下、一定温度での水素化を受けさせる。
【００２０】
これに関して、パラジウム触媒は好ましくは、０．１〜３０重量％の量、またより好ましくは０．５〜１０重量％の量で使用される。例えば、０．１重量％未満の量は加水分解を行うのに不十分である。他方、３０重量％を超える量は生成費用に悪影響を有する。エナンチオマー性α−ＨＣＣＡエステルの触媒加水分解は好ましくは、１ないし１０ｂａｒ、またより好ましくは１〜５ｂａｒの水素分圧で行われる。例えば、１ｂａｒ未満の水素分圧で行われるとき、加水分解は効率において顯著に低下する。他方、１０ｂａｒを超える水素分圧は、多くの副産物の形成を生じる。他の条件は、１ないし２０時間、また好ましくは１ないし８時間の反応時間、および０ないし７０℃、また好ましくは２０ないし４０℃の反応温度で設定される。
【００２１】
ＴＨＦＡエステルのうち、ＴＨＦＡベンジルエステルは、ＴＨＦＡをそれから非常に容易に回収されるようにすることができる。例えば、有機溶媒中のＴＨＦＡベンジルエステルの溶液は、一定温度、一定水素分圧下で水素化されて、ＴＨＦＡおよびトルエンを生成し、そして単純な真空蒸留はトルエンを除去し、ＴＨＦＡのみを残存させる。
【００２２】
もう一つの方法は、一定のｐＨおよび温度の維持で、α−ＨＣＣＡエステルの回収された光学異性体のエステル官能基を非エナンチオマー選択的に加水分解できる酵素を用いることである。非エナンチオマーマ選択的加水分解において使用されるとき、酵素は粉末または水溶液の形態であり得る。
【００２３】
酵素加水分解の完了後、水性相が収集され、そしてＨＣｌでｐＨを２〜３に調整される。有機溶媒での酸性化された水性相を数回の抽出は、非常に純粋なα−ＨＣＣＡのＳ−またはＲ体を生じる。
【００２４】
本発明のより良好な理解は、説明して示すが、本発明を制限すると解釈されない以下の実施例を参照して与えられ得る。
【００２５】
実施例１
ＴＨＦＡエチルエステルについて特異性を有する酵素の選別
良く混合した後、０．１モルのＴＨＦＡおよび０．３モルのエチルアルコールを、７０℃で１時間、０．１５モルのチオニルクロライドの存在下で反応させてＴＨＦＡエチルエステルを生成した。
５００μｌの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、それぞれ１％および０．１％の量で、ＴＨＦＡエチルエステルおよび加水分解酵素を添加し、そして生じた反応物を３０℃で３０時間培養した。加水分解の完了後、５０μｌの反応物を同量の１Ｎ・ＨＣｌと良く混合し、そして２００μｌの酢酸エチルを添加して残存する物質を抽出した。抽出物を、ＨＰ−５カラム、８０ないし２００℃の温度でのガスクロマトグラフィーにより、および分析し、β−デキストリンＧＣ、１１０ないし２００℃の温度範囲でのキラルガスクロマトグラフィーにより分析した。
分析結果を以下の表１にまとめる。表１に見られるように、残存α−ＨＣＣＡエチルエステルは、酵素のエナンチオマー選択性に依存して、Ｒ体、S体またはラセミ体のいずれかとして存在した。従って、ＴＨＦＡエチルエステルの異なるエナンチオマーが酵素の選択に従い生成されることができることが確認された。
【００２６】
【表１】
1 ｅｅ％＝（Ｒ−Ｓ）／（Ｒ＋Ｓ）×１００［式中、ＲおよびＳは、それぞれＲ体およびとＳ体のエナンチオマーの全モル濃度を表す。］
【００２７】
実施例２
ＴＨＦＡブチルエステルについて特異性を有する酵素の選別
０．１モルのＴＨＦＡを、０．１モルのブチルアルコールと、１２０℃で４時間、０．１５モルのトルエン中、１×１０-4モルのｐ−トルエンスルホン酸の存在下で反応させて、ＴＨＦＡブチルエステルを生成した。
５００μｌの５０ｍＭ燐酸溶液（ｐＨ７．０）に、それぞれ１％および０．１％の量で、ＴＨＦＡエチルエステルおよび加水分解酵素を添加し、次いで３０℃で１６時間培養した。加水分解の完了後、実施例１と同じ方法において基質を抽出および分析した。
分析結果を以下の表２にまとめる。表２のデータから明らかなように、残存α−ＨＣＣＡエチルエステルは、酵素のエナンチオマー選択性に依存して、Ｒ体、S体またはラセミ体のいずれかとして存在した。従って、ＴＨＦＡエチルエステルの異なるエナンチオマーが酵素の選択に従い生成されることができることが確認された。
【００２８】
【表２】
1 ｅｅ％＝（Ｒ−Ｓ）／（Ｒ＋Ｓ）×１００［式中、ＲおよびＳは、それぞれＲ体およびとＳ体のエナンチオマーの全モル濃度を表す。］
【００２９】
実施例３
ＴＨＦＡベンジルエステルについて特異性を有する酵素の選別
ＴＨＦＡベンジルエステルを、ベンジルアルコールを使用することを除いて、実施例１のものと同様な方法において生成した。
５００μｌの５０ｍＭ燐酸溶液（ｐＨ７．０）に、それぞれ１％および０．１％の量で、ＴＨＦＡベンジルエステルおよび加水分解酵素を添加し、そして生じた反応物を３０℃で１６時間培養した。加水分解の完了後、実施例１と同じ方法において基質を抽出および分析した。
分析結果を以下の表３にまとめる。表２のデータから明らかなように、残存α−ＨＣＣＡベンジルエステルは、酵素のエナンチオマー選択性に依存して、Ｒ体、S体またはラセミ体のいずれかとして存在した。従って、ＴＨＦＡエチルエステルの異なるエナンチオマーが酵素の選択に従い生成されることができることが確認された。
【００３０】
【表３】
1 ｅｅ％＝（Ｒ−Ｓ）／（Ｒ＋Ｓ）×１００［式中、ＲおよびＳは、それぞれＲ体およびとＳ体のエナンチオマーの全モル濃度を表す。］
【００３１】
実施例４
有機溶媒を使用するＴＨＦＡエステルおよびＴＨＦＡの分離
ラセミＴＨＦＡエステルを酵素によりエナンチオマー選択的に加水分解し、そして有機溶媒を酵素反応物に添加して、以下のように未加水分解で残存している基質の対応するＳ−またはＲ体から反応生成物のＲ−またはＳ体を分離した。
Ｒ、Ｓ−ＴＨＦＡブチルエステルおよびバシラス・リケニホルミスプロテアーゼを、１リットルの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、それぞれ２％および１％の量で添加し、そして生じた反応物を３０℃で４時間、ｐＨ７．０の条件下で培養した。加水分解反応の完了後、基質を実施例１と同じ方法で抽出および分析した。
残存する反応液に５００ｍｌの酢酸エチルを添加し、そして良く混合し、次いで相分離により有機層を回収した。水層を５００ｍｌの酢酸エチルで再度抽出し、そして得た酢酸エチル層を注いだ。この注いだ有機層を５ｇの硫酸ナトリウム上で乾燥した。真空蒸留は酢酸エチルを除去し、９．６ｇのＳ−ＴＨＦＡブチルエステルが残存し、そのエナンチオマー過剰において９９．４％であると測定した。水層中に残存するＴＨＦＡを、７０％のエナンチオマー過剰であるＲ体であると同定された。
【００３２】
実施例５ないし１３
酵素：基質の比率、温度、およびｐＨによるエナンチオマー過剰における変化
Ｒ、Ｓ−ＴＨＦＡブチルエステルの濃度を８重量％で固定し、酵素：基質の比率、反応温度、およびｐＨを変化させたことを除いて、実施例４でと同じ方法で行った。結果を以下の表４に与える。
【表４】
【００３３】
実施例１４
バシラス・リケニホルミスプロテアーゼを使用するブチルエステルの光学分割
４００ｍｌの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ９．０）に、１２重量％のＲ、Ｓ−ＴＨＦＡブチルエステルおよび１重量％のバシラス・リケニホルミスプロテアーゼを添加し、そして生じた反応物を、３０℃で１０．５時間、ｐＨ９．０の維持で培養した。加水分解の完了の後、基質を実施例１と同じ方法で抽出および分析した。
２００ｍｌの酢酸エチルを使用し、２１ｇのＳ−ＴＨＦＡブチルエステルを実施例４と同じ方法で入手し、そして分析して、エナンチオマー過剰において９９．３％であった。水溶相中に残存するＴＨＦＡは６０％のエナンチオマー過剰であると同定した。
【００３４】
実施例１５
バシラス・リケニホルミスプロテアーゼを使用するブチルエステルの光学分割
２００ｍｌの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加水分解のために２０℃で使用し、そして１００ｍｌの酢酸エチルを基質分離のために添加したことを除いて、１２ｇのＳ−ＴＨＦＡを実施例１４のものと同様な方法で生成し、そしてその光学純度はエナンチオマー過剰において９９．３％であると測定した。
【００３５】
実施例１６
バシラス・リケニホルミスプロテアーゼを使用するブチルエステルの光学分割
加水分解を１０℃で１９時間行ったことを除き、２１ｇのＳ−ＴＨＦＡブチルエステルを実施例１４のものと同様な方法で生成し、そしてその光学純度はエナンチオマー過剰において９９．１％であると測定した。
【００３６】
実施例１７
バシラス・リケニホルミスプロテアーゼを使用するブチルエステルの光学分割
加水分解を２０℃で２６時間、２００ｍｌの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ９．０）中の１５重量％のＲ、Ｓ−ＴＨＦＡブチルエステルで行い、そして１００ｍｌの酢酸エチルを基質分離のために添加したことを除き、２５．７ｇのＳ−ＴＨＦＡブチルエステルを実施例１４のものと同様な方法で生成し、そしてその光学純度はエナンチオマー過剰において９９．８％であると測定した。
【００３７】
実施例１８ないし２２
バシラス・リケニホルミスプロテアーゼを使用するブチルエステルの光学分割
Ｒ、Ｓ−ＴＨＦＡブチルエステルの濃度および酵素と基質との比率を以下の表５に与えるような条件に従い変化させつつ、Ｓ−ＴＨＦＡブチルエステルを実施例１７においてと同じ条件下で生成した。分析結果を表５に与える。
【表５】
【００３８】
実施例２３
ＴＨＦＡの光学分割
ベンジルエステルラセミ体を実施例３でと同じ方法で生成した。２００ｍｌの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ９．０）に、１２重量％の生成したＲ、Ｓ−ＴＨＦＡベンジルエステルおよび１重量％のバシラス・リケニホルミスプロテアーゼを添加し、そして生じた反応液を、２０℃で４．５時間、ｐＨ９．０の維持で培養した。加水分解の完了後、反応物を実施例１でのように分析した。残存する反応物に１００ｍｌの酢酸エチルを添加し、そして良く混合し、その後、１６ｇのＳ−ＴＨＦＡベンジルエステルを実施例１４でと同じ方法で入手し、そしてエナンチオマー過剰において９９．１％であると同定した。
２０ｍｌの酢酸エチル中に、５５ｇの得られたＳ−ＴＨＦＡベンジルエステルを溶解し、そして５５ｍｇ（１重量％）の１０％パラジウム触媒（Ｐｄ／Ｃ）を添加し、次いで該溶液を室温で１０分間撹拌した。水素ガスを反応物に１．５ｂａｒの水素分圧まで少しづつ供給して、その時点で撹拌を１０時間行った。濾過によるパラジウム触媒の除去後、酢酸エチルおよび生成したトルエンの真空蒸留は、２．５ｇのＳ−ＴＨＦＡを与えた。このエナンチオマー化合物は、キラルＧＣにより測定したところエナンチオマー過剰において９９．１％であることが判明した。
【００３９】
実施例２４
Ｓ−ＴＨＦＡブチルエステルからのＳ−ＴＨＦＡの生成
強酸および強塩基を使用せずとも異性体を生成せずに、実施例２においてＲ、Ｓ−ＴＨＦＡブチルエステルを非選択的に加水分解することが示されたカンジダ・アンタルシチカＢ画分リパーゼの存在下で、Ｓ−体ＴＨＦＡブチルエステルをＳ−ＴＨＦＡに加水分解した。
３００ｍｌの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、１重量％のＳ−ＴＨＦＡブチルエステルおよび０．１重量％のカンジダ・アンタルシチカＢ画分リパーゼを添加し、そして生じた反応物を３０℃で１時間培養した。加水分解の完了後、基質を実施例１でと同じ方法で抽出および分析した。
ＧＣ分析は、全てのＳ−ＴＨＦＡブチルエステルのＴＨＦＡへの加水分解を確認し、キラルＧＣにより測定したところエナンチオマー過剰において９９．８％であることが判明した。
【００４０】
実施例２５ないし３３
Ｓ−ＴＨＦＡブチルエステルからのＳ−ＴＨＦＡの生成
実施例２４の手順を異なる酵素を使用して行い、そして結果を以下の表６に与える。
【表６】
【００４１】
実施例３４
ＴＨＦＡの光学分割
２００ｍｌの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ９．０）に、１２重量％のＲ、Ｓ−ＴＨＦＡブチルエステルおよび１重量％のバシラス・リケニホルミスプロテアーゼを添加し、そして生じた反応物を、２０℃で１０．５時間、ｐＨ９．０の維持で培養した。加水分解後、反応物を実施例１でのように分析した。残存する反応物に１００ｍｌの酢酸エチルを添加し、そして良く混合した後、１２ｇのＳ−ＴＨＦＡブチルエステルを実施例１４でと同じ方法で入手し、そしてエナンチオマー過剰において９９．３％であると同定した。
１００ｍｌの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で、１２ｇの生成したＳ−ＴＨＦＡブチルエステルを、３０℃で５時間、１ｇのカンジダ・アンタルシチカＢ画分リパーゼの存在下、ｐＨ７．０の維持で加水分解した。加水分解に続き、反応結果物を実施例１のように分析した。残存する反応物をＨＣｌでｐＨ２．０に調節し、次いで３倍体積の酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル抽出物を注いだ後、６ｇのＳ−ＴＨＦＡを実施例１４でと同じ方法で注ぎ入れたものから回収した。該化合物は、キラルＧＣにより測定したところ、エナンチオマー過剰において９９．３％であることが判明した。
【００４２】
実施例３５
ＴＨＦＡの大規模光学分割
２リットルの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ９．０）を、４０重量％のＲ、Ｓ−ＴＨＦＡブチルエステルおよび３重量％のバシラス・リケニホルミスプロテアーゼを添加し、そして生じた反応物を、２０℃で２３時間、ｐＨ９．０の維持で反応させた。加水分解後、反応物を実施例１のように分析した。残存する反応物に１リットルの酢酸エチルを添加し、そして良く混合した後、４００ｇのＳ−体ＴＨＦＡブチルエステルを実施例１４でと同じ方法で入手し、そしてエナンチオマー過剰において９９．３％であると同定した。
４００ｍｌの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で、１６０ｇの生成したＳ−ＴＨＦＡブチルエステルを、３０℃で６時間、８ｇのカンジダ・アンタルシチカＢ画分リパーゼの存在下、ｐＨ７．０の維持で加水分解した。加水分解に続いて、反応結果物を実施例１のように分析した。残存する反応物をＨＣｌでｐＨ２．０に調節し、次いで３倍体積の酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル抽出物を注いだ後、８０ｇのＳ−ＴＨＦＡを実施例１４でと同じ方法で回収した。該化合物は、キラルＧＣにより測定したところ、エナンチオマー過剰において９９．３％であることが判明した。
【００４３】
以上説明したように、ラセミ混合物のα−ＨＣＣＡは、本発明に従い高い光学純度、高い収率で光学分割されることができる。加えて、本発明は、このようなキラル化合物が低費用で生成されることができるので、経済的に好ましい。
【００４４】
本発明を例示して説明し、そして使用された用語は制限ではなく説明するものであることを意図していることを理解すべきである。本発明の多くの改良および変更が上記の教示に関して可能である。従って、添付した請求項の範囲内で、本発明は特別に記載した以外でも行われ得ることが理解されるべきである。
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、ラセミα−置換ヘテロ環式カルボン酸（以下、“α−ＨＣＣＡ”と称する。）を光学的分割する方法に関する。より特に、本発明は、エナンチオマー選択性の酵素触媒を使用してラセミα−ＨＣＣＡを光学的に分割する方法に関する。
【０００２】
２．従来技術の説明
光学異性体、Ｒ体およびＳ体に分類される、α−ＨＣＣＡの一種であるのテトラヒドロ−２−フル酸（以下、“ＴＨＦＡ”と称する。）は、化学における様々な用途を有する重要なキラルビルディングブロックである。光学異性体のなかで、Ｒ−（＋）−ＴＨＦＡはペネム型抗生物質の合成のための側鎖中間体として用いられ、一方、Ｓ−（−）−ＴＨＦＡは有機合成のためのキラル中間体として有用である。従って、ＴＨＦＡは、そのＲ体およびＳ体において使用用途が異なる。しかしながら、ＴＨＦＡは、化学的合成されたとき、ラセミ化合物の形態で得られるので、ＴＨＦＡをそのエナンチオマー、つまりＲおよびＳ体に分離する、さらなる作業が必要とされる。
【０００３】
光学分割が、ラセミＴＨＦＡをそのＲ体およびＳ体に分割するために通常使用されている。１９８３年に、ベランジャー（Belanger）は、分割剤としてのブルシンおよびエフェドリンの使用により、ＴＨＦＡラセミ体をそのエナンチオマーに首尾良く分割した（Can. J. Chem., 61, 1383 (1983)）。しかしながら、該分割剤は、それが非常に高価であるため、経済的でない。この方法の他の問題は、その生成物がエナンチオマー過剰値において低いことである。
【０００４】
日本国特開平１−２１６９８３号公報は、分割剤としてのキラルアミン（１−（４−ハロゲノフェニル）エチルアミン）の使用を開示し、ジアステレオマー塩が、Ｒ，Ｓ−ＴＨＦＡから生成され、そして光学分割される。この方法もまたキラルアミンの高価により経済的に好ましくない。さらに、初期反応において添加されるＲ，Ｓ−ＴＨＦＡの量が低くとも４ｍｍｏｌの量に限定されているので、低い生成収率のみが得られる。さらに、最終的に得られるキラルＴＨＦＡはエナンチオマー過剰値において乏しい。
【０００５】
光学分割方法とは異なる方法は、日本国特開平８−７１５７６号公報に見出され、これはＲ−またはＳ−ＴＨＦＡ塩をハロゲン化水素で処理することによりＲ−またはＳ−ＴＨＦＡを合成することに関する。
【０００６】
酵素が存在する二つのエナンチオマーの一方をエナンチオマー選択的に加水分解するのを触媒するので、ラセミ体の光学分割が、エステラーゼ、リパーゼおよびプロテアーゼのような酵素の使用により達成されることが時々良く知られている。例えば、米国特許第５，９２８，９３３号は、プロテアーゼ、リパーゼおよびエステラーゼを含む４４種の酵素の反応特異性についての膨大な実験の結果として、９５％のエナンチオマー過剰を有する１種の酵素を開示している。この酵素触媒は、エナンチオマーラセミ体の分離について非常に有用であるが、エナンチオマーについての選択性および生成物の光学純度が酵素の選択およびその基材の化学構造に依存して変化し得るので、基材に適した酵素の組み合わせ見出すために集中的な努力が要求される。特に、酵素を使用するα−ＨＣＣＡの光学分割方法はどこにも見出せなかった。
【０００７】
従って、ラセミα−ＨＣＣＡをＲ−およびＳ体に経済的かつ容易に分割できる酵素的光学分割についての要望が残っている。
【０００８】
発明の要約
本発明を導くために、経済的な方法により高い光学純度のα−ＨＣＣＡを得る目的で、本発明者等により行われたα−ＨＣＣＡの光学分割についての集中的かつ全体にわたる調査は、ある種の微生物または動物由来の加水分解酵素が、α−ＨＣＣＡの特定の光学異性体のエステル官能基を高効率でエナンチオマー選択的に加水分解し得る発見を生み出した。
【０００９】
従って、本発明の目的は、従来技術で遭遇した上記問題点を解決し、そして酵素を使用して、ラセミα−ＨＣＣＡを光学分割する、経済的に好ましい方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の一つの観点において、ラセミα−ＨＣＣＡの光学分割方法であって、
ラセミα−ＨＣＣＡをアルコールと反応させて、下記化学式１
【化３】
式１で表されるラセミ体を、エナンチオマー選択性を有する酵素の使用により光学分割して、該エステルラセミ体のＲ体またはＳ体のいずれかを加水分解し、それにより、α−ＨＣＣＡのＲ体またはＳ体およびα−ＨＣＣＡエステルの反対のエナンチオマー形態を生成する工程であって、該酵素は粉末または水溶液として存在する工程と、
加水分解されていないα−ＨＣＣＡを有機溶媒で抽出する工程と、
抽出されたα−置換ヘテロ環式カルボン酸エステルに、有機溶媒中、一定水素分圧下、一定温度にて、炭素上のパラジウム触媒（Ｐｄ／Ｃ）の存在下での水素化を受けさせる工程
からなる方法を提供する。
【００１１】
本発明の他の観点において、ラセミα−ＨＣＣＡの光学分割方法であって、
ラセミα−ＨＣＣＡをアルコールと反応させて、化学式１で表されるラセミα−ＨＣＣＡエステルを得る工程と、
式１で表されるラセミ体を、エナンチオマー選択性を有する酵素の使用により光学分割して、該エステルラセミ体のＲ体またはＳ体のいずれかを加水分解し、それにより、α−ＨＣＣＡのＲ体またはＳ体およびα−ＨＣＣＡエステルの反対のエナンチオマー形態を生成する工程であって、該酵素は粉末または水溶液として存在する工程と、
加水分解されていないα−ＨＣＣＡエステルを有機溶媒で抽出する工程と、
抽出されたα−ＨＣＣＡエステルを、非エナンチオマー選択的酵素を用いて、水溶液中で、一定のｐＨおよび温度で処理する工程であって、該酵素は粉末または水溶液として存在する工程
からなる方法を提供する。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、酵素によるラセミα−ＨＣＣＡのエステルのエナンチオマー選択的加水分解により、α−ＨＣＣＡのあるエナンチオマー形態およびα−ＨＣＣＡのエステルの反対のエナンチオマー形態を同時に生成することにより特徴付けられる。加水分解されたα−ＨＣＣＡおよびα−ＨＣＣＡの残存エステルの分離は、有機溶媒の使用により達成されることができる。加水分解されていないα−ＨＣＣＡエステルのエナンチオマー形態は、非エナンチオマー選択的酵素の存在下で加水分解されるか、または炭素上のパラジウム触媒（Ｐｄ／Ｃ）の存在下で水素化されて、それに対応するα−ＨＣＣＡを得ることができる。
【００１３】
詳細には、α−ＨＣＣＡのラセミ混合物は、同量でアルコールと反応させられて、α−ＨＣＣＡエステルのラセミ混合物を生成し、その後、一定の温度およびｐＨ、水溶液中、エナンチオマー選択性を有する酵素の存在下で、エナンチオマー選択的に加水分解される。結果として、反応は、α−ＨＣＣＡのＲ−またはＳ体を、加水分解されたα−ＨＣＣＡのものとは反対のエナンチオマー形態を有するα−ＨＣＣＡのエステルと共に生成する。エナンチオマー選択的加水分解の完了後、有機溶媒の添加は、その中にα−ＨＣＣＡのエステルを抽出し、α−ＨＣＣＡのみが水溶液中に残留する。該有機相の除去は、光学的に純粋なα−ＨＣＣＡエステルのＳ−またはＲ体を獲得となる。水溶液中に残存する光学活性に乏しいα−ＨＣＣＡは、例えばカラムを使用する精製作業を通して純度が増加されるか、または本発明の開始材料として再使用され得る。
【００１４】
本発明の好ましい実施例に従うと、α−ＨＣＣＡに属するＴＨＦＡが開始材料として使用され、そして光学分割後、ＴＨＦＡのＲ−またはＳ−体が高いエナンチオマー過剰で得られることができる。ＴＨＦＡ以外に、α−ＨＣＣＡの範囲に属する全ての材料、例えばプロリンおよびテトラヒドロチオペン−２−カルボン酸は、本発明にしたがって光学分割されることができる。
【００１５】
本発明に有用なのは、線状または分岐した炭素原子数１ないし６のアルコール、芳香族アルコール、炭素原子数３ないし６のシクロアルキルアルコール、置換または未置換のアリールアルキルアルコール、および置換または未置換のヘテロアリールアルキルアルコールである。好ましいのは、反応時間および光学純度を考慮したとき、４個またはそれ以上の炭素原子を含む線状アルコールまたは芳香族アルコールである。
【００１６】
ラセミα−ＨＣＣＡエステルの光学分割にける使用のために、酵素はラセミ体の特定の異性体のエステル官能基をエナンチオマー選択的に加水分解しなければならない。好ましくは、該酵素は、微生物または動物から誘導されたリパーゼ、プロテアーゼおよびエステラーゼからなる群より選択される。酵素および基材の化学構造に依存して、加水分解されたα−ＨＣＣＡの立体配置が決定される。同様に、エナンチオマーの選択性および生成物のエナンチオマー過剰値も、酵素および基材に依存する。使用されるとき、そのようなエナンチオマー選択的酵素は、粉末または水溶液の形態で使用され得る。酵素は好ましくは、α−ＨＣＣＡエステル１００重量部に基いて０．１ないし１００重量部の量で使用される。例えば、酵素が０．１重量部より少ない量で使用される場合、加水分解は、完了するのに膨大な時間を要するかもしれない。他方、１００重量部を超える酵素量は生成費用を増加する。
【００１７】
酵素反応は最適には、０ないし６０℃およびｐＨ４ないし１２で行われる。残存するエナンチオマー性α−ＨＣＣＡエステルを抽出する有機溶媒については、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、トルエンおよびそれらの混合物からなる群より選択されることが好ましい。
【００１８】
生成されたエナンチオマー性α−ＨＣＣＡエステルの、α−ＨＣＣＡの対応する立体配置への還元については、本発明に従い、α−ＨＣＣＡエステルの光学的に純粋なＳ−またはＲ体を、高いエナンチオマー過剰（＞９９％）を有するα−ＨＣＣＡの対応する立体配置に変換する二つの方法が与えられる。
【００１９】
第一に、有機溶媒中の回収されたＳ−またはＲ体のα−ＨＣＣＡの溶液に、炭素上のパラジウム触媒（Ｐｄ／Ｃ）の存在下、一定水素分圧下、一定温度での水素化を受けさせる。
【００２０】
これに関して、パラジウム触媒は好ましくは、０．１〜３０重量％の量、またより好ましくは０．５〜１０重量％の量で使用される。例えば、０．１重量％未満の量は加水分解を行うのに不十分である。他方、３０重量％を超える量は生成費用に悪影響を有する。エナンチオマー性α−ＨＣＣＡエステルの触媒加水分解は好ましくは、１ないし１０ｂａｒ、またより好ましくは１〜５ｂａｒの水素分圧で行われる。例えば、１ｂａｒ未満の水素分圧で行われるとき、加水分解は効率において顯著に低下する。他方、１０ｂａｒを超える水素分圧は、多くの副産物の形成を生じる。他の条件は、１ないし２０時間、また好ましくは１ないし８時間の反応時間、および０ないし７０℃、また好ましくは２０ないし４０℃の反応温度で設定される。
【００２１】
ＴＨＦＡエステルのうち、ＴＨＦＡベンジルエステルは、ＴＨＦＡをそれから非常に容易に回収されるようにすることができる。例えば、有機溶媒中のＴＨＦＡベンジルエステルの溶液は、一定温度、一定水素分圧下で水素化されて、ＴＨＦＡおよびトルエンを生成し、そして単純な真空蒸留はトルエンを除去し、ＴＨＦＡのみを残存させる。
【００２２】
もう一つの方法は、一定のｐＨおよび温度の維持で、α−ＨＣＣＡエステルの回収された光学異性体のエステル官能基を非エナンチオマー選択的に加水分解できる酵素を用いることである。非エナンチオマーマ選択的加水分解において使用されるとき、酵素は粉末または水溶液の形態であり得る。
【００２３】
酵素加水分解の完了後、水性相が収集され、そしてＨＣｌでｐＨを２〜３に調整される。有機溶媒での酸性化された水性相を数回の抽出は、非常に純粋なα−ＨＣＣＡのＳ−またはＲ体を生じる。
【００２４】
本発明のより良好な理解は、説明して示すが、本発明を制限すると解釈されない以下の実施例を参照して与えられ得る。
【００２５】
実施例１
ＴＨＦＡエチルエステルについて特異性を有する酵素の選別
良く混合した後、０．１モルのＴＨＦＡおよび０．３モルのエチルアルコールを、７０℃で１時間、０．１５モルのチオニルクロライドの存在下で反応させてＴＨＦＡエチルエステルを生成した。
５００μｌの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、それぞれ１％および０．１％の量で、ＴＨＦＡエチルエステルおよび加水分解酵素を添加し、そして生じた反応物を３０℃で３０時間培養した。加水分解の完了後、５０μｌの反応物を同量の１Ｎ・ＨＣｌと良く混合し、そして２００μｌの酢酸エチルを添加して残存する物質を抽出した。抽出物を、ＨＰ−５カラム、８０ないし２００℃の温度でのガスクロマトグラフィーにより、および分析し、β−デキストリンＧＣ、１１０ないし２００℃の温度範囲でのキラルガスクロマトグラフィーにより分析した。
分析結果を以下の表１にまとめる。表１に見られるように、残存α−ＨＣＣＡエチルエステルは、酵素のエナンチオマー選択性に依存して、Ｒ体、S体またはラセミ体のいずれかとして存在した。従って、ＴＨＦＡエチルエステルの異なるエナンチオマーが酵素の選択に従い生成されることができることが確認された。
【００２６】
【表１】
【００２７】
実施例２
ＴＨＦＡブチルエステルについて特異性を有する酵素の選別
０．１モルのＴＨＦＡを、０．１モルのブチルアルコールと、１２０℃で４時間、０．１５モルのトルエン中、１×１０-4モルのｐ−トルエンスルホン酸の存在下で反応させて、ＴＨＦＡブチルエステルを生成した。
５００μｌの５０ｍＭ燐酸溶液（ｐＨ７．０）に、それぞれ１％および０．１％の量で、ＴＨＦＡエチルエステルおよび加水分解酵素を添加し、次いで３０℃で１６時間培養した。加水分解の完了後、実施例１と同じ方法において基質を抽出および分析した。
分析結果を以下の表２にまとめる。表２のデータから明らかなように、残存α−ＨＣＣＡエチルエステルは、酵素のエナンチオマー選択性に依存して、Ｒ体、S体またはラセミ体のいずれかとして存在した。従って、ＴＨＦＡエチルエステルの異なるエナンチオマーが酵素の選択に従い生成されることができることが確認された。
【００２８】
【表２】
【００２９】
実施例３
ＴＨＦＡベンジルエステルについて特異性を有する酵素の選別
ＴＨＦＡベンジルエステルを、ベンジルアルコールを使用することを除いて、実施例１のものと同様な方法において生成した。
５００μｌの５０ｍＭ燐酸溶液（ｐＨ７．０）に、それぞれ１％および０．１％の量で、ＴＨＦＡベンジルエステルおよび加水分解酵素を添加し、そして生じた反応物を３０℃で１６時間培養した。加水分解の完了後、実施例１と同じ方法において基質を抽出および分析した。
分析結果を以下の表３にまとめる。表２のデータから明らかなように、残存α−ＨＣＣＡベンジルエステルは、酵素のエナンチオマー選択性に依存して、Ｒ体、S体またはラセミ体のいずれかとして存在した。従って、ＴＨＦＡエチルエステルの異なるエナンチオマーが酵素の選択に従い生成されることができることが確認された。
【００３０】
【表３】
【００３１】
実施例４
有機溶媒を使用するＴＨＦＡエステルおよびＴＨＦＡの分離
ラセミＴＨＦＡエステルを酵素によりエナンチオマー選択的に加水分解し、そして有機溶媒を酵素反応物に添加して、以下のように未加水分解で残存している基質の対応するＳ−またはＲ体から反応生成物のＲ−またはＳ体を分離した。
Ｒ、Ｓ−ＴＨＦＡブチルエステルおよびバシラス・リケニホルミスプロテアーゼを、１リットルの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、それぞれ２％および１％の量で添加し、そして生じた反応物を３０℃で４時間、ｐＨ７．０の条件下で培養した。加水分解反応の完了後、基質を実施例１と同じ方法で抽出および分析した。
残存する反応液に５００ｍｌの酢酸エチルを添加し、そして良く混合し、次いで相分離により有機層を回収した。水層を５００ｍｌの酢酸エチルで再度抽出し、そして得た酢酸エチル層を注いだ。この注いだ有機層を５ｇの硫酸ナトリウム上で乾燥した。真空蒸留は酢酸エチルを除去し、９．６ｇのＳ−ＴＨＦＡブチルエステルが残存し、そのエナンチオマー過剰において９９．４％であると測定した。水層中に残存するＴＨＦＡを、７０％のエナンチオマー過剰であるＲ体であると同定された。
【００３２】
実施例５ないし１３
酵素：基質の比率、温度、およびｐＨによるエナンチオマー過剰における変化
Ｒ、Ｓ−ＴＨＦＡブチルエステルの濃度を８重量％で固定し、酵素：基質の比率、反応温度、およびｐＨを変化させたことを除いて、実施例４でと同じ方法で行った。結果を以下の表４に与える。
【表４】
実施例１４
バシラス・リケニホルミスプロテアーゼを使用するブチルエステルの光学分割
４００ｍｌの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ９．０）に、１２重量％のＲ、Ｓ−ＴＨＦＡブチルエステルおよび１重量％のバシラス・リケニホルミスプロテアーゼを添加し、そして生じた反応物を、３０℃で１０．５時間、ｐＨ９．０の維持で培養した。加水分解の完了の後、基質を実施例１と同じ方法で抽出および分析した。
２００ｍｌの酢酸エチルを使用し、２１ｇのＳ−ＴＨＦＡブチルエステルを実施例４と同じ方法で入手し、そして分析して、エナンチオマー過剰において９９．３％であった。水溶相中に残存するＴＨＦＡは６０％のエナンチオマー過剰であると同定した。
【００３４】
実施例１５
バシラス・リケニホルミスプロテアーゼを使用するブチルエステルの光学分割
２００ｍｌの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加水分解のために２０℃で使用し、そして１００ｍｌの酢酸エチルを基質分離のために添加したことを除いて、１２ｇのＳ−ＴＨＦＡを実施例１４のものと同様な方法で生成し、そしてその光学純度はエナンチオマー過剰において９９．３％であると測定した。
【００３５】
実施例１６
バシラス・リケニホルミスプロテアーゼを使用するブチルエステルの光学分割
加水分解を１０℃で１９時間行ったことを除き、２１ｇのＳ−ＴＨＦＡブチルエステルを実施例１４のものと同様な方法で生成し、そしてその光学純度はエナンチオマー過剰において９９．１％であると測定した。
【００３６】
実施例１７
バシラス・リケニホルミスプロテアーゼを使用するブチルエステルの光学分割
加水分解を２０℃で２６時間、２００ｍｌの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ９．０）中の１５重量％のＲ、Ｓ−ＴＨＦＡブチルエステルで行い、そして１００ｍｌの酢酸エチルを基質分離のために添加したことを除き、２５．７ｇのＳ−ＴＨＦＡブチルエステルを実施例１４のものと同様な方法で生成し、そしてその光学純度はエナンチオマー過剰において９９．８％であると測定した。
【００３７】
実施例１８ないし２２
バシラス・リケニホルミスプロテアーゼを使用するブチルエステルの光学分割
Ｒ、Ｓ−ＴＨＦＡブチルエステルの濃度および酵素と基質との比率を以下の表５に与えるような条件に従い変化させつつ、Ｓ−ＴＨＦＡブチルエステルを実施例１７においてと同じ条件下で生成した。分析結果を表５に与える。
【表５】
実施例２３
ＴＨＦＡの光学分割
ベンジルエステルラセミ体を実施例３でと同じ方法で生成した。２００ｍｌの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ９．０）に、１２重量％の生成したＲ、Ｓ−ＴＨＦＡベンジルエステルおよび１重量％のバシラス・リケニホルミスプロテアーゼを添加し、そして生じた反応液を、２０℃で４．５時間、ｐＨ９．０の維持で培養した。加水分解の完了後、反応物を実施例１でのように分析した。残存する反応物に１００ｍｌの酢酸エチルを添加し、そして良く混合し、その後、１６ｇのＳ−ＴＨＦＡベンジルエステルを実施例１４でと同じ方法で入手し、そしてエナンチオマー過剰において９９．１％であると同定した。
２０ｍｌの酢酸エチル中に、５５ｇの得られたＳ−ＴＨＦＡベンジルエステルを溶解し、そして５５ｍｇ（１重量％）の１０％パラジウム触媒（Ｐｄ／Ｃ）を添加し、次いで該溶液を室温で１０分間撹拌した。水素ガスを反応物に１．５ｂａｒの水素分圧まで少しづつ供給して、その時点で撹拌を１０時間行った。濾過によるパラジウム触媒の除去後、酢酸エチルおよび生成したトルエンの真空蒸留は、２．５ｇのＳ−ＴＨＦＡを与えた。このエナンチオマー化合物は、キラルＧＣにより測定したところエナンチオマー過剰において９９．１％であることが判明した。
【００３９】
実施例２４
Ｓ−ＴＨＦＡブチルエステルからのＳ−ＴＨＦＡの生成
強酸および強塩基を使用せずとも異性体を生成せずに、実施例２においてＲ、Ｓ−ＴＨＦＡブチルエステルを非選択的に加水分解することが示されたカンジダ・アンタルシチカＢ画分リパーゼの存在下で、Ｓ−体ＴＨＦＡブチルエステルをＳ−ＴＨＦＡに加水分解した。
３００ｍｌの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、１重量％のＳ−ＴＨＦＡブチルエステルおよび０．１重量％のカンジダ・アンタルシチカＢ画分リパーゼを添加し、そして生じた反応物を３０℃で１時間培養した。加水分解の完了後、基質を実施例１でと同じ方法で抽出および分析した。
ＧＣ分析は、全てのＳ−ＴＨＦＡブチルエステルのＴＨＦＡへの加水分解を確認し、キラルＧＣにより測定したところエナンチオマー過剰において９９．８％であることが判明した。
【００４０】
実施例２５ないし３３
Ｓ−ＴＨＦＡブチルエステルからのＳ−ＴＨＦＡの生成
実施例２４の手順を異なる酵素を使用して行い、そして結果を以下の表６に与える。
【表６】
実施例３４
ＴＨＦＡの光学分割
２００ｍｌの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ９．０）に、１２重量％のＲ、Ｓ−ＴＨＦＡブチルエステルおよび１重量％のバシラス・リケニホルミスプロテアーゼを添加し、そして生じた反応物を、２０℃で１０．５時間、ｐＨ９．０の維持で培養した。加水分解後、反応物を実施例１でのように分析した。残存する反応物に１００ｍｌの酢酸エチルを添加し、そして良く混合した後、１２ｇのＳ−ＴＨＦＡブチルエステルを実施例１４でと同じ方法で入手し、そしてエナンチオマー過剰において９９．３％であると同定した。
１００ｍｌの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で、１２ｇの生成したＳ−ＴＨＦＡブチルエステルを、３０℃で５時間、１ｇのカンジダ・アンタルシチカＢ画分リパーゼの存在下、ｐＨ７．０の維持で加水分解した。加水分解に続き、反応結果物を実施例１のように分析した。残存する反応物をＨＣｌでｐＨ２．０に調節し、次いで３倍体積の酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル抽出物を注いだ後、６ｇのＳ−ＴＨＦＡを実施例１４でと同じ方法で注ぎ入れたものから回収した。該化合物は、キラルＧＣにより測定したところ、エナンチオマー過剰において９９．３％であることが判明した。
【００４２】
実施例３５
ＴＨＦＡの大規模光学分割
２リットルの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ９．０）を、４０重量％のＲ、Ｓ−ＴＨＦＡブチルエステルおよび３重量％のバシラス・リケニホルミスプロテアーゼを添加し、そして生じた反応物を、２０℃で２３時間、ｐＨ９．０の維持で反応させた。加水分解後、反応物を実施例１のように分析した。残存する反応物に１リットルの酢酸エチルを添加し、そして良く混合した後、４００ｇのＳ−体ＴＨＦＡブチルエステルを実施例１４でと同じ方法で入手し、そしてエナンチオマー過剰において９９．３％であると同定した。
４００ｍｌの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で、１６０ｇの生成したＳ−ＴＨＦＡブチルエステルを、３０℃で６時間、８ｇのカンジダ・アンタルシチカＢ画分リパーゼの存在下、ｐＨ７．０の維持で加水分解した。加水分解に続いて、反応結果物を実施例１のように分析した。残存する反応物をＨＣｌでｐＨ２．０に調節し、次いで３倍体積の酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル抽出物を注いだ後、８０ｇのＳ−ＴＨＦＡを実施例１４でと同じ方法で回収した。該化合物は、キラルＧＣにより測定したところ、エナンチオマー過剰において９９．３％であることが判明した。
【００４３】
以上説明したように、ラセミ混合物のα−ＨＣＣＡは、本発明に従い高い光学純度、高い収率で光学分割されることができる。加えて、本発明は、このようなキラル化合物が低費用で生成されることができるので、経済的に好ましい。
【００４４】
本発明を例示して説明し、そして使用された用語は制限ではなく説明するものであることを意図していることを理解すべきである。本発明の多くの改良および変更が上記の教示に関して可能である。従って、添付した請求項の範囲内で、本発明は特別に記載した以外でも行われ得ることが理解されるべきである。
Claims (12)
- ラセミテトラヒドロ−２−フル酸（ＴＨＦＡ）の光学分割方法であって、
ラセミＴＨＦＡをアルコールと反応させて、ＴＨＦＡエステルのラセミ体（ここで、該ＴＨＦＡエステルは、ＴＨＦＡエチルエステル、ＴＨＦＡブチルエステル及びＴＨＦＡベンジルエステルからなる群より選択される。）を得る工程と、
該ＴＨＦＡエステルのラセミ体を、水溶液中で、エナンチオマー選択性を有する酵素の使用により光学分割して、該エステルラセミ体のＲ体またはＳ体のいずれかを加水分解し、それにより、ＴＨＦＡのＲ体またはＳ体およびＴＨＦＡエステルの反対のエナンチオマー形態を生成する工程であって、該酵素は粉末または水溶液の形態であり、前記ＴＨＦＡエステルがＴＨＦＡエチルエステルである場合、該酵素は、豚膵臓（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ）又はカンジダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のリパーゼであり、前記ＴＨＦＡエステルがＴＨＦＡブチルエステルである場合、該酵素は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）又はバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のプロテアーゼ、カンジダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）又はカンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｓａ ｒｕｇｏｓａ）由来のリパーゼ、ノボ（Ｎｏｖｏ）（登録商標）ＩＭリパーゼ或いはＬ６２リパーゼであり、前記ＴＨＦＡエステルがＴＨＦＡベンジルエステルである場合、該酵素は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）又はバチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のプロテアーゼ或いはＫ８０リパーゼである工程と、
ラセミ体の加水分解されていないＴＨＦＡエステルを有機溶媒で抽出し、次いでＴＨＦＡエステルを有機相から、またＴＨＦＡを水相からそれぞれ回収する工程と、
回収されたＴＨＦＡエステルに、有機溶媒中、一定水素分圧下、一定温度にて、炭素上のパラジウム触媒（Ｐｄ／Ｃ）の存在下での水素化を受けさせ、生成されたＴＨＦＡを得る工程
からなる方法。 - 前記アルコールは、１ないし６個の炭素原子を含む線状または分岐したアルコール、芳香族アルコール、３ないし６個の炭素原子を含むシクロアルキルアルコール、置換または未置換のアリールアルキルアルコール、および置換または未置換のヘテロアリールアルキルアルコールからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
- 前記酵素は、ＴＨＦＡエステル１００重量部に基いて０．１ないし１００重量部の量で使用される、請求項１記載の方法。
- 前記光学分割工程は、水溶液中、０ないし６０℃にて、４ないし１２でのｐＨの維持で行われる、請求項１記載の方法。
- 前記有機溶媒は、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、トルエン、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
- 前記パラジウム触媒は、０．１ないし３０重量％の量で使用される、請求項１記載の方法。
- 前記水素分圧は、１ないし１０ｂａｒの範囲内で維持され、そして水素化は０ないし７０℃で行われる、請求項１記載の方法。
- ラセミテトラヒドロ−２−フル酸（ＴＨＦＡ）の光学分割方法であって、
ラセミＴＨＦＡをアルコールと反応させて、ＴＨＦＡエステルのラセミ体（ここで、該ＴＨＦＡエステルは、ＴＨＦＡエチルエステル、ＴＨＦＡブチルエステル及びＴＨＦＡベンジルエステルからなる群より選択される。）を得る工程と、
該ＴＨＦＡエステルのラセミ体を、水溶液中で、エナンチオマー選択性を有する酵素の使用により光学分割して、該エステルラセミ体のＲ体またはＳ体のいずれかを加水分解し、それにより、ＴＨＦＡのＲ体またはＳ体およびＴＨＦＡエステルの反対のエナンチオマー形態を生成する工程であって、該酵素は粉末または水溶液の形態であり、前記ＴＨＦＡエステルがＴＨＦＡエチルエステルである場合、該酵素は、豚膵臓（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ）又はカンジダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のリパーゼであり、前記ＴＨＦＡエステルがＴＨＦＡブチルエステルである場合、該酵素は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）又はバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のプロテアーゼ、カンジダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）又はカンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｓａ ｒｕｇｏｓａ）由来のリパーゼ、ノボ（Ｎｏｖｏ）（登録商標）ＩＭリパーゼ或いはＬ６２リパーゼであり、前記ＴＨＦＡエステルがＴＨＦＡベンジルエステルである場合、該酵素は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）又はバチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のプロテアーゼ或いはＫ８０リパーゼである工程と、
ラセミ体の加水分解されていないＴＨＦＡエステルを有機溶媒で抽出し、次いでＴＨＦＡエステルを有機相から、またＴＨＦＡを水相からそれぞれ回収する工程と、
回収されたＴＨＦＡエステルを、非エナンチオマー選択的酵素を用い、水溶液中で、一定のｐＨおよび温度で加水分解して、生成されたＴＨＦＡを得る工程であって、該酵素は粉末または水溶液の形態である工程
からなる方法。 - 前記アルコールは、１ないし６個の炭素原子を含む線状または分岐したアルコール、芳香族アルコール、３ないし６個の炭素原子を含むシクロアルキルアルコール、置換または未置換のアリールアルキルアルコール、および置換または未置換のヘテロアリールアルキルアルコールからなる群より選択される、請求項８記載の方法。
- 前記エナンチオマー選択性を有する酵素は、ＴＨＦＡエステル１００重量部に基いて０．１ないし１００重量部の量で使用される、請求項８記載の方法。
- 前記光学分割工程は、水溶液中で、０ないし６０℃、４ないし１２でのｐＨの維持で行われる、請求項８記載の方法。
- 前記有機溶媒は、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、トルエン、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項８記載の方法。
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