FI86415C - Process for Preparation of L-Tryptophan - Google Patents

Process for Preparation of L-Tryptophan Download PDF

Info

Publication number
FI86415C
FI86415C FI873705A FI873705A FI86415C FI 86415 C FI86415 C FI 86415C FI 873705 A FI873705 A FI 873705A FI 873705 A FI873705 A FI 873705A FI 86415 C FI86415 C FI 86415C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
serine
tryptophan
solution
concentrated
sugar
Prior art date
Application number
FI873705A
Other languages
Finnish (fi)
Swedish (sv)
Other versions
FI86415B (en
FI873705A (en
FI873705A0 (en
Inventor
Hans Plischke
Walter Steinmetzer
Original Assignee
Amino Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amino Gmbh filed Critical Amino Gmbh
Publication of FI873705A0 publication Critical patent/FI873705A0/en
Publication of FI873705A publication Critical patent/FI873705A/en
Publication of FI86415B publication Critical patent/FI86415B/en
Application granted granted Critical
Publication of FI86415C publication Critical patent/FI86415C/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07DHETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/10Indoles; Hydrogenated indoles with substituted hydrocarbon radicals attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/18Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D209/20Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals substituted additionally by nitrogen atoms, e.g. tryptophane
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/227Tryptophan

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Fodder In General (AREA)

Description

8641 58641 5

MENETELMX L-TRYPTOFÄÄNIN VALMISTAMISEKSI - FÖRFARANDE FÖR FRAMSTÄLLNING AV L-TRYPTOFANMETHOD FOR MANUFACTURING L-TRYPTOPHANE - FÖRFARANDE FÖR FRAMSTÄLLNING AV L-TRYPTOFAN

L-tryptofaani on luontainen välttämätön aminohappo ja sillä on moninaisia käyttömahdollisuuksia ravintoaineiden ja rehujen täydennysaineena, koska se on rajoittavana aminohappona eräissä kasviproteiineissa. Näin on erityisesti maissiproteiinin kohdalla, ja L-tryptofääniä lisäämällä voidaan maissiproteiinin ravintofysiolo-gista arvoa parantaa oleellisesti.L-tryptophan is an inherently essential amino acid and has a variety of uses as a nutrient and feed supplement because it is a limiting amino acid in some plant proteins. This is especially the case for corn protein, and the addition of L-tryptophan can substantially improve the nutritional value of corn protein.

Tällä hetkellä valmistettu L-tryptofaani käytetään kuitenkin lähes yksinomaan lääkinnällisiin tarkoituksiin eli infuusioliuosten aineosana tai hermoston välittäjäaineena, koska sen käyttö ravintoaineissa ja rehuissa kariutuu liian korkeaan hintaan, ja näin ollen onkin uhrattu paljon tutkimusta L-tryptofäänin valmistamiseen hinnaltaan edullisesti.However, currently produced L-tryptophan is used almost exclusively for medical purposes, as an ingredient in infusion solutions or as a neurotransmitter, as its use in nutrients and feed fails at too high a cost, and thus much research has been sacrificed to produce L-tryptophan at low cost.

Intialaisessa patenttijulkaisussa no. 61 235 vuodelta 1957 selostetaan mikrobiologista menetelmää L-tryptofäänin valmistamiseksi L-seriinistä ja indolista käyttämällä Escherichia coli ATCC 12783-kannan auksotrofista mutant-tia ja saksalaisessa patenttijulkaisussa no. 28 41 642 ehdotetaan Escherichia coli W 3110-kannan L-tryptofaani-auksotrofisen mutantin käyttöä L-seriinin ja indolin väliseen biokemialliseen kondensointiin lisäämällä ei-ionista tensidiä tai immobilisoimalla solut. Escherichia colin tilalla voidaan biokemialliseen tryptofaanisyntee-siin käyttää myös muita tryptofaanisyntetaasipitoisia mikro-organismeja, joista mainittakoon Proteus vulgaris IFO 3045 ja Pseudomonas Punctata MT 10243 (japanilainen patenttijulkaisu no. 49 81 591).Indian patent publication no. 61 235 from 1957 describes a microbiological process for the preparation of L-tryptophan from L-serine and indole using the auxotrophic mutant of Escherichia coli strain ATCC 12783 and German patent publication no. 28 41 642 proposes the use of an L-tryptophan auxotrophic mutant of Escherichia coli strain W 3110 for biochemical condensation between L-serine and indole by adding a non-ionic surfactant or by immobilizing the cells. Other tryptophan synthetase-containing microorganisms, such as Proteus vulgaris IFO 3045 and Pseudomonas Punctata MT 10243 (Japanese Patent Publication No. 49,891,591), can also be used in place of Escherichia coli for biochemical tryptophan synthesis.

Näissä ennestään tunnetuissa menetelmissä on haittapuolena L-seriinin korkeat valmistuskustannukset. . Koska tähän mennessä ei seriiniä ole suoraan kyetty fermentoimaan sokerista, tapahtuu L-seriinin valmistus biokemiallisel- 2 86415 la reaktiolla glysiinistä, DL-seriinin entsymaattisella hajottamisella tai uuttamalla proteiinihydrolysaateista.The disadvantage of these previously known methods is the high production cost of L-serine. . To date, since serine has not been directly fermentable from sugar, L-serine is prepared by a biochemical reaction of glycine, enzymatic degradation of DL-serine, or extraction from protein hydrolysates.

Silkin fibroiinin ja villan keratiinin seriinipitoi-suus on korkea, mutta maapähkinän ja soijan proteiineissa on myös suurehkoja seriinipitoisuuksia. Kun nämä proteiinit hydrolysoidaan suolahapolla tai rikkihapolla, saadaan vapaita aminohappoja, ja kun nämä hydrolysaatit neutraloidaan, saadaan vaikealiukoiset aminohapot saostumaan ja erottumaan. Suodos tai tämän saostuksen ulostu-lovirtaus sisältää helppoliukoiset aminohapot, mm. L-se-riinin. L-seriini voidaan eristää näistä ulostulovir-tauksista seostamalla seriinin vaikealiukoisen p-hydrok-siatsobentseeni-p-sulfonihapposuolan muodossa. Tämä suola pitää vielä hajottaa bariumasetaattilla (Greenstein, Winitz, Chemistry of the Amino Acids, Vol. 3, s. 2202). Tämä L-seriinin erotusmenetelmä on hyvin monimutkainen.The serine content of silk fibroin and wool keratin is high, but peanut and soy proteins also have higher serine levels. When these proteins are hydrolyzed with hydrochloric acid or sulfuric acid, free amino acids are obtained, and when these hydrolysates are neutralized, sparingly soluble amino acids are precipitated and separated. The filtrate or effluent of this precipitate contains readily soluble amino acids, e.g. L-It-cephalosporin. L-serine can be isolated from these effluents by doping the serine in the form of a sparingly soluble p-hydroxyazobenzene-p-sulfonic acid salt. This salt still needs to be decomposed with barium acetate (Greenstein, Winitz, Chemistry of the Amino Acids, Vol. 3, p. 2202). This method of separating L-serine is very complex.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on tarjota sellainen menetelmä L-tryptofäänin ja DL-seriinin valmistamiseksi, että on mahdollista saada aikaan riittävän puhdas L-seriiniliuos hinnaltaan edullisesti, jota liuosta voidaan käyttää L-typtofaanin biosynteesiin.It is an object of the present invention to provide a process for the preparation of L-tryptophan and DL-serine which makes it possible to obtain a sufficiently pure L-serine solution at a low cost which can be used for the biosynthesis of L-tryptophan.

Sokerijuurikkaidenjalostuksessa saatujen saturoitujen mehujen ja sokerisiirappien ioninvaihtoeluaateista tai muista seriinipitoisista ulostulovirtauksista, jotka on saatu poistettaessa sokeria melassista, valmistetaan keksinnönmukaisesti pH-alueella 5,5 - 6,5 ioni-kromatografiällä niukkatuhkainen seriiniliuos, joka sen jälkeen konsentroidaan niin, että DL-seriini erottuu, ja jäljelle jäänyt konsentroitunut L-seriiniliuos saatetaan reagoimaan indolin kanssa tryptofaanisyntetaasia sisältävien solujen suspensiossa, jolloin syntyy L-tryptofaania.From ion exchange alternatives of saturated juices and sugar syrups obtained from sugar beet processing or from other serine-containing effluents obtained by removing sugar from molasses, a low-ash serine solution is prepared by ion chromatography at pH 5.5 to 6.5, and then concentrated so that D is concentrated so that the remaining concentrated L-serine solution is reacted with indole in a suspension of tryptophan synthetase-containing cells to form L-tryptophan.

L-seriiniliuoksen valmistukseen sopivan raaka-aineen löytäminen ja valinta ovat menetelmän kannalta erittäin tärkeitä, koska proteiinihydrolyysien ulostulovirtauk-set ovat vain rajoitetussa määrin käyttökelpoisia 3 86415 ja lisäksi niiden raaka-aine- ja valmistuskustannukset ovat korkeat.The search for and selection of a suitable raw material for the preparation of the L-serine solution is very important for the process, since the output streams of the protein hydrolyses have only a limited use 3 86415 and, in addition, their raw material and manufacturing costs are high.

Sen sijaan sokerijuurikkaidenjalostuksessa syntyvät ulostulovirtaukset sekä melassin sokerinpoistossa syntyvät ulostulovirtaukset ovat suurina määrinä syntyviä jätteitä, jotka ovat käytettävissä. Sokerijuurikkaassa ovat aminohapot vapaassa muodossa ja joutuvat sokerin-uutossa raakamehuun. Nämä aminohapot ovat sokeriteknologi-an kannalta katsottuina "haitallista typpeä", koska ne estävät sokerin kiteytymistä. Suurempina määrinä esiintyvät typpiyhdisteet, kuten beetaiini, glutamiini, glutamiinihappo ja asparagiinihappo, on tutkittu perusteellisesti, kun taas pienempinä määrinä esiintyviin aminohappoihin ei ole juuri kiinnitetty huomiota. Kun näitä aminohappoja on yritetty eristää näistä sokerinval-mistuksen jäteliemistä, on havaittu, että jotkut näistä aminohapoista ovat osittain rasemisoituneina. Kun se-riini tutkittiin HPLC-menetelmällä kiraalipylväissä, todettiin DL-seriinin pitoisuudeksi 20 - 30 %. Tämä tähän mennessä tuntematon raseemisen seriinin esiintyminen sokerijuurikasmelassissa vaikeuttaa L-seriinin eristämistä.In contrast, the outflows from sugar beet processing and the outflows from molasses sugar removal are the large amounts of waste that are available. Sugar beet contains amino acids in free form and is extracted into raw juice during sugar extraction. From the point of view of sugar technology, these amino acids are "harmful nitrogen" because they prevent the crystallization of sugar. Nitrogen compounds present in higher amounts, such as betaine, glutamine, glutamic acid, and aspartic acid, have been extensively studied, while amino acids present in lower amounts have received little attention. In attempts to isolate these amino acids from these sugar production effluents, it has been found that some of these amino acids are partially racemized. When serine was analyzed by HPLC on chiral columns, the concentration of DL-serine was found to be 20-30%. This hitherto unknown presence of racemic serine in sugar beet molasses makes it difficult to isolate L-serine.

Sokerijuurikasmelassi sisältää noin 48 % sakkaroosia, 10 % tuhka-aineita ja noin 4 % aminohappoja.Sugar beet molasses contains about 48% sucrose, 10% ash and about 4% amino acids.

Sokerin poisto melassista voidaan suorittaa seostamalla sakkaroosi kalsiumilla tai bariumsuoloilla tai erottamalla muut kuin sokeriaineosat nestekromatografiällä. Viimeksimainittu erotusmenetelmä on selostettu saksalaisissa patenttijulkaisuissa no. 22 32 093, 22 31 784 ja 26 62 211. Tässä käytetään stationäärifaasina ionin-vahdinta ja liikkuvana faasina laimennettua melassia ja vettä vuorotellen. Erotuspylväiden ulostulovirtauk-sina saadaan sokeripitoisia jakeita ja niukkasokerisia jakeita. Eräät tässä erotusprosessissa saadut korkean aminohappopitoisuuden omaavat ulostulovirtaukset ovat edullisia raaka-aineita keksinnönmukaisessa seriinin- 4 86415 talteenotossa käytettäviksi.The removal of sugar from molasses can be carried out by mixing sucrose with calcium or barium salts or by separating the non-sugar components by liquid chromatography. The latter separation method is described in German patent publications no. 22 32 093, 22 31 784 and 26 62 211. Here, an ion exchanger is used as the stationary phase and dilute molasses and water are used alternately as the mobile phase. Sugar-containing fractions and low-sugar fractions are obtained as the effluent streams of the separation columns. Some of the high amino acid output streams obtained in this separation process are preferred feedstocks for use in the serine-4,86415 recovery of the invention.

Ionikromatografiässä tulee kationinvaihdin kyllästetyksi suodatettavan liuoksen ioneilla.In ion chromatography, the cation exchanger becomes saturated with ions of the solution to be filtered.

Tässä systeemissä läpäisevät tuodut vahvat elektrolyytit vaihtimen muuttumattomina, kun taas vaihtimen matriisi adsorboi heikot elektrolyytit tai ei-elektro-lyytit.In this system, the imported strong electrolytes pass through the exchanger unchanged, while the exchanger matrix adsorbs weak electrolytes or non-electrolytes.

Kun tämän jälkeen suoritetaan eluointi vedellä, liukenevat nämä adsorboituneet aineet matriisista. Kun vuorotellen suoritetaan lataaminen käsiteltävällä materiaalilla ja eluointi vedellä, saadaan aikaan elektrolyyttien ja ei-elektrolyyttien erottuminen toisistaan. Täisin uutta ja odottamatonta oli se, että erotettaessa seriinipitoiset ulostulovirtaukset kromatografises-ti natriummuodossa olevalla kationinvaihtimella voitiin vahvojen elektrolyyttien erottamisen lisäksi saada aikaan vielä seriinin erottuminen sakkaroosista ja muista aminohapoista. Tällä keksinnönmukaisella kromatografi-sealla erotuksella voidaan voidaan seriinipitoisuus nostaa 10- - 15-kertaiseksi lähtöliuokseen verrattuna. Koska tässä menetelmässä toisin kuin ioninvaihtokromato-grafiässä ei käytetä mitään regenerointiaineita, on tämä uusi erotusmenetelmä hyvin ympäristöystävällinen eikä synnytä jätevesikuormitusta.When eluted with water is then performed, these adsorbed substances dissolve from the matrix. Alternating charging with the material to be treated and eluting with water results in the separation of electrolytes and non-electrolytes. What was completely new and unexpected was that by separating the serine-containing effluents chromatographically with a sodium cation exchanger, in addition to the separation of strong electrolytes, the separation of serine from sucrose and other amino acids could be achieved. With this chromatographic separation according to the invention, the serine content can be increased 10- to 15-fold compared to the starting solution. Since this method, unlike ion exchange chromatography, does not use any regenerating agents, this new separation method is very environmentally friendly and does not generate wastewater load.

Syötetyn liuoksen pH-arvolla on oleellinen vaikutus seriinin erottumiseen. On havaittu, että pH-arvon pitäisi olla välillä 5, 5 - 6,5. Parhaat erotustulokset saatiin lähellä seriinin isoelektristä pistettä, joka on 5,7. Toinen tärkeä parametri on erotuspylvään lämpötila. Jotta saavutettaisiin hyvä erottuminen ja vältyttäisiin mikrobiologisilta kontaminaatioilta, on tarkoituksenmukaista työskennellä lämpötila-alueella 80 - 90 °C. Kationinvahtimina on edullista käyttää polystyreenihartseja, joiden divinyylibentseenisilloittu-misaste on 4 - 7 %. Hiukkaskoon pitää olla 0,3 - 0,5 mm ja 90 % hartsirakeista pitää olla 20 % sisällä hiukkas- 5 86415 koon keskiarvosta.The pH of the fed solution has a significant effect on serine release. It has been found that the pH should be between 5.5 and 6.5. The best separation results were obtained near the isoelectric point of serine, which is 5.7. Another important parameter is the temperature of the separation column. In order to achieve good separation and to avoid microbiological contamination, it is expedient to work in the temperature range of 80 to 90 ° C. It is preferred to use polystyrene resins having a degree of crosslinking of divinylbenzene of 4 to 7% as cation exchangers. The particle size should be 0.3 to 0.5 mm and 90% of the resin granules should be within 20% of the average particle size.

Vielä eräs ratkaistava kysymys on ulostulovirtauk-sen ohjaus niin, että yksittäiset jakeet saadaan erotetuiksi. Ennestään tunnettua aminohappojen osoitusta ninhydriinivärjäyksellä ei substraatin oman värin vuoksi voitu käyttää ja muut osoitusreaktiot, esimerkiksi ami-nohappoanalyysi, olivat niin hitaita, etteivät ne olleet käyttökelpoisia prosessin ohjaukseen. Yllättäen ja odottamatta havaittiin, että seriinifraktio voitiin erottaa hyvin tarkasti yksinkertaisella tiheys- ja johto-kykymittauksella. Erotusmenetelmää valaistaan kuvan 1 avulla. Tiheydenmittaukseen käytettiin sokerikemiassa tavallisesti käytettyä Bx-arvoa ja johtokyky ilmaistaan mikrosiemenseinä.Another issue to be solved is the control of the outlet flow so that the individual fractions can be separated. The previously known detection of amino acids by ninhydrin staining could not be used due to the color of the substrate itself, and other detection reactions, for example amino acid analysis, were so slow that they were not useful for process control. Surprisingly and unexpectedly, it was found that the serine fraction could be separated very accurately by a simple density and conductivity measurement. The separation method is illustrated by Figure 1. The Bx value commonly used in sugar chemistry was used for density measurement and conductivity is expressed as microseeds.

Kuten kuvasta 1 voidaan havaita, kasvavat tiheys ja johtokyky voimakkaasti erotusprosessin alussa, saavuttavat maksimin ja laskevat sen jälkeen jyrkästi ja saavuttavat käännepisteen jälkeen tasanteen, joka viettää syklin loppua kohti. Näiden arvojen käännepisteessä on myös seriinifraktion leikkauspiste. Tämä yksinkertainen mittaus teki mahdolliseksi erotusprosessin välittömän ohjauksen. Seriinijakeen ohella saadaan myös sokeripitoinen jae, joka sisältää myös muut ei-sokerlaineet.As can be seen from Figure 1, the density and conductivity increase sharply at the beginning of the separation process, reach a maximum and then fall sharply, and after a turning point reach a plateau that spends towards the end of the cycle. The inflection point of these values also has the intersection of the serine fraction. This simple measurement made it possible to control the separation process immediately. In addition to the serine fraction, a sugar-containing fraction is also obtained, which also contains other non-sugar waves.

Tämä sokeripitoinen jae voidaan konsentroinnin jälkeen käyttää rehuteollisuudessa tai käymisteollisuudessa. Erotusprosessin aikana otetaan myös välijakeita, kuten palaute 1 ja palaute 2, jotka viedään takaisin seuraavaan erotussykliin.After concentration, this sugar-containing fraction can be used in the feed industry or in the fermentation industry. During the separation process, intermediate fractions, such as feedback 1 and feedback 2, are also taken and taken back to the next separation cycle.

Erotusmenetelmällä saadaan niukkatuhkaisia seriini-liuoksia tai hyvin puhtaita seriinijakeita. Näistä liuoksista pitää erottaa D-seriini, koska seriiniliuosta tryptofaaninvalmistukseen käytettäessä vain L-seriini reagoi. D-seriinin erottamiseen löydettiin yllättävän yksinkerainen ratkaisu. Kun seriinijae konsentroitiin 35 % kuiva-ainepitoisuuteen ja sen jälkeen jäähdytettiin 20 °C:een, voitiin pääosa D-seriinistä erottaa suodattamalla DL-seriininä. Kiteytyneen DL-seriinin tarkempi « 86415 tutkimus osoitti, että siinä oli epäpuhtautena tyrosii-nia, ja koska tyrosiini on hyvin vaikealiukoinen aminohappo, ei pelkällä uudelleenkiteytyksellä kyetä saamaan aikaan tyydyttävää puhtausastetta. Tutkimuksissa havaittiin, että aromaattiset aminohapot, fenyylialaniini ja tyrosiini, adsorboituivat selektiivisesti voimakkaasti emäksisiin anioninvaihtimiin. Seriini adsorboituu tällöin anioninvaihtimiin vain vähäisessä määrin ja syrjäytyy sitoutuvan tyrosiinin toimesta. Seriinihäviöiden välttämiseksi säädetään suhde tyrosiini:ioninvaihdin niin, että poistettavaa tyrosiinimoolia kohti käytetään 2 litraa ioninvaihdinta. Tyrosiinittomasta DL-seriini-liuoksesta saadaan konsentroimalla ja kiteyttämällä puhdasta DL-seriiniä. Sen sijaan, että tryptofaaninval-mistukseen käytettäisiin L-seriiniliuosta, voidaan liuosta eteenpäin haihduttamalla kiteyttää L-seriini ja puhdistaa se uudelleenkiteyttämällä.The separation method gives sparse ashy serine solutions or very pure serine fractions. D-serine must be separated from these solutions because, when using a serine solution for tryptophan production, only L-serine reacts. A surprisingly simple solution was found for the separation of D-serine. After the serine fraction was concentrated to a dry matter content of 35% and then cooled to 20 ° C, most of the D-serine could be separated by filtration as DL-serine. A more detailed study of crystallized DL-serine showed that it contained tyrosine as an impurity, and since tyrosine is a very sparingly soluble amino acid, recrystallization alone cannot achieve a satisfactory degree of purity. Studies found that aromatic amino acids, phenylalanine and tyrosine, were selectively strongly adsorbed to basic anion exchangers. The serine is then adsorbed to the anion exchangers only to a small extent and is displaced by the binding tyrosine. To avoid serine losses, adjust the tyrosine: ion exchanger ratio so that 2 liters of ion exchanger are used per mole of tyrosine removed. Tyrosine-free DL-serine solution is obtained by concentrating and crystallizing pure DL-serine. Instead of using an L-serine solution for the preparation of tryptophan, L-serine can be crystallized by further evaporation of the solution and purified by recrystallization.

Ennestään tunnettuun L-tryptofaanin syntetisointiin L-seriinistä ja indolista käytetään tryptofaanisyntetasi-pitoisia mikro-organismeja. Keksintö ei koske näiden mikro-organismien kasvatusta tai immobilisointia, vaan ainoastaan keksinnönmukaisesti valmistetun seriiniliuok-sen käyttöä biokemialliseen kondensointiin L-tryptofaa-niksi. Koska tämän liuoksen seriinikonsentraatio on suuri, on tämä reaktio erittäin tehokas, ja lisättäessä solususpensioon stoikiometriset määrät indolia ja serii-niä, saadaan tryptofaania niin suurina pitoisuuksina, että se kiteytyy ja voidaan erottaa solujen kanssa yhdessä. Jäljellejäänyt emäliuos konsentroidaan ja lisätty etanoli otetaan talteen. Kun tämä emäliuos jäähdytetään, kiteytyy toinen raakatryptofaanijae, joka erotetaan.Tryptophan synthetase-containing microorganisms are used to synthesize L-tryptophan from L-serine and indole. The invention does not concern the growth or immobilization of these microorganisms, but only the use of a serine solution prepared according to the invention for biochemical condensation to L-tryptophan. Due to the high serine concentration of this solution, this reaction is very efficient, and by adding stoichiometric amounts of indole and serine to the cell suspension, tryptophan is obtained in such high concentrations that it crystallizes and can be separated together with the cells. The remaining mother liquor is concentrated and the added ethanol is recovered. When this mother liquor is cooled, a second crude tryptophan fraction crystallizes which is separated.

Nyt jäljelle jäänyt konsentroitunut emäliuos voidaan sitten mielellään käyttää täydennyksenä rehuissa. Jos käytetään proteiinihydrolysaattien seriinipitoisia ulos-tulovirtauksia, voidaan näistä emäliuoksista eristää myös muita aminohappoja sinänsä tunnetuilla menetelmillä.The remaining concentrated mother liquor now can then preferably be used as a supplement in feed. If serine-containing effluents of protein hydrolysates are used, other amino acids can also be isolated from these mother liquors by methods known per se.

ä > t 7 86415ä> t 7 86415

Raakatryptofaani liuotetaan kuumaan veteen ja solut erotetaan aktiivihiilen ja suodatusapuaineiden lisäämisen jälkeen. Tryptofaaniliuos, josta väri on poistettu, konsentroidaan vakuumissa, jäähdytetään ja kiteytynyt tryptofaani erotetaan. Infuusioliuoksissa käyttöä varten pitää L-tryptofaani vapauttaa pyrogeeni-sistä aineista. Nämä pyrogeeniset aineet ovat reaktiossa käytetyistä mikro-organismeista peräisin olevia endo-toksiineja ja ne saavat infuusion yhteydessä aikaan voimakkaita kuumereaktioita. Koska näiden pyrogeenisten aineiden keskimääräinen molekyylipaino on 10 000, ei niitä varmasti pystytä poistamaan ultrasuodatuksella, ja tästä syystä kokeiltiin erilaisia adsorbentteja.The crude tryptophan is dissolved in hot water and the cells are separated after the addition of activated carbon and filter aids. The decolorized tryptophan solution is concentrated in vacuo, cooled and the crystallized tryptophan is separated. For use in infusion solutions, L-tryptophan must be released from pyrogenic substances. These pyrogenic substances are endotoxins derived from the microorganisms used in the reaction and cause strong febrile reactions during infusion. Since these pyrogenic substances have an average molecular weight of 10,000, they certainly cannot be removed by ultrafiltration, and for this reason various adsorbents were experimented with.

Tällöin piti halutun adsorbentin adsorboida vain pyrogeeniset aineet, mutta ei tryptofaania. Happamaksi aktivoitu alumiinioksidi täytti tämän vaatimuksen. Keksinnönmu-kaisesti perkoloidaan tryptofäänin vesiliuos, josta väri on poistettu, alumiinioksidipylväässä ja sen jälkeen poistetaan alumiinioksidipartikkelit steriilin levysuodat-timen läpi suodattamalla. Tämän jälkeen suodatettu liuos konsentroidaan steriileissä olosuhteissa ja saadaan pyrogeenitöntä L-tryptofaania.In this case, the desired adsorbent had to adsorb only pyrogenic substances, but not tryptophan. Acidified alumina met this requirement. According to the invention, the decolorized aqueous solution of tryptophan is percolated on an alumina column and then the alumina particles are removed by filtration through a sterile plate filter. The filtered solution is then concentrated under sterile conditions to give pyrogen-free L-tryptophan.

Toteutustapaesimerkki 1Implementation example 1

Kaksivaippainen lasipylväs (850 x 40 mm) täytetään 1000 ml:11a natriummuodossa olevaa kationinvaihtajaa. Erotuspylvään kaksoisvaippa kuumennetaan termostaatin avulla 85°C:een. Sitten pylvääseen tuodaan virtausnopeudella 6 ml/min 120 ml melassinsokerinpoistosta saatua seriinipitoista ulostulovirtausta, jonka kuiva-aineesta 60 % on sakkaroosia ja 4 % seriiniä, ja jonka pH on säädetty arvoon 6,0, ja 20 minuutin kuluttua syötetään 85 minuutin ajan vettä, josta suolat on poistettu kokonaan. Sitten alkaa toinen sykli siten, että syötetään seuraava seriinipitoinen ulostulovirtaus.Fill a 1000 ml double-capped glass column (850 x 40 mm) with 1000 ml of sodium cation exchanger. The double jacket of the separation column is heated to 85 ° C by means of a thermostat. A 120 ml serine-containing effluent from molasses removal, 60% sucrose and 4% serine in dry matter, adjusted to pH 6.0, is then introduced into the column at a flow rate of 6 ml / min, and after 20 minutes water is added for 85 minutes, from which salts are added. has been completely removed. The second cycle then begins by feeding the next serine-containing output stream.

Erotuspylväästä poistuvat liuokset kulkevat jatkuvasti tiheyden- ja johtokyvynmittauslaitteen läpi ja s 86415 mitatut arvot siirretään piirturiin. Mitattujen tiheys-ja johtokykyarvojen perusteella leikataan mikroproses-soriohjauksella seuraavat jakeet: - 50 minuuttia ei-sokeri- ja sakkaroosijae -10 minuuttia palaute 1 - 30 minuuttia seriinijae -15 minuuttia palaute 2The solutions leaving the separation column pass continuously through the density and conductivity measuring device and the measured values of s 86415 are transferred to a plotter. Based on the measured density and conductivity values, the following fractions are cut by microprocessor control: - 50 minutes non-sugar and sucrose fraction -10 minutes feedback 1 to 30 minutes serine fraction -15 minutes feedback 2

Palautejae 1 syötetään yhdessä seuraavan seriini-pitoisen ulostulovirtauksen kanssa ja palautejae 2 palautetaan yhdessä veden kanssa. Ei-sokerijae palautetaan sokerinpoistoprosessiin ja seriiniliuos, jonka kuiva-aineesta 40 % on seriiniä, jatkokäsitellään seuraavalla tavalla: 3000 g seriiniliuosta konsentroidaan 450 g:aan ja jäähdytetään sekoittaen 20°C:een, kiteytynyt DL-seriini suodatetaan pois, liuotetaan 90°C:ssa 500 ml:aan vettä, lisätään 3 g aktiivihiiltä ja suodatetaan. Suodos johdetaan 40°C:ssa lasipyIvaan läpi, joka sisältää 50 ml voimakkaasti emäksistä geelityyppistä anioninvahdinta ja puhdistettu, tyrosiinista vapaa liuos konsentroidaan 150 g:aan, jäähdytetään ja kiteytynyt DL-seriini suodatetaan pois. Kuivauksen jälkeen sadaan 13 g DL-seriiniä. Konsentroi-. . tu L-seriiniliuos jatkokäsitellään seuraavalla tavalla:Feedback fraction 1 is fed together with the next serine-containing outlet stream and feedback fraction 2 is fed together with water. The non-sugar fraction is returned to the de-sugaring process and the serine solution with 40% serine in the dry matter is further processed as follows: 3000 g of serine solution is concentrated to 450 g and cooled with stirring to 20 ° C, the crystallized DL-serine is filtered off, dissolved at 90 ° C: to 500 ml of water, add 3 g of activated carbon and filter. The filtrate is passed through a glass column at 40 ° C containing 50 ml of a strongly basic gel-type anion exchanger and the purified tyrosine-free solution is concentrated to 150 g, cooled and the crystallized DL-serine is filtered off. After drying, 13 g of DL-serine are obtained. Concentrated. . The L-serine solution is further treated as follows:

Ennestään tunnetulla tavalla kasvatetaan ravinne-liuoksessa aerobisissa olosuhteissa sopivaa E. colin ·' mutanttia ja pestyt solut sentrifugoidaan pois kasvu- : liemestä.In a known manner, a suitable E. coli mutant is grown in a nutrient solution under aerobic conditions and the washed cells are centrifuged out of the growth broth.

· 50 g tätä sentrifugoitua solumassaa suspensoidaan : : : 400 g:aan L-seriiniliuosta ja lisätään 10 g ammoniumsul- .'faattia. jalO mg pyridoksaalifosfaattia ja pH säädetään .·. : ammoniakkia lisäämällä arvoon 8,0. Tähän suspensioon lisätään sekoituksen alaisena liuos, jossa on 60 g indolia 300 ml:ssa etanolia, ja lisäysnopeus säädetään sellaiseksi, että vapaan indolin pitoisuus reaktioliuok-sessa pysyy alle 1,5 g:na per litra. Reaktioaika on .*··. 35°C:ssa 40 tuntia. Reaktion loputtua säädetään liuoksen 9 86415 pH fosforihapolla arvoon 4,0, kuumennetaan 50°C:een ja lisätään 10 g aktiivihiiltä. Koaguloituneet solut erotetaan sen jälkeen yhdessä kiteytyneen tryptofäänin kanssa.· 50 g of this centrifuged cell mass are suspended::: in 400 g of L-serine solution and 10 g of ammonium sulphate are added. and mg mg of pyridoxal phosphate and the pH is adjusted. : by adding ammonia to 8.0. To this suspension is added, with stirring, a solution of 60 g of indole in 300 ml of ethanol, and the rate of addition is adjusted so that the concentration of free indole in the reaction solution remains below 1.5 g per liter. The reaction time is. * ··. At 35 ° C for 40 hours. After completion of the reaction, the pH of solution 9 86415 is adjusted to 4.0 with phosphoric acid, heated to 50 ° C and 10 g of activated carbon are added. The coagulated cells are then separated together with the crystallized tryptophan.

Saanto: 200 g raakatryptofaania I.Yield: 200 g of crude tryptophan I.

Raakatryptofaanin emäliuos konsentroidaan 300 g:aan tislaamalla pois etanoli, jäähdytetään huoneenlämpö-tilaan ja erotetaan toinen raakatryptofaanijae.The crude cryptophan mother liquor is concentrated to 300 g by distilling off ethanol, cooled to room temperature and the second crude cryptophan fraction is separated.

Saanto: 20 g raakatryptofaania II.Yield: 20 g of crude tryptophan II.

220 g raakatryptofaania liuotetaan 70°C:ssa 4000 ml:aan vettä, lisätään 20 g aktiivihiiltä ja 50 g piimaata ja soluaine suodatetaan pois. Suodatettu liuos, josta väri on poistunut, johdetaan sitten pylvääseen, jossa on 50 ml alumiinioksidia, ja sen jälkeen suodatetaan steriilin kalvon läpi. Pyrogeeniton liuos konsentroidaan kiertohaihduttimessa 500 ml:aan, jäähdytetään, tyrptofaani suodatetaan pois ja kuivataan vakuumissa 80°C:ssa. Näin saadaan 70 g puhdasta pyrogeenitöntä L-tryptofaania.220 g of crude cryptophan are dissolved in 4000 ml of water at 70 ° C, 20 g of activated carbon and 50 g of diatomaceous earth are added and the cellular material is filtered off. The decolorized filtered solution is then applied to a column of 50 ml of alumina and then filtered through a sterile membrane. The pyrogen-free solution is concentrated on a rotary evaporator to 500 ml, cooled, the tryptophan is filtered off and dried in vacuo at 80 ° C. This gives 70 g of pure pyrogen-free L-tryptophan.

j Toteutustapaesimerkki 2j Implementation example 2

Kahteen peräkkäin kytkettyyn voimakkaasti happamaan kationinvaihtimeen, joiden kunkin tilavuus on 1 1, johdetaan sokerinvalmistuksessa saatua saturoitua mehua, kunnes ensimmäisen kationinvaihtimen pH on muuttunut arvosta 2,0 arvoon 3,0. Sitten kummastakin kationinvaihti-mesta poistetaan makeus ja suoritetaan jälkipesu vedellä. Toinen eli jäljempänä oleva kationinvahdin, jossa on pääosa aminohaposta, regeneroidaan 1,5 litralla IN natrium-hydroksidia tai 1 N ammoniakkiliuosta ja suoritetaan jälkipesu vedellä. Eluaatti ja pesuvesi konsentroidaan sitten yhdessä noin 15 % kuiva-ainepitoisuuteen ja saatu liuos, jonka kuiva-ainepitoisuudesta noin 2 % on seriiniä, . jatkokäsitellään toteutustapaesimerkin 1 mukaisesti.Saturated juice obtained in the manufacture of sugar is introduced into two strongly acidic cation exchangers connected in series, each with a volume of 1 l, until the pH of the first cation exchanger has changed from 2.0 to 3.0. The sweetness is then removed from each cation exchanger and washed with water. The second, hereinafter cationic, with the major part of the amino acid, is regenerated with 1.5 liters of 1N sodium hydroxide or 1 N ammonia solution and washed with water. The eluate and washings are then concentrated together to a dry matter content of about 15% and the resulting solution having a serine dry matter content of about 2% is. further processed according to Implementation Example 1.

10 8641 510 8641 5

Toteutustapaesimerkki 3 1000 g villajätettä hydrolysoidaan 5 litrassa 6N suolahappoa 8 tuntia 105°C:ssa. Saostuneet humiiniai-neet suodatetaan pois ja suolahappohydrolysaatti neutraloidaan sekoituksen alaisena lisäämällä varovasti natriumkarbonaattia, kunnes saavutetaan pH-arvo 5,0 - 6,0. Liuos jäähdytetään huoneenlämpötilaan, jossa kiteytymisen annetaan tapahtua 48 tuntia, ja sitten vaikealiukoiset, kiteytyneet aminohapot suodatetaan pois ja emäliuos, jonka kuiva-aineesta noin 5 % on serii-niä, jatkokäsitellään esimerkin 1 mukaisesti. Raaka-tryptofäänin erottamisen jälkeen saaduista ulostulovis-tauksista voidaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä, kuten ioninvaihtokromatografilla, saada talteen muita aminohappoja.Embodiment Example 3 1000 g of wool waste are hydrolyzed in 5 liters of 6N hydrochloric acid for 8 hours at 105 ° C. The precipitated humic substances are filtered off and the hydrochloric acid hydrolyzate is neutralized with stirring by careful addition of sodium carbonate until a pH of 5.0 to 6.0 is reached. The solution is cooled to room temperature where crystallization is allowed to proceed for 48 hours, and then sparingly soluble, crystallized amino acids are filtered off and the mother liquor with about 5% serine in the dry matter is worked up as in Example 1. Other amino acids can be recovered from the effluents obtained after separation of the crude tryptophan by methods known per se, such as ion exchange chromatography.

Claims (6)

11 8641 511 8641 5 1. Menetelmä L-tryptofäänin ja DL-seriinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että sokerijuurikkaiden jalostuksessa saatujen saturoitujen mehujen ja sokeri-siirappien ioninvaihtoeluaateista tai muista seriinipi-toisista ulostulovirtauksista, jotka on saatu poistettaessa sokeria meiassista, valmistetaan pH-alueella 5,5 - 6,5 ionikromatografian avulla niukkatuhkainen seniniliuos, joka sen jälkeen konsentroidaan niin, että DL-seriini erottuu, ja jäljelle jäänyt konsentroi-tunut L-seriiniliuos saatetaan reagoimaan indolin kanssa tryptofaanisyntetaasia sisältävien solujen suspensiossa, jolloin syntyy L-tryptofaania.A process for the preparation of L-tryptophan and DL-serine, characterized in that the ion exchange substitutes of saturated juices and sugar syrups obtained from sugar beet processing or other serine-containing effluents obtained from the removal of sugar from honey are prepared in a pH range of 5.5 to 6, By ion chromatography, the low-ash senine solution, which is then concentrated to separate DL-serine, and the remaining concentrated L-serine solution are reacted with indole in a suspension of tryptophan synthetase-containing cells to form L-tryptophan. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että seriinipitoiset ulostulo-virtaukset kromatografoidaan lämpötila-alueella 80 -90°C natriummuodossa olevassa kationinvaihtimessa.Process according to Claim 1, characterized in that the serine-containing effluents are chromatographed in a cation exchanger in the sodium form at a temperature in the range from 80 to 90 ° C. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kromatografista seriininero-tusta seurataan mittaamalla ulos virtaavan liuoksen tiheyttä ja sähkönjohtokykyä.Method according to Claim 1 or 2, characterized in that the chromatographic serine separation is monitored by measuring the density and the electrical conductivity of the effluent solution. 4. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen : menetelmä, tunnettu siitä, että seriinijae konsent- roidaan, kiteytynyt DL-seriini erotetaan, liuotetaan veteen ja puhdistetaan käsittelemällä voimakkaasti emäk-sisessä anioninvaihtimessa ja uudelleenkiteyttämällä sen jälkeen.A process according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the serine fraction is concentrated, the crystallized DL-serine is separated, dissolved in water and purified by vigorous treatment in a basic anion exchanger and subsequent recrystallization. 5. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiteytynyt L-tryp- . . tofaani erotetaan yhdessä solujen kanssa sen jälkeen, / kun on lisätty aktiivihiiltä ja suodatusapuainetta, ja -* ‘ emäliuoksesta otetaan jatkohaihdutuksen jälkeen talteen •r toinen raakatryptofaanijae.Process according to any one of Claims 1 to 4, characterized in that the crystallized L-tryp-. . the tofan is separated together with the cells after / after the addition of activated carbon and filter aid, and - * 'a second fraction of crude tryptophan is recovered from the mother liquor after further evaporation. 6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että L-tryptof aani liuotetaan • · i2 8641 5 veteen, suodatetaan, liuos, josta väri on poistunut, käsitellään aktiivisella alumiinioksidilla, konsentroidaan ja kiteytetään, jolloin saadaan pyrogeenitöntä L-trypto-faania. li 13. r 4 1 Γ PATENTKRAV ° U H ' 3Process according to Claim 4, characterized in that the L-tryptophan is dissolved in water, filtered, the decolorized solution is treated with active alumina, concentrated and crystallized to give pyrogen-free L-tryptophan. li 13. r 4 1 Γ PATENTKRAV ° U H '3
FI873705A 1986-09-11 1987-08-26 Process for Preparation of L-Tryptophan FI86415C (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3630878 1986-09-11
DE3630878A DE3630878C1 (en) 1986-09-11 1986-09-11 Process for the preparation of L-tryptophan and DL-serine

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI873705A0 FI873705A0 (en) 1987-08-26
FI873705A FI873705A (en) 1988-03-12
FI86415B FI86415B (en) 1992-05-15
FI86415C true FI86415C (en) 1992-08-25

Family

ID=6309331

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI873705A FI86415C (en) 1986-09-11 1987-08-26 Process for Preparation of L-Tryptophan

Country Status (4)

Country Link
DE (1) DE3630878C1 (en)
FI (1) FI86415C (en)
FR (1) FR2603887B1 (en)
IT (1) IT1222637B (en)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102006061479A1 (en) * 2006-12-23 2008-06-26 Evonik Degussa Gmbh Process for the preparation of various products containing a target substance

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR1248113A (en) * 1959-10-30 1960-12-09 Commerciale D Applic Chimiques Process for the separation of amino acids from candy juice
DE2231784C3 (en) * 1972-06-29 1982-09-02 Pfeifer & Langen, 5000 Köln Process for regenerating the ion exclusion resins used in the extraction of sugar by the ion exclusion process
IT986260B (en) * 1972-06-29 1975-01-20 Pfeifer Und Langen PROCEDURE AND PLANT FOR RECEIVING SUGAR FROM MOLASSA BY ION BREAKDOWN
DE2257864C3 (en) * 1972-11-25 1978-09-07 Pfeifer & Langen, 5000 Koeln Process for regenerating the ion exchange resins used in the extraction of sugar from molasses
JPS531836B2 (en) * 1972-12-15 1978-01-23
DE2362211C3 (en) * 1973-12-14 1978-05-11 Sueddeutsche Zucker Ag, 6800 Mannheim Process for processing molasses
DE2841642C2 (en) * 1978-09-25 1983-03-03 Joachim Prof. Dr. Klein Process for the microbial production of L-tryptophan
GB2048266B (en) * 1979-05-09 1983-11-30 Mitsui Toatsu Chemicals Enzymatic preparation of l-tryptophan

Also Published As

Publication number Publication date
FI86415B (en) 1992-05-15
FI873705A (en) 1988-03-12
IT8721872A0 (en) 1987-09-10
FR2603887B1 (en) 1991-03-15
FR2603887A1 (en) 1988-03-18
DE3630878C1 (en) 1988-03-10
FI873705A0 (en) 1987-08-26
IT1222637B (en) 1990-09-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK202000086U1 (en) Separation of 2'-fl from a fermentation broth
CN108299278B (en) Method for extracting and separating L-tryptophan
CN112979482B (en) High-purity L-valine as well as preparation method and application thereof
CZ234192A3 (en) Method of lysine isolating
US4584399A (en) Purification of L-phenylalanine
FI86415C (en) Process for Preparation of L-Tryptophan
CN113429448B (en) Method for extracting inosine from fermentation liquor
CN115772549A (en) Preparation method for extracting nicotinamide containing trace nicotinic acid from fermentation liquor
US11814334B2 (en) Separation of basic amino acids
KR940000810B1 (en) Process for the preparation of crystallized glutamic acid
EP3720841B1 (en) Method for preparing natural l-cysteine hydrochloride hydrate crystals by continuous chromatography
JP4778913B2 (en) L-ornithine crystal and method for producing the same
CN114213276B (en) Method for extracting and purifying theanine from enzyme catalytic reaction
JP7100138B2 (en) Method for Producing Natural L-Cysteine Crystal Using Continuous Chromatography Step
CN106674037B (en) A method of separating L-phenylalanine from Abbas's sweet tea synthesis mother liquid
KR20000013855A (en) Recovery method of l-threonine from fermentation broth
CN116621760A (en) Purification method of L-tryptophan for cell culture medium
JP3776160B2 (en) Method for producing D-calcium pantothenate
SU990814A1 (en) Process for producing p-tryptophan
CN118359522A (en) Method for separating and purifying L-methionine from fermentation broth
CN117105796A (en) Method for recovering glutamic acid, ammonium sulfate and pyroglutamic acid from glutamic acid isoelectric mother solution
JP3719309B2 (en) Manufacturing method of ribitol
KR910004369B1 (en) Method for purification of l-glutamine
CN114436899A (en) Method for extracting L-arginine by using ion exchange method
JPH0267256A (en) Isolation and purification of carnitine and carnitinenitrile

Legal Events

Date Code Title Description
MM Patent lapsed

Owner name: AMINO-GMBH