NL8002603A - Werkwijze voor de enzymatische bereiding van l-tryptofaan. - Google Patents

Description

, V 'A

-1- 21299/Vk/mv

Aanvrager: Mitsuitoatsu Chemicals Inc. Tokio, Japan,

Korte aanduiding: Werkwijze voor de enzymatische bereiding van L-trypto-faan.

5 De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de en zymatische bereiding van L-tryptofaan door uit te gaan van indoöl en serine.

Met name heeft de uitvinding betrekking op een verbeterde werkwijze voor de enzymatische bereiding van L-tryptofaan door indool in reactie te brengen met serine in aanwezigheid van bepaalde enzymen. Er 10 zijn een aantal werkwijzen bekend voor het bereiden van L-tryptofaan onder toepassing van enzymen, waarbij met name tryptofaansynsthetase of tryptofanase wordt toegepast. De werkwijze ter bereiding van L-tryptofaan onder toepassing van tryptofaansynthetase is aangegeven in "The Journal of Biological Chemistry", 249 bladzijde 7756-7763 (1974) en de bereiding 15 van L-tryptöfaan onder toepassing van een tryptofanase-bereidend micro-organisme is aangegeven in "Vitaminologica et Enzymologica" 29 bladzijde 248-251 (1975).

Indool wordt toegepast als een van dei uitgangsstoffen, bij deze bekende werkwijzen en dit is een stof die op goedkope wijze industri-20 eel kan worden bereid. De bereiding van serine, het andere uitgangsmateriaal, kan plaatshebben door eiwitten te extraheren, een fermentatie -procédé, een enzymatische bereiding of door organische synthese. Tegenwoordig wordt serine het goedkoopst bereid door de organische synthese toe te passen. Een nadeel van de organische synthese is echter dat serine 25 bereid volgens de organisch synthese DL-serine is. Bij de reactie met het enzym tryptofaansynthetase of tryptofanase kan echter alleen L-serine worden toegepast, terwijl D-serine niet onderhevig is aan de inwerking van deze enzymen. Daaróm is het gebruik van DL-serine als uitgangsmateriaal aanzienlijk problematischer bjij industriëlè toepassing dan L-serine.

30 Met betrekking tot de enzymatisch werkwijze voor de 'synthese van tryptofaan uit indool· en serine waarbij DL-serine wordt toegepast als uitgangsmateriaal is een werkwijze beschreven in "Agricultural and Biological Chemistry" 38 , nr. 7, bladzijden 1343-1349 (1974). Volgens deze werkwijze worden indooien L-serine omgezet tot L-tryptofaan, het niet-35 gereageerde D-serine afgescheiden en teruggewonnen uit het reactiepro-duct, D-serine onderworpen aan een racemiserlng bij hoge temperatuur onder hoge druk in een waterige oplossing en het racemaat-product wordt toegepast als substraat voor de enzymatische reactie. Deze racemisering wordt bijvoor- 800 2 6 03 -2- 21299/Vk/mv beeld bewerkstelligd door D-serine onder hoge druk te behandelen bij een hoge temperatuur van ongeveer 160 °C gedurende ongeveer 4 uren.Door het herhalen van de enzymatische reactie en de racemizering , hetgeen afwisselend kan worden bewerkstelligd kan uiteindelijk DL-serine worden omge-5 zet tot L-tryptofaan welke omzetting nagenoeg volledig kan plaats hebben. Deze werkwijze heeft echter een aantal nadelen te weten: 1) de racemiseringsomstandigheden wordt uitgevoerd bij hogere temperaturen en drukken dan de enzymatische reactie , en daardoor is het onmogelijk om de beide reacties gelijktijdig te laten plaatshebben, 10 2) wanneer L-tryptofaan aanwezig is bij de racemisering wordt niet alleen serine maar ook L-tryptofaan geracemiseerd en daarom moet de racemisatie worden uitgevoerd na volledige afscheiding van L-tryptofaan, 3) omdat het enzym gedesactiveerd wordt onder racemiserings-15 omstandigheden is het noodzakelijk ten einde het enzym continu te gebruiken om het enzym af te scheiden en terug te winnen voordat de racemisatie plaats heeft, 4) een bijproduct wordt gevormd door de warmtebehandeling onder druk voor de racemisatie waarbij een verkleuring van het product.

20 wordt bewerkstelligd en daarom wordt de zuivering uitgevoerd na de reactie, en 5) een grote hoeveelheid energie wordt verbruikt voor de warmtebehandeling onder hoge druk voor de racemisatie en verder moet na de racemisatie het vloeibare reactiemengsel worden afgekoeld tot de 25 enzymatische reactiefcemperatuur.

Het zal duidelijk zijn uit het bovengestelde x dat het gebruik van DL-serine, verkregen volgens de synthetische werkwijze, als uitgangsmateriaal voor de enzymatische reactie ernstige problemen inhoudt en deze problemen zijn opgelost door de synthese van L-tryptofaan volgens 30 de uitvinding.

Een van de doelstelligen volgens de uitvinding is het verkrijgen van een werkwijze voor ter bereiding van L-tryptofaan door indool in reactie te brengen met L-serine in •(aanwezigheid van tryptofaan-synthetase of tryprofanase waarbij DL-serine of D-serine effectief kan 35 worden toegepast voor de "bereiding van L-tryptofaan.

Een andere doelstelling volgens de uitvinding is het verkrijgen van een werkwijze waarbij D-serine kan worden omgezet tot L-serine zonder dat een hoge temperatuur en een hoge druk moet worden toegepast 800 2 6 03 -3- 21299/Vk/rav * * als uitgangsmateriaal voor de synthese van L-tryptofaan. Verder wordt bij de werkwijze volgens de uitvinding gestreefd naar een werkwijze waarbij DL-serine of D-serine kan worden omgezet tot L-tryptofaan waarbij de racemisering wordt uitgevoerd zonder dat de achtereenvolgende staDpen 5 van de racemisering van DL-serine of D-serine ^moeten worden bewerkstelligd en het omzetten van het gevormde L-serine tot L-tryptofaan.

Ook wordt bij de werkwijze volgens de uitvinding gestreefd naar het verkrijgen van een procédé dat op economische wijze kan worden uitgevoerd voor de bereiding van L-tryptofaan waarbij de kwaliteit van 10 het product sterk kan worden verbeterd en de reactie waarbij L-tryptofaan wordt bereid kan worden bewerkstelligd, waarbij de ontleding van serine op gewenste wijze kan worden geregeld.

Bij de werkwijze volgens de uitvinding worden deze doelstellingen bereikt door een werkwijze toe te passen die hierdoor wordt 15 gekenmerkt dat indool’ in reactie wordt gebracht met L-serine in aanwezigheid van tryptofaansynthetase of tryptofanase waarbij DL-serine of D-serine wordt gebruikt als uitgangsmateriaal en DL-serine of D-serine in reactie wordt gebracht met serineracemase zodat ten minste een deel van het D-serine wordt omgezet tot L-serine.

20 Wanneer een serine-racemiseringsenzym aanwezig is samen met tryptofaansynthetase of tryptofanase bij de bovenvermelde werkwijze en ten minste een deel van D-serine wordt omgezet tot DL-serine kan de racemisering zoals tot nu toe noodzakelijk was achterwege blijven.

Wanneer tryptofaansynthetase of tryptofanase en/of een 25 serineracemis£:ringsenzpi worden toegepast bij het bovenvermelde procédé en ammoniüraionen aanwezig zijn in het reactiesysteem kan de kwaliteit van het verkregen L-tryptofaan aanzienlijk worden verbeterd en L-tryptofaan kan op economische wijze worden bereid onder regeling van de ontleding van serine.

30 Het "serineracemise rende enzym" dat toegepast woödt bij de werkwijze volgens de uitvinding wordt hierna aangegeven als "serineracemase". Als serineracemase-producerend micro-organisme kunnen de volgende organismen worden genoemd, Pseudomonas putida IFO 12996,

Brevibacterium leucinophagum MT-10072, Pseudomonas desmolytica MT-10170, 35 Pseudomonas fragi MT-10173 en Pseudomonas taetorolens MT-10186.

Van deze serineracemase-producerende „micro-organismen is Pseudomonas putida IFO 12996 een organisme dat eerst geïdentificeerd was als Pseudomonas striata. De eigenschappen hiervan, de werkwijze voor -4- 21299/Vk/mv extractie van het racemase uit bereide cellen uit een cultuur en de eigenschappen van het geëxtraheerde racemase zijn aangegeven in "Agricultural and Biological Chemistry", 21* nr 9 bladzijden 1097-1099 (1967), evenals 33, nr. 3 bladzijden 424-429 (1969), en 33, nr 33 bladzijden 430-435 5 (1969), "Biochemical and Biophysical Research Communications", 35 nr. 3 bladzijden 363-368 (1969) en een proefschrift getiteld "Studies on Amino Acid of Racemase of Pseudomonas Striata" van Takahura Osumi aan de Kyoto universiteit, landbouwkundige afdeling (Japan). Dit proefschrift vermeldt dat dit racemase wordt aangegeven als "low substrate specificity 10 amino acid racemase" en dat 20 soorten aminozuren met inbegrip van lysine, £-N-acetyl-lysine en serine substraten kunnen zijn voor dit racemase en 13 soorten aminozuren met inbegrip van C^-N-acetyllysine geen substraten kunnen zijn voor dit racemase. Ook is aangegeven dat wanneer serine een substraat is voor dit racemase de relatieve activiteit van 15 serine 8,7 is en aanzienlijk lager dan de activiteit van lysine of £-N-acetyllysine welke 100 bedraagt. Het gedrag van dit racemase ten opzichte van tryptofaan is echter niet aangegeven.

Er is nader onderzoek gedaan naar de eigenschappen van dit racemase met een . lage specificiteit ten opzichte van het substraat en 20 er is gebleken dat dit racemase tryptofaan niet racemiseert dat '.geen racematische remming wordt verkregen door L-tryptofaan, dat het een effectieve activiteit heeft onder een optimale reactietemperatuur en pH-omstandigheden voor de bereiding van L-tryptofaan uit indool en L-serine in aanwezigheid van tryptofaansynthetase of tryptofanase en dat het eigen-25 schappen heeft die geschikt zijn voor de synthese van L-tryptofaan. Op basis hiervan zijn micro-organismen onderzocht die het mogelijk maken dat serineracemase wordt bereid en de bovenvermelde micro-organismen genussen zijn gevonden.

De extractie van het aminozuurracemase met een lage sub-30 straatspecificiteit uit Pseudomonas putida IFO 12996, hetgeen een van de serineracemase producerende genussen is wordt bewerkstelligd door bijvoorbeeld een werkwijze toe te passen bestaande uit de volgende stappen: 1) ruwe extractie, 2) precipitatie met ammoniumsulfaat, 35 3) eerste chromatografische bewerking onder toepassing van diethylamino- ethylcellulose, 4) tweede chromatografische bewerking onder toepassing van diethylaminoethylcellulose 5) chromatografische bewerking onder toepassing van Sephadex G-200 (merknaam voor het product van Pharmacy 800 2 6 03 « 1 -5- 21299/Vk/mv

Fine Chemicals Co.) en 6) kristallisatie.

De extractie en zuivering wordt nader beschreven in "Biochemical and Biophysical Research Communications”, 35 nr. 3 bladzijden 363-368 (1969).

5 Als genus voor het bereiden van tryptofaansynthetase dat toegepast wordt volgens de uitvinding kan vermeld worden Escherichia coli MT-10231, Escherichia coli MT-10232, Escherichia coli MT-10238, en Neurospora crassa ATCC 14692. De werkwijze waarbij de extractie wordt bewerkstelligd van tryptofaansynthetase uit cellen die aanwezig zijn in 10 een cultuur van Escherichia coli is vermeld in '"The Journal of Biochemistry" 252 nr. 19 bladzijden 6594-6599 (1977), en de werkwijze voor het extraheren van tryptofaansynthetase uit cellen aanwezig in een cultuur van Neurospora crassa is vermeld in "The Journal of Biological Chemistry',', 250, 8, bladzijde 2941-2946 (1975).

15 Ter bereiding van tryptofanase kan een genus worden toegepast volgens de uitvinding zoals Proteus vulgaris IFO 3167, Escherichia coli IAM 1268, Aerobacter aerogenes IFO 12019, Klebsiella pneumoniae ATCC 8724 en Bacillus alvei ATCC 6348. De werkwijze voor het extraheren van tryptofanase uit gekweekte cellen is aangegeven in "Amino Acid and 20 Nucleic Acid", nr 31 bladzijden 102-112 (1975). Tryptofanase is ook een in de handel verkrijgbaar reagens dat toegepast kan worden bij de werkwijze volgens de uitvinding.

Elk synthetisch en natuurlijk cultuurmedium kan worden toegepast voor het kweken van een genus ter bereiding van trypfofaansynthetase, 25 tryptofanase, : of serineracemase zolang het een koolstofbron, stikstof-bron , anorganische stoffen en indien noodzakelijk een kleine hoeveelheid voedingsmiddel bevat. Bij het bereiden van een cultuur voor het tryptofaansynthetase producerende genus is het gewoonlijk noodzakelijk om een kleine hoeveelheid tryptofaan, antranilzuur of indool toe te voegen aan 30 het cultuurmedium. Bij het bereiden van een cultuur voor het tryptofanase producerende genus geldt omdat tryptofanase een inducerend, enzym is dat wanneer tryptofaan wordt toegevoegd in een hoeveelheid van ongeveer 0,1 tot 0,5 gew.% aan een cultuurmedium de verkregen cellen een hoge tryptofanase activiteit kunnen diebben. Elke gebruikelijke koolstofbron en 35 stikstofbron kan worden toegepast die gewoonlijk wordt gebruikt bij een dergelijke genus. Zo kan bijvoorbeeld als koolstofbron carbohydraten worden gebruikt zoalè glucose, glycerol, fructose, sucrose, maltose, mannose, zetmeel, gehydroliseerd zetmeel, en melassen. Als stikstofbron 800 2 6 03 -6- 21299/Vk/mv kan gebruik gemaakt worden van diverse organische en anorganisch ammo-niumzouten zoals ammoniak, ammoniumchloride, ammoniumsulfaat, ammonium — carbonaat, ammoniumacetaat en de natuurlijke organische stikstofbronnen kunnen worden toegepast zoals vleesextract, gistextract, raaisweekwater, 5 gehydroliseerd caseïne, vismeel, verteerd vismeel, ontvette sojabonen, en verteerde ontvette sojabonen. De meeste natuurlijke organische stikstofbronnen kunnen niet alleen dienst doen als stikstofbron maar ook als koolstofbron. Wanneer anorganische stoffen worden gebruikt zoals kalium-diwaters tof fosfaat, dikaliumwaterstof fosfaat, kaliumchloride, natriumchloride 10 magnesiumsulfaat en ijzer(II)sulfaat kunnen eveneens goede resultaten worden bewerkstelligd.

De cultuur wordt gebruikt onder aerobe omstandigheden volgens een schudbewerking of belucht onder roeren van een submerse cultuur. De cultuurtemperatuur ligt tussen 20 en 50 °C. Het verdient de voor-15 keur dat de pH van het cultuurmedium gehouden wordt bij een neutrale of zwak alkalische waarde tijdens de cultuur. Gewoonlijk bedraagt de cultuurperiode een tot zeven dagen.

Elk van de enzymen tryptofaansynthetase, tryptofanase en serineracemase, verkregen door de cultuurbewerking onder toepassing van 20 de bovenvermelde werkwijzen , kunnen worden 'gebruikt in de vorm van levende cellen, verzameld uit het cultuurmedium van de enzymproducerende genus, gedroogde cellen ^behandelde cellen verkregen door de cellen fijn te maken , ze te onderwerpen aan een autolyse of sonische behandeling extracten uit deze cellen , een ruw enzym verkregen uit dergelijke ex-25 tracten of een zuiver enzym. Bij de werkwijze volgens de uitvinding kunnen de bovenvermelde enzymen worden toegepast nadat deze gefixeerd zijn volgens bekende werkwijzen die gewoonlijk worden toegepast voor het fixeren van enzymen, bijvoorbeeld door ze te binden aan een drager, door een verknoping te bewerkstelligen of een andere fixeerbewerking. Bij de werk-30 wijze waarbij het enzym gehecht wordt aan een drager wordt het enzym aangebracht op een drager met name een natuurlijk - polymeer een derivaat hiervan een synthetisch polymeer off een anorganische stof onder toepassing van de covalente bindingsmethode zoals de diazo-, peptide-, alkylerings-of acyleringsmethode, de bewerking waarbij ionenbinding optreedt, fysische 35 adsorptie, biologische adsorptie of de adsorptie onder toepassing van de biochemische affiniteit.

Bij de verknopingsmethode wordt het enzym gefixeerd onder toepassing van een bifunctioneelreagens. Als fixeermethode of vasthoud- 800 2 6 03 -7-- 21299/Vk/mv ΐ Λ methode kan gebruik gemaakt worden van de zogenaamde roosterpiethode waarbij een molecuul van het levend enzym aangebracht wordt in een gel , gevormd door polymerisatie van acrylamide of dergelijke en de zogenaamde microcap-sule->methode waarbij het enzym aangebracht wordt in een micro-capsule van 5 een semipermeabel membraan van een natuurlijk polymeer of synthetisch polymeer.

Bij de werkwijze volgens de uitvinding wordt deze enzym-fixerende bewerking in afhankelijkheid van de onder bepaalde omstandigheden meest geschikte werking gekozen en aangepast aan de verschillende reactie-10 omstandigheden een en ander zoals hieronder nader wordt toegelicht. In het algemeen echter zal de werkwijze waarbij een acrylamide type monomeer wordt gebruikt meestal worden toegepast als de bij voorkeur toegepaste bewerking. Als acrylamidemonomeer kan bijvoorbeeld acrylamide,N-N*-methyleen-bis-acrylamide en diacrylamidemethylether worden gebruikt. De polymerisatie 15 van een dergelijke monomeer wordt uitgevoerd in aanwezigheid van een polyme-risatie-initiator zoals kaliumpersulfaat, ammaniumpersulfaat, vitamine B.j of methyl een blauw en een polymerisatiebevorderende stof zoals (dirn2thylamino)-propionnitril of Ν,Ν,Ν», N' - tetramethylethyleendiamine.

Indien tryptofaansynthetase of tryptofansae en/of serine 20 racemase worden gefixeerd volgens de bovenvermelde fixeermethode en toegepast in de gefixeerde toestand bij de reactie kan de bereiding van L-tryp-tofaan met goed gevolg worden uitgevoerd. Met name kan gesteld worden dat L-tryptofaan, gevormd door de enzymatische bewerking, onvermijdbare, onzuiverheden bevat zoals celstoffen, uitgangsstoffen die toegepast zijn voor de 25 cultuur en diverse eiwitten en L-tryptofaan met een hoge zuiverheid kan nauwelijks worden verkregen en omdat hefc relatief moeilijk is het enzym af te scheiden van het gevormde L-tryptofaan is het moeilijk om het enzym herhaaldelijk toe te passen. Hierentegen geldt dat wanneer het gefixeerde enzym wordt toegepast de eluering van onzuiverheden uit het enzym in de waterige 20 oplossing van het gevormde L-tryptofaan makkelijker kan worden geregeld en dat daarom de zuiverheid van het verkregen L-tryptofaan aanzienlijk kan worden verbeterd. Bovendien is het mogelijk om het enzym herhaaldelijk te gebruiken en heeft deze werkwijze meer mogelijkheden voor de bereiding van L-tryptofaan, waardoor de werkwijze kan worden verbeterd.

35 Met name geldt dat voor het omzetten van ten minste een deel van D-serine tot L-serine door de werking van serineracemase en de bereiding van L-tryptofaan bij de werkwijze volgens de uitvinding waarbij indool en DL-serine of D-serine worden toegepast air. uitgangsmateriaal de «00 2 6 03 9 y -8- 21299/Vk/mv reactie voor het omzetten van L-serine tot L-tryptofaan kan worden aangepast door de werking van tryptofaansynthetase of tryptofanase en de reactie voor het racemiseren van serine door de werking van serinerace-mase. De twee reacties kunnen gelijktijdig worden uitgevoerd in een re-5 actievat of zij kunnen onafhankelijk van elkaar worden bewerkstelligd in verschillende reactievaten. De werkwijze waarbij cerineracemase asamen aanwezig is met tryptofaansynthetase of tryptofanase en waarbij L-tryptofaan wordt bereid in één stap verdient echter de voorkeur omdat dit voordelen heeft als de werkwijze· ·ορ grote schaal wordt toegepast en verder 10 kkn de bewerking zodoende worden vereenvoudigd. Wanneer DL-serine wordt gebruikt en deze werkwijze wordt gevolgd is het mogelijk om het DL-serine waarvan wordt uitgegaan om te zetten tot L-tryptofaan waarbij het eindproduct met een hoge opbrengst wordt verkregen in eenvoudige apparatuur omdat L-serine wordt omgezet tot L-tryptofaan en gelijktijdig D-serine 15 geracemiseerd wordt tot DL-erine en omgezet tot L-tryptofaan. Ook wanneer D-serine wordt 'gebruikt wordt de conversie gelijktijdig bewerkstelligd op dezelfde wijze als wanneer DL-serine wordt, gebruikt omdat de conversie tot L-tryptofaan gelijktijdig bewerkstelligd wordt met de racemiserings-reactie.

20 Zoals boven is aangegeven geldt dat bij de werkwijze volgens de uitvinding de reactie of conversie tot L-tryptofaan en de racemiserings-reactie van serine onafhankelijk van elkaar of gelijktijdig kunnen worden uitgevoerd. Wanneer het enzym wordt toegepast in de gefixeerde toestand kan een geschikte fixeerbewerkir.g worden gekozen uit de bovenvermelde re-25 acties. Meer specifiek geldt dat bij de werkwijze volgens de uitvinding een werkwijze kan worden gekozen waarbij alleen tryptofaansynthetase of tryptofanase wordt gefixeerd en een werkwijze waarbij tryptofaansynthetase of tryptofanase en serineracemase worden gefixeerd en deze 2 werkwijzen kunnen worden gecombineerd met de bovenvermelde werkwijzen waarbij 30 beide enzymen afzonderlijk of gelijktijdig hun werking kunnen verrich- . ten. Verder kan een werkwijze worden toegepast waarin beide gefixeerde enzymen worden gebruikt in combinatie of afzonderlijk, een batch-be-werking wordt toegepast of een continue werkwijze onder toepassing van een kolom of dergelijke.

35 De enzymconcentratie , de hoeveelheid substraat zoals in dool , DL-serine en D-serine en de hoeveelheden enzym ,gefixeerd aan een drager, kunnen op geschikte wijze worden aangepast aan de bovenvermelde reactieomstandigheden, en uitvoeringsvormen.

800 2 6 03 , . f * -9- 21299/Vk/mv

De hoeveelheden uitgangsmateriaal zoals indool, DL-serine en D-serine in het reactiesysteem en de verhouding van de hoeveelheid indool tot de hoeveelheid DL-serine en D-serine zijn niet bijzonder kritisch bij de werkwijze volgens de uitvinding, maar de concentratie van 5 het uitgangsmateriaal in de vloeistof is gewoonlijk 0,01 tot 20 gew.% en de bovenvermelde verhouding van het uitgangsmateriaal kan vrij worden gekozen. Het verdient echter gewoonlijk de voorkeur dat ..de indool-concentratie, opgelost in de reactievloeistof lager is dan 500 dpm, met name ongeveer 100 dpm.is. Zodoende kan wanneer het gewenst is om L-10 tryptofaan te verzamelen bij een hoge concentratie vaak een werkwijze worden aangepast waarbij indool f geleidelijk en continu worden toegevoegd zodat de concentratie van indool op een bepaald tijdstip niet wordt verhoogd. Wanneer deze continue toevoegingshewerking niet wordt toegepast kan de hoeveelheid opgelost indool worden verhoogd tot ongeveer 10 gew.% 15 door het toevoegen van een oppervlakte actieve stof bijvoorbeeld Triton X-100 (merk voor polyoxyethyleenalkylfenolether-type niefc-ionisch oppervlakte actief middel bereid en verkocht door TJako Junyaku Kogyo) aan het reactiesysteem. De hoeveelheid toegevoegd oppervlakte actief middel is bij voorkeur"!-10 gew.%, met name ongeveer 5 gew.% in de waterige oplossing 20 hoewel de .hoeveelheid toegevoegd oppervlakte actief middel enigszins kan worden gevarieerd in afhankelijkheid van de indool-concentratie. De oplosbaarheid van DL-serine in de waterige oplossing is ongeveer 6 gew.% bij 30 °C en de oplosbaarheid van D-serine of L-serine in de waterige oplossing is ongeveer 25 gew.% bij een temperatuur van 30 °C. Hierbij kan echter 25 worden gesteld dat wanneer de serineconcentratie tot 10 gew.% bedraagt in de waterige oplossing bij een hogere 1 concentratie de reactiesnelheid hoger is.

De hoeveelheden tryptofaansynthetase, tryptofanase en serineracemase aanwezig in het reactiesysteem worden aangepast volgens 30 de bovenvermelde werkwijzen van de zuivering, afscheiding en verdere behandeling van de enzymen maar deze zijn niet bijzonder kritisch en kunnen op geschikte wijze worden bepaald in afhankelijkheid van de gewenste hoeveelheid en verhouding van de uitgangsstoffen de activiteit van de . enzymen en andere factoren.Wanneer de hoeveelheid serineracemase 35 echter aanzienlijk lager is dan de hoeveelheid tryptofaansynthetase of tryptofanase is de hoeveelheid L-serine in de reactievloeistof laag en de reactiesnelheid is dan laag. Anderzijds wanneer de hoeveelheid tryptofaansynthetase of tryptofanase veel lager is dan de hoeveelheid 800 2 6 03 -10- 21299/Vk/rav serineracemase is de hoeveelheid en de verhouding van D-serine tot L-serine ongeveer 1, maar de vormingssnelheid jvan L-tryptofaan wordt laag.

Zodoende moet de concentratie van tryptofaansynthetase of tryptofanase en de hoeveelheid en verhouding hiervan op geschikte wijze worden bepaald 5 en in afhankelijkheid van de L-tryptofaan-vormigsomstandigheden worden aangepast.

Bij de werkwijze volgens de uitvinding is het mogelijk om vers substraat of uitgangsstoffen toe te voegen tijdens de reactie. Ook is het mogelijk om een deel of alle gevormde L-tryptofaan uit het reactie-10 systeem te verwijderen tijdens de reactie. Bij het uitvoeren van de reactie volgens de uitvinding kan pyridoxaalfosfaat, hetgeen een co-enzym is, in de reactievloeistof worden verwerkt in een kleine hoeveelheid, bijvoorbeeld een concentratie van 1 tot 100 dpm in de reactievloeistof naast de uitgangsstoffen.

15 Wanneer tryptofaansynthetase of tryptofanase wordt gebruikt in de vorm van enzymhoudende gekweekte cellen van de enzymproducerende micro-organismen of een extract uit deze cellen zal omdat een enzym' -ontledende L-serine of D-serine gewoonlijk aanwezig is in dergelijke cellen of extracten ammoniumionen die een dergelijke ontleding kunnen remmen ver-20 werkt worden in de reactievloeistof.

Diverse enzymatische reacties onder toepassing van serine als een van de reactanten zijn bekend. De ontleding van serine in dergelijke reactiesysteaen of de remming van deze ontleding is echter in geen van de gevonden literauurplaaatsen vermeld . Als een van de redenen hiervoor 25 kan worden genoemd dat de ontleding nauwelijks is waargenomen bij deze reacties of nauwelijks plaats heeft wanneer zuivere enzymen worden gebruikt. Wanneer echter cellen van micro-organismen of extracten uit een cultuur worden toegepast verkregen uit een celcultuur, worden enzymen toegepast waarbij de ontleding van serine niet buiten beschouwing kan 30 blijven.

In dit kader zijn onderzoekingen gedaan met als doelstelling om een werkwijze te ontwikkelen waarbij de ontleding van L-serine en/of D-serine door de cellen uit een cultuur van micro-organismen of extracten hiervan effectief kan worden geremd en het is gebleken dat wanneer 35 ammoniumionen aanwezig zijn in de reactievloeistof de ontleding van serine op effectieve wijze kan worden geremd. De concentratie van de ammoniumionen die aanwezig moeten zijn in een serine-houdende waterige oplossing verschilt in afhankelijkheid van de temperatuur en de pH van de waterige 80 0 2 6 03 -11- 21299/Vk/rav # ί oplossing en de hoeveelheden enzym die toegepast worden bij de reactie en het is onmogelijk om deze concentratie eenvoudig aan te geven. De concentratie van het ammonniumion is gewoonlijk echter 0,01 tot 2 mol per liter van de waterige oplossing en bij voorkeur 0,1 tot 2 mol per liter waterige 5 oplossing. Een hogere ammoniumion concentratie verdient de voorkeur met het oog op de remmende werking van de ontleding van serine. Wanneer echter de ammoniumconcentratie te hoog is wordt zelfs de beoogde reactie geremd of wordt de afscheiding van het gewenste reactieproduct uit de reactievloei-stof zeer moeilijk. Daarom verdient het de voorkeur dat de ammoniumion-10 concentratie wordt gehouden op een laag niveau binnen de grenzen die het mogelijk maken om de ontleding van serine te remmen. Daarom is de bovenste grens van de ammoniumionconcentratie aangegeven op 2 mol per liter van de waterige oplossing en de ammoniumionconcentratie is gewoonlijk in -gesteld op 0,1 tot 0,5 mol per liter waterige oplossing. Dit verschijn-15 sel dat de ontleding van serine kan worden geremd bij een dergelijke lege ammoniumionconcentratie is van groot voordeel cwanneer deze werkwijze op industriële schaal moet worden toegepast. Elke verbinding die ammoniumionen in een waterige. · oplossing geeft kan worden toegepast als verbinding ter bewerkstelliging van ammoniumionen in het reactiesysteem.

20 Zodoende* kunnen diverse anorganische en organische ammoniumzouten worden gebruikt zoals ammoniumchloride, ammoniumsulfaat, ammoniumfosfaat, ammo-niumnitraat, ammoniumcarbonaat, ammoniumacetaat en ammoniak.

De reactietemperatuur voor de vorming van L-rtryptofaan onder toepassing van tryptofaansynthetase of tryptofanase en serineracemase 25 is gewoonlijk 20-60 °C en bij voorkeur 30 tot 45 °C. De pH die ingesteld wordt voor deze reactie is gewoonlijk 6,0-11,0 en met name 7,5-9,0.

Deze reactieomstandigheden worden op geschikte wijze ingesteld in afhankelijkheid van de toegepaste reactie met name de methode waarbij de uitgangsstoffen toegevoerd worden door een suspensoide of gefixeerd bed 30 van gefixeerd tryptofaansynthetase of tryptofanase en gefixeerd serineracemase , de werkwijze waarbij tryptofaansynthetase of tryptofanase en de uitgangsstoffen door een gefixeerd bed worden gevoerd van gefixeerd serineracemase en in afhankelijkheid van de werkwijze waarbij serineracemase en de uitgangsstoffen door een gefixeerd bed worden gevoerd van ' 35 gefixeerd tryptofaansynthetase of tryptofanase.

Het afschéiden van het gevormde L-tryptofaan uit de reactie-vloeistof kan gemakkelijk worden bewerkstelligd door het uitvoeren van een adsorptie-desorptiebehandeling onder toepassing van een ionenwisselaars-

fl η n 0 ft X

-12- 21299/Vk/mv hars, actieve koolstof of dergelijke. Met name geldt dat wanneer L-tryptofaan wordt geprecipiteerd in de vorm van kristallen in de reactievloeistof water wordt toegevoegd om de kristallen op te lossen, waarbij de onoplosbare stoffen zoals celresten worden verwijderd uit de. vloeistof door centri-5 fugale afscheiding of filtratie en L-tryptofaan wordt, gewoonlijk teruggewonnen volgens een van de onderveraelde werkwijzen: 1) Een werkwijze waarbij de pH-waarde van de reactievloeistof wordt ingesteld op het isoelectrische punt om L-tryptofaan neer te slaan en het neergeslagen L-tryptofaan wordt gewonnen, 10 2) Een werkwijze waarbij L-tryptofaan wordt geadsorbeerd onder toepassing van een i.onenwisselaarshars en vervolgens hieruit ’gede-sorbeerd, 3) Een werkwijze waarbij L-tryptofaan wordt neergeslagen in de vorm van ëen nauwelijks oplosbaar metaalzout en het neergeslagen metaal- 15 zout wordt teruggewonnen, 4) Een werkwijze waarbij een in water oplosbaar organisch oplosmiddel wordt toegevoegd aan het filtraat om de kristallisatie te bewerkstelligen en het verkregen kristal wordt teruggewonnen en 5) Een werkwijze waarbij het filtraat wordt onderworpen aan 20 een electrodialyse en het afgescheiden L-tryptofaan gewonnen.

De uitvinding zal nader worden toegelicht aan de hand van de volgende^ niet beperkende voorbeelden. In deze voorbeelden is de kwalitatieve bevestiging van het gevormde L-tryptofaan gebaseerd op de Rf-waarde van L-tryptofaan in een papierchromatogramanalyse, het ultravioletadsorp-25 tiespectrum en de kleurtest onder toepassing van Ehrlich's reagens De kwantitatieve bepaling werd uitgevoerd onder toepassing van de adsorptie-waarde van het extract van een vlek op een papierchromatogram bij 280 yum en volgens een bio-bepaling. In de voorbeelden hebben de vermelde percentages betrekking op een gewichtspercentage,, tenzij het tegendeel is vermeld.

30 Voorbeeld I.

Met een platina spatel werd Escherichia coli MT-10232 geënt op 50 ml van een cultuurmedium bestaande uit samenstelling a) zoals hieronder aangegeven en de cultuur werd geschud bij een temperatuur van 30 °C gedurende 20 uren.De samenstelling van cultuur a) was: 1,0% vlees-35 extract, 0,5% pepton , 0,1 % gistextract en 0,2% KH^. De begin pH was 7,0.

Vervolgens werd 1 liter van de cultuurvloeistof gecentrifugeerd om celmateriaal te verzamelen en af te scheiden en het verzamelde 800 2 6 03 -13- 21299/Vk/mv celmateriaal werd gebruikt als uitgangsmateriaal voor de enzymen van tryp-tofaansynthetase.

Met een platina spatel werd Pseudomonas putida IFO 12996 geënt op 50 ml cultuurmedium met samenstelling b) zoals hieronder 5 aangegeven en 1 liter cultuurvloeistof werd gecentrifugeerd om celmateriaal af te scheiden en te verzamelen. Het verzamelde celmateriaal werd gebruikt als enzymbron voor serineracemase. Het cultuurmedium b) had de volgende samenstelling: 1,0 % vleesextract, 1,0% pepton en 0,5% NaCl.

In 50 g Triton X-100 werd 20 g indool opgelost en 36 g 10 DL-serine, 1 g NagSO^, T00 mg pyridoxaalfosfaat en de bovenvermelde 2 soorten cellen werden verzameld door centrifugale afscheiding en toegevoegd aan de oplossing zodat het totale volume 1 liter was. De reactie-vloeistof werd geschud bij een temperatuur van 30 °C terwijl de pH 8,5 bedroeg , gedurende 72 uren om de reactie te bewerkstelligen. Na de re-15 actie werd 28,5 g L-tryptofaan gevormd en verzameld in de reactievloei-stof waarbij de opbrengst 41% bedroeg gebaseerd'op serine.

Ter vergelijking werd een . reactie uitgevoerd op dezelfde wijze als boven is aangegeven behalve dat de cellen uit de cultuur van de serineracemase producerende genus niet werden toegevoegd. Na de reac-20 tie werd L-tryptofaan verzameld in een hoeveelheid van 23,5 g , hetgeen overeenkomt met een opbrengst van 34% gebaseerd op serine en de hoeveelheid verzameld L-tryptofaan was 5,0 g minder dan bij het experiment waarin beide enzymen werden toegepast te weten serineracemase en trypto-faansynthetase.

25 Voorbeeld II

De werkwijze die aangegeven is in voorbeeld I werd herhaald behalve dat Escherichia coli MT-10238 werd gebruikt in plaats van Escherichia coli MT-10231. Nu werd 27,8 g L-tryptofaan in de reactievloeistof verzameld hetgeen overeenkomt met een opbrengst van 40% gebaseerd op 30 serine.

In een vergelijkende proef werd een serineracemase toegevoegd en er werd dan ook geen L-tryptofaan verkregen.

Voorbeeld III

De werkwijze die aangegeven is in voorbeeld I werd herhaald 35 behalve dat Aerobacter aerogenes IF0 3317, hetgeen een tryptofanase producerend micro-organisme is', werd gebruikt in plaats van Escherichia coli MT-10231 en hierbij werd een cultuurmedium gebruikt met samenstelling c) zoals hieronder nader is aangegeven in plaats van cultuurmedium a).

800 2 6 03 -14- 21299/Vk/mv

Er bleek 22,2 g L-tryptofaan in de vloeistof te zijn gevormd. In een vergelijkende proef werd geen serineracemase toegevoegd waarbij de hoeveelheid L-tryptofaan dan 19,3 g bedroeg hetgeen overeenkomet met een opbrengst van 28% gebaseerd op serine.

5 De samenstelling van het cultuurmedium c) was: 0,2% L-tryp tofaan, 0,5% KH^O^,, 0,05% MgS0^.7H20, 6,00% maisweekwater, en 2,0% casaminozuur. De begin-pH was 8,0.

Voorbeeld IV

Verkregen cellen uit de cultuur van tryptofaansynthetase-10 producerend micro-organisme en van serineracemaseproducerend micro-or-ganisme' werden afgescheiden volgens de werkwijze die aangegeven is in voorbeeld I en deze cellen werden afzonderlijk gesuspendeerd in zuiver water zodat 100 ml van elke suspensie werd verkregen. Deze suspensies werden gemengd met 15 g acrylamide, 1 g Ν,Ν'-methyleen-bis-acrylamide, 15 15 ml 4% iP-(dimethylamino)propionnitril en 10 ml 2% kaliumpersulfaat en het mengsel bleef bij kamertemperatuur staan gedurende 15 minuten.

Het reactieproduct werd fijngemaakt en gewassen met zuiver water. Zodoende werd 150 g gefixeerd enzym van elke soort verkregen.

Vervolgens werd 150 g van de gefixeerde enzymes, 1,0 g 20 indool, 2,0 g DL-serine, 1 g natriumsulfaat en 100 mg pyridoxaalfosfaat aan water toegevoegd zodat het totale volume 1 liter bedroeg. De reactie-vloeistof werd geschud bij een temperatuur van 30 °C gedurende 72 uren om de reactie te bewerkstelligen. Hierbij bleek dat 1,14 g L-tryptofaan werd verzameld in de reactievloeistof na de reactie , hetgeen overeen-25 komt met een opbrengst van 29% gebaseerd op serine.

De gefixeerde enzymes werden afgescheiden uit de reactie-vloeistof na de reactie en het gevormde L-tryptofaan werd afgescheiden uit de resterende vloeistof en gelijktijdig werd een oplossing met uitgangsmateriaal dat indool , DL-serine en andere additieven hierin op-30 gelost bevatte toegevoegd aan de afgescheiden, gefixeerde enzymen. D3 reactie werd herhaald op dezelfde wijze als boven is aangegeven. Zelfs nadat de gefixeerde enzymen op deze wijze 30 keren waren gebruikt was de gevormde hoeveelheid L-tryptofaan nauwelijks verminderd.

Verder werd waargenomen dat de afscheiding van de gefixeerde 35 enzymen door filtratie zeer gemakkelijk kan worden bewerkstelligd.

Ter vergelijking werd de reactie uitgevoerd op dezelfde wijze als boven is aangegeven behalve dat de cellen uit de cultuur van het serineracemaseproducerende micro-organisme niet werden gebruikt. Na 800 2 6 03 -15- 21299/Vk/mv de reactie werd L-tryptofaan verzameld en dit bleek slechts aanwezig te zijn in een hoeveelheid van 0,94 g in de reactievloeistof, hetgeen overeenkomt met een opbrengst van 24%, gebaseerd op serine.

Voorbeeld V.

5 De werkwijze die aangegeven is in voorbeeld IV werd herhaald behalve dat Aerobacter aerogenes IFO 3317 werd gebruikt als tryptofanase-producerend micro-organisme in plaats van Escherichia coli MT-10231 dat toegepast werd in voorbeeld IV en het cultuurmedium c) werd toegepast. Hierbij bleek dat 0,89 g L-tryptofaan werd verkregen hetgeen overeenkomt 10 met een opbrengst van 23% gebaseerd op serine. In een vergelijkende proef werd geen serineracemase toegevoegd en dan bleek de hoeveelheid verzameld L-tryptofaan 0,77 g te zijn , hetgeen overeenkomt met een opbrengst van 20% gebaseerd op serine.

Vergelijkend voorbeeld,1.

15 Escherichia coli W werd gekweekt bij een temperatuur van 30 °C en een pH van 7,2 bij een beluchtingssnelheid van 10 liter/minuut gedurende 21,5 uren in een fermentatievat met een inhoud van 20 liter waaraan 10 liter cultuurmedium was toegevoegd met een samenstelling zoals hieronder is aangegeven. Zodoende werden 315 g cellen verkregen met een 20 watergehalte van 80%. De samenstelling van het cultuurmedium wasΛ 2,00% glucose, 0,50% (NH4)2S04, 0,10% KH2P04, 0,05% MgS04, 0,01% indool en 0,025% casaminozuur.

Vervolgens werd 0,16 g van de zo verzamelde cellen in een reageerbuis gedaan samen met een reactievloeistof met een samenstelling 25 zoals hieronder is aangegeven en het mengsel werd bij een temperatuur van 30 °C geschud. De samenstelling van de reactievloeistof was: 1,91% L-serine, 0,10% Na^O^, 0,01% pyridoxaalfosfaat en een variabele hoeveelheid tussen 0 en 2,46% (NH4)?S04.

Nadat de 'reactie gedurende 48 uren was uitgevoerd werd het 30 gehalte aan L-serine bepaald met behulp van een vloeistofchromatograaf waarbij een analyse met een hoge snelheid werd uitgevoerd ter verkrijging van de resultaten die vermeld zijn in tabel A.

35 800 2 6 03 -16- 21299/Vk/mv

TABEL A

Proef 1 2 3 4 (NH^SO^-concentratie (%) 0 o,615 1,23 2,46 (ammoniumion-concentratie mol/1) (o) (0,10) (0,19) (0,37) L-serine-concentratie (g/1) 3,8 8,5 15,4 19,1 L-serine ontledingsverhouding (%) 79,3 55,5 19,4 0 10

Het zal duidelijk zijn uit de resultaten die weergegeven zijn in tabel A dat wanneer de ammoniumconcentratie 0 mol/liter bedroeg de L-serine-ontledingsverhouding 79,3 % was, maar dat wanneer de ammonium-ion-concentratie werd verhoogd de L-serine ontledingsverhouding werd verlaagd 15 en wanneer de ammoniumionconcEntratie 0,37 mol/liter bedroeg de L-serine ontledingsverhouding verminderd was tot 0%.

Vergelijkend voorbeeld 2

De cellen die verkregen zijn in voorbeeld I werden opgeslagen bij een temperatuur van -15 °C gedurende langere tijd en 0,32 g 20 van de cellen werden in een reageerbuis gedaan met 10 ml reactievloeistof met een -samenstelling zoals heronder is aangegeven. Het · mengsel werd geschud bij een temperatuur van 30 °C gedurende 48 uren en D-serine werd geanalyseerd op dezelfde wijze als aangegeven is in vergelijkend voorbeeld 1. De samenstelling van de reactievloeistof was: 2,03% D-serine, 25 0,10% Na^jSO^, 0,01% pyridoxaal fosfaat en een variabele hoeveelheid van 0 tot 2 % NH^Cl.

De hierbij verkregen resultaten zijn samengevat in tabel B. TABEL B

30 ____r

Proef 1 2 3 NH'ifCl-concentratie (%) 0 0,1 2,0 (ammoniumionconcentratie mol/lj (0) (0,02) (0,37) 35 D-serine-concentratie (g/1) 1,2 11,5 17,9 D-serine-ontledingsverhouding (%) 94,0 43,3 11,8 * -------- — 1 1 I > 800 2 6 03 -17- 21299/Vk/mv

Uit de resultaten van tabel B blijkt dat niet alleen L-seri-ne maar ook D-serine werd ontleed en de D-serine-ontledingsverhouding werd verlaagd onder toename van de ammoniumionconcentratie.

Vergelijkend voorbeeld 3.

5 Pseudomonas putida IFO 12996 werd geënt op 150 ml cultuur- medium met een samenstelling zoals hieronder is aangegeven , welke samenstelling werd toegevoerd aan een Sakagushi-kolf met een inhoud van 500 ml en geschud bij een temperatuur van 30 °C gedurende 24 uren. De samenstelling van het cultuurmedium was: 0,3% vleesextract, 0,5% poly-10 pepton en 3,0 % glucose. De pH was 7,0.

Na het kweken werden de cellen verzameld door centrifugale afscheiding . Onder toepassing van de verzamelde cellen in een hoeveelheid die overeenkomt met 20 ml cultuurvloeistof werd de invloed bepaald van heti.ammoniumion op de ontleding van serine. Het experiment werd 15 afzonderlijk uitgevoerd met betrekking tot L-serine en D-serine. De verkregen resultaten zijn weergegeven in ’tabel C,

TABEL C

20 Proef 123 ammoniumionconcentratie .(%) 0 0,5 2,0 (ammoniumionconcentratie mol/l) (0) (0,10) (0,38) L-serineconcentratie 1 (g/1) 0 13,3 18,9 25---- L-serineontledingsverhouding (%) 1Q0 30,0 0 D-serineconcentratie *2 (g/1) 3,8 8,7 17,5 D-serine-ontledingsverhouding (%) 81,3 57,1 13,8 30 Opmerking: *1) De beginconcentratie van L-serine bedroeg 19,0 g/1 ?2) De beginconcentratie van D-serine bedroeg 20,3 g/1.

Voorbeeld VI

35 In 1 liter reactievloeistof met een samenstelling zoals hieronder is aangegeven werden 31,5 g natte cellen gedaan zoals verkregen volgens vergelijkend voorbeeld 1 en de reactie werd uitgevoerd bij een temperatuur van 35 °C gedurende 10 uren. Het gevormde L-tryptofaan en 800 2 6 03 -18- 21299/Vk/mv L-serine werden geanalyseerd volgens vloeistofchromatografie met hoge snelheid. De samenstelling van de reactievloeistof was: 2,0% indool, 3,0% L-serine, 0,10% NagSO^, 0,01% pyridoxaalfosfaat en 0 of 2,5 % (NH^J^SO^ waarbij de ammoniumionconcentratie 0 of 0,19 mol/liter bedroeg.

5 Het indool werd geleidelijk toegevoegd over een periode van 10 uren terwijl de reactie werd bewerkstelligd. Na de reactie gedurende 10 uren werden de hoeveelheden L-tryptofaan en L-serine in de reactievloeistof bepaèld ter verkrijging van de resultaten die aangegeven zijn in tabel D.

10

TABEL D

gevormd L-tryp- rest L-serine tofaan (%) (%) geen (NH^toegevoegd 2,51 lager dan 0,1 2,5 (NH^SO^ toegevoegd 3,49 1,18 20 Uit de resultaten van tabel D blijkt dat wanneer 2,5% (NH^JgSO^ wordt toegevoegd L-tryptofaan werd gevormd met een opbrengst van 100% gebaseerd op de toegevoegde hoeveelheid indool en resterende L-serine werd nauwelijks ontleed terwijl wanneer ammoniumsulfaat niet werd toegevoegd de opbrengst aan L-tryptofaan laag was en het resterende L-serine 25 nagenoeg volledig werd ontleed.

-conclusies- 30 800 2 6 03

Claims (11)

1. Werkwijze voor de enzymatische bereiding van L-tryptofaan door uit te gaan van indool en serine, met het kenmerk, dat indool in 5 reactie wórdt gebracht met L-serine in aanwezigheid van tryptofaansynthe-tase of tryptofanase waarbij DL-serine of D-serine wordt gebruikt als uitgangsmateriaal en DL-serine of D-serine in reactie wordt gebracht met serineracemase zodat ten minste een deel van het D-serine wordt omgezet tot L-serine.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat DL- serine of D-serine eerst in reactie wordt gebracht met serineracemase om ten minste een deel van D-serine om te zetten tot L-serine en vervolgens wordt L-serine in reactie gebracht met indool.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat 15 DL -serine of D-serine in reactie wordt gebracht met serineracemase waarbij eveneens aanwezig is tryptofaansynthetase of tryptofanase om een deel van D-serine om te zetten tot L-serine ’-en gelijktijdig L-serine in reactie wordt gebracht met indool.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de 20 reactie wordt uitgevoerd bij een temperatuur van 25 °C 'tot 60 °C en de pH op 6,0-11,0 wordt gehouden.

5. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de reactie wordt uitgevoerd bij een temperatuur van 30-45 °C en de pH -gehouden wordt op 7,5-9,0 . 25

6, Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat tryptofaansynthetase of tryptofanase of serineracemase wordt gefixeerd.

7. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat tryptofaansynthetase of tryptofanase en serineracemase worden gefixeerd.

8. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat 30 de uit de cultuur verkregen cellen van een micro-organisme die tryptofaansynthetase of tryptofanase of serineracemase bevatten of extracten hiervan worden toegepast.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat ammoniumionen worden toegevoegd aan de reactievloeistof in een hoeveelheid 35 van 0,01 tot 2 mol/liter.

10. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat ammoniumionen in de reactievloeistof worden gebracht in een hoeveelheid van 0,1 tot 0,5 mol/liter. 800 2 6 03 -20- 21299/Vk/mv

11. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat het ammoniumion afkomstig is van een anorganisch of organisch ammonium-ion. \ 5 800 2 6 03