DE3630878C1

DE3630878C1 - Process for the preparation of L-tryptophan and DL-serine

Info

Publication number: DE3630878C1
Application number: DE3630878A
Authority: DE
Inventors: Hans Plischke; Walter Steinmetzer
Original assignee: Amino GmbH
Current assignee: Amino GmbH
Priority date: 1986-09-11
Filing date: 1986-09-11
Publication date: 1988-03-10
Also published as: FI86415B; FI873705A; IT8721872A0; FR2603887B1; FR2603887A1; FI86415C; FI873705A0; IT1222637B

Abstract

To prepare L-tryptophan and DL-serine, serine-containing discharges from protein hydrolysis or sugar beet processing are fractionated by ion exclusion chromatography. The low-ash serine solutions obtained in this way are concentrated, DL-serine is removed and the concentrated L-serine solutions are reacted with indole and a cell suspension containing tryptophan synthetase to give L-tryptophan.

Description

L-Tryptophan ist eine natürliche essentielle Amino säure und hat vielseitige Verwendungsmöglichkeiten bei der Supplementierung von Nahrungs- und Futtermit teln, da sie in einigen pflanzlichen Proteinen eine limitierende Aminosäure ist. Dies gilt besonders für das Maisprotein, und durch einen Zusatz von L-Trypto phan kann der ernährungsphysiologische Wert des Mais proteins wesentlich verbessert werden.L-tryptophan is a natural essential amino acid and has a variety of uses in the supplementation of food and feed as they are found in some vegetable proteins limiting amino acid. This is especially true for the corn protein, and by adding L-trypto The nutritional value of maize can be phan proteins can be significantly improved.

Das derzeit hergestellte L-Tryptophan wird jedoch fast ausschließlich für medizinische Zwecke bei der Herstellung von Infusionslösungen oder als Neurotrans mitter verwendet, da sein Einsatz im Nahrungs- und Futtermittelbereich an seinem zu hohen Preis scheitert, und es hat deshalb nicht an Versuchen gefehlt, L-Trypto phan kostengünstig herzustellen.However, the L-tryptophan currently being manufactured almost exclusively for medical purposes at the Production of infusion solutions or as neurotrans middle used because its use in food and Feed sector fails due to its too high price, and therefore there was no lack of attempts, L-trypto phan inexpensive to manufacture.

Die indische Patentschrift 61 235 von 1957 beschreibt ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von L-Trypto phan aus L-Serin und Indol mit einer auxotrophen Mu tante von Escherichia-coli ATCC 12 783, und in der deutschen Patentschrift 28 41 642 wird eine L-trypto phanauxotrophe Mutante von Escherichia-coli W 3110 für die biochemische Kondensation von L-Serin mit Indol unter Zusatz eines nichtionischen Tensides oder die Verwendung immobilisierter Zellen vorgeschlagen. Anstelle von Escherichia-coli können auch andere trypto phansynthetasehaltige Mikroorganismen, wie Proteus vulgaris IFO 3045 oder Pseudomonas Punctata MT 10 243, für die biochemische Tryptophansynthese eingesetzt werden (japanische Patentschrift 49 81 591).Indian Patent 61,235 of 1957 describes a microbial process for the production of L-trypto phan from L-serine and indole with an auxotrophic mu aunt of Escherichia-coli ATCC 12 783, and in the German patent 28 41 642 is an L-trypto phanauxotrophic mutant of Escherichia coli W 3110 for the biochemical condensation of L-serine with Indole with the addition of a nonionic surfactant or proposed the use of immobilized cells. Instead of Escherichia coli, other trypto microorganisms containing phansynthetase, such as Proteus vulgaris IFO 3045 or Pseudomonas Punctata MT 10 243, used for biochemical tryptophan synthesis be (Japanese Patent Specification 49 81 591).

Nachteilig für die Anwendung dieses bekannten Verfah rens sind die hohen Herstellungskosten für das L-Serin. Da eine direkte Serinfermentation aus Zucker noch nicht bekannt ist, wird L-Serin durch biochemische Umsetzung von Glycin, durch enzymatische Spaltung von DL-Serin oder durch Extraktion aus Proteinhydro lysaten gewonnen.Disadvantageous for the application of this known method Rens are the high production costs for the L-serine. Because a direct serine fermentation from sugar still is not known, L-serine is caused by biochemical Implementation of glycine by enzymatic cleavage of DL-serine or by extraction from protein hydro lysates obtained.

Einen hohen Seringehalt hat das Seidenfibroin und das Wollkeratin, aber auch im Erdnuß- oder Sojaprotein ist Serin in größeren Mengen vorhanden. Durch Hydro lyse dieser Proteine mit Salzsäure oder Schwefelsäure werden die freien Aminosäuren erhalten, und bei der Neutralisation dieser Hydrolysate können die schwer löslichen Aminosäuren ausgefällt und abgetrennt werden. Das Filtrat oder der Ablauf von dieser Fällung ent hält die leichtlöslichen Aminosäuren, u. a. auch das L-Serin. Die Isolierung von L-Serin aus diesen Ab läufen kann über die Fällung des schwerlöslichen Serin salzes der p-Hydroxyazobenzol-p-sulfonsäure erfol gen. Dieses Salz muß dann anschließend mit Barium acetat zerlegt werden (Greenstein, Winitz, Chemistry of the Amino Acids, Vol. 3, p. 2202). Diese Verfah ren zur Isolierung des L-Serins sind sehr aufwendig.The silk fibroin and the wool keratin, but also in peanut or soy protein serine is present in large quantities. By hydro lysis of these proteins with hydrochloric acid or sulfuric acid the free amino acids are obtained, and at the Neutralizing these hydrolyzates can be difficult soluble amino acids are precipitated and separated. The filtrate or the effluent from this precipitation ent holds the easily soluble amino acids, u. a. that too L-serine. The isolation of L-serine from these Ab can run on the precipitation of the poorly soluble serine salt of p-hydroxyazobenzene-p-sulfonic acid This salt must then with barium acetate are broken down (Greenstein, Winitz, Chemistry of the Amino Acids, vol. 3, p. 2202). This procedure Ren to isolate the L-serine are very expensive.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfah ren zur Herstellung von L-Tryptophan und DL-Serin so auszubilden, daß eine konstengünstige Gewinnung einer L-Serinlösung in ausreichender Reinheit ermög licht wird, welche für die L-Tryptophanbiosynthese eingesetzt werden kann.The invention has for its object a method for the production of L-tryptophan and DL-serine to train so that an inexpensive extraction an L-serine solution in sufficient purity light which is required for L-tryptophan biosynthesis can be used.

Zur Lösung vorstehender Aufgabe ist vorgesehen, daß aus serinhaltigen Abläufen bei pH-Werten zwischen 5,5 und 6,5 mittels Ionenausschlußchromatographie eine aschearme Serin lösung gewonnen werden, aus welcher durch nachfolgen des Konzentrieren DL-Serin abgetrennt und die verblei bende konzentrierte L-Serinlösung mit Indol und einer tryptophansynthesehaltigen Zellsuspension zu L-Tryp tophan umgesetzt wird.To solve the above task it is provided that out containing serine Processes at pH values between 5.5 and 6.5 Ion exclusion chromatography a low ash serine solution can be obtained from which by following of the concentrate DL-serine separated and the lead concentrated L-serine solution with indole and one Cell suspension containing tryptophan synthesis to L-Tryp tophan is implemented.

Das Auffinden und die Wahl des geeigneten Rohstoffes für die Herstellung der L-Serinlösung ist für das Verfahren von großer Bedeutung. Abläufe aus der Proteinhydrolyse sind nur begrenzt verfügbar und zudem mit hohen Rohstoff- und Herstellungskosten belastet.Finding and choosing the right raw material for the preparation of the L-serine solution is for the Process of great importance. Processes protein hydrolysis are only available to a limited extent and also burdened with high raw material and manufacturing costs.

Es stehen auch Abläufe der Zuckerrübenverarbei tung und aus der Entzuckerung der Melasse in großen Mengen als Abfallstoffe zur Verfügung. In der Zucker rübe liegen die Aminosäuren in freier Form vor und gelangen bei der Extraktion des Zuckers in den Rohsaft. Diese Aminosäuren sind für den Zuckertechniker "Schäd licher Stickstoff", da sie die Auskristallisation des Zuckers verhindern. Die in größeren Mengen vor kommenden Stickstoffverbindungen, wie Betain, Glutamin, Glutaminsäure und Asparaginsäure, wurden ausführlich untersucht, wohingegen man den in geringen Mengen vorkommenden Aminosäuren kaum Beachtung schenkte. Bei Versuchen zur Isolierung dieser Aminosäuren aus den Abläufen der Zuckerrübenverarbeitung wurde jedoch festgestellt, daß einige dieser Aminosäuren teilweise racemisiert sind. Bei der Untersuchung des Serins mittels HPLC an Chiralsäulen wurde ein Gehalt von 20 bis 30% DL-Serin festgestellt. Dieses bisher nicht bekannte Vorkommen von racemischem Serin in der Zucker rübenmelasse erschwert die Arbeiten zur Isolierung von L-Serin.There are also processes for sugar beet processing tion and from the desugarization of the molasses in large Amounts available as waste. In the sugar beet the amino acids are in free form and get into the raw juice when extracting the sugar. For the sugar technician, these amino acids are "harmful licher nitrogen "as it causes crystallization prevent the sugar. The before in larger quantities upcoming nitrogen compounds, such as betaine, glutamine, Glutamic acid and aspartic acid have been discussed extensively examined, whereas in small quantities paid little attention to occurring amino acids. When trying to isolate these amino acids however, the processes of sugar beet processing became found that some of these amino acids were partially are racemized. When examining the serine a content of. was determined by means of HPLC on chiral columns 20 to 30% DL serine was found. Not so far known occurrence of racemic serine in the sugar Beet molasses complicates insulation work of L-serine.

Die Zuckerrübenmelasse enthält ca. 48% Saccharose, 10% Aschebestandteile und ca. 4% Aminosäuren. Die Entzuckerung der Melasse kann entweder durch Fällen der Saccharose mittels Calcium oder Bariumnsalzen oder durch Abtrennen der Nichtzuckerstoffe mittels Flüssigkeitschromatographie erfolgen. Das letzge nannte Trennverfahren ist in den deutschen Patentschrif ten 22 32 093, 22 31 784, 22 57 864 und 26 62 211 beschrieben. Als stationäre Phase werden hierbei Ionen austauscher verwendet und als mobile Phase werden abwechselnd verdünnte Melasse und Wasser aufgegeben. Im Auslauf der Trennsäulen werden zuckerreiche Fraktio nen und zuckerarme Fraktionen abgezogen. Einige Abläufe aus diesem Trennprozeß mit einem hohen Aminosäure gehalt sind bevorzugte Rohstoffe für das erfindungsgemäße Verfahren.The sugar beet molasses contains approx. 48% sucrose, 10% ash components and approx. 4% amino acids. The De-sugaring of the molasses can occur either through felling sucrose using calcium or barium salts or by separating the non-sugar substances using Liquid chromatography done. The latter called separation process is in the German patent specification ten 22 32 093, 22 31 784, 22 57 864 and 26 62 211 described. Ions are the stationary phase exchangers are used and as a mobile phase alternately diluted molasses and water added. Sugar-rich fractions are found in the outlet of the separation columns and low-sugar fractions are subtracted. Some processes from this separation process with a high amino acid are preferred raw materials for the invention Method.

Bei der chromatographischen Trennung nach dem Prinzip des Ionenausschlußverfahrens wird ein Kationenaus tauscher mit den Ionen der zu filtrierenden Lösung abgesättigt. With the chromatographic separation according to the principle the ion exclusion process becomes a cation exchanger with the ions of the solution to be filtered saturated.

In diesem System passieren die zugeführten starken Elektrolyte unverändert den Austauscher, während schwa che Elektrolyte oder Nichtelektrolyte von der Matrix des Austauschers adsorbiert werden.In this system, the supplied strong ones happen Electrolytes unchanged the exchanger, while schwa electrolytes or non-electrolytes from the matrix of the exchanger are adsorbed.

Durch nachfolgendes Eluieren mit Wasser werden diese adsorbierten Stoffe wieder von der Matrix des Austau schers gelöst. Im Wechsel von Beladen mit Substanz und Eluieren mit Wasser kann somit eine Trennung von Elektrolyten und Nichtelektrolyten erreicht werden. Vollständig neu und unerwartet konnte bei der chroma tographischen Trennung der serinhaltigen Abläufe an einem Kationenaustauscher in Natriumform neben der Abtrennung der starken Elektrolyte auch eine weitge hende Abtrennung des Serins von der Saccharose und den anderen Aminosäuren erreicht werden. Durch diese erfindungsgemäße chromatographische Trennung kann der Seringehalt gegenüber der Ausgangslösung um das 10- bis 15fache angereichert werden. Da bei diesem Verfahren im Gegensatz zur Ionenaustauschchromato graphie keine Regenerationsmittel verwendet werden, ist dieses neue Trennverfahren sehr umweltfreundlich und gibt keine Abwasserbelastungen.By subsequent elution with water, these become adsorbed substances again from the matrix of thawing schers solved. Alternating between loading with substance and elution with water can thus separate from Electrolytes and non-electrolytes can be achieved. Completely new and unexpected at chroma graphic separation of the serine-containing processes a cation exchanger in sodium form next to the Separation of the strong electrolytes also a far separating the serine from the sucrose and the other amino acids. Through this chromatographic separation according to the invention can the serine content compared to the starting solution around the Can be enriched 10 to 15 times. Because with this Process in contrast to the ion exchange chromato no regeneration agents are used, this new separation process is very environmentally friendly and gives no waste water pollution.

Einen wesentlichen Einfluß auf die Abtrennung des Serins hat der pH-Wert der Aufgabelösung. Es wurde gefunden, daß der pH-Wert zwischen 5,5 und 6,5 liegen sollte. Die besten Trennergebnisse wurden nahe beim isoelektrischen Punkt des Serins von pH 5,7 erzielt. Ein weiterer wichtiger, aber selbstverständlicher Parameter ist die Temperatur der Trennkolonne. Zur Erreichung einer guten Trenn leistung und zur Vermeidung mikrobiologischer Kontami nationen wird zweckmäßig bei einer Temperatur von 80-90°C gearbeitet. Als Kationenaustauscher werden vorzugsweise Polystyrolharze mit einer DVB-Vernetzung von 4-7% verwendet. Die Korngröße soll 0,3-0,5 mm betragen, und 90% der Harzkörner sollen innerhalb eines Bereiches von 20% der mittleren Korngröße lie gen.A significant influence on the separation of the Serins has the pH of the feed solution. It was found that the pH was between 5.5 and 6.5 should. The best separation results were close to the Isoelectric point of serine of pH 5.7 achieved. Another important, but self-evident parameter is the temperature the separation column. To achieve a good separation performance and to avoid microbiological contamination nations is useful at a temperature of 80-90 ° C worked. As a cation exchanger preferably polystyrene resins with DVB crosslinking used by 4-7%. The grain size should be 0.3-0.5 mm and 90% of the resin beads are said to be within a range of 20% of the average grain size lie gene.

Es wurde auch eine vorteilhafte Steuerung des Auslaufes zur Trennung der einzelnen Fraktionen gefunden. Die bekannte Nachweisreaktion für Aminosäuren mittels Ninhydrinfärbung konnte aufgrund der Eigenfärbung des Substrates nicht angewendet werden, und andere Nachweisreaktionen, z. B. die automatische Aminosäure analyse, ergaben so große zeitliche Verzögerungen, daß sie für die Steuerung des Prozesses nicht brauch bar waren. Überraschend und nicht vorhersehbar wurde gefunden, daß durch einfache Dichte- und Leitfähig keitsmessung eine sehr genaue Abtrennung der Serin fraktion zu erreichen ist. Der Trennprozeß ist in Abb. 1 erläutert. Für die Dichtemessung wurde der in der Zuckerindustrie übliche Bx-Wert verwendet, und die Leitfähigkeit wird in Mikrosiemens angegeben.An advantageous control of the outlet for separating the individual fractions was also found. The known detection reaction for amino acids by means of ninhydrin staining could not be used due to the self-coloring of the substrate, and other detection reactions, e.g. B. the automatic amino acid analysis, there were such great time delays that they were not usable for the control of the process. Surprisingly and unpredictably, it was found that a very precise separation of the serine fraction can be achieved by simple density and conductivity measurement. The separation process is explained in Fig. 1. The Bx value customary in the sugar industry was used for the density measurement and the conductivity is given in microsiemens.

Wie aus Abb. 1 zu ersehen ist, steigen Dichte und Leitfähigkeit bei Beginn des Trennprozesses stark an, erreichen ein Maximum und fallen dann steil ab und gehen über einen Wendepunkt in ein Plateau über, welches zum Ende des Zyklusses abfällt. Im Wendepunkt dieser Meßwerte befindet sich auch der Schnittpunkt für die Serinfraktion. Durch diese einfache Messung wurde eine unmittelbare Steuerung des Trennprozesses ermöglicht. Neben der Serinfraktion wird noch eine zuckerhaltige Fraktion mit den restlichen Nichtzucker stoffen erhalten. Diese zuckerhaltige Fraktion kann nach dem Konzentrieren in der Futtermittelindustrie oder in der Fermentationsindustrie verwendet werden. Während des Trennprozesses werden auch weitere Zwi schenfraktionen, wie Rückführung 1 und Rückführung 2 , abgezogen und in den nächsten Trennzyklus zurückge führt. As can be seen from Fig. 1, density and conductivity increase sharply at the beginning of the separation process, reach a maximum and then drop steeply and pass over a turning point into a plateau, which drops at the end of the cycle. The point of intersection for the serine fraction is also at the turning point of these measured values. This simple measurement enabled direct control of the separation process. In addition to the serine fraction, a sugar-containing fraction with the remaining non-sugar substances is obtained. This sugar-containing fraction can be used after concentrating in the feed industry or in the fermentation industry. During the separation process, further intermediate fractions, such as recycle 1 and recycle 2 , are withdrawn and fed back into the next separation cycle.

Bei dem Trennprozeß werden aschearme Serinlösungen bzw. Serinfraktionen mit hoher Reinheit erhalten. Aus diesen Lösungen muß die Abtrennung von D-Serin erfolgen, da bei der Verwendung der Serinlösung für die Tryptophanherstellung nur L-Serin umgesetzt wird. Für die Abtrennung des D-Serins wurde eine überraschend einfache Lösung gefunden. Durch Konzentrieren der Serinfraktion auf 35% Trockensubstanz und abschlie ßendes Abkühlen auf 20°C konnte die Hauptmenge des D-Serins als DL-Serin durch Filtration abgetrennt werden. Bei der Untersuchung des auskristallisierten DL-Serins zeigte sich jedoch, daß es mit Tyrosin ver unreinigt war, und da Tyrosin eine sehr schwerlös liche Aminosäure ist, kann durch einfache Umkristalli sation keine befriedigende Reinigung erzielt werden. Bei Untersuchungen wurde festgestellt, daß die aroma tischen Aminosäuren, Phenylalanin und Tyrosin, von starkbasischen Anionenaustauschern selektiv adsor biert werden. Das Serin wird dabei von den Anionen austauschern nur in geringem Umfang adsorbiert und durch das gebundene Tyrosin vom Austauscher verdrängt. Zur Vermeidung von Serinverlusten wird dabei das Ver hältnis Tyrosin : Ionenaustauscher so eingestellt, daß pro Mol des zu entfernenden Tyrosins 2 Liter Ionen austauscher angewendet werden. Aus der tyrosinfreien DL-Serinlösung wird durch Konzentrieren und Kristalli sation reines DL-Serin gewonnen. Neben der Verwendung der L-Serinlösung für die Tryptophanherstellung kann auch durch weiteres Eindampfen der Lösung L-Serin auskristallisiert und durch Umkristallisation gerei nigt werden.The separation process uses low-ash serine solutions or obtained serine fractions with high purity. The separation of D-serine must be obtained from these solutions take place because when using the serine solution for the tryptophan production only L-serine is implemented. One was surprising for the separation of D-serine found a simple solution. By concentrating the Serine fraction to 35% dry matter and finally eats cooling to 20 ° C the majority of the D-Serins as DL-Serin separated by filtration will. When examining the crystallized DL-Serins showed, however, that it ver with tyrosine was uncleaned, and since tyrosine was a very difficult to dissolve Liche amino acid can, by simple recrystallization satisfactory cleaning can not be achieved. Research has shown that the aroma table amino acids, phenylalanine and tyrosine, from strongly basic anion exchangers selectively adsor beers. The serine is from the anions exchangers adsorbed only to a small extent and displaced from the exchanger by the bound tyrosine. To avoid serine losses, Ver Ratio tyrosine: ion exchanger adjusted that 2 liters of ions per mole of tyrosine to be removed exchangers can be used. From the tyrosine free DL serine solution is obtained by concentrating and crystallizing pure DL serine obtained. In addition to use the L-serine solution for tryptophan production also by further evaporating the L-serine solution crystallized out and recrystallized be inclined.

Bei der bekannten Biosynthese von L-Tryptophan aus L-Serin und Indol werden tryptophansynthetasehaltige Mikroorganismen verwendet. Die Züchtung oder die Immo bilisierung dieser Mikroorganismen ist nicht Gegenstand dieser Erfindung, sondern nur die Verwendung der im Rahmen der Erfindung erhaltenen Serinlösung für die bio chemische Kondensation zum L-Tryptophan. Durch die hohe Serinkonzentration in dieser Lösung ist diese Umsetzung sehr effektiv, und durch Zusatz der stöchiome trischen Indol- und Serinmengen zu einer Zellsuspen sion wird Tryptophan in so hohen Konzentrationen er halten, daß es auskristallisiert und gemeinsam mit den Zellen abgetrennt werden kann. Die verbleibende Mutterlauge wird konzentriert und das zugesetzte Etha nol zurückgewonnen. Nach dem Kühlen dieser konzen trierten Mutterlauge wird eine zweite Fraktion Roh tryptophan auskristallisiert und abgetrennt. Die ver bleibende konzentrierte Mutterlauge wird dann vor zugsweise für die Supplementierung von Futtermitteln verwendet. Bei Verwendung serinhaltiger Abläufe aus Proteinhydrolysaten können aus diesen Mutterlaugen auch andere Aminosäuren nach bekanntem Verfahren iso liert werden.In the known biosynthesis of L-tryptophan L-serine and indole become tryptophan synthetase Microorganisms used. The breeding or the real estate Bilification of these microorganisms is not the subject this invention, but only the use of those obtained within the scope of the invention Serine solution for the bio chemical condensation to L-tryptophan. Through the high serine concentration in this solution is this Implementation very effectively, and by adding the stoichioma trical indole and serine amounts to a cell suspension sion will tryptophan in such high concentrations keep it crystallized and shared with the cells can be separated. The remaining one Mother liquor is concentrated and the added etha nol recovered. After cooling this, concentrate A second fraction of crude is added to the mother liquor tryptophan crystallized and separated. The ver then remaining concentrated mother liquor is present preferably for the supplementation of feed used. When using serine-containing processes Protein hydrolyzates can be made from these mother liquors also other amino acids according to the known method iso be lated.

Das Rohtryptophan wird im heißen Wasser gelöst und die Zellen nach Zusatz von Aktivkohle und Filterhilfs mitteln abgetrennt. Die entfärbte Tryptophanlösung wird im Vakuum konzentriert, abgekühlt und das aus kristallisierte Tryptophan abgetrennt. Bei der Verwen dung für Infusionslösungen muß das L-Tryptophan frei von pyrogenen Stoffen sein. Diese pyrogenen Stoffe sind Endotoxine aus den für die Umsetzung verwendeten Mikroorganismen, und sie bewirken bei der Infusion starke Fieberreaktionen. Da diese pyrogenen Stoffe mit einem mittleren Molekulargewicht von 10 000 durch Ultrafiltration nicht sicher zu entfernen sind, wur den verschiedene Adsorbenzien überprüft. Dabei sollte das gesuchte Adsorbens nur die pyrogenen Stoffe und nicht das Tryptophan adsorbieren. Diese Forderung wurde von einem sauer aktivierten Aluminiumoxyd erfüllt. In Ausgestaltung der Erfindung wird die wäßrige entfärbte Tryptophan lösung über eine Säule mit Aluminiumoxyd perkoliert und anschließend zur Entfernung von Aluminiumoxyd partikeln über ein steriles Schichtenfilter nachfil triert. Die filtrierte Lösung wird dann unter den üblichen sterilen Bedingungen konzentriert und pyro genfreies L-Tryptophan gewonnen.The raw tryptophan is dissolved in hot water and the cells after the addition of activated carbon and filter aid separated by means. The decolorized tryptophan solution is concentrated in a vacuum, cooled and that out crystallized tryptophan separated. When using L-tryptophan must be free of infusion solutions of pyrogenic substances. These fumed substances are endotoxins from those used for the implementation Microorganisms, and they cause infusion strong fever reactions. Because these fumed substances with an average molecular weight of 10,000 Ultrafiltration cannot be removed safely which different adsorbents checked. It should the desired adsorbent only the pyrogenic substances and do not adsorb the tryptophan. This requirement was filled with an acid activated aluminum oxide. In the design of Invention is the aqueous decolorized tryptophan solution percolated with aluminum oxide and then to remove alumina particles after a sterile layer filter trated. The filtered solution is then under the usual sterile conditions concentrated and pyro gene-free L-tryptophan obtained.

Embodiment 1

Eine doppelwandige Glaskolonne mit den Abmessungen 850 × 40 mm wird mit 1000 ml Kationenaustauscher in Natriumform befüllt. Über einen Thermostat wird der Doppelmantel der Trennkolonne auf 85°C beheizt. Anschließend werden 120 ml eines serinhaltigen Ablau fes mit 60% Saccharose und 4% Serin i. T. aus der Melasseentzuckerung, welche auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt wurde, mit einer Geschwindigkeit von 6 ml/Minute aufgegeben, und nach 20 Minuten erfolgt die Aufgabe von vollentsalztem Wasser über einen Zeit raum von 85 Minuten. Anschließend beginnt mit der Aufgabe des nächsten serinhaltigen Ablaufes ein neuer Zyklus.A double-walled glass column with the dimensions 850 × 40 mm with 1000 ml cation exchanger filled in sodium form. Via a thermostat the double jacket of the separation column heated to 85 ° C. Then 120 ml of a serine-containing effluent fes with 60% sucrose and 4% serine i. T. from the Molasses desugarization, which have a pH of 6.0 was set at a rate of 6 ml / minute and after 20 minutes the task of demineralized water over a period of time space of 85 minutes. Then begins with the Task of the next sequence containing serine a new one Cycle.

Die aus der Trennkolonne austretenden Lösungen laufen kontinuierlich über ein Dichte- und Leitfähigkeits meßgerät, und die gemessenen Werte werden auf einem Schreiber übertragen. Über einen Mikroprozessor werden anhand der gemessenen Dichte- und Leitfähigkeitswerte folgende Fraktionen geschnitten:The solutions emerging from the separation column run continuously over a density and conductivity measuring device, and the measured values are recorded on a Transfer clerk. Be through a microprocessor based on the measured density and conductivity values cut the following fractions:

- 50 minutes of non-sugar and sucrose fraction
- 10 minutes return 1
- 30 minute serine fraction
- 15 minutes return 2

Die Rückführungsfraktion 1 wird gemeinsam mit dem nächsten serinhaltigen Ablauf aufgegeben, und die Rückführungsfraktion 2 wird gemeinsamt mit dem Wasser aufgegeben. Die Nichtzuckerfraktion wird in den Ent zuckerungsprozeß zurückgeführt, und die Serinlösung mit 40% Serin i. T. wird wie folgt weiterverarbeitet:The recycle fraction 1 is fed in together with the next run containing serine, and the recycle fraction 2 is fed in together with the water. The non-sugar fraction is returned to the de-sugaring process, and the serine solution with 40% serine i. T. is processed as follows:

3000 g Serinlösung werden auf 450 g konzentriert und auf 20°C unter Rühren abgekühlt, das auskristalli sierte DL-Serin abfiltriert, in 500 ml Wasser bei 90°C gelöst, 3 g Aktivkohle zugesetzt und filtriert. Das Filtrat wird bei 40°C über eine Glaskolonne mit 50 ml eines starkbasischen Anionenaustauschers vom Geltyp geleitet und die gereinigte tyrosinfreie Lö sung auf 150 g konzentriert, gekühlt und das auskristal lisierte DL-Serin abfiltriert. Nach dem Trocknen er hält man 13 g reines DL-Serin. Die konzentrierte L-Se rinlösung wird wie folgt weiterverarbeitet:3000 g of serine solution are concentrated to 450 g and cooled to 20 ° C with stirring, the crystallized filtered DL-serine in 500 ml of water 90 ° C dissolved, 3 g of activated carbon added and filtered. The filtrate is at 40 ° C with a glass column 50 ml of a strongly basic anion exchanger from Gel type guided and the cleaned tyrosine-free Lö concentrated to 150 g, cooled and the crystal filtered DL-serine filtered. After drying it hold 13 g of pure DL-serine. The concentrated L-Se rin solution is processed as follows:

Nach bekanntem Verfahren wird in einer Nährlösung unter aeroben Bedingungen eine geeignete Mutante von E.-coli gezüchtet und die gewachsenen Zellen aus der Kulturbrühe abzentrifugiert.According to the known method is in a nutrient solution a suitable mutant of under aerobic conditions E. coli grown and the grown cells from the Culture broth centrifuged.

50 g dieser abzentrifugierten Zellmasse werden in einem Rührwerksreaktor mit 400 g der L-Serinlösung suspensiert, 10 g Ammonsulfat und 10 mg Pyridoxal phosphat zugesetzt, wobei ein pH-Wert von 8,0 durch Zugabe von Ammoniak eingestellt wird. Zu dieser Sus pension wird unter Rühren eine Lösung von 60 g Indol, gelöst in 300 ml Ethanol, zugesetzt, wobei die Zuga begeschwindigkeit so geregelt wird, daß der Gehalt an freiem Indol in der Reaktionslösung unter 1,5 g/Liter bleibt. Die Reaktion verläuft bei 35°C über 40 Stunden. Nach beendeter Reaktion wird die Lösung mit Phosphor säure auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt, auf 50°C erhitzt und 10 g Aktivkohle zugegeben. Die koagulier ten Zellen werden dann gemeinsam mit dem auskristalli sierten Tryptophan abgetrennt.
Ausbeute: 200 g Rohtryptophan I.50 g of this centrifuged cell mass are suspended in a stirrer reactor with 400 g of the L-serine solution, 10 g of ammonium sulfate and 10 mg of pyridoxal phosphate are added, a pH of 8.0 being set by adding ammonia. A solution of 60 g of indole, dissolved in 300 ml of ethanol, is added to this suspension with stirring, the rate of addition being controlled so that the content of free indole in the reaction solution remains below 1.5 g / liter. The reaction proceeds at 35 ° C for 40 hours. After the reaction has ended, the solution is adjusted to a pH of 4.0 with phosphoric acid, heated to 50 ° C. and 10 g of activated carbon are added. The coagulated cells are then separated together with the crystallized tryptophan.
Yield: 200 g of raw tryptophan I.

Die Mutterlauge von Rohtryptophan wird unter Abdestilla tion des Ethanols auf 300 g konzentriert, auf Zimmer temperatur gekühlt und eine zweite Fraktion Rohtryp tophan abgetrennt.
Ausbeute: 20 g Rohtryptophan II.The mother liquor from raw tryptophan is concentrated to 300 g while distilling off the ethanol, cooled to room temperature and a second fraction of raw tryp tophan is separated off.
Yield: 20 g of raw tryptophan II.

220 g Rohtryptophan werden in 4000 ml Wasser bei 70°C gelöst, 20 g Aktivkohle und 50 g Kieselgur zuge setzt und die Zellsubstanz abfiltriert. Die filtrierte entfärbte Lösung wird dann über eine Kolonne mit 50 ml Aluminiumoxyd geleitet und anschließend über ein ste riles Membranfilter filtriert. Die pyrogenfreie Lö sung wird im Rotationsverdampfer auf 500 ml konzen triert, gekühlt, das Tryptophan abfiltriert und im Vakuum bei 80°C getrocknet. Man erhält 70 g reines pyrogenfreies L-Tryptophan.220 g of raw tryptophan are added to 4000 ml of water 70 ° C dissolved, 20 g of activated carbon and 50 g of diatomaceous earth added sets and the cell substance is filtered off. The filtered decolorized solution is then passed through a column with 50 ml Aluminum oxide passed and then over a ste filtered membrane filter. The pyrogen-free solution Solution is concentrated to 500 ml in a rotary evaporator , cooled, the tryptophan filtered off and in the Vacuum dried at 80 ° C. 70 g of pure are obtained pyrogen-free L-tryptophan.

Embodiment 2

Über zwei hintereinandergeschaltete starksaure Kationen austauscher von je 1 l Volumen wird so lange ein Dünn saft aus der Zuckerfabrikation geleitet, bis der pH- Wert am ersten Kationenaustauscher von pH 2,0 auf 3,0 abgefallen ist. Anschließend werden beide Kationen austauscher abgesüßt und mit Wasser nachgewaschen. Der zweite nachgeschaltete Kationenaustauscher, auf dem sich die Hauptmenge der Aminosäure befindet, wird mit 1,5 l 1 N Natronlauge oder 1 N Ammoniaklösung regeneriert und mit Wasser gewaschen. Eluat und Waschwasser werden dann gemeinsam auf ca. 15% Trocken substanz konzentriert, und diese Lösung mit ca. 2% Serin i. T. wird dann gemäß Ausführungsbeispiel 1 wei terverarbeitet. Via two strongly acidic cations connected in series Exchangers with a volume of 1 l each become thin juice from the sugar factory until the pH Value on the first cation exchanger of pH 2.0 3.0 has dropped. Then both cations sweetened exchanger and washed with water. The second downstream cation exchanger, on which contains the majority of the amino acid with 1.5 l of 1 N sodium hydroxide solution or 1 N ammonia solution regenerated and washed with water. Eluate and Wash water will then dry together to approx. 15% substance concentrated, and this solution with approx. 2% Serine i. T. is then white according to embodiment 1 processed.

Embodiment 3

1000 g Wollabfälle werden mit 5 l 6 N Salzsäure 8 Stun den bei 105°C am Rückfluß hydrolysiert. Die ausgefalle nen Huminstoffe werden abfiltriert, und unter Rühren wird das Salzsäurehydrolysat unter vorsichtiger Zu gabe von Natriumcarbonat bis zu einem pH-Wert von 5,0-6,0 neutralisiert. Nach dem Abkühlen auf Zimmer temperatur und einer Kristallisationszeit von 48 Stun den werden die schwerlöslichen auskristallisierten Aminosäuren abfiltriert und die Mutterlauge mit ca. 5% Serin i. T. gemäß Ausführungsbeispiel 1 weiterver arbeitet. Aus den nach Abtrennung des Rohtryptophans verbleibenden Abläufen können auf bekannte Weise, z. B. mittels Ionenaustauschchromatographie, weitere Aminosäuren gewonnen werden.1000 g of wool waste are mixed with 5 l of 6 N hydrochloric acid for 8 hours which hydrolyzed at 105 ° C at reflux. The fancy Nen humic substances are filtered off and with stirring the hydrochloric acid hydrolyzate under careful addition administration of sodium carbonate up to a pH value of 5.0-6.0 neutralized. After cooling to room temperature and a crystallization time of 48 hours the poorly soluble ones are crystallized out Filtered off amino acids and the mother liquor with approx. 5% serine i. T. continue according to embodiment 1 is working. From the after separation of the raw tryptophan remaining processes can be done in a known manner, e.g. B. by means of ion exchange chromatography, others Amino acids can be obtained.

Claims

1. Process for the preparation of L-tryptophan and DL-serine, characterized in that a low-ash serine solution is obtained from serine-containing processes at pH values between 5.5 and 6.5 by means of ion exclusion chromatography, from which DL- Serine separated and the remaining concentrated L-serine solution with indole and a tryptophane-containing cell suspension is converted to L-tryptophan.

2. The method according to claim 1, characterized ge indicates that the serine Processes at a temperature of 80 to 90 ° C above a cation exchanger in sodium chromato form be graphed.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized characterized that the chromatogra Phical separation of serine by density and guide ability of the expiring solution is controlled.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the serine fraction concentrated, the crystalline separated serine, dissolved in water, by Treatment via a strongly basic anion exchanger cleaned and then recrystallized is settled.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, because characterized by that L-trytophan crystallized out together with the Cells after the addition of activated carbon and filter aids separated and from the mother liquor further evaporate a second fraction of raw trypto phan is won.

6. The method according to claim 4, characterized ge indicates that the L-tryptophan dissolved in water, filtered, the decolorized solution treated with active aluminum oxide and by Kon center pyrogenic with subsequent crystallization free L-tryptophan is obtained.