WO2002095045A2 - Procede de preparation d'acides carboxyliques aliphatiques par hydrolyse enzymatique de composes nitriles aliphatiques - Google Patents

Procede de preparation d'acides carboxyliques aliphatiques par hydrolyse enzymatique de composes nitriles aliphatiques Download PDF

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WO2002095045A2
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biological material
nitrile
immobilized
enzymatic hydrolysis
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Georges Gros
Michel Garrait
Jacques Taillades
Patrick Rey
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Adisseo France S.A.S.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/002—Nitriles (-CN)
    • C12P13/004—Cyanohydrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to a new process for the preparation of aliphatic carboxylic acids by enzymatic hydrolysis of aliphatic nitrile compounds.
  • 2-hydroxy-4-methylthiobutyric acid hydroxy-analogue of methionine
  • hydroxy-analogue of methionine widely used as a food additive in the field of animal nutrition, in particular poultry nutrition .
  • monocyano acids are compounds particularly used in the chemical polymer industry.
  • hydrolases lipases, esterases and acylases
  • hydrolysis nitrilase
  • hydration nitrile hydratase
  • the nitrilase from the bacterium Alca ⁇ igenes faecalis ATCC 8750 is capable of producing R - (-) - mandelic acid from racemic mandelonitrile (Yamamoto et al., 1991, Appl. Environ. Microbiol. 57 (10) : 3028-3032). Due to this activity, this enzyme was pondered to have a strong affinity for benzylic nitriles, and therefore to be an arylacetonitrile (Yamamoto et al., 1992, J. Ferm. Bioeng. 73: 425).
  • nitrilases for example nitrilase from the bacterium Comamonas testosteroni, have been identified for their capacity to hydrolyze aliphatic nitriles (Levy-Schil et al., 1995, Gene 161 (1): 15-20).
  • the nitrilase from the bacteria Alca ⁇ igenes faecalis ATCC 8750 is therefore particularly effective, but no known process has so far made it possible to generalize its industrial use to a large number of nitriles.
  • many other aliphatic carboxylic acids have industrial applications, and no process for the synthesis of these other compounds by biocatalysis has been developed.
  • the object of the present invention is to overcome this drawback by proposing an efficient system for the enzymatic synthesis of various aliphatic carboxylic acids from their corresponding nitriles, using nitrilase ⁇ X Alca ⁇ igenes faecalis ATCC 8750.
  • the present invention relates to a process for the preparation of aliphatic carboxylic acids, with the exception of hydroxyanalogue of methionine, by enzymatic hydrolysis of aliphatic nitrile compounds, with the exception of 2-hydroxy 4-methylthio butyromtrile, characterized in that:
  • a biological material having a nitrilase activity is prepared, said activity being obtained from a nitrilase from a bacterium of the genus Alca ⁇ igenes,
  • aliphatic carboxylic acid is intended to mean all the aliphatic carboxylic acids with the exception of the hydroxyanalogue of methionine.
  • aliphatic nitrile compounds means all the aliphatic nitriles with the exception of 2-hydroxy 4-methylthio butyronitrile.
  • the aliphatic nitrile compounds hydrolyzed by the process according to the invention are O-substituted derivatives of 2-hydroxy-4-methylthio butyronitrile, and the acids formed are O-substituted derivatives of hydroxyanalogue methionine.
  • the O-substituted derivatives of 2-hydroxy 4-methylthio butyronitrile are O-acetylated or O-hydroxyalkylated derivatives.
  • the aliphatic nitrile compounds hydrolyzed by the process according to the invention are multi-functional nitriles selected from aliphatic nitriles, vinyl nitriles, nitrile-esters, allyl nitrile-esters, and nitrile ether.
  • multi-functional nitriles is meant nitriles having a nitrile function and at least one additional function other than nitrile.
  • the aliphatic nitrile compounds hydrolyzed by the process according to the invention are symmetrical or asymmetrical aliphatic dinitriles and the acids formed are cyanoacids.
  • the symmetrical aliphatic dinitriles can be malononitrile, adiponitrile, fumaronitrile, or 1,4- dicyanobut-2-ene.
  • asymmetric aliphatic dinitriles mention may be made of 2-alkyl and 2-aryl aliphatic dinitriles of general structure:
  • n is any integer
  • R is an alkyl group, an aryl group or a multifunctional chain.
  • the asymmetric aliphatic dinitriles are 2-methylgmtaronitrile, 2-methylsuccinonitrile, or 2-methyladiponitrile.
  • a person skilled in the art will know how to adapt the process according to the invention to any type of dinitrile, in particular to any asymmetric dinitrile.
  • the hydrolysis of the dinitrile to cyanoacid is carried out on the least sterically hindered nitrile function.
  • Step (a) of the method according to the invention consists in preparing a biological material having a nitrilase activity, said activity being obtained from a nitrilase from a bacterium of the genus Alca ⁇ igenes.
  • Biomaterial can consist of whole cells, living or dead, or broken cells with nitrilase activity. It can also consist of an enzymatic solution comprising an enzyme with nitrilase activity purified or not.
  • a microorganism expressing a nitrilase is used.
  • a transformed microorganism expressing a recombinant nitrilase is used.
  • the nitrilase activity comes from the bacteria Alca ⁇ igenes faecalis
  • the transformed microorganism used is an Escherichia coli bacterium expressing the nitB gene of Alcaligenes faecalis ATCC 8750, as described in patent application WO 98/18941.
  • Step (b) of the process consists in immobilizing the biological material. This immobilization is advantageously carried out in the presence of a solid support and makes it possible to obtain solid particles whose size, shape and mechanical strength can be controlled. It also offers the possibility of simultaneously using a polyazetidine polymer or other crosslinking agents.
  • This immobilization process can involve whole or permeabilized cells, in particular E. cells. coli according to the invention. It can also be applied to an enzyme solution of nitrilases according to the invention free of cells.
  • the immobilization process consists in immobilizing the active biological material on a solid support, with a particle size in particular between 1 ⁇ m and 500 ⁇ m, preferably 10 ⁇ m and 200 ⁇ m, using chemical agents reacting with the amino functions (NH 2 , NH), carboxyl (COOH), hydroxy (OH), thiol (SH) or amide (CONH 2 ) of the biological agent and the support. These chemical agents also make it possible to insolubilize the biological material and the support in water.
  • the mass obtained is very malleable and can be shaped in order to obtain particles of desired shape and size. The cohesion and hardness of these particles are then obtained by drying.
  • the biological material to be immobilized can optionally also contain an inactive biological material present at a rate of 0 to 200% by weight.
  • This inactive biological material can be proteins (albumin, gelatin) or polysaccharides (Chitosan, k-carrageenan, alginate).
  • the solid support on which the biological material, and possibly the polymer, are deposited, can be composed of organic or inorganic particles, porous or non-porous, hydrophilic or hydrophobic. Among these particles, it can be mentioned, without this being limiting: ion exchange resins, - alumina, synthetic or diatomic silicas and silica gels, zeolites, coals, partially soluble or insoluble proteins in water, like gluten, polysaccharides, like starch.
  • the solid support can constitute from 0.01 to 200% by weight of the biological material and preferably from 10 to 100%.
  • the chemical agents used to insolubilize the biological material can be polymers or bi-functionalized molecules which react with the amino (NH 2 , NH), carboxylic (COOH), hydroxy (OH), thiol (SH), amide (CONH) functions. 2 ).
  • amino amino
  • COOH carboxylic
  • OH hydroxy
  • SH thiol
  • CONH amide
  • the immobilization process can involve one or more of these chemical agents.
  • the chemical agent is added at a concentration of between 1 and 50% by weight relative to the biological material and to the support. We prefer a quantity between
  • the duration of the crosslinking treatment is between 0.5 and 24 hours.
  • the process temperature is generally between 4 and 65 ° C. We prefer a temperature between 20 and 40 ° C.
  • the temperature used during the immobilization process can also be very dependent on the stability of the biological material used.
  • the pH during the immobilization phase is maintained between 5 and 11. We prefer a pH between 6 and 10 with a preference towards alkaline pH.
  • the pH is also chosen according to the resistance of the biological material and will be easily determined by a person skilled in the art.
  • the method according to the invention is characterized in that the ratio between the mass of immobilized biological material and the mass of substrate is between 0.1 and 10.
  • the shaping of immobilized biological material must allow its use in any system, in particular in a fixed bed.
  • a formulation method can be extrusion.
  • the biological material and the support are crosslinked by adding one or more chemical agents.
  • the mass insoluble is recovered by centrifugation or after flocculation and filtration.
  • a dry matter content of at least 10% is preferred.
  • the mass is then extradited.
  • vermicelli with a diameter of between 0.3 and 0.5 mm and a length of between 1 and 10 mm is preferably obtained. These vermicelli can be spheronized. The particles obtained are then dried.
  • Another formulation method can be coating ("spray coating"). To do this, the biological material is mixed with one or more chemical agents. After reaction, the mixture is sprayed onto the support in the form of a thin layer. By this method, granules with an average diameter of between 0.1 and 2 mm are obtained. The particles obtained can optionally then be immersed in a solution of a reducing agent such as sodium borohydride in order to reduce the imine functions formed during crosslinking.
  • a reducing agent such as sodium borohydride
  • the particles obtained are sufficiently solid and resistant to attrition to be used in a fixed bed, a fluidized bed or a stirred reactor.
  • Step (c) of the method according to the invention consists in implementing the biological material immobilized in one or more columns or reactors.
  • the purpose of this step is to be able to continuously produce aliphatic carboxylic acids from aliphatic nitrile compounds.
  • the column or columns or reactors are supplied with a pure or dilute solution of an aliphatic nitrile compound.
  • the column (s) or reactors are preferably used at a temperature between 10 and 60 ° C and at a pH between 5 and 9.
  • the system implemented can consist of two or more columns connected to each other in series.
  • the supply of the aqueous solution of the aliphatic nitrile compound is carried out at the head of the first column with a simultaneous supply of other columns with the solution of the aliphatic nitrile compound in a limited quantity the solubility of this compound in the reaction mixture; this system is called the floor system.
  • one or more columns connected to one another are used in parallel in a circulation loop.
  • the aliphatic nitrile compound in aqueous solution feeds the loop continuously, and the reaction medium is pumped continuously so as to maintain a constant volume in said loop; this system is called the loop system.
  • the type of reactor used in this invention can be of the fixed bed, fluid bed, or continuously stirred type. Fixed bed type reactors are preferred because they reduce the attrition problems that can be encountered with immobilized cell particles.
  • the biological material consists of an entire microorganism, it is preferable to use a stirred reactor coupled to an ultrafiltration module to continuously separate the microorganism from the product of interest.
  • the optional step (d) consists in purifying the acid formed.
  • a method of purifying the acid formed is given.
  • the immobilized biological material can be recovered by simple filtration.
  • the aqueous phase can then be concentrated using an evaporator, then extracted using an organic solvent.
  • the organic phase is then dried and then evaporated.
  • the remaining aqueous phase is then concentrated to the maximum, and the residue obtained is suspended in a polar solvent.
  • the insoluble salts of the acid formed are filtered then the solution is dried, filtered and evaporated. All of these operations make it possible to extract the acid, possibly the amide formed and the unconverted nitrile.
  • Other purification methods are for example described in patent application WO 98/18941.
  • the degree of progress of the reaction is determined by HPLC or CPG chromatography.
  • the immobilized biological material is recovered by simple filtration.
  • the aqueous phase is extracted with ethyl acetate or with ether.
  • the organic phase is dried over Na 2 SO 4 and then evaporated.
  • the aqueous phase is concentrated to the maximum.
  • the residue obtained is suspended in methanol.
  • the insoluble salts are filtered then the methanolic solution is dried over Na 2 SO 4 , filtered and evaporated. All of the operations make it possible to extract the acid, possibly the amide formed and the unconverted nitrile.
  • Example 2.3 Synthesis of ( ⁇ ) -2-methoxymethoxy-4-methylthiobutanoic acid (Compound 3)
  • the operating protocol is identical to that described in Example 2.1.
  • the quantities introduced are as follows: 3.80 g (0.022 mole) of ( ⁇ ) -2-methoxymethoxy-4-methylthiobutyronitrile and 2.10 g of biological material immobilized in 220 ml of millipore water.
  • Kinetic monitoring is carried out according to the same elution conditions as that described in Example 2.1.
  • the yield obtained, after 120 hours, is 70% in ( ⁇ ) -2-methoxymethoxy-4-methylthiobutanoic acid (Compound 3a).
  • Example 3 Enzymatic hydrolysis of bi-functional nitrile compounds
  • Example 3.1 Enzymatic hydrolysis of isobutyronitrile (Compound 4)
  • the operating protocol is identical to that described in Example 2.1.
  • the amounts introduced are as follows: 9.40 g (0.075 mole) of commercial ( ⁇ ) -2-acetoxy-3-butenenitrile and 5.20 g of immobilized biological material are then added.
  • the yield obtained, after 27 hours, is 92% in ( ⁇ ) -2-acetoxybut-3-enoic acid.
  • NMR analysis reveals the presence of 6 mol% of ( ⁇ ) -2-hydroxy-but-3-enoic acid.
  • the operating protocol is identical to that described in Example 2.1.
  • the amounts introduced are as follows: 7.8 g (0.05 mole) of ( ⁇ ) -2- (l-ethoxyethoxy) -but-3-enenitrile and 4.5 g of biological material immobilized in 500 ml of water millipore.
  • the yield obtained, after 26 hours, is 86% in ( ⁇ ) -2- (1-ethoxyethoxy) -but-3-enoic acid. !
  • the operating protocol is identical to that described in Example 2.1.
  • the quantities introduced are as follows: 3.81 g (0.030 mole) of ( ⁇ ) -2-methoxymethoxy-but-3-enenitrile and 4.5 g of biological material immobilized in 300 ml of millipore water.
  • the yield obtained, after 47 hours, is 80% in ( ⁇ ) -2-methoxymethoxy-but-3-enoic acid.
  • Example 4.2 Enzymatic hydrolysis of Vadiponitrile (Compound 11)
  • the operating protocol is identical to that described in Example 2.1.
  • the amounts introduced are as follows: 8.02 g (0.075 mole) of commercial adiponitrile and 4.50 g of immobilized biological material.
  • the yield obtained, after 53 hours, is 90% in 5- acid. cyanopentanoic.
  • the operating protocol is identical to that described in Example 2.1.
  • the quantities introduced are as follows: 5.90 g (0.075 mole) of commercial fumaronitrile and 3.25 g of immobilized biological material.
  • the yield obtained, after 25 hours, is 72% in 3-cyanoacrylic acid and 28% in 3-cyanoacrylamide.

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Abstract

La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation d'acides carboxyliques aliphatiques par hydrolyse enzymatique de composés nitriles aliphatiques caractérisé en ce que: (a) on prépare un matériel biologique ayant une activité nitrilase, (b) on immobilise ledit matériel biologique (c) on met en présence un composé nitrile avec le matériel biologique ainsi immobilisé, pour obtenir le sel d'ammonium de l'acide carboxylique aliphatique formé (d) éventuellement, on purifie l'acide formé.

Description

Procédé de préparation d'acides carbo yliques aliphatiques par hydrolyse enzymatique de composés nitriles aliphatiques
La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation d'acides carboxyliques aliphatiques par hydrolyse enzymatique de composés nitriles aliphatiques.
De nombreux acides carboxyliques aliphatiques ont des applications industrielles, ou sont des précurseurs de composés ayant de telles applications, dans les domaines pharmaceutiques, agrochimiques ou nutritionnels.
A titre d'exemple, on peut citer l'acide 2-hydroxy-4-méthylthiobutyrique (hyroxy- analogue de la méthionine) largement employé en tant qu'additif alimentaire dans le domaine de l'alimentation animale, notamment l'alimentation des volailles.
D'autre part, les monocyanoacides sont des composés particulièrement utilisés dans l'industrie chimique des polymères.
La plupart des procédés permettant de synthétiser ces composés sont essentiellement des procédés de synthèse organique faisant intervenir la chimie conventionnelle. En ce qui concerne la synthèse d'acides carboxyliques aliphatiques par hydrolyse des composés nitriles correspondants, on connaît des procédés faisant intervenir des catalyseurs organométalliques. À titre d'exemple, nous pouvons notamment citer ceux faisant intervenir des complexes de métaux de transition tels que le palladium (Paraskewas, 1974, Synthesis: 574) , le cobalt (Chin et Kim, 1990, Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 29: 523), ou le platine (Bennet et Yoshida, 1973, J. Am. Chem. Soc. 95: 3030) qui ont été employés avec plus ou moins de succès. Néanmoins, l'inconvénient majeur de ces méthodes réside dans l'élaboration complexe et onéreuse du catalyseur organométallique.
De plus en plus de procédés de synthèse organique font intervenir la biocatalyse. De nombreuses études ont porté sur les enzymes à pouvoir hydrolytique appelées plus communément les hydrolases (lipases, estérases et acylases), notamment pour leur aptitude à bioconvertir un grand nombre de substrats naturels ou non-naturels dans des conditions opératoires identiques (Zhu et Telford, 1990, Tetrahedron 46: 6587; Santaniello et al., 1992, Chem. Rev. 92, 1071). Comparativement, un faible nombre d'enzymes catalysant l'hydrolyse (nitrilase) ou l'hydratation (nitrile hydratase) des nitriles en acides carboxyliques ou amides a été identifié. Cependant, de telles enzymes constituent des réactifs importants pouvant être employés dans des biocatalyseurs destinés à la synthèse d'acides carboxyliques ayant des applications dans les domaines agrochimique, pharmaceutique ou nutritionnel. Un autre avantage des enzymes nitrilasiques est leur remarquable tolérance vis-à-vis des groupes fonctionnels (de Raadt et al., 1991, Tetrahedron Lett. 32: 341). De plus, les conditions expérimentales et les réactifs généralement employés sont dénués de toxicité et peuvent donc être engagés dans des schémas de synthèse de composés à visée pharmaceutique ou agrochimique. II est connu que certaines nitrilases convertissent efficacement différents types de nitriles.
En particulier, la nitrilase de la bactérie Alcaïigenes faecalis ATCC 8750 est capable de produire de l'acide R-(-)-mandélique à partir de mandélonitrile racémique (Yamamoto et al., 1991, Appl. Environ. Microbiol. 57(10): 3028-3032). De part cette activité, cette enzyme était réputée pour avoir un forte affinité pour les nitriles benzyliques, et donc pour être une arylacétonitrilase (Yamamoto et al., 1992, J. Ferm. Bioeng. 73: 425). D'autres nitrilases, par exemple la nitrilase de la bactérie Comamonas testosteroni, ont été identifiées pour leur capacité à hydrolyser les nitriles aliphatiques (Levy-Schil et al., 1995, Gène 161(1): 15-20).
Par ailleurs, on connait de la demande de brevet WO 98/18941 l'utilisation de la nitrilase & Alcaïigenes faecalis ATCC 8750 pour la conversion par hydrolyse enzymatique du 2-hydroxy 4-méthylthio butyronitrile en acide 2-hydroxy 4-méthylthio butyrique et/ou son sel d'ammonium.
La nitrilase de la bactérie Alcaïigenes faecalis ATCC 8750 est donc particulièrement efficace, mais aucun procédé connu n'a jusqu'alors permis de généraliser son utilisation industrielle à un grand nombre de nitriles. Toutefois, de nombreux autres acides carboxyliques aliphatiques ont des applications industrielles, et aucun procédé de synthèse de ces autres composés par biocatalyse n'a été développé. La présente invention a pour but de pallier cet inconvénient en proposant un système efficace de synthèse enzymatique d'acides carboxyliques aliphatiques variés à partir de leurs nitriles correspondants, mettant en oeuvre la nitrilase <X Alcaïigenes faecalis ATCC 8750.
Description
La présente invention concerne un procédé de préparation d'acides carboxyliques aliphatiques, à l'exception de hydroxyanalogue de la méthionine, par hydrolyse enzymatique de composés nitriles aliphatiques, à l'exception du 2-hydroxy 4-méthylthio butyromtrile, caractérisé en ce que:
(a) on prépare un matériel biologique ayant une activité nitrilase, ladite activité étant obtenue à partir d'une nitrilase d'une bactérie du genre Alcaïigenes,
(b) on immobilise ledit matériel biologique,
(c) on met en présence un composé nitrile avec le matériel biologique ainsi immobilisé, pour obtenir le sel d'arnmonium de l'acide carboxylique aliphatique formé,
(d) éventuellement, on purifie l'acide formé
Selon l'invention, on entend par acide carboxylique aliphatique tous les acides carboxyliques aliphatiques à l'exception de rhydroxyanalogue de la méthionine. De même, on entend par composés nitriles aliphatiques tous les nitriles aliphatiques à l'exception du 2- hydroxy 4-méthylthio butyronitrile.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les composés nitriles aliphatiques hydrolyses par le procédé selon l'invention sont des dérivés O-substitués du 2-hydroxy 4- méthylthio butyronitrile, et les acides formés sont des dérivés O-substitués de hydroxyanalogue de la méthionine. De préférence, les dérivés O-substitués du 2-hydroxy 4-méthylthio butyronitrile sont des dérivés O-acétylés ou O-hydroxyalkylés.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les composés nitriles aliphatiques hydrolyses par le procédé selon l'invention sont des nitriles multi-fonctionnels sélectionnés parmi les nitriles aliphatiques, les nitriles vinyliques, les nitrile-esters, les nitrile-ester allyliques, et les nitrile-éther. Par nitriles multi-fonctionnels, on entend les nitrile possédant une fonction nitrile et au moins une fonction supplémentaire autre que nitrile.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les composés nitriles aliphatiques hydrolyses par le procédé selon l'invention sont des dinitriles aliphatiques symétriques ou dissymétriques et les acides formés sont des cyanoacides. A titre d'exemple, les dinitriles aliphatiques symétriques peuvent être le malononitrile, l'adiponitrile, le fumaronitrile, ou le 1,4- dicyanobut-2-ène. A titre de dinitriles aliphatiques dissymétriques, on peut citer les 2-alkyl et les 2-aryl dinitriles aliphatiques de structure générale:
NC CH (CH2)n CN
I
R
dans laquelle: n est un nombre entier quelconque, et
R est un groupe alkyl, un groupe aryl ou une chaîne multifonctionnelle. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les dinitriles aliphatiques dissymétriques sont le 2-méthylgmtaronitrile, le 2-méthylsuccinonitrile, ou le 2- méthyladiponitrile. D'une manière générale, l'homme du métier saura adapter le procédé selon l'invention à tout type de dinitrile, en particulier à tout dinitrile dissymétrique.
Lorsque le procédé selon l'invention s'applique aux dinitriles dissymétriques tels que décrits ci-dessus, l'hydrolyse du dinitrile en cyanoacide s'effectue sur de la fonction nitrile la moins encombrée stériquement.
L'étape (a) du procédé selon l'invention consiste à préparer un matériel biologique ayant une activité nitrilase, ladite activité étant obtenue à partir d'une nitrilase d'une bactérie du genre Alcaïigenes.
Le matériel biologique peut consister en des cellules entières, vivantes ou mortes, ou des cellules brisées ayant une activité nitrilase. Elle peut aussi consister en une solution enzymatique comprenant une enzyme à activité nitrilase purifiée ou non.
Avantageusement, on utilise un microorganisme exprimant une nitrilase. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on utilise un microorganisme transformé exprimant une nitrilase recombinante. De manière préférentielle, l'activité nitrilase provient de la bactérie Alcaïigenes faecalis
ATCC 8750.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le microorganisme transformé utilisé est une bactérie Escherichia coli exprimant le gène nitB d'Alcaligenes faecalis ATCC 8750, telle que décrite dans la demande de brevet WO 98/18941. L'étape (b) du procédé consiste à immobiliser le matériel biologique. Cette immobilisation se fait avantageusement en présence d'un support solide et permet d'obtenir des particules solides dont la taille, la forme et la résistance mécanique peuvent être contrôlées. Elle offre également la possibilité d'employer simultanément un polymère de polyazétidine ou d'autres agents réticulants.
Ce procédé d'immobilisation peut faire intervenir des cellules entières ou perméabilisées, en particulier des cellules d'E. coli selon l'invention. Il peut aussi s'appliquer à une solution enzymatique de nitrilases selon l'invention exempte de cellules.
Le procédé d'immobilisation consiste à immobiliser le matériel biologique actif sur un support solide, de granulométrie notamment comprise entre 1 μm et 500 μm, de préférence 10 μm et 200 μm, grâce à des agents chimiques réagissant avec les fonctions aminé (NH2, NH), carboxyle (COOH), hydroxy (OH), thiol (SH) ou amide (CONH2) de l'agent biologique et du support. Ces agents chimiques permettent aussi d' insolubiliser dans l'eau le matériel biologique et le support. La masse obtenue est très malléable et peut être mise en forme afin d'obtenir des particules de forme et de taille souhaitées. La cohésion et la dureté de ces particules sont ensuite obtenues par séchage.
Le matériel biologique à immobiliser peut éventuellement contenir également un matériel biologique inactif présent à raison de 0 à 200 % en poids. Ce matériel inactif biologique peut être des protéines (albumine, gélatine) ou des polysaccharides (Chitosan, k-carraghénane, alginate).
Le support solide, sur lequel sont déposés le matériel biologique, et éventuellement le polymère, peut se composer de particules organiques ou inorganiques, poreuses ou non poreuses, hydrophiles ou hydrophobes. Parmi ces particules on peut signaler, sans que cela ne soit limitatif: les résines échangeuses d'ions, - l'alumine, les silices de synthèse ou diatomées et les gels de silice, les zéolites, les charbons, les protéines partiellement solubles ou insolubles dans l'eau, comme le gluten, les polysaccharides, comme l'amidon. Le support solide peut constituer de 0,01 à 200 % en poids du matériel biologique et de préférence de 10 à 100 %. Les agents chimiques utilisés pour insolubiliser le matériel biologique peuvent être des polymères ou des molécules bi-fonctionnalisées qui réagissent avec les fonctions aminé (NH2, NH), carboxylique (COOH), hydroxy (OH), thiol (SH), amide (CONH2). A titre d'exemple, on peut citer : - les polymères de polyazétidine,
- les polymères de polyéthylènimine,
- les polymères de polyamide,
- les polymères d'isocyanates,
- les gels d'alginate, - les gels de k-carraghénane,
- les aminés comme l'hexaméthylène diamine,
- les aldéhydes comme le glutaraldéhyde,
- les acides carboxyliques comme l'acide adipique, et
- les isocyanates.
Le procédé d'immobilisation peut faire intervenir un ou plusieurs de ces agents chimiques. L'agent chimique est ajouté selon une concentration comprise entre 1 et 50 % en poids par rapport au matériel biologique et au support. On préférera une quantité comprise entre
5 et 30 % afin d'obtenir des particules suffisamment solides et qui conservent une activité importante et qui ne présentent pas trop de problèmes de diffusion interne.
La durée du traitement de réticulation est comprise entre 0,5 et 24 heures.
La température du procédé est généralement comprise entre 4 et 65°C. On préférera une température comprise entre 20 et 40°C. La température employée lors du procédé d'immobilisation peut être aussi très dépendante de la stabilité du matériel biologique employé. Le pH durant la phase d'immobilisation est maintenu entre 5 et 11. On préférera un pH compris entre 6 et 10 avec une préférence vers les pH alcalins. Le pH est aussi choisi en fonction de la résistance du matériel biologique et sera aisément déterminé par l'homme du métier.
De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le rapport entre la masse de matériel biologique immobilisé et la masse de substrat est compris entre 0,1 et 10.
La mise en forme du matériel biologique immobilisé doit permettre son emploi dans un système quelconque, notamment dans un lit fixe.
Une méthode de formulation peut être l'extrusion. Pour ce faire, le matériel biologique et le support sont réticulés par ajout d'un ou plusieurs agents chimiques. Après traitement, la masse insoluble est récupérée par centrifugation ou après floculation et filtration. Un taux de matière sèche d'au moins 10% est préféré. La masse est ensuite extradée. Par cette méthode, on obtient de préférence des vermicelles de diamètre compris entre 0,3 et 0,5 mm et d'une longueur comprise entre 1 et 10 mm. Ces vermicelles peuvent être sphéronisés. Les particules obtenues sont ensuite séchées.
Une autre méthode de formulation peut être le pelliculage ("spray coating"). Pour ce faire, le matériel biologique est mélangé avec un ou plusieurs agents chimiques. Après réaction, le mélange est pulvérisé sur le support sous forme d'une couche mince. Par cette méthode, on obtient des granulés de diamètre moyen compris entre 0,1 et 2 mm. Les particules obtenues peuvent éventuellement être ensuite plongées dans une solution d'un agent réducteur comme le borohydrure de sodium afin de réduire les fonctions imines formées lors de la réticulation.
Les particules obtenues sont suffisamment solides et résistantes à l'attrition pour être employées dans un lit-fixe, un lit fluidisé ou un réacteur agité.
L'étape (c) du procédé selon l'invention consiste à mettre en œuvre le matériel biologique immobilisé dans une ou plusieurs colonnes ou réacteurs. Le but de cette étape est de pouvoir produire en continu les acides carboxyliques aliphatiques à partir des composés nitriles aliphatiques. La ou les colonnes ou réacteurs sont alimentés par une solution pure ou diluée d'un composé nitrile aliphatique.
La ou les colonnes ou réacteurs sont mises en œuvre de préférence à une température comprise entre 10 et 60°C et à un pH compris entre 5 et 9.
Le système mis en œuvre peut être constitué de deux ou plusieurs colonnes connectées l'une à l'autre en série.
Selon une première manière de mettre en œuvre l'invention, l'alimentation de la solution aqueuse du composé nitrile aliphatique est réalisée en tête de la première colonne avec une alimentation simultanée d'autres colonnes avec la solution du composé nitrile aliphatique en une quantité limitée à la solubilité de ce composé dans le mélange réactionnel ; ce système est intitulé système étage.
Selon une deuxième manière de mettre en œuvre l'invention, on utilise une ou plusieurs colonnes connectées l'une à l'autre en parallèle dans une boucle de circulation. Selon cette installation, le composé nitrile aliphatique en solution aqueuse alimente la boucle en continu, et le milieu de réaction est pompé en continu de façon à conserver un volume constant dans ladite boucle; ce système est intitulé système boucle.
Le type de réacteur utilisé dans cette invention peut être du type lit fixe, lit fluide, ou du type agité en continu. On préfère utiliser les réacteurs du type lit fixe parce qu'ils réduisent les problèmes d'attrition qui peuvent être rencontrés avec les particules de cellules immobilisées. Lorsque le matériel biologique consiste en un microorganisme entier, on préférera utiliser un réacteur agité couplé à un module d'ultrafiltration pour séparer de façon continue le microorganisme du produit d'intérêt.
L'étape (d), facultative, consiste à purifier l'acide formé. A titre d'exemple, une méthode de purification de l'acide formé est donnée. L'homme du métier saura identifier ou adapter d'autres méthodes de purification au procédé selon l'invention. Dans un premier temps, le matériel biologique immobilisé peut être récupéré par simple filtration. La phase aqueuse peut ensuite être concentrée à l'aide d'un évaporateur, puis extraite à l'aide d'un solvant organique. La phase organique est alors séchée puis évaporée. La phase aqueuse restante est ensuite concentrée au maximum, et le résidu obtenu est mis en suspension dans un solvant polaire. Les sels insolubles de l'acide formé sont filtrés puis la solution est séchée, filtrée et évaporée. L'ensemble de ces opérations permet d'extraire l'acide, éventuellement l'amide formée et le nitrile non converti. D'autres méthodes de purification de sont par exemple décrites dans la demande de brevet WO 98/18941.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer la présente invention, sans toutefois en limiter la portée.
Exemples
Exemple 1: Protocole général de l'hydrolyse enzymatique des nitriles
Le substrat est mis en suspension dans 750 mL d'eau millipore thermostatée à 30°C et tamponnée par KH2PO4 et K2HPO4 à pH = 7,3. L'agitation est maintenue constante à 250 rpm pendant toute la durée de l'essai. La quantité du matériel biologique immobilisé est ensuite additionnée de façon que Mcatalyseur / Msubstrat = 0,55. Le degré d'avancement de la réaction est déterminé par chromatographie HPLC ou CPG. La réaction terminée, le matériel biologique immobilisé est récupéré par simple filtration. La phase aqueuse est ensuite concentrée à l'évaporateur rotatif jusqu'à 200 mL environ puis acidifiée par de l'HCl 36% jusqu'à pH = 1,5. La phase aqueuse est extraite à l'acétate d'éthyle ou à l'éther. La phase organique est séchée sur Na2SO4 puis évaporée. La phase aqueuse est concentrée au maximum. Le résidu obtenu est mis en suspension dans du méthanol. Les sels insolubles sont filtrés puis la solution méthanolique est séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée. L'ensemble des opérations permet d'extraire l'acide, éventuellement l'amide formée et le nitrile non converti.
Exemple 2: Hydrolyse enzymatique des précurseurs de dérivés O-substitués de rhydroxyanalogue de la méthionine
Exemple 2.1: Synthèse de l'acide (±)-2-acétoxy-4-méihylthiobutanoïque (Composé 1)
Dans un réacteur parfaitement agité à 250 rpm, thermostaté à 30°C, 13,0 g (0,075 mole) du (±)-2-acétoxy-4-méthylthiobutyronitrile sont introduits dans 750 mL d'eau millipore tamponnée à pH = 7,3. 7,15 g de matériel biologique immobilisé sont ensuite additionnés. Le suivi cinétique est réalisé par HPLC (éluant: eau / acétonitrile 80/20 (v/v) / 0,05% (v/v) d'acide trifluoroacétique (TFA); λ = 210 nm; Débit ≈ 1 mL/min; colonne: Nucléosil RP Cl 8 (5 μm, 100 Â). Le mélange est laissé sous agitation à 30°C pendant 48 heures. Le rendement obtenu, après 48 heures, est de 89%» en acide (±)-2-acétoxy-4-méthylthiobutanoïque (Composé la). L'analyse RMN lH révèle la présence de 6% molaire d'acide (±)-2-hydroxy-4-méthylthiobutanoïque (Composé lb). Η RMN (DMSO d6) δH ppm: 1,75 (m, 2H, S-CH2-CH2-), 1,79 (s, 3H, CH3CO2-), 1,84 (s, 3H, CHj-S-), 2,28 (t, 2H, CH3-S-CH2-), 4,69 (td, 1H, -CH(OAc)CN), 11,9 (s, 1H, CO^. 13C RMN (DMSO d6) δc ppm: 15,24 (Ç_H3-S), 21,17 (ÇH3-CO), 29,73 (CH3-S-ÇH2), 30,96 (S- CH2-Ç_H2-), 71,35 (-ÇH(OAc)CN), 170,77 (CH3-Ç_OO), 171,86 (ÇO2H). IR (CHC13) cm-':2500- 3500, 1745, 1720. Masse FAB" (NBA): m/e (intensité relative) 191 (100), 149 (70), 59 (25).
Exemple 2,2: Synthèse de l'acide (±)-2-(l-éthoxyéthoxy)-4-méthylthiobutanoïque (Composé 2)
Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 3,0 g (0,022 mole) du (±)-2-(l-éthoxyéthoxy)-4- méthylthiobutyronitrile et 3,0 g de matériel biologique immobilisé dans 220 mL d'eau millipore. Le suivi cinétique est réalisé par HPLC (éluant: eau / acétonitrile 95/5 (v/v) / 0,05% (v/v) de TFA). Le rendement obtenu, après 25 heures, est de 93% en acide (±)-2-(l-éthoxyéthoxy)-4- méthylthiobutanoïque (Composé 2a). Η RMN (DMSO d6) δH ppm: 1,09 (td, 3H, CH3-CH2-O), 1,18 (dd, 3H, CH3-CH), 1,72-1,84 (m, 2H, -S-CH.-CI-L,-), 2,10 (s, 3H, CH3-S), 2,52 (t, 2H, S- CH2-CH2), 3,51 (m, 2H, O-CH2-CH3), 3,84 (m, 1H, O-CH-CO2H), 4,72 (qd, 1H, -O-CH(CH3)- O). 13C RMN (DMSO d6) δc ppm: 15,42 (ÇH3-S), 16,1 (ÇH3-CH2-O), 21,32 (Ç_H3-CH-), 30,07 (S-ÇH2-CH2-CH), 33,89 (S-CH2-Ç_H2-CH), 62,00 (CH3-ÇH2-O), 77,06 (Ç_H(CO2H)-O), 99,49 (- O-ÇH(CH3)-O), 176,42 (ÇO2H). IR (CHC13) cm"1: 2500-3500, 1725. Masse FAB" (NBA): m/e (intensité relative) 221 (100), 152 (40), 122 (30), 46 (65).
Exemple 2.3: Synthèse de l'acide (±)-2-méthoxyméthoxy-4-méthylthiobutanoïque (Composé 3) Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 3,80 g (0,022 mole) du (±)-2-méthoxyméthoxy-4- méthylthiobutyronitrile et 2,10 g de matériel biologique immobilisé dans 220 mL d'eau millipore. Le suivi cinétique est réalisé selon les mêmes conditions d'élution que celui décrit à l'exemple 2.1. Le rendement obtenu, après 120 heures, est de 70% en acide (±)-2- méthoxyméthoxy-4-méthylthiobutanoïque (Composé 3a). *H RMN (DMSO d6) δH ppm: 1,96 (m, 2H, S-CH2-CH2-CH), 2,05 (s, 3H, CH3-S-CH2), 2,59 (t, 2H, -S-CH2-CH2), 3,31 (s, 3H, CH3- O), 3,91 (m, 1H, O-CH-CO2H), 4,60-4,72 (dd, 2H, O-CH2-O), 11,32 (CO2H). 13C RMN (DMSO d6) δc ppm: 15,37 (Ç_H3-S), 30,80 (CH3-S-Ç_H2-), 33,60 (S-CH2-Ç_H2-CH) 55,74 (Ç_H3-O), 76,55 (O-ÇH-CO2H), 95,44 (O-Ç_H2-O), 176,13 (ÇO2H). IR (CHC13) cm"1: 1720. Masse FAB" (NBA): m/e (intensité relative) 193 (70), 149 (55), 115 (20), 46 (100).
Les résultats des exemples 2.1 à 2.3 sont compilés dans le Tableau 1 ci-dessous. Tableau 1: Hydrolyse enzymatique des précurseurs de dérivés O-substitués de rhydroxyanalogue de la méthionine
Substrat Conditions" Produit formé Rendement (%)b
1 0,55 (33) la (lb) 82 (6)
2 0,55 (115) 2a 93
3 0,55 (120) 2a 70 a Equivalents de matériel biologique immobilisé /substrat (w/w); temps de réaction (h) b Rendement en acide obtenu après extraction puis purification
Exemple 3: Hydrolyse enzymatique de composés nitriles bi-fonctionnels Exemple 3.1: Hydrolyse enzymatique de l'isobutyronitrile (Composé 4)
Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 5,21 g (0,075 mole) d'isobutyronitrile commercial et 2,86 g de matériel biologique immobilisé sont ensuite additionnés. Le rendement obtenu, après 58 heures, est de 71% en acide isobutyrique. 'H RMN (DMSO d6) δH ppm: 1,05 (d, 6H, (CH^-CH), 2,40 (h, 1H, (CH3)2-CH), 11,74 (s, 1H, CO,!!). 13C RMN (DMSO d6) δc ppm: 19,61 ((ÇH3)2-CH), 33,90 (CH3)2-ÇH), 178,7 (s, 1H, ÇO2H). IR (CHC13) cm"1: 2500-3500, 1715. Masse FAB' (GT): m/e (intensité relative) 87 (100), 79 (20).
Exemple 3.2: Hydrolyse enzymatique de l'acrylonitrile (Composé S)
Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 4,0 g (0,075 mole) d'acrylonitrile commercial et 2,30 g de matériel biologique immobilisé. Le rendement obtenu, après 9 heures, est de 93% en acide acrylique. L'analyse RMN révèle la présence de 0,8% molaire d'acrylamide. 'H RMN (DMSO d6) δH ppm: 5,90-6,13 (m, 2H, CH2=CH), 6,32 (dd, 1H, CH2=CH), 12,43 (s, 1H, CO,®. 13C RMN (DMSO d6) δc ppm: 130,7 (CH2=ÇH), 131,45 (Ç_H2=CH), 171,16 (CO2H). IR (CHC13) cm"1: 2500-3500, 1695. Masse FAB" (GT): m/e (intensité relative) 71 (70), 53 (20).
Exemple 3.3: Hydrolyse enzymatique du (±)-2-acétoxy-3-butènenitrile (Composé 6)
Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 9,40 g (0,075 mole) du (±)-2-acétoxy-3-butènenitrile commercial et 5,20 g de matériel biologique immobilisé sont ensuite additionnés. Le rendement obtenu, après 27 heures, est de 92% en acide (±)-2-acétoxybut-3-ènoïque. L'analyse RMN révèle la présence de 6% molaire de l'acide (±)-2-hydroxy-but-3-ènoïque. 1H RMN (DMSO d6) δH ppm: 2,01 (s, 3H, CH3-CO2), 4,87-5,25 (m, 3H, CH2=CH-CH), 5,93-6,01 (m, IH, CH2=CH-CH), 12,33 (CO2H). 13C RMN (DMSO d6) δc ppm: 21,77 (ÇH3-CO2), 76,69 (CH2-=CH-ÇH), 115,12 (ÇH2=CH), 135,59 (CH2=ÇH), 171,24 (CH3-ÇO2), 176,86 (ÇO2H). IR (CHC13) cm"1: 2500-3500, 1740, 1715. Masse FAB- (GT): m/e (intensité relative) 143 (100), 59 (30).
Exemple 3.4: Hydrolyse enzymatique du (±)-2-(l-éthoxyéthoxy)-but-3-ènenitrile (Composé 7)
Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 7,8 g (0,05 mole) du (±)-2-(l-éthoxyéthoxy)-but-3-ènenitrile et 4,5 g de matériel biologique immobilisé dans 500 mL d'eau millipore. Le rendement obtenu, après 26 heures, est de 86% en acide (±)-2-(l-éthoxyéthoxy)-but-3-ènoïque. !H RMN (DMSO d6) δH ppm: 1,06 (t, 3H, CH^-CH^O), 1,19 (d, 3H, CH3-CH), 3,40-3,55 (m, 2H, CH3-CH2-O-), 4,32 (m, IH, CH2=CH-CH), 4,75-4,66 (qd, IH, O-CH-O), 4,95-5,2 (m, 2H, CH2=CH-), 5,78-5,91 (m, IH, CH2=CH), 12,32 (s, IH, CO2H). 13C RMN (DMSO d6) δc ppm: 15,94 et 16,06 (ÇH3-CH2-O- ), 20,75 et 21,15 (ÇH3-CH), 60,24 et 61,10 (CH3-ÇH2-O-), 78,61 et 78,92 (CH2=CH-Ç_H), 98,31 et 98,87 (O-ÇH-O), 113,86 et 115,0 (Ç_H2-=CH-), 138,25 et 138,56 (CH2=Ç_H), 174,56 (ÇO2H). IR (CHC13) cm'1: 2500-3500, 1725. Masse FAB' (GT): m/e (intensité relative) 173 (100), 43 (35).
Exemple 3.5: Hydrolyse enzymatique du (±)-2-méthoxyméthoxy-but-3-ènenitrile (Composé 8)
Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 3,81 g (0,030 mole) du (±)-2-méthoxyméthoxy-but-3-ènenitrile et 4,5 g de matériel biologique immobilisé dans 300 mL d'eau millipore. Le rendement obtenu, après 47 heures, est de 80% en acide (±)-2-méthoxyméthoxy-but-3-ènoïque. 'H RMN (DMSO d6) δH ppm: 3,30-3,95 (m, 3H, CH3-O-), 4,37 (m, IH, CH2-=CH-CH), 4,62-4,71 (dd, O-CH2-O), 5,07- 5,23 (m, 2H, CH2=CH-), 5,91-5,98 (m, IH, CH2=CH), 11,47 (s, IH, CO^). 13C RMN (DMSO d6) δc ppm: 55,58 (ÇH3-O-), 78,87 (CH2=CH-Ç_H), 94,62 (O-ÇH2-O), 114,38 (ÇH2=CH-), 138,11 (CH2=ÇH), 173,67 (s, IH, ÇO2H). IR (CHC13) cm'1: 2500-3500, 1725. Masse FAB' (GT): m/e (intensité relative) 193 (100)
Exemple 3.6: Hydrolyse enzymatique du 2-cyanoacétate d'éthyle (Composé 9)
Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 8,50 g (0,075 mole) du 2-cyanoacétate d'éthyle et 4,7 g de matériel biologique immobilisé sont ensuite additionnés. Le rendement obtenu, après 7 heures, est de 94% en acide 2-carbétoxyacétique. Η RMN (DMSO d6) δH ppm: 1,19 (t, 3H, CH3-CH2-O), 3,33 (s, 2H, HO2C-CH2-CO2Et), 4,12 (q, 3H, CH3-CH2-O), 10,71 (s, IH, CO2H). 13C RMN (DMSO d6) δc ppm: 14,66 (QH3-CH2-O-), 42,34 (HO2C-ÇH2-CO2Et), 64,47 (CH3-ÇH2-O), 167,7 (-ÇO2-CH2- CH3), 168,9 (ÇO2H). IR (CHC13) cm'1: 2500-3500, 1745, 1725. Masse FAB" (GT): m/e (intensité relative) 131 (65), 104 (40), 87 (100), 41 (25).
Les résultats des exemples 3.1 à 3.6 sont compilés dans le Tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2: Hydrolyse enzymatique de composés nitriles bi-fonctionnels
Substrat Temps de réaction (h) Rendement (%)a
_ _ _
5 9 93
6 27 92
7 25 86
8 47 80
9 7 94 a Rendement en acide extrait après bioconversion totale du nitrile (excepté pour le nitrile 4)
Exemple 4: Hydrolyses enzymatiques de dinitriles
Exemple 4.1: Hydrolyse enzymatique du malononitrile (Composé 10)
Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 5,0 g (0,075 mole) de malononitrile commercial et 2,75 g de matériel biologique immobilisé. Le rendement obtenu, après 51 heures, est de 87% en acide 2- cyanoacétique (Composé 10a). Η RMN (DMSO d6) δH ppm: 3,57 (s, 2H, -CH2-), 11,57 (s, IH, COÎH). 13C RMN (DMSO d6) δc ppm: 25,46 (ÇH2-CN), 115,4 (ÇN), 165,6 (ÇO2H). IR (CHC13) cm'1: 2500-3500, 2240, 1725. Masse FAB' (GT): m/e (intensité relative) 84 (100), 46 (60).
Exemple 4.2: Hydrolyse enzymatique de Vadiponitrile (Composé 11) Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 8,02 g (0,075 mole) d'adiponitrile commercial et 4,50 g de matériel biologique immobilisé. Le rendement obtenu, après 53 heures, est de 90% en acide 5- cyanopentanoïque. 1H RMN (DMSO d6) δH ppm: 1,60 (m, 2H, HO2C-CH2-CH2-), 1,62 (m, 2H, NC-CH2-CH2-), 2,23 (t, 2H, -CH2-CO2H), 2,51 (t, 2H, -CH2-CN), 12,41 (s, IH, CO2H). 13C RMN (DMSO d6) δc ppm: 16,92 (NC-ÇH2-CH2), 24,92 (NC-CH2-ÇH2), 25,31 (ÇH2-CH2-CO2H), 34,95 (ÇH2-CO2H), 121,38 (ÇN), 176,41 (s, IH, ÇO2H). IR (CHC13) cm'1: 2500-3500, 2245, 1730. Masse FAB' (GT): m/e (intensité relative) 126 (100).
Exemple 4.3: Hydrolyse enzymatique dufumaronitrile (Composé 12)
Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 5,90 g (0,075 mole) de fumaronitrile commercial et 3,25 g de matériel biologique immobilisé. Le rendement obtenu, après 25 heures, est de 72% en acide 3- cyanoacrylique et de 28% en 3-cyanoacrylamide.
Acide 3-cyanoacrylique
Η RMN (DMSO d6) δH ppm: 5,84 (d, IH, HO2C-CH=CH-CN), 6,54 (d, IH, HO2C-CH-=CH- CN), 13,10 (s, IH, Cθ2H).13C RMN (DMSO d6) δc ppm: 115,03 (HO2C-CH=ÇH-CN), 119,09 (ÇN), 153,22 (HO2C-ÇH-=CH-CN), 167,13 (ÇO2H). IR (CHC13) cm'1: 2500-3500, 2225, 1695. Masse FAB' (GT): m/e (intensité relative) 96 (100), 52 (10).
3-cyanoacrylamide Η RMN (DMSO d6) δH ppm: 6,56 (d, IH, H2NOC-CH=CH-CN), 7,04 (d, IH, H2NOC-CH=CH- CN), 7,72-7,99 (d, 2H, CONH,). 13C RMN (DMSO d6) δc ppm: 109,54 (H2NOC-CH=ÇH-CN), 117,95 (ÇN), 144,95 (H2NOC-ÇH=CH-CN), 164,01 (ÇONH2). IR (CHC13) cm'1: 3100-3500, 2235, 1695. Masse FAB' (GT): m/e (intensité relative) 95 (10).
Exemple 4.4: Hydrolyse enzymatique du l,4-dicyanobut-2-ène (Composé 13)
Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 5,30 g (0,05 mole) de l,4-dicyanobut-2-ène commercial et 3,0 g de matériel biologique immobilisé dans 500 mL d'eau millipore. Le rendement obtenu, après 25 heures, est de 82% en acide S-cyanopentθ-ènoïque.Η RMN (DMSO d6) δH ppm: 3,04 (dd, 2H, HO2C-CH2), 3,31 (dd, 2H, CH2-CN), 5,51 (td, IH, NC-CH2-CH=), 5,82 (td, IH, H2OC-CH2- CH=), 10,51 (s, IH, COjH). 13C RMN (DMSO d6) δc ppm: 20,34 (ÇH2-CN), 38,14 (H2OC-ÇH2), 119,44 (ÇN), 122,21 (NC-CH2-ÇH=), 128,75 (H2OC-CH2-ÇH=), 173,44 (ÇO2H). IR (CHC13) cm'1: 2500-3500, 2255, 1725. Masse FAB' (GT): m/e (intensité relative) 124 (100), 80 (25), 46 (30). Exemple 4.5: Hydrolyse enzymatique du 2-méthylglutaronitrile (Composé 14)
Le protocole opératoire est identique à celui décrit à l'exemple 2.1. Les quantités introduites sont les suivantes: 8,27 g (0,075 mole) de 2-méthylglutaronitrile commercial et 4,56 g de matériel biologique immobilisé. Le rendement obtenu, après 96 heures, est de 91% en acide 4- cyanopentanoïque. Η RMN (DMSO d6) δH ppm: 1,23 (d, 3H, CH3-CH), 1,79 (td, 2H, NC- CH(CH3)-CH2-), 2,35 (td, 2H, -CH2-CO2H), 2,84 (m, 2H, -CH-CN), 10,89 (s, IH, CO,!!). 13C RMN (DMSO d6) δc ppm: 18,08 (ÇH3-CH), 24,94 (NC-ÇH-), 29,33 (ÇH2-CH2-CO2H), 31,89 (ÇH2-CO2H), 123,78 (ÇN), 174,25 (s, IH, ÇO2H). IR (CHC13) cm'1: 2500-3500, 2240, 1735. Masse FAB' (GT): m/e (intensité relative) 126 (100), 54 (5).
Les résultats des exemples 4.1 à 4.5 sont compilés dans le Tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3: Hydrolyse enzymatique de composés dinitriles
Substrat Temps de réaction (h) Conversion (%) a Rendement (%) b
_ _
89 87
11 53 91 90
12 25 100 72
13 25 98 82
14 96 92 91 a % conversion du dinitrile Rendement en monoacide obtenu après purification

Claims

Revendications
1- Procédé de préparation d'acides carboxyliques aliphatiques, à l'exception de hydroxyanalogue de la méthionine, par hydrolyse enzymatique de composés nitriles aliphatiques, à l'exception du 2-hydroxy 4-méthylthio butyronitrile, caractérisé en ce que:
(a) on prépare un matériel biologique ayant une activité nitrilase, ladite activité étant obtenue à partir d'une nitrilase d'une bactérie du genre Alcaïigenes,
(b) on immobilise ledit matériel biologique
(c) on met en présence un composé nitrile avec le matériel biologique ainsi immobilisé, pour obtenir le sel d'ammonium de l'acide carboxylique aliphatique formé
(d) éventuellement, on purifie l'acide formé
2- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'activité mtrilase est obtenue à partir de la nitrilase de la bactérie Alcaïigenes faecalis ATCC8750
3 - Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le matériel biologique consiste en un microorganisme hôte transformé exprimant une activité nitrilase recombinante
4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le microorganisme hôte est la bactérie Escherichia coli exprimant le gène nitB d'Alcaligenes faecalis ATCC 8750
5- Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les composés mtriles aliphatiques sont des dérivés O-substitués du 2-hydroxy 4-méthylthio butyronitrile et que les acides formés sont des dérivés O-substitués de hydroxyanalogue de la méthionine
6- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les dérivés O-substitués du 2- hydroxy 4-méthylthio butyronitrile sont des dérivés O-acétylés ou O-hydroxyalkylés
7- Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les composés nitriles aliphatiques sont des nitriles multi-fonctionnels sélectionnés parmi les mtriles aliphatiques, les nitriles vinyliques, les nitrile-esters, les nitrile-ester allyliques, et les nitrile-éther 8- Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les composés mtriles aliphatiques sont des dinitriles aliphatiques symétriques ou dissymétriques et que les acides formés sont des cyanoacides
9- Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les dinitriles aliphatiques symétriques sont sélectionnés parmi le malononitrile, l'adiponitrile, le fumaronitrile, ou le 1,4- dicyanobut-2-ène
10- Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les dinitriles aliphatiques disymétriques sont des 2-alkyl ou des 2-aryI dinitriles aliphatiques de structure générale:
NC — CH (CH2)n CN
I
R
dans laquelle: n est un nombre entier quelconque, et R est un groupe alkyl, un groupe aryl ou une chaîne multifonctionnelle
11- Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les dinitriles aliphatiques dissymétriques sont le 2-méthylglutaronitrile, le 2-méthylsuccinonitrile, ou le 2- méthyladiponitrile
12- Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le matériel biologique de l'étape (a) est immobilisé sur un support solide.
13- Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le support solide a une granulométrie comprise entre 1 μm et 500 μm, de préférence 10 μm et 200 μm, et en ce qu'il constitue de 0,01 à 200 %, de préférence 10 à 100 % en poids du matériel biologique.
14- Procédé selon l'une des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce que le support solide est choisi parmi: - les résines échangeuses d'ions,
- l'alumine, - les silices de synthèse ou diatomées et les gels de silice,
- les zéolites,
- les charbons,
- les protéines partiellement solubles ou insolubles dans l'eau, et - les polysaccharides.
15 - Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le support solide est le gluten.
16- Procédé selon l'une des revendications 1 à 15 caractérisé en ce que le rapport entre la masse de matériel biologique immobilisé et la masse de substrat est de 0,1 et 10
17- Procédé selon l'une des revendications 12 à 16, caractérisé en ce que le matériel biologique immobilisé est formulé selon une méthode de pelliculage
18- Procédé selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que l'étape (c) est réalisée dans une ou plusieurs colonnes ou réacteurs
19- Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que la ou les colonnes ou réacteurs sont mis en œuvre à une température comprise entre 10 et 60°C
20- Procédé selon l'une des revendications 18 ou 19, caractérisé en ce que la ou les colonnes ou réacteurs sont mis en œuvre à un pH compris entre 5 et 9
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