EA010305B1 - Стереоселективное биопревращение алифатических динитрилов в цианокарбоновые кислоты - Google Patents

Стереоселективное биопревращение алифатических динитрилов в цианокарбоновые кислоты Download PDF

Info

Publication number
EA010305B1
EA010305B1 EA200601574A EA200601574A EA010305B1 EA 010305 B1 EA010305 B1 EA 010305B1 EA 200601574 A EA200601574 A EA 200601574A EA 200601574 A EA200601574 A EA 200601574A EA 010305 B1 EA010305 B1 EA 010305B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cyano
formula
alkyl
unchanged
acid
Prior art date
Application number
EA200601574A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200601574A1 (ru
Inventor
Майкл Пол Бернс
Джастин Кейн Уивер
Джон Винг Вонг
Original Assignee
Пфайзер Продактс Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Пфайзер Продактс Инк. filed Critical Пфайзер Продактс Инк.
Publication of EA200601574A1 publication Critical patent/EA200601574A1/ru
Publication of EA010305B1 publication Critical patent/EA010305B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/002—Nitriles (-CN)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/20—Oxygen containing
    • Y10T436/200833—Carbonyl, ether, aldehyde or ketone containing
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/20—Oxygen containing
    • Y10T436/207497—Molecular oxygen

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к регио- и стереоселективному биопревращению ряда алифатических динитрилов в соответствующие цианокарбоновые кислоты. Более конкретно, в настоящем изобретении предложены способы превращения 2-изобутилсукцинонитрила в (S)-3-циано-5-метилгексановую кислоту, представляющую собой полезное промежуточное соединение в синтезе (S)-3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (прегабалина). Прегабалин может быть использован для лечения некоторых церебральных заболеваний, например, в лечении и профилактике эпилептических припадков, боли и психотических расстройств.

Description

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к новым биокаталитическим способам регио- и стереоселективного превращения выбранных алифатических динитрилов в соответствующие цианокарбоновые кислоты. Более конкретно, в настоящем изобретении предложены способы превращения 2-изобутилсукцинонитрила в (8)-3-циано-5-метилгексановую кислоту, представляющую собой полезное промежуточное соединение для синтеза (8)-3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (прегабалин). Прегабалин может быть использован для лечения ряда церебральных заболеваний, например в лечении и профилактике эпилептических припадков, боли, и психотических расстройств. Поскольку прегабалин эффективен в улучшении церебральных функций, он также полезен при лечении гериатрических пациентов.
Предшествующий уровень техники
Ферментативный гидролиз органических нитрилов до соответствующих карбоновых кислот и амидов представляет собой важный альтернативный способ синтеза широкого спектра полезных соединений. Обычный химический гидролиз нитрилов до соответствующих карбоновых кислот и амидов, как правило, осуществляют с использованием в качестве катализатора сильной кислоты или основания в сочетании с высокими температурами реакции, что делает его непригодным для соединений, содержащих чувствительные функциональные группы. Кроме того, низкая селективность химического гидролиза может привести в результате к нежелательным побочным продуктам наряду со значительными количествами неорганических солей. Напротив, ферментативный гидролиз нитрилов происходит в мягких условиях (нейтральный рН, 30°С), обеспечивающих возможность для высокой хемо-, регио- и стереоселективности. В качестве дополнительного преимущества, он позволяет избежать образования в качестве побочных продуктов неорганических солей.
Наиболее известным промышленным применением нитрилконвертирующих ферментов является получение акриламида (Т. Ыадазата е! а1., Т1Ы!есй., 1992, νοί. 10, 402-408) и никотинамида (Т. Ыадазата с1 а1., Αρρί. ΕηνίΓοη. М1сгоЫю1., 1998, νοί. 54, 1766-1769) с использованием нитрилгидратазы Вйойососсиз гНобосНгоиз Л. В нескольких недавних обзорах (Ь. МагЦпкота е! а1., СиггсгИ Огдашс Сйет1зйу, 2003, νοί. 7, 1279-1295 и Ό. Οο\νηη е! а1., Ех!геторЫ1ез, 1998, νο1. 2, 207-216) описана биохимия и возможные промышленные применения нитрилконвертирующих ферментов.
Ферментативный гидролиз нитрилов катализируется нитрилазами, превращающими нитрилы в соответствующие карбоновые кислоты, и нитрилгидратазами, превращающими нитрилы в соответствующие амиды. Для превращения нитрилов в карбоновые кислоты могут быть использованы амидазы, гидролизующие амиды до соответствующих карбоновых кислот, в комбинации с нитрилгидратазами.
Применение фермента нитрилазы для получения карбоновой кислоты из соответствующего нитрила раскрыто в УО 02/072856. Включение фермента в структурированную полимерную матрицу позволяет получить катализатор, обладающий улучшенной физической и биохимической целостностью.
Региоселективное получение ω-нитрилкарбоновых кислот из алифатических α,ω-динитрилов с помощью биокатализатора раскрыто в патенте США № 5,814,508. Например, катализатор, обладающий нитрилазной активностью, использовали для превращения 2-метилглутаронитрила в 4-цианопентановую кислоту.
К. УататоЮ. е! а1. 1. ЕегтеШ. Вюепщпееппд. 1992, νο1. 73, 125-129 описывает применение микробных клеток, обладающих нитрилгидратазной и амидазной активностью, для превращения тиранс-1,4дицианоциклогексана в транс А-цианоциклогексанкарбоновую кислоту.
Для ряда алифатических α,ω-динитрильных соединений сообщалось о региоселективных биокаталитических превращениях динитрилов в цианозамещенные карбоновые кислоты с использованием микробных клеток, обладающих активностью алифатической нитрилазы, или комбинацией нитрилгидратазной и амидазной активностей (I. Е. Сауадап е! а1. 1. Огд. С1ет., 1998, νο1. 63,4792-4801).
Стереоселективные ферментативные превращения нитрилов описаны для получения хиральных карбоновых кислот и амидов, обогащенных одним энантиомером (М У1езег е! а1., С1ар!ег ίη 8!егеозе1есНсе Вюса!а1уз1з, Магсе1 Эеккег 1пс.: №\ν Уогк, 2000, 461-486). Фермент стереоселективную нитрилазу из Л1саНдепе8 каеса11з АТСС 8750 используют для получения (В)-миндальной кислоты из рацемического манделонитрила (К. Уатато!о е! а1., Αρρ11. ΕηνΕοη. МкгоЫюк, 1991, νο1. 57, 3028-3032). Нитрилаза из РНобососсиз гйойосйтоиз ЫС1МВ 11216 преимущественно гидролизует (+)-2-метилгексанитрил в рацемической смеси 2-метилгексанитрила, при этом (-)-2-метилгексанитрил не вступает в реакцию (М. Сгаб1еу е! а1., Вю!есйпо1оду Ьей., 1994, νο1. 16, 41-46). В патенте США № 5,593,871 раскрыт способ получения амидов 2-алкановой кислоты, обогащенных одним энантиомером, из нитрилов с использованием микроорганизмов, содержащих стереоселективные нитрилгидратазы. Энантиомерно чистые α-аминокислоты и амиды получали из рацемических α-арил- и α-алкилзамещенных глициннитрилов с использованием Кйойососсиз зр. Л1270, содержащего стереоселективную нитрилгидратазу и стереоселективную амидазу (М.-С. ХУамд е! а1., ί. Огд. С1ет., 2002, νο1. 67, 6542). Вышеуказанные ссылки включены в данное описание путем ссылки.
Было обнаружено, что терапевтическая ценность рацемического прегабалина, в особенности его эффективность в качестве противосудорожного средства, обусловлена прежде всего (8)-энантиомером. В
- 1 010305 процессе решения задачи обеспечения рентабельной лекарственной терапии прегабалином исследовали множество путей синтеза соединения, обогащенного (8)-энантиомером. Например, асимметричное гидрирование соответствующего цианозамещенного олефина с последующим восстановлением цианогруппы до соответствующего амина позволяет получить прегабалин, существенно обогащенный (8)энантиомером (публикация заявки на патент США № 2003/0212290).
Синтез прегабалина, его производных и аналогов чисто химическими способами раскрыт в патентах США 6,642,398; 6,635,673 и 6,046,353.
Краткое изложение сущности изобретения
В способе в соответствии с настоящим изобретением регио- и стереоселективные биокаталитические превращениия алифатических динитрилов в цианокарбоновые кислоты осуществляют с использованием ферментативных катализаторов, обладающих нитрилазной активностью.
Настоящее изобретение относится к новому способу получения (8)-энантиомера соединения формулы I
где С3 имеет (8)-конфигурацию;
Я1 представляет собой водород, (С1-С6)алкил или фенил; и
Я2 представляет собой (С1-С8)эалкил, (С2-С8)эалкенил, (С3-С8)циклоалкил, -О(С1-С6)алкил, -СН2СН2-О-(С1-С6)алкил, (С1-С6)алкил-ОН, -фенил-(С1-С6)алкил-ОН, -фенил-О-(С1-С6)алкил, фенил или замещенный фенил;
при условии, что когда Я2 представляет собой метил, тогда Я1 представляет собой водород, (С1С6)алкил или фенил;
включающий стадии:
(1а) приведения соединение формулы II
в реакционной среде в контакт с ферментным катализатором, обладающим нитрилазной активностью; и (1б) выделения (8)-изомера соединения формулы I из реакционной среды и возможно выделения неизмененного (Я)-изомера соединения II.
Соединения формулы I полезны для синтеза соединений, обладающих фармацевтической активностью, таких как прегабалин.
В предпочтительном воплощении изобретения Я1 и Я2 независимо представляет собой водород или С1-С3алкил.
В предпочтительном воплощении изобретения соединение формулы II представляет собой рацемическую смесь, содержащую 3Я и 38 изомеры.
Предпочтительное воплощение настоящего изобретения представляет собой способ, посредством которого рацемический 2-изобутил-сукцинонитрил (соединение формулы II, где Я1 представляет собой Н, и Я2 представляет собой метил) превращают в (8)-3-циано-5-метилгексановую кислоту (соединение формулы I, где Я1 представляет собой Н и Я2 представляет собой метил), включающий стадии:
(2а) приведения рацемического 2-изобутил-сукционитрила в реакционной среде в контакт с ферментным катализатором, обладающим нитрилазной активностью, и (2б) выделения (8)-3-циано-5-метилгексановой кислоты из водной смеси и возможно выделения неизмененного (Я)-2-изобутилсукцинонитрила.
Предпочтительно реакционная среда представляет собой водную среду.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения выделенный и неизмененный (Я)-изомер соединения II затем рацемизируют путем нагревания со слабым основанием в присутствии органического растворителя. Предпочтительное основание представляет собой 1,8-диазабицикло[5.4.0.]ундец-7-ен, а предпочтительный растворитель представляет собой толуол. Возможно получающийся в результате рацемат II может быть возвращен в любой из вышеуказанных способов на стадиях (1а) или (2а).
В одном из воплощений настоящего изобретения ферментный катализатор представлен в форме целых микробных клеток, экстрактов микробных клеток, частично очищенных ферментов, очищенных
- 2 010305 ферментов или ферментных катализаторов, иммобилизованных на подложке.
В еще одном воплощении настоящего изобретения ферментный катализатор представляет собой частично очищенный фермент. Примеры частично очищенных примеров включают ΝΙΤ-101, ΝΙΤ-102, ΝΙΤ-103 (ВюСа!а1уйс8 1пс., Ракабеиа, СА) и нитрилазу из АгаЫборкгк !йайапа (1ийсй Рше Сйетгса1к, 1ийсй, Сегтаиу), но не ограничиваются ими.
В предпочтительном воплощении в соответствии с настоящим изобретением катализатор, представляющий собой фермент нитрилазу, иммобилизован на подложке. Примеры иммобилизованных катализаторов, представляющих собой фермент нитрилазу, включают ΝΙΤ-102 С2 (ВюСа!а1уйс8 1ис., Ракабеиа, СА), ΝΙΤ-102, иммобилизованный на Еирегдй (Войт СтйН & Со. КС, Эагт81аб1. Сегтаиу), и нитрилазу из АгаЫборкгк !йайапа, иммобилизованную на Еирегдй, но не ограничиваются ими. В предпочтительном воплощении иммобилизованный катализатор, представляющий собой фермент нитрилазу, представляет собой ΝΙΤ-102 С2.
В еще одном воплощении реакционные среды состоят из дистиллированной воды или забуференной воды. Предпочтительно забуференная вода забуферена до рН в диапазоне от приблизительно 5,0 до приблизительно 10,0 и наиболее предпочтительно до рН в диапазоне от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0.
Настоящее изобретение также относится к способу получения (8)-3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (прегабалина), включающему стадии:
(а) приведения рацемического 2-изобутил-сукцинонитрила в реакционной среде в контакт с ферментным катализатором, обладающим нитрилазной активностью;
(б) выделения (8)-3-циано-5-метилгексановой кислоты из реакционной среды;
(в) превращения (8)-3-циано-5-метилгексановой кислоты в ее соль и (г) гидрирования указанной соли кислоты с получением (8)-3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (прегабалин).
Предпочтительно соль кислоты имеет формулу
где М представляет собой №, К, Ы, ΝΗ4, ΝΗ2Β6Β7, ΝΗ3Β' или ΝΗ(Β6)2Β7, где каждый из В6 и В7 независимо представляет собой (С1-С6)алкил.
Далее для удобства представлены некоторые термины, использованные в описании, примерах и формуле изобретения. Если не указано иное, все использованные здесь технические и научные термины имеют значение, как правило, очевидное для специалистов в области техники, к которой относится изобретение.
Термин алкил представляет собой прямую или разветвленную группу, состоящую из 1-8 атомов углерода, включая метил, этил, пропил, бутил, изобутил и трет-бутип, но ими не ограничен.
Использованный здесь термин циклоалкил включает группировки, являющиеся производными циклических углеводородов, содержащих от трех до семи атомов углерода в кольце, включая циклические углеводородные группировки, замещенные прямыми или разветвленными алкильными группировками.
Использованный здесь термин алкокси означает алкил-О-, где алкил является таким, как определено выше.
Термин алкенил включает углеводородные цепи, имеющие прямую или разветвленную конфигурацию, содержащие одну или более углерод-углеродных двойных связей, которые могут находиться в любой стабильной точке вдоль цепи, такие как этенил и пропенил. Алкенильные группы обычно содержат от 2 до приблизительно 12 атомов углерода, более типично от 2 до приблизительно 8 атомов углерода.
Использованный здесь термин рацемат означает эквимолярную смесь пары энантиомеров. Рацемат обычно образуется тогда, когда в результате синтеза образуется стереоцентр. Использованный здесь термин рацемическая смесь обозначает рацемат.
Использованный здесь термин энантиомеры относится к соединениям, которые на молекулярном уровне являются ненакладываемыми с зеркальными изображениями друг друга. Энантиомеры могут существовать в (В) или (8) конфигурации.
Использованный здесь термин стереоселективный синтез относится к химической реакции, которая ведет к образованию одного стереоизомера или энантиомерно-обогащенной смеси изомеров из числа двух или более возможных стереоизомеров.
Использованный здесь термин региоселективная относится к реакции, которая происходит по одному атому или одной группе атомов из числа двух или более возможных атомов или групп атомов. Региоселективный гидролиз динитрила приводит в результате к превращению одной нитрильной группы в карбоксильную группу.
- 3 010305 °С оозначает градусы Цельсия;
Использованный здесь термин ферментный катализатор означает катализатор, который характеризуется нитрилазной активностью или комбинацией нитрилгидратазной активности и амидазной активности. Катализатор может находиться в форме целой микробной клетки, пермеабилизованной(ых) микробной(ых) клетки(ок), одного или более компонентов микробного клеточного экстракта, частично очищенного(ых) фермента(ов) или очищенного(ых) фермента(ов).
Использованный здесь термин энантиомерный избыток относится к выраженной в процентах мольной фракции основного энантиомера в смеси энантиомеров.
Термин водная реакционная смесь означает смесь субстрата и ферментного катализатора в преимущественно водной среде.
Термин нитрилазная активность означает ферментативную активность, которая превращает нитрильную группу в группу карбоновой кислоты.
Использованный здесь термин нитрилгидратазная активность означает ферментативную активность, которая превращает нитрильную группу в амидную группу.
Термин амидазная активность означает ферментативную активность, которая превращает амидную группу в группу карбоновой кислоты.
АТСС представляет собой Американскую коллекцию типовых культур (Атепсап Туре СиНигс Со11есбоп), расположенную по адресу 10801 ишуегЩу Вои1еуагб. Мапаззаз, Уа., 20110-2209, и.8.А. ВюСа1а1убсз 1пс. расположена по адресу 129 N. НШ Ауепие, 8ийе 103, Разабепа, СА, 91106, и.8.А. 1ийсй Рше Сйетюак СтЬН расположена по адресу Вибо1Г-8сйи11еп-81гаВе 5, Ό-52428 1ийсй, Сегтапу.
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении предложен ферментативный способ получения алифатических цианокарбоновых кислот формулы I из динитрилов формулы II. Для получения динитрильных (II) исходных веществ может быть использован любой подходящий способ, обычно используемый в данной области техники.
Схема 1 относится к конкретному воплощению настоящего изобретения, в котором для превращения 2-изобутилсукцинонитрила (V) в (8)-3-циано-5-метилгексановую кислоту (VI) применяют хемоферментативный способ. Соединение VI может быть использовано в качестве промежуточного соединения в синтезе прегабалина (VII) так, как это проиллюстрировано на схеме 2. На стадии 3 схемы 1 изображена рацемизация побочного продукта (В)-изомера Ща) и последующий его возврат на стадию 2.
На стадии 1 схемы 1 рацемический 2-изобутил-сукцинонитрил (V) получают путем конденсации изовалерианового альдегида (III) с этилцианоацетатом (IV) с последующим добавлением КСК Рацемат имеет место в силу наличия стереоцентра, возникающего на атоме углерода С3 в V.
На стадии 2 схемы 1 изображен регио- и стереоселективный гидролиз рацемата динитрила V с получением (8)-3-циано-5-метилгексановой кислоты (VI) и неизмененного (В)-изомера V.
Катализируемый нитрилазой гидролиз 2-изобутил-сукцинонитрила (V) до (8)-3-циано-5-метилгексановой кислоты VI является региоселективным и стереоселективным. Региоселективность основана на превращении цианогруппы в карбоксильную группу только на атоме углерода С1. Реакция стереоселективна в том, что (8)-энантиомер соединения V преимущественно вовлечен в превращение, тогда как (В)-энантиомер по существу остается неизменным.
В соответствии со схемой 2 соль А1а 8-цианокислоты VI гидрируют на следующей стадии с получением (8)-3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (прегабалин). Реакцию осуществляют в присутствии катализатора гидрирования, предпочтительно никеля Рэнея. Приемлемые соли кислоты включают соединения формулы ΥΕι, где М представляет собой №, К, Ь1, ΝΗ4, ΝΗ2Β6Β7, ΝΗ3Β6 или ΝΗ(Β6)2Β7, где В6 и В7 независимо представляют собой (С1-С6)алкил.
Схема 1
- 4 010305
В регио- и стереоселективном превращении рацемата V в (8)-цианокислоту VI в соответствии со схемой I фермент нитрилаза взаимодействует преимущественно с (8)-энантиомером. Соответственно, реакционная смесь во все большей степени обогащается (К)-энантиомером να по мере осуществления превращения.
Задача настоящего изобретения также заключается в том, чтобы избежать экономических потерь путем возвращения в оборот или повторного использования неизмененного (Я)-динитрила να. Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ рацемизации (К)-динитрила (стадия 3, схема 1) и последующего возвращения в оборот посредством стадии 2 схемы 1.
Различные ферменты в соответствии с настоящим изобретением, обладающие нитрилазной активностью или комбинацией нитрилгидратазной и амидазной активностей, могут быть обнаружены путем использования протоколов скрининга, таких как методики выделения с обогащением, согласно которым сначала отбирают микроорганизмы на основании их способности расти в средах, обогащенных нитрилом. Методики выделения с обогащением, как правило, включают использование сред с ограничением по углероду или азоту, обогащенных нитрилом, который может представлять собой нитрильный субстрат для желаемого биопревращения или структурно родственное нитрильное соединение. Микроорганизмы, которые обладают нитрилазной активностью, первоначально могут быть отобраны по их способности расти в среде, обогащенной нитрилом. Сауадап с1 а1., (Арр1. МкгоЬюЕ Вю1сс1ню1. (1999) νοί. 52, 654-659) применял методики с обогащением для выделения из почвы грамотрицательной бактерии Ас1άονοπιχ £асй18 72^ (АТСС 55746), используя 2-этилсукцинонитрил в качестве единственного источника азота. Показано, что Ααάονοπιχ £асШк 72\С (АТСС 55746) полезен для селективного превращения 2метилглутаронитрила в 4-цианопентановую кислоту. Методику с обогащением также использовали для выделения термофильной бактерии ВасШик раШбик Эас521. которая катализирует превращение 3цианопиридина в никотиновую кислоту (А1ша!а^ай апб ΕοίΜ-ιη, Епхутс МюгоЬ. Тсс1ню1. (1999) νοί. 25, 718-724). Микроорганизмы, выделенные при помощи методик с обогащением, могут быть протестированы на нитрилгидролизующую активность путем приведения суспензий микробных клеток в контакт с нитрильным соединением и тестирования на присутствие соответствующей карбоновой кислоты с использованием соответствующих аналитических способов, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография, газожидкостная хроматография или жидкостная хроматография/масс-спектрометрия (ЖХ/МС). О методиках тестирования нитрилгидролизующей активности Αάάονοπιχ £асШк 72\С (АТСС 55746) сообщается в патенте США № 5,814,508.
После выделения микроорганизма, обладающего нитрилазной активностью или нитрилгидратазной и амидазной активностями, для улучшения различных аспектов этих фермента(ов) может быть использована ферментная инженерия. Эти улучшения могут быть полезны для настоящего изобретения и включают увеличение селективности, каталитическую эффективность фермента, стабильность при более высоких температурах и более широком диапазоне рН, и дают ферменту возможность функционировать в реакционной среде, включающей смесь водного буфера и органического растворителя.
Разнообразные методики, которые могут быть использованы в настоящем изобретении для получения ферментного катализатора, обладающего нитрилазной активностью или нитрилгидратазной и амидазной активностями, в дополнение к улучшенному выходу, производительности и качеству продукта, подходящего для конкретного способа биопревращения, включают методики ферментной инженерии, такие как способы рационального конструирования, которые включают сайт-направленный мутагенез и методики направленной эволюции с использованием способов случайного мутагенеза или «перетасовки» ДНК, но не ограничиваются ими.
Подходящие ферментные катализаторы для превращения соединений формулы II в соединения формулы I представлены в форме целых микробных клеток, пермеабилизованных микробных клеток, экстрактов микробных клеток, частично очищенных ферментов или очищенных ферментов, и такие катализаторы могут быть иммобилизованы на подложке.
Этот способ можно осуществлять в одну фазу путем приведения 2-изобутилсукцинонитрила в контакт с ферментным катализатором в дистиллированной воде или водном растворе буфера, который будет поддерживать исходное значение рН реакционной смеси между 5,0 и 10,0, предпочтительно между 6,0 и 8,0. Подходящие буферы включают фосфат калия и ацетат кальция. По мере протекания реакции рН реакционной смеси может меняться вследствие образования аммониевой соли карбоновой кислоты из соответствующей нитрильной функциональной группы динитрила. Реакция может проходить в отсутствие контроля рН, либо по мере протекания реакции для поддержания желаемого значения рН могут быть
- 5 010305 добавлены подходящие кислота или основание. Однако, как указано выше, с помощью таких методик, как ферментная инженерия и направленная эволюция, можно получать ферментные катализаторы, которые эффективно действуют в более широких диапазонах рН.
Этот способ может быть осуществлен в реакционных смесях, состоящих из двух фаз: водной фазы, которая первоначально содержит фермент и растворенный 2-изобутил-сукцинонитрил, и органической фазы, которая состоит в основном из рацемического 2-изобутил-сукцинонитрила. Двухфазные реакционные смеси готовят путем добавления 2-изобутил-сукцинонитрила к водному раствору фермента и буферного агента таким образом, чтобы добавленное количество 2-изобутил-сукцинонитрила превышало предел его водной растворимости. Предел водной растворимости 2-изобутил-сукцинонитрила в 50 мМ фосфате калия (30°С, рН 7,5) составляет приблизительно 0,06 М. В ходе реакции образуется аммониевая соль (8)-3-циано-5-метилгексановой кислоты, и ее концентрация в водной фазе увеличивается, тогда как органическая фаза уменьшается в объеме и обогащается (К.)-2-изобутил-сукцинонитрилом. Альтернативно, этот способ также может быть осуществлен в реакционных смесях, состоящих из трех фаз: водной фазы, которая первоначально содержит растворенный 2-изобутил-сукцинонитрил, органической фазы, состоящей в основном из рацемического 2-изобутил-сукцинонитрила, и твердой фазы, состоящей из фермента, иммобилизованного на нерастворимой подложке. Трехфазные реакционные смеси готовят с помощью методики, описанной для двухфазной реакционной смеси, за исключением того, что вместо неиммобилизованного фермента используют фермент, иммобилизованный на нерастворимой подложке.
Возможно, фермент может быть иммобилизован в полимерной матрице или на нерастворимой подложке. Иммобилизованные ферментные катализаторы могут быть использованы повторно и в непрерывных способх и могут быть отделены от продуктов ферментативного способа легче, нежели неиммобилизованные ферментные катализаторы. Способы иммобилизации ферментов в полимерной матрице, такой как альгинат кальция или полиакриламид, или на нерастворимой подложке, такой как целит, хорошо известны специалистам в данной области техники. ΝΙΤ-102 С2 (ВюСа1а1убс8 1пс., Ракабеиа, СА), представляющий собой фермент нитрилазу, иммобилизованный на нерастворимой подложке, особенно полезен для превращения ΙΙ в ΙΙΙ, поскольку он может быть повторно использован в периодических или непрерывных способах. Концентрацию ΝΙΤ-102 С2, используемого в реакции, выбирают таким образом, чтобы достигать желаемой скорости реакции, и она зависит от специфической активности катализатора и концентрации субстрата. Как правило, ΝΙΤ-102 С2 используют в диапазоне от приблизительно от 0,001 г до 0,3 г влажной массы на 1 мл реакционного объема, причем предпочтительный диапазон составляет от 0,01 до 0,15 г влажной массы на 1 мл реакционного объема.
Кроме того, для превращения ΙΙ в ΙΙΙ также подходят несколько лиофилизированных лизатов, полученных из микробных клеток и обозначенных ΝΙΤ-101, ΝΙΤ-102, ΝΙΤ-103 (ВюСа1а1убс§ 1ис., Ракабеиа, СА), а также нитрилаза из АгаЫбор818 ШаПаиа (бйПсП Рше СйетюаП, бйПсП, Сегтаиу). Контакт ΝΙΤ-101, ΝΙΤ-102, ΝΙΤ-103 и нитрилазы из А. Шайаиа с Ι в водной реакционной смеси приводит в результате к образованию ΙΙ. Реакции с использованием ΝΙΤ-101, ΝΙΤ-102, ΝΙΤ-103 и нитрилазы из АгаЫбор818 Шайаиа могут быть осуществлены в двухфазных реакционных смесях с использованием концентраций катализатора, находящихся в диапазоне 0,001-0,04 г сухой массы на 1 мл реакционного объема, причем предпочтительный диапазон составляет 0,002-0,02 г сухой массы на 1 мл реакционного объема.
Температуру реакции гидролиза выбирают таким образом, чтобы оптимизировать скорость реакции и стабильность активности ферментного катализатора. Температура реакционной смеси может варьровать от точки замерзания суспензии (прибл. 0°С) до 60°С, причем предпочтительный диапазон температуры реакции составляет от 5 до 35°С.
Выделение (38) изомера соединения формулы Ι и выделение неизмененного (3В) изомера соединения формулы ΙΙ может быть осуществлено с использованием подходящих способов разделения, выделения и очистки, хорошо известных специалистам в данной области техники.
В предпочтительном способе выделения неизмененный (3В) изомер соединения формулы ΙΙ отделяют от основной водной реакционной смеси путем экстракции органическим растворителем, таким как этилацетат. (38) изомер соединения формулы Ι в виде соли кислоты предпочтительно растворяют в водном слое и затем выделяют путем подкисления и экстракции органическим растворителем, таким как этилацетат.
Соединения формулы Ι могут быть использованы для синтеза соединений, таких как прегабалин, которые полезны для лечения таких расстройств, как эпилепсия, судороги, тревога, боль и нейродегенеративные расстройства, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Гентингтона и болезнь Паркинсона.
Примерами конкретных соединений формулы Ι являются следующие соединения: (8)-3-циано-5-метил-октановая кислота;
(8)-3 -циано-5-метил-гептановая кислота;
(8)-3-циано-5-метил-гексановая кислота;
(8)-3 -циано-5-метил-нонановая кислота;
(8)-3-циано-5-этокси-гексановая кислота;
(8)-3-циано-5-циклогексил-гексановая кислота и
- 6 010305 (8)-3 -циано-5-трифторметил-гексановая кислота.
Пример 1. Получение 2-изобутил-сукцинонитрила.
Смесь этилцианоацетата (733 г, 6,48 моль), изовалерианового альдегида (613,9 г, 7,13 моль), пиперидина (5,5 г, 0,065 моль) и гексана (0,5 л) помещали в условия кипячения с обратным холодильником с непрерывным удалением воды. Когда вода больше не собиралась, смесь охлаждали и перегоняли в вакууме для удаления растворителя. К оставшемуся маслу добавляли изопропанол (1 л), а затем раствор цианида калия (422 г, 6,48 моль) в воде (2 л). В ходе добавления раствора цианида калия реакционную смесь поддерживали при температуре ниже 35°С, а затем выдерживали при приблизительно 35°С в течение 4 ч. Реакционную смесь перегоняли при атмосферном давлении до тех пор, пока температура не достигала 95°С, а затем кипятили с обратным холодильником при этой температуре в течение 5 ч. Реакционную смесь охлаждали, разбавляли водой (0,5 л) и экстрагировали 1 л метил-трет-бутилового эфира (МТВЕ). МТВЕ экстракт промывали водой (0,5 л), сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением 873,4 г 2-изобутил-сукцинонитрила в виде масла. Очищенные образцы 2-изобутил-сукцинонитрила могут быть получены путем вакуумной перегонки (90°С при 36,66 Па (0,275 мм Нд)).
'|| ЯМР (СОС13, 400 МГц): δ 0.93-0.99 (т, 6Н), 1.43-1.50 (т, 1Н), 1.71-1.78 (т, 1Н), 1.81-1.91 (т, 1Н), 2.69 (б, 2Н, 1=6,5 Гц), 2.90-2.97 (т, 1Н).
Пример 2. Получение (8)-3-диано-5-метилгексановой кислоты из 2-изобутил-сукцинонитрила с ΝΙΤ-101, ΝΙΤ-102, ΝΙΤ-103 и нитрилазой АтаЫборык (йайапа.
В каждый из трех стеклянных сосудов с завинчивающимися пробками объемом 8 мл помещали 2изобутил-сукцинонитрил (20 мг), 1 мл 50 мМ буфера на основе фосфата калия (рН 7,5, 2 мМ дитиотреитола (ΌΤΤ)) и 10 мг фермента нитрилазы, выбранного из ΝΙΤ-101, ΝΙΤ-102 или ΝΙΤ-103 (Вюса1а1у1Ю8 1пс., Ракабепа, СА). В один стеклянный сосуд с завинчивающейся пробкой объемом 8 мл помещали 2изобутил-сукцинонитрил (20 мг) и 1 мл раствора нитрилазы АтаЫборкщ (йайапа в 50 мМ фосфатном буфере (рН 7,8), содержащем 100 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 2 мМ ΌΤΤ (1ййсй Еше Сйепйсай. 1ййсй, Сеттапу). Четыре реакционные смеси перемешивали при помощи магнитных мешалок в течение 15 ч при 30°С и затем индивидуально экстрагировали этилацетатом (2x6 мл). После удаления этилацетатных экстрактов водные фазы обрабатывали 4н. НС1 (0,15 мл) и экстрагировали этилацетатом (3х 6 мл). Этилацетатные экстракты подкисленных водных фаз концентрировали в вакууме с получением 7,8 мг (выход 34,2%), 8,8 мг (выход 38,6%), 8,1 мг (выход 35,5%) и 4,0 мг (выход 17,5%) (8)3-циано-5-метилгексановой кислоты ((8)-СМНА) для реакций, проведенных соответственно с ΝΙΤ-101, ΝΙΤ-102, ΝΙΤ-103 и нитрилазой А. (йайапа. Образцы (8)-3-циано-5-метилгексановой кислоты, полученные в результате каждой из реакций, обрабатывали избытком (триметилсилил)диазометана с получением их производных в виде метилового эфира и анализировали при помощи газовой хроматографии (ГХ) на колонке Сй1га1бех™ С-ΤΑ (30 М х 0,25 мм внутренний диаметр (в.д.), толщина пленки 125 микрон) для определения энантиомерной чистоты. Энантиомерная чистота продуктов реакции с ΝΙΤ-101, ΝΙΤ-102, ΝΙΤ-103 и нитрилазой А. 1йайапа составляла соответственно 96,3%, 91,1%, 95,5% и 98,5% э.и. (э.и. означает энантиомерный избыток).
Пример 3. Получение (8)-3-циано-5-метилгексановой кислоты из 2-изобутил-сукцинонитрила с ΝΙΤ-102.
В реакционный сосуд с рубашкой объемом 125 мл, в котором поддерживали 30°С, помещали 2изобутил-сукцинонитрил (3,33 г), ΝΙΤ-102 (0,5 г) и 122 мл 50 мМ буфера на основе фосфата калия (рН 7,5), содержащего 5 мМ ΌΤΤ и 1 мМ ЭДТА (реакционный буфер). После перемешивания в течение 12,5 ч смесь продуктов экстрагировали этилацетатом (4 х 50 мл). Этилацетатные экстракты удаляли и водную фазу доводили до рН 2,5 с помощью 4М НС1 и экстрагировали этилацетатом (3x50 мл). Этилацетатные экстракты подкисленной водной фазы объединяли, сушили безводным Мд8О4, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением 1,56 г (8)-СМНА (41,1%). Образец продукта реакции обрабатывали (триметилсилил)диазометаном и анализировали при помощи ГХ в соответствии с примером 2 с установлением энантиомерной чистоты 98,5% э.и.
'|| ЯМР (СПС13, 400 МГц): δ 0.93-0.97 (т, 6Н), 1.30-1.37 (т, 1Н), 1.61-1.68 (т, 1Н), 1.82-1.89 (т, 1Н), 2.57-2.63 (т, 1Н), 2.72-2.78 (т, 1Н), 2.98-3.06 (т, 1Н).
Пример 4. Получение (8)-3-циано-5-метилгексаноата калия из 2-изобутил-сукцинонитрила с ΝΙΤ102 С2.
В каждый из двух реакционных сосудов с рубашками объемом 125 мл, в которых поддерживали 30°С, помещали 2-изобутил-сукцинонитрил (6,81 г), ΝΙΤ-102 С2 (1,70 г) и 118,2 мл реакционного буфера. После перемешивания в течение 24 ч смеси продуктов декантировали, оставляя ферментный катализатор в реакционных сосудах. В каждый из реакционных сосудов добавляли реакционный буфер (20 мл), перемешивали в течение приблизительно 2 мин и затем декантировали и добавляли к смесям продуктов. Реакции повторяли путем добавления в каждый из реакционных сосудов 2-изобутил-сукцинонитрила (6,81 г) и реакционного буфера (118,2 мл) и перемешивания реакционных смесей в течение 24 ч. После завершения четырех реакций в каждом сосуде (всего восемь периодических реакций) смеси продуктов объе- 7 010305 диняли и экстрагировали МТВЕ (3 х 500 мл). Экстракты МТВЕ удаляли и водную фазу доводили до рН
2.1 фосфорной кислотой и экстрагировали МТВЕ (2 х 500 мл). МТВЕ эктракт подкисленной водной фазы концентрировали в вакууме с получением масла, которое обрабатывали водой (100 мл) и КОН (8,5 г). Получающийся в результате раствор концентрировали в вакууме с получением 24,2 г (31,3%) (8)-3циано-5-метилгексаноата калия. Из (8)-3-циано-5-метилгексаноата калия получали метил-(8)-3-циано-5метилгексаноат и анализировали при помощи хиральной ГХ с установлением энантиомерной чистоты
99.1 % э.и.
1Н ЯМР (И2О, 400 МГц): δ 0.75-0.78 (т, 6Н), 1.18-1.25 (т, 1Н), 1.43-1.50 (т, 1Н), 1.53-1.68 (т, 1Н), 2.28-2.38 (й, 2Н, 1=6,5 Гц), 2.86-2.93 (т, 1Н).
Пример 5. Получение (8)-3-циано-5-метилгексановой кислоты из 2-изобутил-сукцинонитрила с ΝΙΤ-102 С2 в атмосфере азота.
В реакционный сосуд с рубашкой объемом 125 мл, в котором поддерживали 30°С, помещали 2изобутил-сукцинонитрил (6,53 г), ΝΙΤ-102 С2 (2,61 г), 120 г реакционного буфера и продували азотом. Получающуюся в результате смесь перемешивали в течение 24 ч и затем декантировали в стеклянный сосуд объемом 250 мл, оставляя катализатор в реакционном сосуде. Реакцию повторяли путем повторной загрузки в реакционный сосуд, содержащий используемый катализатор, 2-изобутилсукцинонитрила (6,53 г) и 120 г реакционного буфера, продувания азотом и перемешивания получающейся в результате смеси в течение 24 ч. Образцы реакционной смеси (0,1 мл) смешивали с 0,4 мл смеси вода:метанол:трифторуксусная кислота (60:40:0,09, об./об./об.) и анализировали посредством ВЭЖХ на колонке 8утте1гу™ С8 (150 х 3,9 мм), поддерживаемой при 30°С. Колонку элюировали смесью вода:метанол:трифторуксусная кислота (60:40:0,09, об./об./об.) и осуществляли детектирование с использованием рефрактометрического детектора.
В общей сложности были осуществлены пятьдесят периодических реакций с возвращением в оборот катализатора. Смеси продуктов из двух следующих друг за другом периодических реакций объединяли и экстрагировали этилацетатом (2 х 150 мл). Водную фазу затем доводили до рН 2 с использованием 4М НС1 и экстрагировали этилацетатом (2х150 мл). Этилацетатные экстракты подкисленной водной фазы объединяли, сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением (8)-СМНА. В общей сложности в результате пятидесяти периодических реакций получили 160,8 г (выход 43,2%) (8)-СМНА. Исходные скорости для первой, двадцать шестой и пятидесятой реакции составляли соответственно 14,8, 17,4 и 15,1 мМ (8)-СМНА/ч. Анализ путем хиральной ГХ производного (8)-СМНА в виде метилового эфира, выделенного из периодических реакций с 39-ой по 50-ую, выявил среднюю энантиомерную чистоту 99,0 % э.и.
Пример 6. Получение (8)-3-циано-5-метилгексановой кислоты из 2-изобутилсукцинонитрила с ΝΙΤ102 С2 в атмосфере окружающей среды.
Серии периодических реакций для превращения 2-изобутил-сукцинонитрила в (8)-СМНА с использованием ΝΙΤ-102 С2 проводили так, как описано в примере 5, за исключением того, что реакции осуществляли в атмосфере окружающей среды вместо атмосферы азота. Образцы реакционной смеси анализировали путем ВЭЖХ, как описано в примере 5.
В общей сложности были осуществлены пятьдесят периодических реакций с возвращением в оборот катализатора в атмосфере окружающей среды. Исходные скорости реакций, определенные в образцах реакционной смеси, отобранных через четыре часа, составляли 14,2, 13,2 и 9,3 мМ (8)-СМНА/ч для первой, двадцать шестой и пятидесятой реакции соответственно.
Пример 7. Получение (8)-3-циано-5-метилгексаноата трет-бутиламмония.
Смеси продуктов превращения 2-изобутил-сукцинонитрила в (8)-СМНА (пример 6, реакции 37-44) объединяли и экстрагировали этилацетатом (2 х 250 мл). Этилацетатные экстракты сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением масла (32,5 г, выход 62,2%), которое представляло собой в основном (К.)-2-изобутил-сукцинонитрил. Водную фазу доводили до рН 2 с помощью 4М НС1 и экстрагировали этилацетатом (2 х 250 мл). Этилацетатные экстракты концентрировали до объема 470 мл и затем перемешивали, одновременно добавляя по каплям третбутиламин (15,9 мл, 151,5 ммоль). Образовавшуюся белую кристаллическую соль собирали путем фильтрации и сушили на воздухе в течение ночи с получением 30,0 г (8)-3-циано-5-метилгексаноата трет-бутиламмония. Метил-(8)-3-циано-5-метилгексаноат получали из (8)-3-циано-5-метилгексаноата трет-бутиламмония и анализировали путем хиральной ГХ с установлением энантиомерной чистоты 99,5% э.и.
'Н ЯМР (СИС13, 400 МГц): δ 0.90-0.94 (т, 6Н), 1.26-1.32 (т, 10Н), 1.54-1.61 (т, 1Н), 1.78-1.88 (т, 1Н), 2.30-2.35 (т. 1Н), 2.43-2.50 (т, 1Н), 2.96-3.04 (т, 1Н).
Пример 8. Получение (8)-3-аминометил-5-метилгексановой кислоты из (8)-3-циано-5-метилгексаноата калия.
Смесь (8)-3-циано-5-метилгексаноата калия (20 г, 103,5 ммоль), воды (50 мл), 45%-ного КОН (12 г), изопропанола (12 г) и никеля Рэнея встряхивали в течение ночи в шейкере Парра при давлении водорода 344,5 кПа (50 ф./кв.дюйм). Смесь фильтровали, нагревали приблизительно до 50°С, обрабатывали уксус
- 8 010305 ной кислотой (6,5 мл) и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Смесь затем доводили до значения рН 7, чуть больше 7, с помощью 45%-ного КОН и концентрировали в вакууме для удаления большей части изопропанола. К смеси добавляли изопропанол (20 мл) и затем подкисляли уксусной кислотой, перемешивали в течение ночи при комнатной температуре и фильтровали с получением 4,3 г (8)-3-аминометил-5-метилгексановой кислоты в виде белого кристаллического твердого вещества. Путем получения производного (8)-3-аминометил-5-метилгексановой кислоты с помощью реагента Марфея (МагТеу'к геадепО Ыа-(2,4-динитро-5-фторфенил)-Ь-аланинамид) и анализа путем ВЭЖХ на колонке ΒΌ8 Нурегкй С18 (250 х 4,6 мм, 5 мк) с элюцией смесью ацетонитрил:1% триэтиламин (рН 3) (38:62, об./об.) определяли энантиомерную чистоту, которая составила 100% э.и.
Пример 9. Получение (8)-3-аминометил-5-метилгексановой кислоты из (8)-3-циано-5-метилгексаноата трет-бутиламмония.
Смесь (8)-3-циано-5-метилгексаноата трет-бутиламмония (26 г, 113,9 ммоль), воды (48,8 мл), этанола (35,8 мл), КОН (7,2 г, 91% хлопья) и 8ропде №ске1™ (А-7000, 16,3 г влажная масса, АсОуа1еб Ме1а15 & Сйеткак, 1пс., 8еу1егуй1е, ΤΝ) встряхивали в течение ночи в шейкере Парра при давлении водорода 344,5 кПа (50 ф./кв.дюйм). Смесь фильтровали (целит) и остаток на фильтре промывали водой (10 мл) и этанолом (5 мл). К фильтрату добавляли уксусную кислоту (9,4 мл) и получающуюся в результате смесь перемешивали в течение ночи при 4°С. Продукт фильтровали, промывали 10 мл изопропилового спирта и сушили в вакууме с получением 11,1 г (61%) белого твердого вещества. Порцию (10,0 г) этого вещества кристаллизовали из смеси 1:1 изопропилового спирта и воды с получением 8,8 г (8)-3-аминометил-5метилгексановой кислоты с 100% э.и.
Пример 10. Рацемизация (Р)-2-изобутилсукцинонитрила с использованием 1,8-диазабицикло [5.4.0]ундец-7-ена (ЭВИ).
Рацемизацию (Р)-2-изобутил-сукцинонитрила осуществляли на материале, выделенном в результате биопревращения рацемического 2-изобутил-сукцинонитрила с ΝΙΤ-102 С2. Смесь (Р)-2-изобутилсукцинонитрила (1,36 г, 10 ммоль, 69% э.и.), толуола (5 мл) и 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (ЭВИ, 0,076 г, 5 ммоль) кипятили с обратным холодильником в течение 2 ч. К реакционной смеси добавляли воду (10 мл) и получающуюся в результате смесь экстрагировали этилцетатом (2х10 мл). Объединенные органические экстракты последовательно промывали 5%-ной НС1 (20 мл) и насыщенным водным хлоридом натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением рацемического 2-изобутил-сукцинонитрила (1,14 г, 84%). Энантиомерную чистоту определяли путем ГХ с использованием колонки СЫгаИех™ С-ТА (30 М х 0,25 мм в.д., толщина пленки 125 микрон).
Пример 11. Рацемизация (Р)-2-изобутил-сукцинонитрила с использованием АтЬегШе® 1РА-400.
Смолу АтЬегШе® IРА-400 (1 г влажной массы, Ройт & Наак, РЫ1абе1рЫа, РА) перемешивали с 5%-ным №ОН (10 мл) в течение 10 мин и промывали водой до тех пор, пока промывки не стали нейтральными. К смоле добавляли этанол (25 мл) и (Р)-2-изобутил-сукцинонитрил (69% э.и.) и получающуюся в результате смесь кипятили с обратным холодильником в течение 2 ч. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток переносили в этилацетат (25 мл) и промывали водой (3х100 мл). Органическую фазу сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением рацемического 2-изобутил-сукцинонитрила (0,81 г, 81%).

Claims (13)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ получения соединения формулы I где С3 имеет (8)-конфигурацию;
    Р1 представляет собой водород, (С1-С6)алкил или фенил и
    Р2 представляет собой (С1-С8)алкил, (С2-С8)алкенил, (С3-С8)циклоалкил, -О(С1-С6)алкил, -СН2-СН2О-(С1-С6)алкил, (С1-С6)алкил-ОН, -фенил-(С1-С6)алкил-ОН, -фенил-О-(С1-С6)алкил, фенил или замещенный фенил;
    при условии, что когда Р2 представляет собой метил, тогда Р1 представляет собой водород, (С1-С6) алкил или фенил; включающий стадии:
    (а) приведения соединения формулы II
    - 9 010305 в реакционной среде в контакт с ферментным катализатором, обладающим нитрилазной активностью; и (б) выделения (38)-изомера соединения формулы I из реакционной среды и возможно выделения неизмененного (ЗВ)-изомера соединения формулы II.
  2. 2. Способ по п.1, где указанный выделенный неизмененный (ЗВ)-изомер соединения формулы II со стадии (б) рацемизируют в рацемат соединения формулы II путем нагревания этого (ЗВ)-изомера с основанием в присутствии органического растворителя.
  3. 3. Способ по п.2, где стадию (а) повторяют с использованием рацемата, рацемизованного из выделенного неизмененного (ЗВ)-изомера со стадии (б).
  4. 4. Способ по п.1, где указанный ферментный катализатор выбран из группы, состоящей из ШТ-101, МТ-102. ШТ-103 и нитрилазы из ЛгаЫборкщ Юайапа.
  5. 5. Способ по п.1, где указанная реакционная среда состоит из дистиллированной воды или воды, забуференной до рН в диапазоне от приблизительно 5,0 до приблизительно 10,0.
  6. 6. Способ по п.1, где соединение формулы I представляет собой (8)-3-циано-5-метилгексановую кислоту, соединение формулы II представляет собой рацемический 2-изобутилсукцинонитрил, а выделенный неизмененный изомер со стадии (б) представляет собой (К.)-2-изобутилсукцинонитрил.
  7. 7. Способ по п.6, где указанный выделенный неизмененный (К.)-2-изобутилсукцинонитрил со стадии (б) рацемизируют в рацемический 2-изобутилсукцинонитрил путем нагревания с основанием в растворителе.
  8. 8. Способ по п.7, где стадию (а) повторяют с использованием рацемического 2изобутилсукцинонитрила, рацемизированного из выделенного неизмененного (К.)-2-изобутилсукцинонитрила со стадии (б).
  9. 9. Способ получения (8)-3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (прегабалина), включающий стадии:
    (а) приведения 2-изобутилсукцинонитрила в реакционной среде в контакт с ферментным катализатором, обладающим нитрилазной активностью;
    (б) выделения (8)-3-циано-5-метилгексановой кислоты из реакционной среды;
    (в) превращения (8)-3-циано-5-метилгексановой кислоты в соль кислоты и (г) гидрирования этой соли кислоты с образованием (8)-3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (прегабалина).
  10. 10. Способ по п.9, где неизмененную (К.)-3-циано-5-метилгексановую кислоту выделяют из реакционной среды со стадии (а).
  11. 11. Способ по п.9, где указанную неизмененную (К.)-3-циано-5-метилгексановую кислоту со стадии (а) рацемизируют путем нагревания с основанием в присутствии органического растворителя с образованием рацемического 2-изобутилсукцинонитрила и стадию (а) повторяют с использованием указанного рацемического 2-изобутилсукцинонитрила.
  12. 12. Способ по п.9, где указанный ферментный катализатор представляет собой нитрилазу в форме целых микробных клеток, пермеабилизованных микробных клеток, экстрактов микробных клеток, частично очищенных ферментов, очищенных ферментов или ферментного катализатора, иммобилизованного на подложке.
  13. 13. Способ по п.9, где указанный ферментный катализатор выбран из группы, состоящей из ШТЮЦ ШТ-102, ШТ-103 и нитрилазы из ЛгаЫборкщ 1йайапа.
EA200601574A 2004-04-14 2005-04-01 Стереоселективное биопревращение алифатических динитрилов в цианокарбоновые кислоты EA010305B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56213304P 2004-04-14 2004-04-14
PCT/IB2005/000873 WO2005100580A1 (en) 2004-04-14 2005-04-01 Stereoselective bioconversion of aliphatic dinitriles into cyano carboxylic acids

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200601574A1 EA200601574A1 (ru) 2007-04-27
EA010305B1 true EA010305B1 (ru) 2008-08-29

Family

ID=34962755

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200601574A EA010305B1 (ru) 2004-04-14 2005-04-01 Стереоселективное биопревращение алифатических динитрилов в цианокарбоновые кислоты

Country Status (44)

Country Link
US (2) US7727749B2 (ru)
EP (1) EP1745136B1 (ru)
JP (1) JP4051082B2 (ru)
KR (1) KR100887777B1 (ru)
CN (1) CN1942587B (ru)
AP (1) AP2301A (ru)
AR (1) AR048690A1 (ru)
AT (1) ATE445019T1 (ru)
AU (1) AU2005233371B2 (ru)
BR (1) BRPI0509908A (ru)
CA (1) CA2563307C (ru)
CR (2) CR8686A (ru)
CY (1) CY1109556T1 (ru)
DE (1) DE602005017027D1 (ru)
DK (1) DK1745136T3 (ru)
DO (1) DOP2005000055A (ru)
EA (1) EA010305B1 (ru)
EC (1) ECSP066917A (ru)
ES (1) ES2331140T3 (ru)
GE (1) GEP20084530B (ru)
GT (1) GT200500086A (ru)
HK (1) HK1105215A1 (ru)
HN (1) HN2005000162A (ru)
HR (1) HRP20090562T1 (ru)
IL (1) IL177918A (ru)
MA (1) MA28536B1 (ru)
ME (1) ME01107B (ru)
MY (1) MY144296A (ru)
NL (1) NL1028762C2 (ru)
NO (1) NO335624B1 (ru)
NZ (1) NZ549698A (ru)
PA (1) PA8629801A1 (ru)
PE (1) PE20060252A1 (ru)
PL (1) PL1745136T3 (ru)
PT (1) PT1745136E (ru)
RS (1) RS50994B (ru)
SI (1) SI1745136T1 (ru)
SV (1) SV2005002085A (ru)
TN (1) TNSN06329A1 (ru)
TW (1) TWI304095B (ru)
UA (1) UA82292C2 (ru)
UY (1) UY28851A1 (ru)
WO (1) WO2005100580A1 (ru)
ZA (1) ZA200607476B (ru)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100491282B1 (ko) 1996-07-24 2005-05-24 워너-램버트 캄파니 엘엘씨 통증 치료용 이소부틸가바 및 그의 유도체
AT412092B (de) * 2003-02-27 2004-09-27 Dsm Fine Chem Austria Gmbh Verfahren zur herstellung chiraler alpha-hydroxycarbonsäuren durch enzymatische hydrolyse von chiralen cyanhydrinen
US7417165B2 (en) 2005-04-06 2008-08-26 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Crystalline forms of pregabalin
US7488846B2 (en) 2005-04-11 2009-02-10 Teva Pharmaceuical Industries Ltd. Pregabalin free of lactam and a process for preparation thereof
ATE486841T1 (de) 2005-05-10 2010-11-15 Teva Pharma Verfahren zur herstellung von pregabalin und salzen daraus
WO2006122255A1 (en) 2005-05-10 2006-11-16 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Pregabalin free of isobutylglutaric acid and a process for preparation thereof
MX2007014129A (es) 2005-05-10 2008-01-11 Teva Pharma Resolucion optica del acido 3-carbamoilmetil-5-metil hexanoico.
ES2398579T3 (es) 2005-09-19 2013-03-20 Teva Pharmaceutical Industries Ltd Una síntesis asimétrica de ácido (S)-(+)-3-(aminometil)-5-metilhexanoico
US20070141684A1 (en) * 2005-12-21 2007-06-21 Pfizer Inc Preparation of gamma-amino acids having affinity for the alpha-2-delta protein
KR20080027880A (ko) 2006-05-24 2008-03-28 테바 파마슈티컬 인더스트리즈 리미티드 Ｒ-(+)-3-(카바모일메틸)-5-메틸헥산산 및 이의 염의 제조방법
KR20080036060A (ko) * 2006-05-31 2008-04-24 테바 파마슈티컬 인더스트리즈 리미티드 프레가발린의 중간체의 제조에 효소 분할을 이용하는 방법
EP1881077A1 (en) * 2006-07-19 2008-01-23 Solvay Organics GmbH Process for the production of fluorine containing a-hydroxy carboxylic acids
EP2021318A2 (en) 2007-03-22 2009-02-11 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Synthesis of (s)-(+)-3-(aminomethyl)-5-methyl hexanoic acid
WO2009087650A2 (en) * 2007-10-15 2009-07-16 V.B. Medicare Pvt. Ltd. A novel process for synthesis of pregabalin from substituted cyclopropane intermediate and a process for enzymatic resolution of racemic pregabalin
MX2010012698A (es) 2008-05-21 2011-03-15 Sandoz Ag Proceso para la hidrolisis enzimatica estereoselectiva del ester del acido 5-metil-3-nitro-metil-hexanoico.
WO2011011630A2 (en) 2009-07-23 2011-01-27 Codexis, Inc. Nitrilase biocatalysts
WO2011141923A2 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Lupin Limited Improved synthesis of optically pure (s) - 3-cyano-5-methyl-hexanoic acid alkyl ester, an intermediate of (s)- pregabalin
US8604062B2 (en) * 2011-10-20 2013-12-10 Hoffman-La Roche Inc. Process for the preparation of isoxazolyl-methoxy nicotinic acids
CA2888877C (en) * 2012-11-07 2021-07-27 Hikal Limited A process for the preparation of pregabalin
WO2016075082A1 (en) 2014-11-10 2016-05-19 Sandoz Ag Stereoselective reductive amination of alpha-chiral aldehydes using omega-transaminases for the synthesis of precursors of pregabalin and brivaracetam
CN105017072B (zh) * 2015-06-30 2017-10-03 河北诚信有限责任公司 异丁基琥珀腈的合成方法
CN105176955B (zh) 2015-08-27 2018-11-02 浙江工业大学 来源于高山南芥的腈水解酶、基因、载体、工程菌及其应用
CN108424900B (zh) * 2018-02-09 2020-11-03 浙江工业大学 一种腈水解酶突变体及其构建方法和应用
CN114164197B (zh) * 2020-01-13 2023-08-18 浙江工业大学 一种热稳定性和活力提高的腈水解酶突变体及其应用
CN113651717B (zh) * 2021-08-05 2024-08-30 浙江工业大学 一种光学纯异丁基丁二腈的消旋方法
CN116041214A (zh) * 2022-11-15 2023-05-02 奥锐特药业股份有限公司 一种普瑞巴林中间体的制备方法及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5593871A (en) * 1990-09-20 1997-01-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for the preparation of enantiometric 2-alkanoic acid amides from nitriles
US6046353A (en) * 1995-06-07 2000-04-04 Warner-Lambert Company Method of making (S)-3-(aminomethyl)-5-methylhexanoic acid
WO2002095045A2 (fr) * 2001-05-21 2002-11-28 Adisseo France S.A.S. Procede de preparation d'acides carboxyliques aliphatiques par hydrolyse enzymatique de composes nitriles aliphatiques
US20040014195A1 (en) * 1999-12-29 2004-01-22 Diversa Corporation Nitrilases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
WO2004111256A1 (en) * 2003-06-19 2004-12-23 Pfizer Products Inc. Biocatalytic preparation of 1-cyanocyclohexaneacetic acid

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3218133B2 (ja) * 1993-02-03 2001-10-15 三菱レイヨン株式会社 フェニル基を有する光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造法
US5858736A (en) * 1996-05-17 1999-01-12 E. I. Du Pont De Nemours And Company Preparation of lactams from aliphatic α,ω-dinitriles
BR9813284B1 (pt) * 1997-10-27 2012-08-21 aminoácidos cìclicos e derivados dos mesmos úteis como agentes farmacêuticos e composição farmacêutica.
US6642398B2 (en) * 1999-06-10 2003-11-04 Warner-Lambert Company Mono-and disubstituted 3-propyl gamma-aminobutyric acids
US6551804B2 (en) 1999-07-12 2003-04-22 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for preparing 4-cyanopentanoic acid
SI1250311T1 (en) * 2000-01-27 2004-10-31 Warner-Lambert Company Asymmetric synthesis of pregabalin

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5593871A (en) * 1990-09-20 1997-01-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for the preparation of enantiometric 2-alkanoic acid amides from nitriles
US6046353A (en) * 1995-06-07 2000-04-04 Warner-Lambert Company Method of making (S)-3-(aminomethyl)-5-methylhexanoic acid
US20040014195A1 (en) * 1999-12-29 2004-01-22 Diversa Corporation Nitrilases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
WO2002095045A2 (fr) * 2001-05-21 2002-11-28 Adisseo France S.A.S. Procede de preparation d'acides carboxyliques aliphatiques par hydrolyse enzymatique de composes nitriles aliphatiques
WO2004111256A1 (en) * 2003-06-19 2004-12-23 Pfizer Products Inc. Biocatalytic preparation of 1-cyanocyclohexaneacetic acid

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GAVAGAN J.E. ET AL.: "A GRAM-NEGATIVE BACTERIUM PRODUCING A HEAT-STABLE NITRILASE HIGHLY ACTIVE ON ALIPHATIC DINITRILES" APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, SPRINGER VERLAS, BERLIN, DE, vol. 52, November 1999 (1999-11), pages 654-659, XP000964621 ISSN: 0175-7598, abstract; figure 2; table 1, page 654, right-hand column, line 16 - line 21 *
GAVAGAN J.E. ET AL.: "Chemoenzymic Production of Lactams from Aliphatic alpha,omega-Dinitriles" JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY. EASTON, US, vol. 63, no. 14, 1998, pages 4792-4801, XP002294596 ISSN: 0022-3263 cited in the application, abstract; table 1, page 4792, page 4793, left-hand column, line 1 - line 10, page 4793, right-hand column, line 3 - line 5 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20100204503A1 (en) 2010-08-12
PT1745136E (pt) 2009-11-26
UA82292C2 (ru) 2008-03-25
IL177918A0 (en) 2006-12-31
AP2006003764A0 (en) 2006-10-31
ES2331140T3 (es) 2009-12-22
TW200533756A (en) 2005-10-16
KR20070020009A (ko) 2007-02-16
GT200500086A (es) 2006-01-10
HN2005000162A (es) 2007-11-16
DK1745136T3 (da) 2009-11-30
NO335624B1 (no) 2015-01-12
WO2005100580A1 (en) 2005-10-27
PA8629801A1 (es) 2005-11-25
ME01107B (me) 2012-12-20
CA2563307A1 (en) 2005-10-27
TNSN06329A1 (fr) 2008-02-22
NL1028762A1 (nl) 2005-10-17
CR8686A (es) 2006-11-21
EA200601574A1 (ru) 2007-04-27
BRPI0509908A (pt) 2007-09-18
ZA200607476B (en) 2008-05-28
SI1745136T1 (sl) 2009-12-31
ECSP066917A (es) 2006-12-20
MA28536B1 (fr) 2007-04-03
AR048690A1 (es) 2006-05-17
NZ549698A (en) 2009-10-30
EP1745136B1 (en) 2009-10-07
HK1105215A1 (en) 2008-02-06
DE602005017027D1 (de) 2009-11-19
KR100887777B1 (ko) 2009-03-09
PE20060252A1 (es) 2006-04-01
CA2563307C (en) 2011-02-08
JP2007532125A (ja) 2007-11-15
HRP20090562T1 (en) 2009-11-30
AU2005233371B2 (en) 2007-12-20
EP1745136A1 (en) 2007-01-24
CY1109556T1 (el) 2014-08-13
TWI304095B (en) 2008-12-11
US8304252B2 (en) 2012-11-06
UY28851A1 (es) 2005-11-30
RS50994B (sr) 2010-10-31
CR20110356A (es) 2011-07-21
PL1745136T3 (pl) 2010-02-26
AP2301A (en) 2011-10-31
US20070196905A1 (en) 2007-08-23
ATE445019T1 (de) 2009-10-15
DOP2005000055A (es) 2005-12-15
JP4051082B2 (ja) 2008-02-20
US7727749B2 (en) 2010-06-01
SV2005002085A (es) 2005-12-13
NO20065181L (no) 2006-11-10
GEP20084530B (en) 2008-11-10
AU2005233371A1 (en) 2005-10-27
MY144296A (en) 2011-08-29
IL177918A (en) 2013-11-28
CN1942587B (zh) 2010-05-05
CN1942587A (zh) 2007-04-04
NL1028762C2 (nl) 2006-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA010305B1 (ru) Стереоселективное биопревращение алифатических динитрилов в цианокарбоновые кислоты
EP2294207B1 (en) Process for the stereoselective enzymatic hydrolysis of 5-methyl-3-nitromethyl-hexanoic acid ester
KR20050053618A (ko) 에스시탈로프람의 제조에 사용할 수 있는 중간체들의 분리방법
JP3896162B2 (ja) 治療用アミドの立体選択的調製のための酵素的方法
JP4129077B2 (ja) アシル化されたアミノ酸エステルおよび光学活性アミノ酸エステルの製造法、ならびに光学活性アミノ酸エステルおよびｎ−アシルアミノ酸エステル
FI106266B (fi) Stereospesifisten GABA-T-inhibiittoreiden raseemisen seoksen entsymaattinen erotus
WO2012176715A1 (ja) １－アミノ－２－ビニルシクロプロパンカルボン酸アミドおよびその塩、ならびにその製造方法
JP5329973B2 (ja) リパーゼ触媒を用いるエナンチオ選択的アシル化とその後の硫酸による沈殿によって、ラセミ体の４−（１−アミノエチル）安息香酸メチルエステルから（ｒ）−および（ｓ）−４−（１−アンモニウムエチル）安息香酸メチルエステル硫酸塩を調製する方法
MXPA06010259A (en) Stereoselective bioconversion of aliphatic dinitriles into cyano carboxylic acids
EP1290208A1 (en) Method for optically resolving a racemic alpha-substituted heterocyclic carboxylic acid using enzyme
JP2015012838A (ja) 光学活性アミノ酸の製造法
JP2000086605A (ja) Ｌ―アリシンアセタ―ルの製造法
WO2010004577A1 (en) Preparation of enantiomerically enriched gamma-nitro acid and pregabalin
JP4042557B2 (ja) 光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸及びそのエステルの製法
KR20110086167A (ko) γ-아미노-α,β-불포화 카르복실산 유도체의 거울상이성질체선택적 합성
JP2006021999A (ja) 光学活性β−アミノニトリル化合物およびその対掌体アミド化合物の製造方法
JPWO2011013340A1 (ja) 光学活性３−置換グルタル酸モノアミドの製造法
MXPA98007922A (en) Enzimative process for the stereoselective preparation of amidas terapeuti

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU