KR100190203B1 - 커플링된 효소반응에 의해 l-포스피노트리신을 제조하는 방법 - Google Patents
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Abstract
아미노 공여체 글루타메이트가 촉매량으로 사용되고 아미노 공여체 아스파르테이트가 HMPB에 대하여 약 동몰량으로 사용되는 경우, GOT 활성을 갖는 트랜스아미나제 및 L-포스피노트리신 트랜스아미나제 활성을 갖는 트랜스아미나제의 커플링된 효소 반응은 사실상 정량적 수율로 그리고 천연 아미노산에 의한 어떤 오염도 없이 포스피노트리신을 생성한다.
Description
본 발명은 2개의 효소반응을 커플링(coupling)시켜 4-(하이드록시메틸포스피닐)-2-옥소부티르산(HMPB)으로부터 L-2-아미노-4-(하이드록시메틸포스피닐)부티르산(L-포스피노트리신)을 합성 하는 방법에 관한 것이다.
커플링된 효소합성에서 포스피노트리신의 제조는 이미 유럽 특허 제249,188호에 기술되어 있다. 이것은 아미노 공여체 아스파르테이트 및 글루타메이트/옥살아세데이트 트랜스아미나제(GOT)의 존재하에서 α-케토글루타레이트의 글루타메이트로의 전환을 기술하고 있다. 이러한 전환은 제1반응에서 형성된 아미노 공여체 글루타메이트의 존재하에서 4-(하이드록시메틸포스피닐)-2-옥소부티르산(HMPB)을 L-포스피노트리신으로 전환시키는 또 다른 트랜스아미나제 반응과 커플링되어 있다.
그런데 커플링된 효소반응에서 기질 전환을 완성하기 위해서는, 개개의 효소반응의 평형 상수가 서로 상이해야 하는 점이 중요하다. 그러나, 아미노기전이반응의 평형 상수가 약 1.0이므로, 일반적으로 목적하는 생성물의 50% 수율 획득은 가능하다[참조: 미합중국 특허 제4,826,766호].
평형으로부터 하나의 반응 생성물을 제거하거나 하나의 출발물질을 과량으로 사용함으로써 생성물이 유리하게 생성되도록 효소 반응의 평형을 바꾸는 것은 가능하다.
일반적으로 아미노 공여체 글루타메이트는 L-포스피노트리신을 합성하기 위한 상기 아미노기전이반응을 위해 매우 과량으로 사용된다[참조: A. Schulz 등, (1990) Appl. Environ. Microbiol. 56, 1-6, No. 1]. 그러나, 이것은 비-단백질 생성 아미노산 L-포스피노트리신이 천연 아미노산(예: 글루타메이트)으로 부터 매우 정교한 방법(예: 2개의 연속적인 이온 교환 크로마토그라피)에 의해서만 분리될 수 있다는 단점을 갖는다[참조: A. Schulz 등 (1990) Appl. Environ. Microbiol. 56, 1-6 No. 1].
포스피노트리신-특이적 트랜스아미나제 및 GOT를 수반하는 커플링된 과정에서의 다른 가능한 방법은 포스피노트리신 트랜스아미나제에 의해 소모되는 글루타메이트를 재순환시킴으로써 GOT에 의해 포스피노트리신 합성 방향으로 추진되는 반응에 관한 것인데, 왜냐하면, GOT 반응 생성물인 옥살아세테이트는 이중으로 하전된 금속 이온의 존재하에서 자연발생적으로 탈카복실화되어 피루베이트가 됨으로써 반응 평형으로부터 제거되기 때문이다. 그러나 지금까지 기술된 모든 GOT는 글루타메이트의 존재하에서 피루베이트를 알라닌으로 아미노기전이반응시키는 보조 활성을 가짐으로써, NH4 +가 반응으로부터 연속적으로 제거되도록 하므로, L-포스피노트리신을 수득하기 위한 반응에서 동몰량의 HMPB 및 아미노 공여체(글루타메이트 및/또는 아스파르테이트)가 사용되는 경우 완결될 수 없다. 또한, 생성된 L-포스피노트리신은 알라닌으로 오염된다. 본 발명에 이르러 아미노 공여체 글루타메이트가 촉매량으로 사용되고 아미노 공여체 아스파르테이트가 HMPB에 대하여 약 동몰량으로 사용되는 경우, 포스피노트리신은, GOT 활성을 갖는 트랜스아미나제 및 L-포스피노트리신 트랜스아미나제 활성을 갖는 트랜스아미나제가 사용되는 커플링된 효소 반응에서 사실상 정량적 수율로 그리고 천연 아미노산에 의한 어떤 오염도 없이 생성된다는 것이 밝혀졌다.
그러므로, 본 발명은, a) 적합한 트랜스아미나제 1의 존재하에서 아스파르테이트와 α-케토글루타레이트를 반응시켜 옥살아세테이트 및 글루타메이트를 수득한 후, b) 적합한 트랜스아미나제 2의 존재하에서 글루타메이트와 구조식(Ⅱ)의 4-(하이드록시메틸포스피닐)-2-옥소부티르산(HMPB)을 반응시켜 α-케토글루타메이트 및 L-포스피노트리신을 수득하는 단계를 포함하는 커플링된 효소 반응(여기서, 아스파르테이트 대 HMPB의 몰비는 0.5 내지 1.5 대 1, 바람직하게는 0.8 내지 1.2 대 1, 특히 동몰비이고, 글루타메이트 또는 α-케토글루타레이트는 촉매량으로 첨가한다)으로, 구조식(Ⅱ)의 HMPB로부터 구조식(Ⅰ)의 L-2-아미노-4-(하이드록시메틸포스피닐)부티르산(L-포스피노트리신)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
글루타메이트, 아스파르테이트 및 α-케토글루타레이트 또는 이의 상응하는 산은 구입될 수 있는 물질이다. HMPB는 유럽 특허 제30424호에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
트랜스아미나제 1은 트랜스아미나제 활성을 가지며 아미노 공여체로서 아스파르테이트의 존재하에 α-케토글루타레이트를 글루타메이트로 아미노기전이반응시킬 수 있는 특정 효소(소위 GOT 활성을 갖는 효소)이다. 피루베이트를 알라닌으로 아미노기전이반응시킬 수 없는 GOT(글루타메이트/옥살아세테이트 트랜스아미나제)를 사용하는 것이 바람직하며, 이 방법에서는 커플링된 반응의 목적하는 생성물인 L-포스피노트리신이 다른 천연 아미노산으로 오염되지 않는다. 예를 들어, 피루베이트는, 아스파르테이트의 아미노기전이반응 생성물인 옥살아세테이트의 탈카복실화에 의해 생성된다.
특히, 에스케리치아 콜라이(E. coli) 또는 바실러스(Bacillus)속의 세균으로부터 GOT 활성을 갖는 트랜스아미나제 및 피루베이트-특이적 활성을 가지지 않는 트랜스아미나제를 사용하는 것이 가능하다.
트랜스아미나제 2는 트랜스아미나제 활성을 가지며 아미노 공여체로서 글루타메이트의 존재하에서 HMPB를 L-포스피노트리신으로 아미노기전이반응시킬 수 있는 특정 효소이다. 이러한 유형의 효소는 유럽 특허 제249,188호에 기술되어 있다. 트랜스아미나제 1과 유사하게, 트랜스아미나제 2로서, 피루베이트를 알라닌으로 아미노기전이반응시킬 수 없는 트랜스아미나제를 사용하는 것이 바람직하다.
특히, 이.콜라이로부터의 L-포스피노트리신-특이적 트랜스아미나제는 피루베이트-특이적 활성을 갖지 않으므로 바람직하게 사용될 수 있다. 이.콜라이로부터 수득된 L-포스피노트리신-특이적 트랜스아미나제는, 예를 들어, A.Schulz (1990)의 방법에 의해 농축시킬 수 있다.
또한, 특수한 트랜스아미나제 활성을 갖는 전체 세포, 세포 추출물, 부분적으로 정제된 세포 추출물 또는 정제된 효소를 아미노기전이반응을 위해 사용하는 것은 원칙적으로 가능하다. 그러나, 보조반응이 더이상 일어나지 않을때까지, 특히 피루베이트의 알라닌으로의 아미노기전이반응이 일어나지 않을때까지, 정제된 효소를 사용하는 것이 유리하다.
2개중 적어도 하나의 효소를, 특히는 2개 모두를 고정화된 형태로 사용하는 것이 특히 유리하다.
트랜스아미나제의 고정화를 위한 가능한 방법은, 예를 들어, 문헌[참조: A.Schulz 등 (1990)]에 기술되어 있다.
아미노기전이반응은 일반적으로 생적합 완충액, 즉, pH가 6.5 내지 10, 바람직하게는 7.5 내지 9.0, 특히 7.5 내지 8.5의 범위를 유지하고 개개의 반응물과는 반응하지 않는 생적합 완층액중에서 수행된다. 인산염 또는 트리스 완충액을 선택하는 것이 바람직하며 특히 트리스 완충액이 바람직하다. 아스파르테이트 대 HMPB의 몰비는 0.5 내지 1.5 대 1, 바람직하게는 0.8 내지 1.2 대 1, 특히는 동몰량이다. 글루타메이트 또는 α-케토글루타레이트는 반응 혼합물에 촉매량으로 첨가된다. HMPB 대 글루타메이트 또는 α-케토글루타레이트의 비는 일반적으로 0.01 내지 1 대 1, 바람직하게는 0.01 내지 0.2 대 1, 특히 0.05 내지 0.2 대 1 이다. 일반적으로 반응 혼합물은 또한, 예를 들어, 농축시 1 내지 500㎛, 바람직하게는 5 내지 100㎛ 중에 소량의 보조인자 피리독살 포스페이트를 함유한다. 반응 온도는 일반적으로 약 20 내지 70℃, 바람직하게는 30 내지 40℃ 이다.
L-포스피노트리신의 수율을 증가시키기 위해, 글루타메이트/옥살아세테이트 트랜스아미나제 반응에서 생성된 옥살아세테이트를 다중적으로 하전된 금속이온의 존재하에서 탈카복실화시키는 것이 바람직하다[참조: 영국 특허원 제2 161 159호]. 적합한 다중으로 하전된 금속이온의 예는 영국 특허원에 기술된 모든 금속이온, 바람직하게는 Al3+, Mg2+, Mn2+, Fe2+또는 Fe3+이다. 상기 바람직한 양태에서 추가의 피루베이트-특이적 활성을 갖는 트랜스아미나제 또는 트랜스아미나제 분획을 사용하지 않는것이 또한 유리하다. 상기 기술된 반응 조건하에서 옥살아세테이트의 탈카복실화 반응에 의한 L-포스피노트리신의 수율의 증가는 완전히 기대되지 않는데, 왜냐하면, 영국 특허원 제2 161 159호에 따르면, 최고의 생성물 수율은 반응계내에서 유일한 아미노 공여체로서 아스파르테이트를 사용하는 경우에만 수득되기 때문이다.
아미노 공여체 아스파르테이트 및 글루타메이트의 사실상 완전한 소모로 사실상 천연 아미노산이 없는 생성물 L-포스피노트리신이 생성되며, 형성된 α-케토산인 α-케토 글루타레이트 및 옥살아세테이트 또는 피루베이트로부터의 L-포스피노트리신의 분리는 일 단계로 가능하다. α-케토 글루타레이트 또는 글루타메이트는 과량이 아니라 단지 매우 소량으로 첨가되고, 마찬가지로 아스파르테이트도 과량이 아니라 바람직하게는 HMPB에 관하여 동몰량으로 첨가되지만, 그럼에도 불구하고 HMPB의 L-포스피노트리신으로의 사실상 완전한 전환이 관찰된다. 이것은 결코 예측할 수 없었던 것이다.
L-포스피노트리신은 공지된 방법, 예를 들어, 메틸 이소부틸 케톤을 사용한 추출 또는 양이온 교환 크로마토그라피(예: Amberlite IR 120)에 의해 간단하게 정제될 수 있다.
수득된 L-포스피노트리신은 일반적으로 농업에서 제초제로서 사용된다. 하기 실시예는 어떤식으로든 본 발명을 제한하지 않으면서 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 하는 것이다.
[실시예 1]
에스케리치아 콜라이 K-12를 사용한 생물학적 전환(biotransformation)에 의한 L-포스피노트리신의 합성
이.콜라이 K-12를 LB 배지 (10g/l 트립톤, 5g/l 효모 추출물, 10g/l NaCl)중에 37℃에서 15시간 동안 배양시킨다. 세균 세포를 5000g에서 10분 동안 원심분리로 수거하고 인산염 완충액 (10mM 인산나트륨, pH=7.0, 10mM NaCl)중에서 2회 세척한 다음 하기 용액중에 100mg/ml의 농축물로 재현탁시킨다.
용액 1 :
NMPB : 글루탐산 : 아스파르트산 = 1 : 1 : 1
100mM HMPB
100mM 글루탐산
100mM 아스파르트산
50mM 트리스/HCl, pH=8.0.
용액 2 :
HMPB : 글루탐산 = 1 : 4
100mM HMPB
400mM 글루탐산
50mM 트리스/HCl, pH=8.0.
세포 현탁액을 37℃에서 반응 혼합물과 함께 배양시킨다. 반응 혼합물중의 L-포스피노트리신 함량은 합성 과정동안 여러 반응 시간대에서 아미노산 분석기로 측정한다. 표 1은 생물학적 전환 혼합물 모두를 위한 반응의 과정동안 L-포스피노트리신으로의 전환율(%)을 나타낸다.
L-PPT 수율은 4배 과량의 아미노 공여체 글루탐산(용액 2)을 사용한 경우 85%를 초과하지 않는 반면, 동몰량의 아미노 공여체 글루탐산 및 아스파르트산(용액 1)을 사용한 경우 거의 100%의 전환율을 달성할 수 있다.
[표 1 : 이.콜라이 K-12의 세포를 사용한 L-포스피노트리신 생성]
L-포스피노트리신(전환율%)
반응 혼합물
시 간(h) L-포스피노트리신:Glu:Asp=1:1:1 PPT:Glu=1:4
2 1 2
4 3 4
24 23 36
48 71 72
120 94 78
165 96 82
218 98 86
[실시예 2]
돼지로부터 글루타메이트/옥살아세테이트 트랜스아미나제의 정제
[실시예 3]
다양한 글루탐산 농도에서 이.콜라이로부터 정제된 L-포스피노트리신-특이적 트랜스아미나제 및 돼지로부터 정제된 GOT를 사용한 L-포스피노트리신의 합성
이.콜라이 K-12로부터 수득한 L-포스피노트리신-특이적 트랜스아미나제(PST)[참조: 유럽 특허원 제0 344 683호] 및 돼지심장으로부터 수득한 GOT(실시예 2 참조)를 인산염 완충액(20mM 인산 나트륨, pH=7.0, 0.1mM 피리독살 포스페이트, 1mM 2-케토글루타레이트, 5mM β-머캅토에탄올) 중에 1mg/ml의 농도로 용해시킨다. 그 다음에 2개의 효소를 각 경우에 1유니트의 활성 (PST의 경우에서는 1μmol의 L-포스피노트리신/분 및 GOT의 경우에서는 1μmol의 글루타메이트/분)에 상응하는 용적으로 혼합하고 하기 반응 용액과 함께 37℃에서 1시간동안 항온처리한다.
모든 반응 혼합물은 100mM HMPB, 100mM 아스파르트산, 50mM 트리스/HCl (pH=8.0)을 포함하고 가로 글루탐산을 실시예 1에서는 100mM, 실시예 2에서는 50mM, 실시예 3에서는 20mM, 실시예 4에서는 10mM, 실시예 5에서는 5mM 함유하고 실시예 6에서는 함유하지 않는다.
반응시간이 지난후 다양한 혼합물중의 L-포스피노트리신 함량을 아미노산 분석기(Biotronic LC 5001)로 측정한다. 이로부터 전환율(%)로 계산되는 L-포스피노트리신 합성율은 표 2에 기재되어 있다. 실험들은, 글루탐산 농도를 사용되는 HMPB 또는 아스파르테이트의 농도의 0.2배로 감소시키는 것이 L-포스피노트리신 합성율에 대해 거의 역효과를 초래하지 않으면서 가능하다는 것을 보여준다.
[표 2 : 다양한 글루타메이트 농도에서의 L-포스피노트리신 합성]
실험 반응 혼합물 L-PPT(전환%/시간)
1 HMPB:Glu:Asp=1:1:1 55.5
2 HMPB:Glu:Asp=1:0.5:1 48.5
3 HMPB:Glu:Asp=1:0.2:1 43.5
4 HMPB:Glu:Asp=1:0.1:1 30.6
5 HMPB:Glu:Asp=1:0.05:1 18.9
6 HMPB:Asp=1:1 3.0
[실시예 4]
다양한 효소비에서 정제된 PST (이.콜라이) 및 GOT(돼지)를 사용한 L-포스피노트리신의 합성
2개의 정제된 트랜스아미나제를 실시예 3에 기술된 바와 같이 100mM HMPB, 20mM 글루탐산, 100mM 아스파르트산 및 50mM 트리스/HCl (pH=8.0)로 구성된 반응 용액과 함께 37℃에서 항온처리한다. 2개 효소의 활성의 다양한 비를 상기 목적을 위해 사용한다.
1. 1유니트의 PST/10 유니트의 GOT
2. 1유니트의 PST/1 유니트의 GOT
3. 1유니트의 PST/0 유니트의 GOT
혼합물중의 L-포스피노트리신 함량은 합성 반응 과정동안 다양한 시간대에서 아미노산 분석기로 시험 샘플을 계측함으로써 측정한다.
이로부터 계산된 L-포스피노트리신 합성은 표 3에 나타나 있다. 최고의 전환은 효소비 PST:GOT=1:1(혼합물 2)로서 달성된다. GOT의 첨가없이 달성가능한 최대 PPT 전환율(혼합물 3)은 단지 약 20%인데, 왜냐하면, 이 경우에서는 아스파르트산이 아닌 글루탐산만이 L-포스피노트리신의 합성을 위해 사용될 수 있기 때문이다.
[표 3 : 다양한 효소비를 사용한 L-PPT 합성]
[실시예 5]
L-포스피노트리신 합성에 대한 염화망간의 효과
정제된 트랜스아미나제는 실시예 3에 기술된 바와 같이 1:1(각각 1유니트)비로 혼합하고 MnC12첨가없이 1mM MnCl2의 존재하에서 반응 용액(100mM HMPB, 20mM 글루탐산, 100mM 아스파르트산, 50mM 트리스/HCl, pH=8.0)으로 37℃에서 항온처리한다. L-포스피노트리신 합성 과정을 실시예 4에 기술된 바와 같이 측정하고 표 4에 요약한다. 염화망간의 첨가에 의해 반응율을 증가시키는 것은 명백하게 가능하다. 24시간의 반응후의 L-포스피노트리신 전환율은 염화망간을 첨가하지 않은 대조 혼합물에서의 전환율보다 약 10% 높다.
[표 4 : L-PPT 합성 반응에 대한 염화 망간의 효과]
[실시예 6]
PST 트랜스아미나제의 실리카겔상 고정화
50ml의 활성화된 실리카겔[문헌(참조: K. Mosbach, Methods in Enzymology, Vol. XLIV; Academic Press, New York, 1976, pages 139 and 140]에 기술한 바와 같이 실란화 및 글루타르알데하이드 활성화 됨)을 50ml의 PST 용액(이.콜라이로부터 정제한 PST 0.25M 인산칼륨 완충액중 pH8 중의 10mg 단백질/ml 용액)에 가하고 반응물을 3시간 동안 온화하게 교반시킨다.
이어서, 여전히 축축한 상태로 있는 촉매를 여과해내고 100m1의 0.25M 인산염 완충액(pH 8)으로 세척한다. 이러한 방법으로 제조한 생물학적 촉매는 후술되는 반응에 사용될 수 있다.
[실시예 7]
GOT트랜스아미나제의 실리카겔상 고정화
10ml의 GOT 용액(돼지로부터 정제한 GOT 8.4mg 단백질/10ml 용액)을 실시예 6에서 기술한 바와 같이 10ml의 실리카겔상에 고정화시킨다. 생물학적 촉매는 이러한 형태로 커플링된 아미노기전이반응에 사용될 수 있다.
[실시예 8]
고정화된 PST 및 고정화된 GOT를 사용한 커플링된 아미노기전이반응 180mg(1mmol)의 HMPB, 133mg(1mmol)의 L-아스파르트산, 29.4mg(0.2mmol)의 L-글루탐산, 10mg의 피리독살 포스페이트 및 0.6g의 트리스를 증류수에 용해시켜 5g의 용액을 만들고 pH를 8로 조절한다. 여기에 0.5ml의 고정화된 PST(실시예 6) 및 0.5ml의 고정화된 GOT(실시예 7)를 가하고 반응물을 pH 8, 26℃에서 48시간 동안 주의깊게 교반시킨다. 반응 혼합물을 아미노산 함량에 대하여 HPLC(아미노산 분석기)로 조사한다.
수율(HPLC) : L-PPT 0.122g(HMPB를 기준으로 68%)
L-아스파르트산 0.0l2g
L-글루탐산 0.028g
L-알라닌 0.025g
[실시예 9]
고정화된 PST 및 고정화된 GOT를 사용한 커플링된 아미노기전이반응
1g(5.6mmol)의 HMPB, 715mg(5.6mmol)의 L-아스파르트산, 163mg(1.1mmol)의 L-글루탐산 및 10mg의 피리독살 포스페이트를 증류수에 용해시켜 20g의 용액을 제조한 다음 KHCO3을 사용하여 pH를 8로 조절한다. 1ml의 고정화된 PST(실시예 6) 및 1ml의 GOT(실시예 7)를 첨가한 후에 반응물을 36℃에서 72시간 동안 온화하게 교반한다. 생성물 용액을 아미노산 함량에 대하여 HPLC(AAA)로 조사한다.
수율(HPLC) : L-PPT 0.58g (HMPB를 기준으로 58%)
L-아스파르트산 0.30g
L-글루탐산 0.16g
L-알라닌 0.02g
[실시예 10]
고정화된 PST 및 유리 GOT를 사용한 커플링된 아미노기전이반응
180mg(1mmol)의 HMPB, 147mg(1mmol)의 L-글루탐산, 133mg(1mmol)의 L-아스파르트산, 10mg의 피리독살 포스페이트 및 0.7g의 트리스를 증류수에 용해시켜 50g의 용액(pH 8)을 제조하고, 실시예 6의 용액으로부터의 0.5ml의 고정화된 PST 및 실시예 7에서 제조된 GOT 용액으로부터의 유리 GOT 42㎕를 가한다. 반응을 36℃에서 주의깊게 교반시켜 수행한다. 48시간후에 용액중의 아미노산 함량을 HPLC(AAA)로 조사한다.
수율(HPLC) : L-PPT 0.145g(HMPB를 기준으로 80%)
L-아스파르트산 0.024g
L-글루탐산 0.147g
L-알라닌 0.003g
[실시예 11]
고정화된 PST 및 고정화된 GOT를 사용한 커플링된 아미노기전이반응 반응을 실시예 10과 유사하게 수행한다. 0.5ml의 고정화된 GOT(실시예 6)를 유리 GOT에 대체하여 사용한다. 생성물 용액중의 아미노산 조성물은 실시예 10으로부터의 아미노산 조성물에 상응한다.
L-PPT 함량은 박층 크로마토그라피로 측정시 약 80%이다.
Claims (10)
- a) 적합한 트랜스아미나제 1의 존재하에서 아스파르테이트와 α-케토글루타레이트를 반응시켜 옥살아세테이트 및 글루타메이트를 수득하는 단계, 및 b) 적합한 트랜스아미나제 2의 존재 하에서 글루타메이트와 구조식(Ⅱ)의 4-(하이드록시메틸포스피닐)-2-옥소부티르산(HMPB)을 반응시켜 α-케토글루타메이트 및 L-포스피노트리신을 수득하는 단계를 포함하는 커플링된 효소 반응(여기서, 아스파르테이트 대 HMPB의 몰비는 0.5 내지 1.5 대 1, 바람직하게는 0.8 내지 1.2 대 1, 특히 동몰비이고, 글루타메이트 또는 α-케토글루타레이트는 촉매량으로 첨가된다)으로, 구조식(Ⅱ)의 HMPB로부터 구조식(Ⅰ)의 L-2-아미노-4-(하이드록시메틸포스피닐)부티르산 (L-포스피노트리신)을 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 글루타메이트 또는 α-케토글루타레이트가 HMPB에 대해 0.01 내지 1 대 1, 바람직하게는 0.01 내지 0.2 대 1, 특히 0.05 내지 0.2 대 1의 물비로 첨가되는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 트랜스아미나제 1이 글루타메이트/옥살아세테이트 트랜스아미나제 활성(GOT 활성)을 갖는 방법.
- 제3항에 있어서, GOT가 돼지, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coil) 또는 바실러스(Bacillus), 바람직하게는 에스케리치아 콜라이 또는 바실러스로부터 수득되는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 트랜스아미나제 2가 L-포스피노트리신 트랜스아미나제 활성을 갖는 방법.
- 제5항에 있어서, L-포스피노트리신-특이적 트랜스아미타제가 에스케리치아 콜라이로부터 수득되는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 옥살아세테이트가 다중 하전된 양이온, 바람직하게는 Al3+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, Fe2+또는 Fe3+의 존재하에서 피루베이트로 탈카복실화되는 방법.
- 제7항에 있어서, 트랜스아미나제 1 및 트랜스아미나제 2가 피루베이트를 알라닌으로 전환시키지 않는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 트랜스아미나제가 고정화된 형태로 존재하는 방법.
- 제9항에 있어서, 고정화된 트랜스아미나제가 칼럼 반응기내에 존재하는 방법.
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