JP2006021999A - 光学活性β−アミノニトリル化合物およびその対掌体アミド化合物の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】医薬、農薬等の原料または合成中間体として有用な光学活性β−アミノニトリル化合物の効率的な製造方法を提供する。
【解決手段】ラセミ体若しくは低光学純度のβ−アミノニトリルアミド化合物に、不斉加水分解能力を有する酵素源を接触させることにより、光学活性β−アミノニトリルおよびその対掌対のアミド化合物を製造する。
【選択図】 なし。
【解決手段】ラセミ体若しくは低光学純度のβ−アミノニトリルアミド化合物に、不斉加水分解能力を有する酵素源を接触させることにより、光学活性β−アミノニトリルおよびその対掌対のアミド化合物を製造する。
【選択図】 なし。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬、農薬等の原料または中間体として有用な光学活性β−アミノニトリル化合物の製造方法に関する。光学活性β−アミノニトリル化合物は医薬農薬等の合成中間体として有用な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性β−アミノニトリル化合物の製造方法としては、化学的方法と生化学的方法があげられる。
【０００３】
光学活性β−アミノニトリル化合物の化学的製法としては、従来、光学活性アミノアルコールを原料として、アミノ基に保護基を導入した後、シアン化ナトリウムを用いてシアノ化する方法（Ｊ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｄ．， ６５， ２９−３１， （２００２）：非特許文献１）が報告されている。しかし、この方法は高価な光学活性アミノアルコールを原料とすること、またシアン化ナトリウムの安全性に問題があることから工業的に有利な方法であるとは言い難い。
【０００４】
一方、生化学的方法は一般に温和な条件で反応を行なうことができ、ニトリルの加水分解など副反応を引き起こしにくいため、工業的に有利と考えられるが、生化学的製法による光学活性β−アミノニトリル化合物の製法に関しては今までに報告がない。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｊ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｄ．， ６５， ２９−３１， （２００２）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、医薬農薬合成中間体として有用な光学活性β−アミノニトリル化合物を生化学的に効率よく製造するための新たな方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ラセミ体若しくは低光学純度のβ−アミノニトリルのアミド化合物を立体選択的に加水分解する活性を有する今までに報告例のない酵素源を発見し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、一般式（Ｉ）；
【０００９】
【化４】
【００１０】
（式中、Ｒ1は炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数２〜８のアルケニル基、炭素数２〜８のアルキニル基を示し、Ｒ2は炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数２〜８のアルケニル基、炭素数２〜８のアルキニル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数６〜１４の複素環残基を示す。）で表されるアミド化合物に、不斉加水分解活性を有する酵素源を作用させることを特徴とする、一般式（ＩＩ）；
【００１１】
【化５】
【００１２】
（式中、Ｒ1は上記一般式（Ｉ）中で定義した通り。＊は不斉点を示す。）で表される光学活性β−アミノニトリル化合物およびその対掌体アミド化合物の製造方法に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明の原料であるβ−アミノニトリルのアミド化合物は、一般式（Ｉ）；
【００１５】
【化６】
【００１６】
で表される。前記式（Ｉ）において、Ｒ1は炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数１〜８のアルケニル基、炭素数１〜８のアルキニル基を示す。
【００１７】
前記炭素数１〜８のアルキル基としては、直鎖状であっても分岐鎖状であっても良く、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、又はオクチル基等が挙げられる。前記炭素数１〜８のアルコキシ基としては、アルキル部分が上記アルキル基であるアルコキシ基が挙げられる。前記炭素数２〜８のアルケニル基としては、ビニル基、アリル基等が挙げられる。前記炭素数２〜８のアルキニル基としては、エチニル基、プロピニル基等が挙げられる。
【００１８】
上記アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基は置換基を有していても良く、置換基としては、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基等が挙げられる。
【００１９】
Ｒ1として、好ましくは炭素数１〜８のアルキル基であり、より好ましくは炭素数１〜４の低級アルキル基であり、最も好ましくはエチル基である。
【００２０】
Ｒ2は炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数２〜８のアルケニル基、炭素数２〜８のアルキニル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数６〜１４の複素環残基を示す。
【００２１】
上記アルキル基、アルコキシ基、アルケニル基およびアルキニル基は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、前記Ｒ1における例示と同様の基が挙げられる。炭素数６〜１４のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。炭素数６〜１４の複素環残基としては、ピリジル基等が挙げられる。
【００２２】
なお、上記のアルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、および複素環残基は、置換基を有していても良く、置換基としては、前記Ｒ1において例示したものと同様の置換基が挙げられる。
【００２３】
Ｒ2として、好ましくはメチル基、プロピル基、ペンチル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、フェニル基であり、最も好ましくはイソプロピル基である。
【００２４】
なお、前記式（Ｉ）においてＲ1が炭素数１〜４のアルキル基であり、Ｒ2が炭素数１〜８のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基であるアミド化合物、即ち、下記式（ＩＩＩ）；
【００２５】
【化７】
【００２６】
（式中、Ｒ3は炭素数２〜４のアルキル基、Ｒ4は炭素数１〜８のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基を示す。）で表されるアミド化合物またはその塩は、文献未収載の新規化合物である。ラセミ体の前記アミド化合物（ＩＩＩ）を本発明の方法で不斉加水分解して得られる光学活性なアミド化合物（ＩＩＩ）も、言うまでもまく、新規化合物である。
【００２７】
上記β−アミノニトリルのアミド化合物（Ｉ）は、ラセミ体であっても良く、また低光学純度のものであっても良い。ラセミ体β−アミノニトリルのアミド化合物（Ｉ）は、例えばＵＳ５９０２８８３公報に記載の方法により、ラセミ体３−アミノペンタンニトリルに代表されるラセミ体β−アミノニトリル化合物を合成後、このものに酸無水物あるいは酸クロライドを公知の方法で反応させることにより得られる。
【００２８】
本発明において使用する不斉加水分解活性をもつ酵素源は、前記式（Ｉ）に示されるラセミ体β−アミノニトリルのアミド化合物を不斉加水分解する能力を有すれば酵素種を問わないが、その中でもリパーゼ類、エステラーゼ類、プロテアーゼ類、アミダーゼ類、アシラーゼ類と称される酵素が特に有効である。
【００２９】
そのような酵素源としては、特に制限はないが、代表的なものとして、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、クラビスポラ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ）属 、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属 、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属 、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属に属する微生物由来の酵素源があげられ、好ましくは、アルカリゲネス・ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）クレブシエラ・プランティコラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）、コリネバクテリウム・フラベセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ノカルディア・グロベルーラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、キャンディダ・キャンタレリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ）、キャンディダ・カテヌラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｔｅｎｕｌａｔａ）、キャンディダ・グイリアモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、キャンディダ・モギ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍｏｇｉｉ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・ベルサティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、クリプトコッカス・フミコラス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｈｕｍｉｃｏｌｕｓ）、クリプトコッカス・ラウレンティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、クラビスポラ・ルシタニエ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、デバリオマイセス・カルソニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｓｏｎｉｉ）、デバリオマイセス・カステリ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌｌｉｉ）、ピキア・ブルトニ（Ｐｉｃｈｉａ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）、ピキア・カルソニ（Ｐｉｃｈｉａ ｃａｒｓｏｎｉｉ）、トロコスポロン・カタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ）等の微生物に由来する酵素源である。
【００３０】
より好ましくはアルカリゲネス・ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＩＦＯ１３１１１、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＩＦＯ１３２６３、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＩＦＯ１２６１２、クレブシエラ・プランティコラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）ＩＦＯ３３１７、コリネバクテリウム・フラベセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ１４１３６、ノカルディア・グロベルーラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）ＩＦＯ１３５１０、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ３２４３、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ３３８４、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＩＦＯ１２３２０、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＩＡＭ１４７４、キャンディダ・キャンタレリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ）ＩＦＯ１２６１、キャンディダ・カテヌラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｔｅｎｕｌａｔａ）ＩＦＯ７４５、キャンディダ・グイリアモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）ＩＦＯ４５４、キャンディダ・モギ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍｏｇｉｉ）ＩＦＯ４３６、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＩＦＯ６１８、キャンディダ・ベルサティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）ＩＦＯ１２２８、クリプトコッカス・フミコラス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｈｕｍｉｃｏｌｕｓ）ＩＦＯ１５２７、クリプトコッカス・ラウレンティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）ＩＦＯ６０９、クラビスポラ・ルシタニエ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）ＩＦＯ１０１９、デバリオマイセス・カルソニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｓｏｎｉｉ）ＩＦＯ９４６、デバリオマイセス・カルソニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｓｏｎｉｉ）ＩＦＯ７９５、デバリオマイセス・カステリ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌｌｉｉ）ＩＦＯ１３５９、ピキア・ブルトニ（Ｐｉｃｈｉａ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）ＩＦＯ８４４、トロコスポロン・カタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ）ＩＦＯ１１９８に由来する酵素源である。
【００３１】
最も好ましくは、コリネバクテリウム・フラベセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ１４１３６、ノカルディア・グロベルーラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）ＩＦＯ１３５１０、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ３４２３、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ） ＩＦＯ３３８４に由来する酵素源である。
【００３２】
これらの微生物は、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）、あるいは東京大学応用微生物研究所微生物微細藻類総合センター（ＩＡＭ）等から入手することができるが、自然界から分離することもできる。なお、これらの微生物に変異を生じさせてより本反応に有利な性質を有する株を得ることもできる。
【００３３】
また、これらの微生物から単離した酵素遺伝子を通常の方法で各種宿主ベクター系に導入した遺伝子操作微生物の利用も可能である。
【００３４】
本発明においては、酵素源として、上記微生物を適当な培地中で培養して得られる微生物培養液を使用できるほか、培養液の処理物を使用することもできる。該処理物としては、微生物培養液から遠心分離などの集菌操作によって得られる培養上清、微生物菌体、微生物菌体の破砕物、該破砕物より得られる無細胞抽出物、固定化菌体、精製された精製酵素、固定化酵素等が挙げられる。
【００３５】
本発明においては、前記酵素源を通常１種類用いて不斉加水分解反応を実施するが、同様な能力を有する２種類以上のそれを混合して反応を行なうことも可能である。
【００３６】
本発明においてこれらの微生物を培養するための培地としては、通常これらの微生物が生育し得るものであればいずれのものでも使用できる。炭素源としては、たとえばグルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、酢酸、クエン酸、フマル酸等の有機酸あるいはその塩、エタノール、グリセロール等のアルコール類等を使用できる。窒素源としては、たとえば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、アミノ酸等の一般天然窒素源のほか、各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。その他、無機塩、微量金属塩、ビタミン等が必要に応じて添加される。
【００３７】
また、高い酵素活性を得るために、エステル結合あるいはアミド結合をもつ化合物、例えば前記式（Ｉ）で示されるβ−アミノニトリルのアミド化合物等を酵素産生の誘導物質として培地に添加することも有効である。
【００３８】
微生物の培養は常法に従って行なえばよく、たとえば、ｐＨ４〜１０、温度１５〜４５℃の範囲で６〜９６時間培養するのが好ましい。
【００３９】
本発明において、前記式（Ｉ）で示されるラセミ体β−アミノニトリルのアミド化合物の光学選択的加水分解による光学活性β−アミノニトリル化合物およびその対掌体アミド化合物の製造は以下の方法で行なうことができる。反応溶媒に基質である前記式（Ｉ）で示されるラセミ体β−アミノニトリルのアミド化合物を溶解もしくは懸濁する。また、基質を反応溶媒に添加する前にあるいは添加した後に触媒となる上記加水分解能力を有する酵素源を添加する。そして、反応温度、必要により反応ｐＨを制御しながら反応を行う。
【００４０】
反応液の基質濃度は０．０１〜５０重量％の間で特に制限は無いが、生産性を考慮すると０．１〜３０質量％が好ましい。
【００４１】
反応液の酵素濃度は、通常０．０１〜５０重量％であり、好ましくは０．０５〜３０質量％である。
【００４２】
反応液のｐＨは、用いる酵素の至適ｐＨに依存するが、一般的にはｐＨ４〜１１の範囲である。化学的加水分解による収率の低下およびラセミ化による光学純度の低下等抑制する観点からｐＨ５〜９で行なうのが好ましい。加水分解が進行するに従いｐＨが変化するが、この場合は適当な中和剤、例えば、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、塩酸、等を添加して最適ｐＨに調整することが望ましい。
【００４３】
反応温度は５〜７０℃が好ましく、１０〜５０℃がより好ましい。
【００４４】
反応溶媒は、通常イオン交換水、緩衝液等の水性媒体を使用するが、有機溶媒を含んだ系でも反応を行なうことができる。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等のアルコール系溶媒、ペンタン、ヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒、塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン等ケトン系溶媒、その他アセトニトリル等を適宜使用できる。
【００４５】
これらの有機溶媒を水への溶解度以上に加えて２相系で反応を行なうことも可能である。有機溶媒を反応系に共存させることで、選択率、変換率、収率などが向上する場合も多い。
【００４６】
反応は、通常、ラセミ体のアミド化合物（Ｉ）の半量程度が加水分解されるまで反応をおこなう。通常、１時間〜１週間、好ましくは１〜７２時間であり、そのような時間で反応が終了する反応条件を選択することが好ましい。なお、求められる生成物の光学純度や収率に応じて、反応の初期段階で反応を中断したり、あるいは過剰に反応させてもよい。
【００４７】
上記の反応により、前記式（Ｉ）で示されるβ−アミノニトリルのアミド化合物が立体選択的に加水分解され、光学活性β−アミノニトリル（ＩＩ）および未反応の対掌体アミド化合物が生成する。生成した光学活性β−アミノニトリル（ＩＩ）および未反応の対掌体アミド化合物は反応混合液から抽出、蒸留、再結晶、カラム分離など公知の方法によって単離することができる。
【００４８】
例えばｐＨを酸性に調整後、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；ヘキサン、オクタン、ベンゼン等の炭化水素類；塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素等一般的な溶媒により、生成した光学活性β−アミノニトリル（ＩＩ）を水相に残存させたまま未反応の対掌体アミド化合物を選択的に抽出することができる。一方、生成した光学活性β−アミノニトリル（ＩＩ）は、例えばｐＨを塩基性に調整後、同様に一般的な有機溶媒で抽出分離することができる。
【００４９】
生成物の光学純度は必要に応じてアシル化等により誘導体に変換した後、光学活性カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、測定することができる。例えば、本反応により得られる光学活性３−アミノペンタンニトリルはベンゾイルクロライドでアシル化した後、光学分割カラム（ダイセル化学工業社製キラルセルＯＤ）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により決定することができる。
【００５０】
未反応の対掌体アミド化合物は光学活性を維持したままアミド部分を通常の方法で加水分解することができ、上記反応で得られた光学活性β−アミノニトリル（ＩＩ）とは逆の立体配置を有するβ−アミノニトリルに導くことができる。
【００５１】
また、光学活性β−アミノニトリル（ＩＩ）は光学活性を維持したままアミド化することができる。このようにアミド化して得られたアミド化合物を同基質として本発明の酵素反応を複数回繰り返すことにより、より光学純度の高い目的化合物を得ることも可能である。
【００５２】
また、本発明により得られた光学活性β−アミノニトリル化合物は、その光学活性を維持したまま酸処理等によりニトリルを加水分解することにより、容易に光学活性β−アミノ酸カルボン酸アミド化合物およびβ−アミノ酸を製造することができる。
【００５３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。なお、以下の記載において、「％」は特に断らない限り「重量％」を意味する。また、β−アミノニトリル化合物の分析は以下の条件にて実施した。
定量分析
ガスクロマトグラフィー
カラム：ＤＢ−６２４（Ｊ＆Ｗ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）（０．５３ｍｍＸ３０ｍ）
検出：ＦＩＤ
カラム温度：１７０℃
注入温度：２００℃
検出温度：２００℃
キャリアーガス：ヘリウム（１００ｋＰａ）
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
薄層プレート：ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ２５４（メルク社製）
展開溶媒：ｎ−ブタノール／酢酸／水＝４／１／１
検出：ニンヒドリン
光学異性体分析
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
カラム：キラルセルＯＤ（ダイセル化学工業社製）
移動相：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝９／１
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
カラム温度：室温
流速：１．０ｍＬ／分
【００５４】
（実施例１）Ｎ−アセチル−３−アミノペンタンニトリルの製造方法
３−アミノペンタンニトリル９．８ｇとピリジン１０．３ｇを塩化メチレン１００ｍＬに溶解させ、氷冷下、無水酢酸１１．２ｇを滴下し、氷冷下で１時間、室温で４時間攪拌した。この反応液に２規定塩酸２００ｍＬ加えた後、塩化メチレン相と水相に分液した。塩化メチレン相を２規定水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、粗オイルを得た。このオイルを蒸留精製し、Ｎ−アセチル−３−アミノペンタンニトリル３．９ｇを得た。収率２８％。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：４．０４−３．９８（１Ｈ，ｍ），２．６８（２Ｈ，ｄｑ），２．０３（１Ｈ，ｓ），１．６５−１．７２（２Ｈ，ｍ），０．９９（３Ｈ，ｔ）。
赤外吸収スペクトルνｃｍ-1：３２８８，２９６８，２９３４，２２４５，１６５１，１５４９，１３７５，１３０６，１１３８，１０７８，９６２，７４８，６２１，６０８。
【００５５】
（実施例２）
表１記載の微生物を、ペプトン１０ｇ、肉エキス１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる滅菌培地１０ｍｌ（ｐＨ７．２）を入れた試験管に植菌し、３０℃で２日間往復振盪しながら培養した。次に各試験管から培養液２ｍＬをとり、遠心分離により菌体を回収後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬで１回洗浄した。菌体を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍＬに懸濁し、あらかじめラセミ体Ｎ−アセチル−３−アミノペンタンニトリル２．５ｍｇをいれた試験管に加えて、３０℃にて１８時間振盪しながら反応した。反応液上清４μＬを上記条件による薄層クロマトグラフィー上で展開させ、ニンヒドリンによる発色から生成した３−アミノペンタンニトリルを定量した。生成した光学活性３−アミノペンタンニトリルを塩基性条件下にてジニトロベンゾイルクロライドを作用させて誘導体化し、ＨＰＬＣを用いて光学純度を分析した。結果を表１に示す。
【００５６】
【表１】
【００５７】
（実施例３）
表２記載の微生物を、グルコース４０ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸水素二アンモニウム６．５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．８ｇ、硫酸亜鉛７水和物６０ｍｇ、硫酸鉄７水和物９０ｍｇ、硫酸銅５水和物５ｍｇ、硫酸マンガン４水和物１０ｍｇ、塩化ナトリウム１００ｍｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる滅菌培地１０ｍｌ（ｐＨ７．０）を入れた試験管に植菌し、３０℃で２日間往復振盪しながら培養した。次に試験管から培養液１．５ｍＬをとり、遠心分離により菌体を回収後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬで１回洗浄した。菌体を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍＬに懸濁し、あらかじめラセミ体Ｎ−アセチル−３−アミノペンタンニトリル２．５ｍｇをいれた試験管に加えて、３０℃にて１８時間振盪しながら反応した。生成した光学活性３−アミノペンタンニトリルを実施例１と同様の方法で分析した。結果を表２に示す。
【００５８】
【表２】
【００５９】
（実施例４）Ｎ−ブチリル−３−アミノペンタンニトリルの製造方法
３−アミノペンタンニトリル９．８ｇとピリジン１０．３ｇを塩化メチレン１００ｍＬに溶解させ、氷冷下、無水酪酸１７．４ｇを滴下し、氷冷下で１時間、室温で４時間攪拌した。反応終了後、２規定塩酸２００ｍＬで３回、２規定水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬで３回、飽和食塩水２００ｍＬで１回洗浄した。洗浄した反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去し、粗オイルを得た。このオイルを蒸留精製し、Ｎ−ブチリル−３−アミノペンタンニトリル８．４ｇを得た。収率５０％。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：４．０１−４．０５（１Ｈ，ｍ），２．６８（２Ｈ，ｄｑ），２．１９（２Ｈ，ｔ），１．６１−１．７２（２Ｈ×２，ｍ），０．９５−１．０１（３Ｈ×２，ｍ）。
赤外吸収スペクトルνｃｍ-1：３２７７，２９６６，２２４５，１６４７，１５５１，１４５８，１２８８，１２１５，１１３８，９５７，８９５。
【００６０】
（実施例５）Ｎ−ヘキサノイル−３−アミノペンタンニトリルの製造方法
３−アミノペンタンニトリル９．８ｇとピリジン１０．３ｇを塩化メチレン１００ｍＬに溶解させ、氷冷下、無水カプロン酸２３．６ｇを滴下し、氷冷下で１時間、室温で４時間攪拌した。反応終了後、２規定塩酸２００ｍＬで３回、２規定水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬで３回、飽和食塩水２００ｍＬで１回洗浄した。洗浄した反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去し、Ｎ−ヘキサノイル−３−アミノペンタンニトリル１８．４ｇを得た。収率９４％。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：４．００−４．０５（１Ｈ，ｍ），２．６８（２Ｈ，ｄｑ），２．２０（２Ｈ，ｔ），１．６１−１．７２（２Ｈ×２，ｍ），１．３１−１．３５（２Ｈｘ２，ｍ），０．８９−１．０１（３Ｈ×２，ｍ）。
赤外吸収スペクトルνｃｍ-1：３２９０，２９６１，２９３２，２３５９，２２４９，１６４７，１５４１，１４６０。
【００６１】
（実施例６）Ｎ−イソブチリル−３−アミノペンタンニトリルの製造方法
３−アミノペンタンニトリル９．８ｇとピリジン１０．３ｇを塩化メチレン１００ｍＬに溶解させ、氷冷下、無水イソ酪酸１７．４ｇを滴下し、氷冷下で１時間、室温で４時間攪拌した。反応終了後、２規定塩酸２００ｍＬで３回、２規定水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬで３回、飽和食塩水２００ｍＬで１回洗浄した。洗浄した反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去し、Ｎ−イソブチリル−３−アミノペンタンニトリル１７．５ｇを得た。収率８９％。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：３．９８−４．０３（１Ｈ，ｍ），２．６８（２Ｈ，ｄｑ），２．３６−２．４３（１Ｈ，ｍ），１．６６−１．７３（２Ｈ，ｍ），１．２８−１．１６（３Ｈ×２，ｍ），０．９９（３Ｈ，ｔ）。
赤外吸収スペクトルνｃｍ-1：３２８６，２９７４，２２４５，１６５１，１５４１，１２６３，１２４２，１１３６，１０９５，９５１，７２１。
【００６２】
（実施例７）Ｎ−イソペンタノイル−３−アミノペンタンニトリルの製造方法３−アミノペンタンニトリル９．８ｇとピリジン１０．３ｇを塩化メチレン１００ｍＬに溶解させ、氷冷下、無水イソ吉草酸２０．５ｇを滴下し、氷冷下で１時間、室温で４時間攪拌した。反応終了後、２規定塩酸２００ｍＬで３回、２規定水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬで３回、飽和食塩水２００ｍＬで１回洗浄した。洗浄した反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去し、Ｎ−イソペンタノイル−３−アミノペンタンニトリル１５．０ｇを得た。収率８２％。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：４．００−４．０７（１Ｈ，ｍ），２．６８（２Ｈ，ｄｑ），２．０５−２．１５（１Ｈ×１，２Ｈ×１，ｍ），１．６１−１．７４（２Ｈ，ｍ），０．９６−１．０１（３Ｈ×３，ｍ）。
赤外吸収スペクトルνｃｍ-1：３２７９，２９５９，２２４５，１６４５，１５５３，１３７１，１３０６，１２５９，１２２１，１１４０，７２７，６０９。
【００６３】
（実施例８）Ｎ−ピバロイル−３−アミノペンタンニトリルの製造方法
３−アミノペンタンニトリル９．８ｇとピリジン１０．３ｇを塩化メチレン１００ｍＬに溶解させ、氷冷下、ピバリン酸クロライド１３．３ｇを滴下し、氷冷下で１時間、室温で４時間攪拌した。反応終了後、２規定塩酸２００ｍＬで３回、２規定水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬで３回、飽和食塩水２００ｍＬで１回洗浄した。洗浄した反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去し、Ｎ−ピバロイル−３−アミノペンタンニトリル１４．７ｇを得た。収率８１％。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：３．９５−４．０３（１Ｈ，ｍ），２．６８（２Ｈ，ｄｑ），１．６８−１．７６（２Ｈ，ｍ），１．２２−１．２７（３Ｈ×３，ｍ），０．９９（３Ｈ，ｔ）。
赤外吸収スペクトルνｃｍ-1：３３２９，２９６２，２２５１，１６３６，１５３３，１３６４，１３０４，１２２３，１１３２，１０７８，８９１，６８１。
【００６４】
（実施例９）Ｎ−ベンゾイル−３−アミノペンタンニトリルの製造方法
３−アミノペンタンニトリル９．８ｇとピリジン１０．３ｇを塩化メチレン１００ｍＬに溶解させ、氷冷下、ベンゾイルクロライド１５．５ｇを滴下し、氷冷下で１時間、室温で４時間攪拌した。反応終了後、２規定塩酸２００ｍＬで３回、２規定水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬで３回、飽和食塩水２００ｍＬで１回洗浄した。洗浄した反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去し、Ｎ−ベンゾイル−３−アミノペンタンニトリル１８．６ｇを得た。収率９２％。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：７．４４−７．７９（５Ｈ，ｍ），４．２０−４．２８（１Ｈ，ｍ），２．８１（２Ｈ，ｄｑ），１．７８−１．８６（２Ｈ，ｍ），１．０７（３Ｈ，ｔ）。
赤外吸収スペクトルνｃｍ-1：３２３０，２９７２，２２５１，１６３７，１５２９，１３１３，１０７６，７００。
【００６５】
（実施例１０）
表３記載の微生物を、実施例２と同様に培養した。各培養液１０ｍＬをとり、遠心分離により菌体を回収後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍＬで１回洗浄した。菌体を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬに懸濁し、あらかじめ表３記載の基質３７．５μｍｏｌをいれた試験管に加えて、３０℃にて１９〜４５時間振盪しながら反応した。生成した光学活性３−アミノペンタンニトリルを実施例１と同様の方法で分析した。結果を表３に示す。
【００６６】
【表３】
【００６７】
（実施例１１）
ノカルディア・グロベルーラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ） ＩＦＯ１３５１０株を、ペプトン２０ｇ、肉エキス１０ｇ、酵母エキス５ｇ、グルコース１０ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、アデカノール１滴（いずれも１Ｌ当たり）、の組成からなる滅菌培地４００ｍｌ（ｐＨ７．２）を入れた坂口フラスコに植菌し、２９℃で２日間往復振盪しながら培養した。培養液を遠心分離し、菌体を回収後、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍＬで１回洗浄した。菌体を２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４０ｍＬに懸濁し、菌体懸濁液とした。あらかじめ基質であるラセミ体Ｎ−イソブチリル−３−アミノペンタンニトリル３５７μｍｏｌをいれた試験管に菌体懸濁液３ｍＬ加えて、３０℃にて２５時間振盪しながら反応した。反応液１００μＬをとり、これに２Ｎ水酸化ナトリウム１００μＬ、酢酸エチル１ｍＬを加えて十分攪拌し、遠心分離した後、その酢酸エチル相をガスクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣを用いて分析したところ、変換率２６％で９８．２％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−３−アミノペンタンニトリルが生成していた。
【００６８】
（実施例１２）
ノカルディア・グロベルーラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ） ＩＦＯ１３５１０株を、実施例１１と同様に培養し、菌体懸濁液を調製した。あらかじめ基質であるラセミ体Ｎ−イソブチリル−３−アミノペンタンニトリル７．１３ｍｍｏｌをいれた坂口フラスコに菌体懸濁液３０ｍＬ加えて、３０℃にて６４時間振盪しながら反応した。この反応液に２Ｎ塩酸を加えてｐＨ５とし、酢酸エチル３０ｍＬを加えて十分攪拌し、遠心分離した後、その酢酸エチル相を除いた。これに２Ｎ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ１０とした後、酢酸エチル９０ｍＬを用いて抽出した。抽出溶媒を無水硫酸ナトリウムで脱水後、蒸留にて精製を行ない、３−アミノペンタンニトリル１３９ｍｇを取得した。これをガスクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣを用いて光学純度を分析したところ、Ｒ体で９７．９％ｅ．ｅ．であった。
【００６９】
（実施例１３）
実施例１１記載の液体培地４Ｌを１０Ｌ容のジャーファーメンターに入れて殺菌後、これに実施例１１記載の培養方法で得られるノカルディア・グロベルーラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）ＩＦＯ１３５１０の培養液４０ｍＬを無菌的に接種し、通気０．５ｖｖｍ、温度２８℃、攪拌数２６０ｒｐｍにて５６時間培養した。得られた培養液から菌体を回収し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１．５Ｌに懸濁した。あらかじめラセミ体Ｎ−イソブチリル−３−アミノペンタンニトリル３０ｇをいれた５Ｌ容のジャーファーメンターに上記菌体懸濁液を加え、３０℃で２６時間攪拌しながら反応を行なった。反応終了後、１５％硫酸を加えてｐＨ４に調整後、反応液に対して２．５倍容量の塩化メチレンを用いた抽出操作を２回行ない、Ｎ−イソブチリル−３−アミノペンタンニトリルを回収した。水相を３０％水酸化ナトリウムを用いてｐＨ１１に調整後、反応液に対して２．５倍容量の塩化メチレンを用いた抽出操作を３回行ない、３−アミノペンタンニトリルを回収した。それぞれの抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下にて溶媒を留去し、３−アミノペンタンニトリル５．８ｇ、およびＮ−イソブチリル−３−アミノペンタンニトリル１８．１ｇを取得した。得られた３−アミノペンタンニトリルをベンゾイルクロライドで誘導体化後、ＨＰＬＣにて光学純度を分析したところ、Ｒ体９８．２％ｅ．ｅ．であった。1Ｈ−ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ3）：０．９８（３Ｈ，ｔ），１．４３−１．６３（２Ｈ，ｍ），２．４２（２Ｈ，ｄｑ），２．９２−３．０８（１Ｈ，ｍ）。
【００７０】
また、Ｎ−イソブチリル−３−アミノペンタンニトリルの光学純度を下記条件で分析したところ、Ｓ体６１．２％ｅ．ｅ．であった。
［キャピラリーガスクロマトグラフィー分析条件］
カラム：ＡＳＴＥＣ社製Ｃｈｉｒａｌｄｅｘ Ｇ−ＴＡ（２０ｍ×０．２５ｍｍ）
検出：ＦＩＤ、カラム温度：１３０℃、注入温度：２００℃、検出温度：２００℃、キャリアーガス：ヘリウム（１４０ｋＰａ）。
【００７１】
【発明の効果】 本発明は、不斉加水分解活性を有する酵素源を作用させて、β−アミノニトリルのアミド化合物を立体選択的に加水分解させることにより、光学活性β−アミノニトリル化合物および対掌体アミド化合物を効率よく製造することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬、農薬等の原料または中間体として有用な光学活性β−アミノニトリル化合物の製造方法に関する。光学活性β−アミノニトリル化合物は医薬農薬等の合成中間体として有用な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性β−アミノニトリル化合物の製造方法としては、化学的方法と生化学的方法があげられる。
【０００３】
光学活性β−アミノニトリル化合物の化学的製法としては、従来、光学活性アミノアルコールを原料として、アミノ基に保護基を導入した後、シアン化ナトリウムを用いてシアノ化する方法（Ｊ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｄ．， ６５， ２９−３１， （２００２）：非特許文献１）が報告されている。しかし、この方法は高価な光学活性アミノアルコールを原料とすること、またシアン化ナトリウムの安全性に問題があることから工業的に有利な方法であるとは言い難い。
【０００４】
一方、生化学的方法は一般に温和な条件で反応を行なうことができ、ニトリルの加水分解など副反応を引き起こしにくいため、工業的に有利と考えられるが、生化学的製法による光学活性β−アミノニトリル化合物の製法に関しては今までに報告がない。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｊ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｄ．， ６５， ２９−３１， （２００２）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、医薬農薬合成中間体として有用な光学活性β−アミノニトリル化合物を生化学的に効率よく製造するための新たな方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ラセミ体若しくは低光学純度のβ−アミノニトリルのアミド化合物を立体選択的に加水分解する活性を有する今までに報告例のない酵素源を発見し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、一般式（Ｉ）；
【０００９】
【化４】
（式中、Ｒ1は炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数２〜８のアルケニル基、炭素数２〜８のアルキニル基を示し、Ｒ2は炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数２〜８のアルケニル基、炭素数２〜８のアルキニル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数６〜１４の複素環残基を示す。）で表されるアミド化合物に、不斉加水分解活性を有する酵素源を作用させることを特徴とする、一般式（ＩＩ）；
【００１１】
【化５】
（式中、Ｒ1は上記一般式（Ｉ）中で定義した通り。＊は不斉点を示す。）で表される光学活性β−アミノニトリル化合物およびその対掌体アミド化合物の製造方法に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明の原料であるβ−アミノニトリルのアミド化合物は、一般式（Ｉ）；
【００１５】
【化６】
で表される。前記式（Ｉ）において、Ｒ1は炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数１〜８のアルケニル基、炭素数１〜８のアルキニル基を示す。
【００１７】
前記炭素数１〜８のアルキル基としては、直鎖状であっても分岐鎖状であっても良く、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、又はオクチル基等が挙げられる。前記炭素数１〜８のアルコキシ基としては、アルキル部分が上記アルキル基であるアルコキシ基が挙げられる。前記炭素数２〜８のアルケニル基としては、ビニル基、アリル基等が挙げられる。前記炭素数２〜８のアルキニル基としては、エチニル基、プロピニル基等が挙げられる。
【００１８】
上記アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基は置換基を有していても良く、置換基としては、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基等が挙げられる。
【００１９】
Ｒ1として、好ましくは炭素数１〜８のアルキル基であり、より好ましくは炭素数１〜４の低級アルキル基であり、最も好ましくはエチル基である。
【００２０】
Ｒ2は炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数２〜８のアルケニル基、炭素数２〜８のアルキニル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数６〜１４の複素環残基を示す。
【００２１】
上記アルキル基、アルコキシ基、アルケニル基およびアルキニル基は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、前記Ｒ1における例示と同様の基が挙げられる。炭素数６〜１４のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。炭素数６〜１４の複素環残基としては、ピリジル基等が挙げられる。
【００２２】
なお、上記のアルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、および複素環残基は、置換基を有していても良く、置換基としては、前記Ｒ1において例示したものと同様の置換基が挙げられる。
【００２３】
Ｒ2として、好ましくはメチル基、プロピル基、ペンチル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、フェニル基であり、最も好ましくはイソプロピル基である。
【００２４】
なお、前記式（Ｉ）においてＲ1が炭素数１〜４のアルキル基であり、Ｒ2が炭素数１〜８のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基であるアミド化合物、即ち、下記式（ＩＩＩ）；
【００２５】
【化７】
（式中、Ｒ3は炭素数２〜４のアルキル基、Ｒ4は炭素数１〜８のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基を示す。）で表されるアミド化合物またはその塩は、文献未収載の新規化合物である。ラセミ体の前記アミド化合物（ＩＩＩ）を本発明の方法で不斉加水分解して得られる光学活性なアミド化合物（ＩＩＩ）も、言うまでもまく、新規化合物である。
【００２７】
上記β−アミノニトリルのアミド化合物（Ｉ）は、ラセミ体であっても良く、また低光学純度のものであっても良い。ラセミ体β−アミノニトリルのアミド化合物（Ｉ）は、例えばＵＳ５９０２８８３公報に記載の方法により、ラセミ体３−アミノペンタンニトリルに代表されるラセミ体β−アミノニトリル化合物を合成後、このものに酸無水物あるいは酸クロライドを公知の方法で反応させることにより得られる。
【００２８】
本発明において使用する不斉加水分解活性をもつ酵素源は、前記式（Ｉ）に示されるラセミ体β−アミノニトリルのアミド化合物を不斉加水分解する能力を有すれば酵素種を問わないが、その中でもリパーゼ類、エステラーゼ類、プロテアーゼ類、アミダーゼ類、アシラーゼ類と称される酵素が特に有効である。
【００２９】
そのような酵素源としては、特に制限はないが、代表的なものとして、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、クラビスポラ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ）属 、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属 、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属 、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属に属する微生物由来の酵素源があげられ、好ましくは、アルカリゲネス・ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）クレブシエラ・プランティコラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）、コリネバクテリウム・フラベセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ノカルディア・グロベルーラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、キャンディダ・キャンタレリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ）、キャンディダ・カテヌラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｔｅｎｕｌａｔａ）、キャンディダ・グイリアモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、キャンディダ・モギ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍｏｇｉｉ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・ベルサティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、クリプトコッカス・フミコラス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｈｕｍｉｃｏｌｕｓ）、クリプトコッカス・ラウレンティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、クラビスポラ・ルシタニエ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、デバリオマイセス・カルソニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｓｏｎｉｉ）、デバリオマイセス・カステリ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌｌｉｉ）、ピキア・ブルトニ（Ｐｉｃｈｉａ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）、ピキア・カルソニ（Ｐｉｃｈｉａ ｃａｒｓｏｎｉｉ）、トロコスポロン・カタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ）等の微生物に由来する酵素源である。
【００３０】
より好ましくはアルカリゲネス・ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＩＦＯ１３１１１、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＩＦＯ１３２６３、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＩＦＯ１２６１２、クレブシエラ・プランティコラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）ＩＦＯ３３１７、コリネバクテリウム・フラベセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ１４１３６、ノカルディア・グロベルーラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）ＩＦＯ１３５１０、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ３２４３、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ３３８４、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＩＦＯ１２３２０、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＩＡＭ１４７４、キャンディダ・キャンタレリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ）ＩＦＯ１２６１、キャンディダ・カテヌラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｔｅｎｕｌａｔａ）ＩＦＯ７４５、キャンディダ・グイリアモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）ＩＦＯ４５４、キャンディダ・モギ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍｏｇｉｉ）ＩＦＯ４３６、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＩＦＯ６１８、キャンディダ・ベルサティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）ＩＦＯ１２２８、クリプトコッカス・フミコラス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｈｕｍｉｃｏｌｕｓ）ＩＦＯ１５２７、クリプトコッカス・ラウレンティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）ＩＦＯ６０９、クラビスポラ・ルシタニエ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）ＩＦＯ１０１９、デバリオマイセス・カルソニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｓｏｎｉｉ）ＩＦＯ９４６、デバリオマイセス・カルソニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｓｏｎｉｉ）ＩＦＯ７９５、デバリオマイセス・カステリ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌｌｉｉ）ＩＦＯ１３５９、ピキア・ブルトニ（Ｐｉｃｈｉａ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）ＩＦＯ８４４、トロコスポロン・カタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ）ＩＦＯ１１９８に由来する酵素源である。
【００３１】
最も好ましくは、コリネバクテリウム・フラベセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ１４１３６、ノカルディア・グロベルーラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）ＩＦＯ１３５１０、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ３４２３、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ） ＩＦＯ３３８４に由来する酵素源である。
【００３２】
これらの微生物は、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）、あるいは東京大学応用微生物研究所微生物微細藻類総合センター（ＩＡＭ）等から入手することができるが、自然界から分離することもできる。なお、これらの微生物に変異を生じさせてより本反応に有利な性質を有する株を得ることもできる。
【００３３】
また、これらの微生物から単離した酵素遺伝子を通常の方法で各種宿主ベクター系に導入した遺伝子操作微生物の利用も可能である。
【００３４】
本発明においては、酵素源として、上記微生物を適当な培地中で培養して得られる微生物培養液を使用できるほか、培養液の処理物を使用することもできる。該処理物としては、微生物培養液から遠心分離などの集菌操作によって得られる培養上清、微生物菌体、微生物菌体の破砕物、該破砕物より得られる無細胞抽出物、固定化菌体、精製された精製酵素、固定化酵素等が挙げられる。
【００３５】
本発明においては、前記酵素源を通常１種類用いて不斉加水分解反応を実施するが、同様な能力を有する２種類以上のそれを混合して反応を行なうことも可能である。
【００３６】
本発明においてこれらの微生物を培養するための培地としては、通常これらの微生物が生育し得るものであればいずれのものでも使用できる。炭素源としては、たとえばグルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、酢酸、クエン酸、フマル酸等の有機酸あるいはその塩、エタノール、グリセロール等のアルコール類等を使用できる。窒素源としては、たとえば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、アミノ酸等の一般天然窒素源のほか、各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。その他、無機塩、微量金属塩、ビタミン等が必要に応じて添加される。
【００３７】
また、高い酵素活性を得るために、エステル結合あるいはアミド結合をもつ化合物、例えば前記式（Ｉ）で示されるβ−アミノニトリルのアミド化合物等を酵素産生の誘導物質として培地に添加することも有効である。
【００３８】
微生物の培養は常法に従って行なえばよく、たとえば、ｐＨ４〜１０、温度１５〜４５℃の範囲で６〜９６時間培養するのが好ましい。
【００３９】
本発明において、前記式（Ｉ）で示されるラセミ体β−アミノニトリルのアミド化合物の光学選択的加水分解による光学活性β−アミノニトリル化合物およびその対掌体アミド化合物の製造は以下の方法で行なうことができる。反応溶媒に基質である前記式（Ｉ）で示されるラセミ体β−アミノニトリルのアミド化合物を溶解もしくは懸濁する。また、基質を反応溶媒に添加する前にあるいは添加した後に触媒となる上記加水分解能力を有する酵素源を添加する。そして、反応温度、必要により反応ｐＨを制御しながら反応を行う。
【００４０】
反応液の基質濃度は０．０１〜５０重量％の間で特に制限は無いが、生産性を考慮すると０．１〜３０質量％が好ましい。
【００４１】
反応液の酵素濃度は、通常０．０１〜５０重量％であり、好ましくは０．０５〜３０質量％である。
【００４２】
反応液のｐＨは、用いる酵素の至適ｐＨに依存するが、一般的にはｐＨ４〜１１の範囲である。化学的加水分解による収率の低下およびラセミ化による光学純度の低下等抑制する観点からｐＨ５〜９で行なうのが好ましい。加水分解が進行するに従いｐＨが変化するが、この場合は適当な中和剤、例えば、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、塩酸、等を添加して最適ｐＨに調整することが望ましい。
【００４３】
反応温度は５〜７０℃が好ましく、１０〜５０℃がより好ましい。
【００４４】
反応溶媒は、通常イオン交換水、緩衝液等の水性媒体を使用するが、有機溶媒を含んだ系でも反応を行なうことができる。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等のアルコール系溶媒、ペンタン、ヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒、塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン等ケトン系溶媒、その他アセトニトリル等を適宜使用できる。
【００４５】
これらの有機溶媒を水への溶解度以上に加えて２相系で反応を行なうことも可能である。有機溶媒を反応系に共存させることで、選択率、変換率、収率などが向上する場合も多い。
【００４６】
反応は、通常、ラセミ体のアミド化合物（Ｉ）の半量程度が加水分解されるまで反応をおこなう。通常、１時間〜１週間、好ましくは１〜７２時間であり、そのような時間で反応が終了する反応条件を選択することが好ましい。なお、求められる生成物の光学純度や収率に応じて、反応の初期段階で反応を中断したり、あるいは過剰に反応させてもよい。
【００４７】
上記の反応により、前記式（Ｉ）で示されるβ−アミノニトリルのアミド化合物が立体選択的に加水分解され、光学活性β−アミノニトリル（ＩＩ）および未反応の対掌体アミド化合物が生成する。生成した光学活性β−アミノニトリル（ＩＩ）および未反応の対掌体アミド化合物は反応混合液から抽出、蒸留、再結晶、カラム分離など公知の方法によって単離することができる。
【００４８】
例えばｐＨを酸性に調整後、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；ヘキサン、オクタン、ベンゼン等の炭化水素類；塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素等一般的な溶媒により、生成した光学活性β−アミノニトリル（ＩＩ）を水相に残存させたまま未反応の対掌体アミド化合物を選択的に抽出することができる。一方、生成した光学活性β−アミノニトリル（ＩＩ）は、例えばｐＨを塩基性に調整後、同様に一般的な有機溶媒で抽出分離することができる。
【００４９】
生成物の光学純度は必要に応じてアシル化等により誘導体に変換した後、光学活性カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、測定することができる。例えば、本反応により得られる光学活性３−アミノペンタンニトリルはベンゾイルクロライドでアシル化した後、光学分割カラム（ダイセル化学工業社製キラルセルＯＤ）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により決定することができる。
【００５０】
未反応の対掌体アミド化合物は光学活性を維持したままアミド部分を通常の方法で加水分解することができ、上記反応で得られた光学活性β−アミノニトリル（ＩＩ）とは逆の立体配置を有するβ−アミノニトリルに導くことができる。
【００５１】
また、光学活性β−アミノニトリル（ＩＩ）は光学活性を維持したままアミド化することができる。このようにアミド化して得られたアミド化合物を同基質として本発明の酵素反応を複数回繰り返すことにより、より光学純度の高い目的化合物を得ることも可能である。
【００５２】
また、本発明により得られた光学活性β−アミノニトリル化合物は、その光学活性を維持したまま酸処理等によりニトリルを加水分解することにより、容易に光学活性β−アミノ酸カルボン酸アミド化合物およびβ−アミノ酸を製造することができる。
【００５３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。なお、以下の記載において、「％」は特に断らない限り「重量％」を意味する。また、β−アミノニトリル化合物の分析は以下の条件にて実施した。
定量分析
ガスクロマトグラフィー
カラム：ＤＢ−６２４（Ｊ＆Ｗ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）（０．５３ｍｍＸ３０ｍ）
検出：ＦＩＤ
カラム温度：１７０℃
注入温度：２００℃
検出温度：２００℃
キャリアーガス：ヘリウム（１００ｋＰａ）
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
薄層プレート：ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ２５４（メルク社製）
展開溶媒：ｎ−ブタノール／酢酸／水＝４／１／１
検出：ニンヒドリン
光学異性体分析
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
カラム：キラルセルＯＤ（ダイセル化学工業社製）
移動相：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝９／１
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
カラム温度：室温
流速：１．０ｍＬ／分
【００５４】
（実施例１）Ｎ−アセチル−３−アミノペンタンニトリルの製造方法
３−アミノペンタンニトリル９．８ｇとピリジン１０．３ｇを塩化メチレン１００ｍＬに溶解させ、氷冷下、無水酢酸１１．２ｇを滴下し、氷冷下で１時間、室温で４時間攪拌した。この反応液に２規定塩酸２００ｍＬ加えた後、塩化メチレン相と水相に分液した。塩化メチレン相を２規定水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、粗オイルを得た。このオイルを蒸留精製し、Ｎ−アセチル−３−アミノペンタンニトリル３．９ｇを得た。収率２８％。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：４．０４−３．９８（１Ｈ，ｍ），２．６８（２Ｈ，ｄｑ），２．０３（１Ｈ，ｓ），１．６５−１．７２（２Ｈ，ｍ），０．９９（３Ｈ，ｔ）。
赤外吸収スペクトルνｃｍ-1：３２８８，２９６８，２９３４，２２４５，１６５１，１５４９，１３７５，１３０６，１１３８，１０７８，９６２，７４８，６２１，６０８。
【００５５】
（実施例２）
表１記載の微生物を、ペプトン１０ｇ、肉エキス１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる滅菌培地１０ｍｌ（ｐＨ７．２）を入れた試験管に植菌し、３０℃で２日間往復振盪しながら培養した。次に各試験管から培養液２ｍＬをとり、遠心分離により菌体を回収後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬで１回洗浄した。菌体を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍＬに懸濁し、あらかじめラセミ体Ｎ−アセチル−３−アミノペンタンニトリル２．５ｍｇをいれた試験管に加えて、３０℃にて１８時間振盪しながら反応した。反応液上清４μＬを上記条件による薄層クロマトグラフィー上で展開させ、ニンヒドリンによる発色から生成した３−アミノペンタンニトリルを定量した。生成した光学活性３−アミノペンタンニトリルを塩基性条件下にてジニトロベンゾイルクロライドを作用させて誘導体化し、ＨＰＬＣを用いて光学純度を分析した。結果を表１に示す。
【００５６】
【表１】
（実施例３）
表２記載の微生物を、グルコース４０ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸水素二アンモニウム６．５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．８ｇ、硫酸亜鉛７水和物６０ｍｇ、硫酸鉄７水和物９０ｍｇ、硫酸銅５水和物５ｍｇ、硫酸マンガン４水和物１０ｍｇ、塩化ナトリウム１００ｍｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる滅菌培地１０ｍｌ（ｐＨ７．０）を入れた試験管に植菌し、３０℃で２日間往復振盪しながら培養した。次に試験管から培養液１．５ｍＬをとり、遠心分離により菌体を回収後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬで１回洗浄した。菌体を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍＬに懸濁し、あらかじめラセミ体Ｎ−アセチル−３−アミノペンタンニトリル２．５ｍｇをいれた試験管に加えて、３０℃にて１８時間振盪しながら反応した。生成した光学活性３−アミノペンタンニトリルを実施例１と同様の方法で分析した。結果を表２に示す。
【００５８】
【表２】
（実施例４）Ｎ−ブチリル−３−アミノペンタンニトリルの製造方法
３−アミノペンタンニトリル９．８ｇとピリジン１０．３ｇを塩化メチレン１００ｍＬに溶解させ、氷冷下、無水酪酸１７．４ｇを滴下し、氷冷下で１時間、室温で４時間攪拌した。反応終了後、２規定塩酸２００ｍＬで３回、２規定水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬで３回、飽和食塩水２００ｍＬで１回洗浄した。洗浄した反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去し、粗オイルを得た。このオイルを蒸留精製し、Ｎ−ブチリル−３−アミノペンタンニトリル８．４ｇを得た。収率５０％。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：４．０１−４．０５（１Ｈ，ｍ），２．６８（２Ｈ，ｄｑ），２．１９（２Ｈ，ｔ），１．６１−１．７２（２Ｈ×２，ｍ），０．９５−１．０１（３Ｈ×２，ｍ）。
赤外吸収スペクトルνｃｍ-1：３２７７，２９６６，２２４５，１６４７，１５５１，１４５８，１２８８，１２１５，１１３８，９５７，８９５。
【００６０】
（実施例５）Ｎ−ヘキサノイル−３−アミノペンタンニトリルの製造方法
３−アミノペンタンニトリル９．８ｇとピリジン１０．３ｇを塩化メチレン１００ｍＬに溶解させ、氷冷下、無水カプロン酸２３．６ｇを滴下し、氷冷下で１時間、室温で４時間攪拌した。反応終了後、２規定塩酸２００ｍＬで３回、２規定水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬで３回、飽和食塩水２００ｍＬで１回洗浄した。洗浄した反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去し、Ｎ−ヘキサノイル−３−アミノペンタンニトリル１８．４ｇを得た。収率９４％。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：４．００−４．０５（１Ｈ，ｍ），２．６８（２Ｈ，ｄｑ），２．２０（２Ｈ，ｔ），１．６１−１．７２（２Ｈ×２，ｍ），１．３１−１．３５（２Ｈｘ２，ｍ），０．８９−１．０１（３Ｈ×２，ｍ）。
赤外吸収スペクトルνｃｍ-1：３２９０，２９６１，２９３２，２３５９，２２４９，１６４７，１５４１，１４６０。
【００６１】
（実施例６）Ｎ−イソブチリル−３−アミノペンタンニトリルの製造方法
３−アミノペンタンニトリル９．８ｇとピリジン１０．３ｇを塩化メチレン１００ｍＬに溶解させ、氷冷下、無水イソ酪酸１７．４ｇを滴下し、氷冷下で１時間、室温で４時間攪拌した。反応終了後、２規定塩酸２００ｍＬで３回、２規定水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬで３回、飽和食塩水２００ｍＬで１回洗浄した。洗浄した反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去し、Ｎ−イソブチリル−３−アミノペンタンニトリル１７．５ｇを得た。収率８９％。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：３．９８−４．０３（１Ｈ，ｍ），２．６８（２Ｈ，ｄｑ），２．３６−２．４３（１Ｈ，ｍ），１．６６−１．７３（２Ｈ，ｍ），１．２８−１．１６（３Ｈ×２，ｍ），０．９９（３Ｈ，ｔ）。
赤外吸収スペクトルνｃｍ-1：３２８６，２９７４，２２４５，１６５１，１５４１，１２６３，１２４２，１１３６，１０９５，９５１，７２１。
【００６２】
（実施例７）Ｎ−イソペンタノイル−３−アミノペンタンニトリルの製造方法３−アミノペンタンニトリル９．８ｇとピリジン１０．３ｇを塩化メチレン１００ｍＬに溶解させ、氷冷下、無水イソ吉草酸２０．５ｇを滴下し、氷冷下で１時間、室温で４時間攪拌した。反応終了後、２規定塩酸２００ｍＬで３回、２規定水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬで３回、飽和食塩水２００ｍＬで１回洗浄した。洗浄した反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去し、Ｎ−イソペンタノイル−３−アミノペンタンニトリル１５．０ｇを得た。収率８２％。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：４．００−４．０７（１Ｈ，ｍ），２．６８（２Ｈ，ｄｑ），２．０５−２．１５（１Ｈ×１，２Ｈ×１，ｍ），１．６１−１．７４（２Ｈ，ｍ），０．９６−１．０１（３Ｈ×３，ｍ）。
赤外吸収スペクトルνｃｍ-1：３２７９，２９５９，２２４５，１６４５，１５５３，１３７１，１３０６，１２５９，１２２１，１１４０，７２７，６０９。
【００６３】
（実施例８）Ｎ−ピバロイル−３−アミノペンタンニトリルの製造方法
３−アミノペンタンニトリル９．８ｇとピリジン１０．３ｇを塩化メチレン１００ｍＬに溶解させ、氷冷下、ピバリン酸クロライド１３．３ｇを滴下し、氷冷下で１時間、室温で４時間攪拌した。反応終了後、２規定塩酸２００ｍＬで３回、２規定水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬで３回、飽和食塩水２００ｍＬで１回洗浄した。洗浄した反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去し、Ｎ−ピバロイル−３−アミノペンタンニトリル１４．７ｇを得た。収率８１％。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：３．９５−４．０３（１Ｈ，ｍ），２．６８（２Ｈ，ｄｑ），１．６８−１．７６（２Ｈ，ｍ），１．２２−１．２７（３Ｈ×３，ｍ），０．９９（３Ｈ，ｔ）。
赤外吸収スペクトルνｃｍ-1：３３２９，２９６２，２２５１，１６３６，１５３３，１３６４，１３０４，１２２３，１１３２，１０７８，８９１，６８１。
【００６４】
（実施例９）Ｎ−ベンゾイル−３−アミノペンタンニトリルの製造方法
３−アミノペンタンニトリル９．８ｇとピリジン１０．３ｇを塩化メチレン１００ｍＬに溶解させ、氷冷下、ベンゾイルクロライド１５．５ｇを滴下し、氷冷下で１時間、室温で４時間攪拌した。反応終了後、２規定塩酸２００ｍＬで３回、２規定水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬで３回、飽和食塩水２００ｍＬで１回洗浄した。洗浄した反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去し、Ｎ−ベンゾイル−３−アミノペンタンニトリル１８．６ｇを得た。収率９２％。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：７．４４−７．７９（５Ｈ，ｍ），４．２０−４．２８（１Ｈ，ｍ），２．８１（２Ｈ，ｄｑ），１．７８−１．８６（２Ｈ，ｍ），１．０７（３Ｈ，ｔ）。
赤外吸収スペクトルνｃｍ-1：３２３０，２９７２，２２５１，１６３７，１５２９，１３１３，１０７６，７００。
【００６５】
（実施例１０）
表３記載の微生物を、実施例２と同様に培養した。各培養液１０ｍＬをとり、遠心分離により菌体を回収後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍＬで１回洗浄した。菌体を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬに懸濁し、あらかじめ表３記載の基質３７．５μｍｏｌをいれた試験管に加えて、３０℃にて１９〜４５時間振盪しながら反応した。生成した光学活性３−アミノペンタンニトリルを実施例１と同様の方法で分析した。結果を表３に示す。
【００６６】
【表３】
（実施例１１）
ノカルディア・グロベルーラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ） ＩＦＯ１３５１０株を、ペプトン２０ｇ、肉エキス１０ｇ、酵母エキス５ｇ、グルコース１０ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、アデカノール１滴（いずれも１Ｌ当たり）、の組成からなる滅菌培地４００ｍｌ（ｐＨ７．２）を入れた坂口フラスコに植菌し、２９℃で２日間往復振盪しながら培養した。培養液を遠心分離し、菌体を回収後、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍＬで１回洗浄した。菌体を２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４０ｍＬに懸濁し、菌体懸濁液とした。あらかじめ基質であるラセミ体Ｎ−イソブチリル−３−アミノペンタンニトリル３５７μｍｏｌをいれた試験管に菌体懸濁液３ｍＬ加えて、３０℃にて２５時間振盪しながら反応した。反応液１００μＬをとり、これに２Ｎ水酸化ナトリウム１００μＬ、酢酸エチル１ｍＬを加えて十分攪拌し、遠心分離した後、その酢酸エチル相をガスクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣを用いて分析したところ、変換率２６％で９８．２％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−３−アミノペンタンニトリルが生成していた。
【００６８】
（実施例１２）
ノカルディア・グロベルーラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ） ＩＦＯ１３５１０株を、実施例１１と同様に培養し、菌体懸濁液を調製した。あらかじめ基質であるラセミ体Ｎ−イソブチリル−３−アミノペンタンニトリル７．１３ｍｍｏｌをいれた坂口フラスコに菌体懸濁液３０ｍＬ加えて、３０℃にて６４時間振盪しながら反応した。この反応液に２Ｎ塩酸を加えてｐＨ５とし、酢酸エチル３０ｍＬを加えて十分攪拌し、遠心分離した後、その酢酸エチル相を除いた。これに２Ｎ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ１０とした後、酢酸エチル９０ｍＬを用いて抽出した。抽出溶媒を無水硫酸ナトリウムで脱水後、蒸留にて精製を行ない、３−アミノペンタンニトリル１３９ｍｇを取得した。これをガスクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣを用いて光学純度を分析したところ、Ｒ体で９７．９％ｅ．ｅ．であった。
【００６９】
（実施例１３）
実施例１１記載の液体培地４Ｌを１０Ｌ容のジャーファーメンターに入れて殺菌後、これに実施例１１記載の培養方法で得られるノカルディア・グロベルーラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）ＩＦＯ１３５１０の培養液４０ｍＬを無菌的に接種し、通気０．５ｖｖｍ、温度２８℃、攪拌数２６０ｒｐｍにて５６時間培養した。得られた培養液から菌体を回収し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１．５Ｌに懸濁した。あらかじめラセミ体Ｎ−イソブチリル−３−アミノペンタンニトリル３０ｇをいれた５Ｌ容のジャーファーメンターに上記菌体懸濁液を加え、３０℃で２６時間攪拌しながら反応を行なった。反応終了後、１５％硫酸を加えてｐＨ４に調整後、反応液に対して２．５倍容量の塩化メチレンを用いた抽出操作を２回行ない、Ｎ−イソブチリル−３−アミノペンタンニトリルを回収した。水相を３０％水酸化ナトリウムを用いてｐＨ１１に調整後、反応液に対して２．５倍容量の塩化メチレンを用いた抽出操作を３回行ない、３−アミノペンタンニトリルを回収した。それぞれの抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下にて溶媒を留去し、３−アミノペンタンニトリル５．８ｇ、およびＮ−イソブチリル−３−アミノペンタンニトリル１８．１ｇを取得した。得られた３−アミノペンタンニトリルをベンゾイルクロライドで誘導体化後、ＨＰＬＣにて光学純度を分析したところ、Ｒ体９８．２％ｅ．ｅ．であった。1Ｈ−ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ3）：０．９８（３Ｈ，ｔ），１．４３−１．６３（２Ｈ，ｍ），２．４２（２Ｈ，ｄｑ），２．９２−３．０８（１Ｈ，ｍ）。
【００７０】
また、Ｎ−イソブチリル−３−アミノペンタンニトリルの光学純度を下記条件で分析したところ、Ｓ体６１．２％ｅ．ｅ．であった。
［キャピラリーガスクロマトグラフィー分析条件］
カラム：ＡＳＴＥＣ社製Ｃｈｉｒａｌｄｅｘ Ｇ−ＴＡ（２０ｍ×０．２５ｍｍ）
検出：ＦＩＤ、カラム温度：１３０℃、注入温度：２００℃、検出温度：２００℃、キャリアーガス：ヘリウム（１４０ｋＰａ）。
【００７１】
【発明の効果】 本発明は、不斉加水分解活性を有する酵素源を作用させて、β−アミノニトリルのアミド化合物を立体選択的に加水分解させることにより、光学活性β−アミノニトリル化合物および対掌体アミド化合物を効率よく製造することができる。
Claims (17)
- 一般式（Ｉ）；
- Ｒ2がメチル基、プロピル基、イソプロピル基、イソブチル基、ピバロイル基、フェニル基である請求項１記載の製造方法。
- Ｒ2がイソプロピル基である請求項１記載の製造方法。
- Ｒ1が炭素数１〜４のアルキル基である請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
- Ｒ1がエチル基である請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
- 酵素源がアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属 、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、クラビスポラ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物の培養液またはその処理物である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
- 酵素源がアルカリゲネス・ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）クレブシエラ・プランティコラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）、コリネバクテリウム・フラベセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ノカルディア・グロベルーラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、キャンディダ・キャンタレリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ）、キャンディダ・カテヌラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｔｅｎｕｌａｔａ）、キャンディダ・グイリアモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、キャンディダ・モギ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍｏｇｉｉ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・ベルサティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、クリプトコッカス・フミコラス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｈｕｍｉｃｏｌｕｓ）、クリプトコッカス・ラウレンティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、クラビスポラ・ルシタニエ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、デバリオマイセス・カルソニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｓｏｎｉｉ）、デバリオマイセス・カステリ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌｌｉｉ）、ピキア・ブルトニ（Ｐｉｃｈｉａ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）、ピキア・カルソニ（Ｐｉｃｈｉａ ｃａｒｓｏｎｉｉ）、トロコスポロン・カタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ）からなる群から選択される少なくとも１種の微生物の培養液またはその処理物である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
- 酵素源がアルカリゲネス・ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＩＦＯ１３１１１、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＩＦＯ１３２６３、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＩＦＯ１２６１２、クレブシエラ・プランティコラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）ＩＦＯ３３１７、コリネバクテリウム・フラベセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ１４１３６、ノカルディア・グロベルーラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）ＩＦＯ１３５１０、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ３４２３、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ３３８４、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＩＦＯ１２３２０、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＩＡＭ１４７４、キャンディダ・キャンタレリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ）ＩＦＯ１２６１、キャンディダ・カテヌラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｔｅｎｕｌａｔａ）ＩＦＯ７４５、キャンディダ・グイリアモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）ＩＦＯ４５４、キャンディダ・モギ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍｏｇｉｉ）ＩＦＯ４３６、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＩＦＯ６１８、キャンディダ・ベルサティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）ＩＦＯ１２２８、クリプトコッカス・フミコラス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｈｕｍｉｃｏｌｕｓ）ＩＦＯ１５２７、クリプトコッカス・ラウレンティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）ＩＦＯ６０９、クラビスポラ・ルシタニエ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）ＩＦＯ１０１９、デバリオマイセス・カルソニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｓｏｎｉｉ）ＩＦＯ９４６、デバリオマイセス・カルソニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓｃａｒｓｏｎｉｉ）ＩＦＯ７９５、デバリオマイセス・カステリ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌｌｉｉ）ＩＦＯ１３５９、ピキア・ブルトニ（Ｐｉｃｈｉａ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）ＩＦＯ８４４、トロコスポロン・カタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ）ＩＦＯ１１９８からなる群から選択された１種類以上の微生物の菌体、培養液、それらの処理物、および／またはこれら微生物から得られる酵素であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
- 酵素源がコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）からなる群から選択された１種類以上の微生物の菌体、培養液、それらの処理物、および／またはこれら微生物から得られる酵素であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
- 酵素源が、コリネバクテリウム・フラベセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ノカルディア・グロベルーラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）からなる群から選択される少なくとも１種の微生物の培養液またはその処理物ある請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
- 酵素源がコリネバクテリウム・フラベセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ１４１３６、ノカルディア・グロベルーラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）ＩＦＯ１３５１０、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ３２４３、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ３３８４からなる群から選択されされる少なくとも１種の微生物の培養液またはその処理物である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
- 酵素源がノカルディア・グロベルーラ（Ｎｏｃａｒｄｉａｇｌｏｂｅｒｕｌａ）ＩＦＯ１３５１０の培養液またはその処理物である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
- 酵素源として微生物菌体を用いることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の製造方法。
- 一般式（ＩＩＩ）；
- Ｒ4がメチル基、プロピル基、イソプロピル基、イソブチル基、ピバロイル基、フェニル基である請求項１４記載のアミド化合物またはその塩。
- Ｒ3がエチル基である請求項１４〜１５のいずれかに記載のアミド化合物またはその塩。
- 光学活性体である請求項１４〜１６のいずれかに記載のアミド化合物またはその塩。
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