JPS63500983A

JPS63500983A - 結合アミノトランスフェラ−ゼを用いたアミノ酸の合成

Info

Publication number: JPS63500983A
Application number: JP61505182A
Authority: JP
Inventors: ロッツェル，ジェイ・デービッド
Original assignee: ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド
Priority date: 1985-09-23
Filing date: 1986-09-22
Publication date: 1988-04-14
Also published as: WO1987001727A1; EP0239620A4; EP0239620A1; US4826766A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】結合アミノトランスフェラーゼを用いたアミノ酸の合成本発明はアミノ酸を、対応する２−ケト酸のアミノ酸転換により合成する方法に関するものである。本出願の随所に種々の出版物が引用されている。本発明に関連する技術の状況を十分に説明する為に、この出願に参考としてこれらの出版物の記述がそのままで含まれている。

発明の背景アミノ酸は、一般に動物飼料の添加物、人間の食物の栄養的な補足、点滴液の成分及び薬学や農芸化学品の製造の合成中間体として使用されている。Ｌ−グルタミン酸は、毎年、１０億ドル以上の世界的市場をもつ食物の風味強化剤として用いられている。Ｌ−リジンとメチオニンは、動物飼料にかなり多く含まれる添加剤で、また、Ｌ−）リブトファンとＬ−スレオニンも同じ様に使用できる。Ｌ− フェニルアラニンとＬ−アスパラキン酸は、甘味料の製造の大切な成分として非常に重要な市場性をもっている。点滴液は人間の食物において必須なアミノ酸類を必要とする。

アミノ酸の合成の為に開発された方法には、発酵、化学合成、タンパク質加水分解物からの抽出、及び酵素による生物的転化がある。化学合成は一般に、最初にラセミ混合物の合成を行い、次にこれを分割し、光学活性物を得るものである。

光学分割は、化学的にアミノ酸のジアステレオマー塩を分別結晶することによって、あるいは、Ｌ−アミノサイクラーゼを使って酵素的に行われる。不必要な異性体は、再びラセミ化してこの工程をリサイクルして必要な異性体は得ることができる。発酵法には、転化速度が遅いことや、精製コストが高いこと、及び非常に投資が大きいという問題点がある。タンパク加水分解物からの抽出法は、２，３の例に用いられるだけである。これは興味のあるアミノ酸が全タンパク質中では、比較的少ないからである。

酵素による転化は、主に投資が少ないこと、精製コストが低いこと、及び転化速度が大きいという利点がある。

以上述べてきた方法の１つには、所定の２−ケト酸を対応するし一アミノ酸にアミノ酸転化する方法が含まれている（米国特許第４，５１８，６９２号（１９８５年５月発行））。その工程において、Ｌ−アスパラギン酸と２−ケト酸はトランスアミナーゼの存在下で反応し、Ｌ−アミノ酸（グルタミン酸）とオキサル酢酸となり、オキサル酢酸は脱炭酸してピルビン酸をつくる。オキサル酢酸の本質的に不可逆的な脱炭酸反応により、全ての工程が終了すると対応する２−ケト酸から理論収率のほぼ約１００％の収率でＬ−アミノ酸が得られる。この反応は、Ｓｃｈｅｍｅ　Ｉに簡単：！：　定この方法では、本発明の実施に使われるトランスアミナーゼがアミノ基のドナーとしてＬ−アスパラギン酸を受け入れる必要性がある。生物的触媒工程で用いられる望ましい特徴と特異性とを兼ね備えたある種のトランスアミナーゼ類が存在するが、これらのトランスアミナーゼ類は、アミノ基のドナーとしてＬ−アスパラギン酸を用いることができない。本発明は、これまで述べてきた米国特許第４．５１８．６９２号の方法を改良したものである。つまりこの転化により、Ｌ− アスパラギン酸−他の多くのアミノ酸についても同様であるが−を使うという利点を利用する方法がでてくる。酵素を含むアミノ酸転化反応においてアミノ基のドナーとしてアミノ酸をほとんど用いないかあるい本発明は、必要とするα−アミノ酸Ａ　Ａ　ｄあるいはその誘導体を合成する方法に関するものである。その方法は、以下より成る。

（ａ）　最初のα−アミノ酸ＡＡ　と最初のα−ケト酸とのＨ２反応及び最初のα−アミノ酸ＡＡ　と２番目のα−ケＨ２ト酸ＫＡｐｒｏとの反応である。これらは、最初のトランスアミナーゼ酵素及び２番目のトランスアミナーゼ酵素の存在下で行われ、（１）α−アミノ酸ＡＡ、と（１１）３番目のα−ケト酸ＫＡｐ、。、を与える。

（ｂ）　他のケト酸、アミノ酸、酵素からＫＡ、、。、を除去する。

ここで、ＡＡ　とＫＡ　％ＡＡ　とＫＡｔ１ＡＡＮＨ２ｄ　ｐｒｅ　ｔとＫＡｐｒｏｄは、互いに交換可能である。最初のトランスアミナーゼは、反応（１）に触媒作用を及ぼすが反応（１１）には及ぼさない。また２番目のトランスアミナーゼは、（１１）に作用を示すが（１）には示さない。

（ｉ）　ＡＡ　＋ＫＡ　−＝ＡＡ　＋ＫＡＮＨ２ｔ　「　ｔ　ｐｒｏｄ（ｉｉ）　ＡＡ　＋ＫＡｐｒ８≠ＡＡ、　＋ＫＡ。

ＫＡｐｒｏｄは、全反応が完了する様に反応混合物から連続的に除かれる。好ましくはアミノ酸とケト酸が選択されると出発原料からのＡＡ、の回収は、通常の方法で都合よく効果的に行われる。もっと詳しくはＡＡ　とＡＡ　は、ＮＨ２を対応するアミノ酸の性質とはかなり異なったｐＫａの溶解性や他の物理化学的性質をもっており、残りのＡＡｔあるいはＡＡＮＨ２からＡＡｄの回収は、高収率で簡単に行われる。

発明の詳細な説明本発明は、希望するα−アミノ酸ＡＡ、あるいはその誘導体の合成工程を含むものである。この工程とは、最初のα−アミノ酸ＡＡ　（アミノ基のドナー）、最初のα−ケト酸Ｈ２ＫＡｏ及び第二のα−ケト酸ＫＡｐｒ８（アミノ基のアクセプター）が、２つのトランスアミナーゼ酵素の存在下で反応して目的とするα−アミノ酸をつくり、副生成物として第三のα−ケト酸ＫＡｐｒｏｄを与えるというものである。以下に更に詳しく議論するが、この方法には反応系、すなわち、他のケト酸、アミノ酸、酵素からＫＡ、、。、の除去もまた必要である。ＫＡｐｒｅ”Ｋ　Ａ　ｔ、　Ａ　Ａ　Ｎ　Ｈ２と２つのトランスアミナーゼは、本発明を個々に具体化するために選ばれるものであり、次のアミノ酸転化がおこる。

ＫＡ、　ＡＡｔＡＡ、　ＫＡ。

上記の反応（１）、（２）で示した様に、ＡＡ　とＫＡＮＨ２ｐｒｏｄゝＡＡ　とＫＡ、　、ＡＡｄとＫ　Ａ　ｐｒｅは、それぞれアミノ基転移により転化可能である。

以上のことを考慮すると、先述のアミノ酸を合成するアミノ酸転化法と比較して本発明の方法は、もう一つのケト酸（ＫＡｔ）やトランスアミナーゼ酵素を用いる必要があることは、米国特許第４．５１８．６９２号を見れば明らかであろう。

これらの特別な必要条件を十二分に満たす本方法は、トランスアミナーゼについて２倍の基質特異性、すなわち、アミノ基のドナーとアミノ基のアクセプターの両方に関しての特異性という点で優っている。トランスアミナーゼ酵素の基質特異性には、以前はこれをアミノ酸合成に用いるにはかなりの制限があった。例えば、その他の点で望ましい性質と特異性をもったあるトランスアミナーゼ類が、Ｌ−アスパラギン酸をアミノ基のドナーとして使えないということがわかっている。従って、この様なトランスアミナーゼ類は、米国特許第４．５１８．６９２号に記載の方法で用いるには適していない。先述の方法に較べて本発明の方法は、ケト酸ＫＡ　のアミノ酸転換により必要とすｐｒｅるアミノ酸を合成するものである。この方法では、ＫＡ　のｐｒｅアミノ酸転換を触媒するために必要とされる特異性と選択性をもったトランスアミナーゼを用いる。しかし、アミノ酸転化のアミノ基として簡単に入手でき、安価で望ましいアミノ酸を効果的に使うことはできない。この目的は本発明中で、２つのトランスアミナーゼ酵素を用いることにより達成されている。第一のトランスアミナーゼは、予め選択されたアミノ酸（アミノ基のドナー）から中間体のケト酸、ＫＡ、（アミノ基のアクセプター）までのアミノ基の移動を触媒することができる。

第一のトランスアミナーゼは、基質特異性がなく、意図するアミノ基のアクセプター、即ちＫＡ　のアミノ酸転化を直接ｒｅ触媒するが、第二のトランスアミナーゼ酵素は、アミノ基のドナーとしてＡＡｔを用いるＫ　Ａ　ｐｒｅのアミノ酸転化を触媒することができる。上述した様に、ＡＡｔは、ＫＡｔのアミノ酸転化の生成物である。つまり、この合成は、第一のトランスアミナーゼにより触媒される。先の反応（１）と（２）に関する２つのトランスアミナーゼの特異性を要約すると、第一のトランスアミナーゼは反応（１）を効果的に触媒し、反応（２）を触媒しない。

一方、第二のトランスアミナーゼは、（２）を触媒するが（１）を触媒しない。

「効果的な触媒作用」というこの申請の中で使われている言葉は、一つの反応を他方の反応よりも少なくとも２倍の速度定数にて触媒することを意味している。

例えば、反応（１）の第一のトランスアミナーゼの速度定数は、少なくとも反応（２）のこの酵素の速度定数の約１０倍である。メカニズム的にこの関係は、次の事実からおこるものである。第一のトランスアミナーゼは、アミノ基のドナーとしてＡＡ　を用いるこＨ２とができるが、アミノ基のアクセプターとしてＫＡ　を用いｐｒｅることはできない。一方、第二のトランスアミナーゼは、アクセプターとしてＫＡ　を使うことができるが、ドナーとしてｐｒｅＡＡＮＨ２を使うことができない。

上述の反応経路において、ＡＡ　のアミノ基は、ＫＡｔＨ２に移動し、ＡＡｔをつくる。代わってアミノ基がＫＡｐｒ８に移動じ請求めるα −アミノ酸ＡＡｄを得る。この様にして適当なケト酸の前駆体ＫＡ　を選ぶことにより請求めるα−アミノｒｅ酸Ａ　Ａ　ｄがつくられる。

これらの反応の組み合わせた性質は、下に、模式的に示す。

上の図で示した様にＫＡ　のＡＡｄへのアミノ酸転換もまｒｅたＫＡ　をつくる。ＫＡ、とＡＡｔの循環的な変換は、最後のアミノ基のドナーＡＡ　から最後のアミノ基のアクセブＨ２ターＫＡｐｒ８へのアミノ基の移動に役立っている。この移動機能は“ＡＡ　” 及び“ＫＡｔ”という語の“ｔ”という文字で表わされる。上述したＫＡｔとＡＡｔの循環的変換からみて、ＫＡ　は、２つのトランスアミナーゼの存在下、ＡＡＮＨ２゜ＡＡｔ、ＫＡ、、８と反応することにより、間接的に反応混合物に加えられることがわかる。対応するアミノ酸ＡＡｔを経て、ＫＡｔを間接的に供給するのは次の様な場合におこりやすい。

つまり、アミノ酸が対応するケト酸よりも安価で、より簡単に入手できる場合である。他の２−ケト酸ＫＡｐｒＯｄがＡ　Ａ　ａとの結合反応の副生成物として生成してくることは、注意を払うべきである。

適当なトランスアミナーゼ類を選ぶことにより、Ｄ−アミノ酸あるいはＬ−アミノ酸は、本発明の方法により、特異的に合成されるだろうＯ例えば、Ｄ−アミノ酸が必要であれば、Ｄ−アミノ酸に特異的なり一トランスアミナーゼ類を特徴的に用いる。多くのＤ−）ランスアミナーゼ類が単離されており、Ｄ−アミノ酸の合成を触媒する。次を参照のこと。バイオケミカルアンド　バイオスイズカル　リサーチ　コミユニケイジョン（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｌｃａｔｉｏｎｓ）１１２２　：　４８５−４９１　（１９８４）、ヨナハ（Ｙｏｎａｈａ、　Ｋ、）等のアミノアシッド、ヌクレ、アシッド（Ａｍｉｎｏ　Ａｃ１ｄ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ）（日本）。

３２　：　３４−３５　（１９７５）、ソッパー（Ｓｏｐｅｒ、　Ｔ、　Ｓ、）とマニング（Ｍａｎｎｉｎｇ、　Ｊ、　Ｍ、）のジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリイ（Ｊ、　Ｂｌｏｔ、　ＣｈｅＩｌｌ、）　２５２　：　１５７１−１５７５　（１９７８）、これらを参照として記しておく。結果として一つのＤ−アミノ酸をつくるこれらのトランスアミナーゼ類や他のトランスアミナーゼ類は、ここで述べた工程で簡単に使える。

この結合アミノ酸転化技術の利点は以下の通りである。

１、求める光学的に純粋なり一及びＬ−アミノ酸は、特異的に合成される。不必要な光学異性体は合成されず光学分割は不必要である。

２．２−ケト酸の前駆体は、化学的合成から便利に入手されるか、または簡単に手に入る対応するアミノ酸から連続的に合成される。

３、反応速度は、比較的速い。

４、資本金は、発酵工程よりも安い。

５、この技術は、幅広い選択性をもったトランスアミナーゼ類が知られているので、一般的である。例えば、芳香族アミノ酸トランスアミナーゼ類、枝分かれ鎖をもつアミノ酸トランスアミナーゼ類、酸性側鎖をもつアミノ酸に特異的なトランスアミナーゼ類など。この様なトランスアミナーゼ類は例えば、次の微生物からつくられる。ニジエリシア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｌａ　ｃｏｌｔ）、バチルス　サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、バチルス　ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｌ　ｌ　１ｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｐｈｌ　１ｕｓ）、アクロモバクターコウリデイウス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｅｕｒｙｄｉｃｅ）　、クレブシエデドモナス　プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）などである。

本発明を実際に行うに当たって役立つトランスアミナーゼ類は、次に記載されているものもある。ランバーガー（）１．　Ｅ、　Ｕｍｂａｒｇｅｒ）によるアンヌユル　レビュウ　オブ　バイオケミストリイ（Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、　４７巻、５３３−６０６頁（１９７８）とアミノ　アシッド（Ａｍｉｎｏ　Ａｃ１ｄｓ）。ヘルマン（に、　Ｍ、　Ｈｅｒｒｍａｎｎ）とサマービル（Ｒ，Ｌ、　Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ）によるバイオスイン　セシス　アンド　ジェネティック　レギュレイション（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｌｃ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）。

ノーメンクラチャア（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）、　２２０− ２３０頁（Ａｃａｄｅａ＋１ｃＰｒｅｓｓ、　１９８４）に記載されているものもある。

６、求めるアミノ酸は、たとえトランスアミナーゼ酵素がアミノドナーをほとんどあるいは全く使えないとしても対応するケト酸、簡単に手に入るアミノドナー及び適当なトランスアミナーゼを用いて合成することができる。

この様な酵素を用いる方法の１つの最大の欠点は、記載の反応の各々のアミノ酸転化の平衡定数が約１．０であるということである。結果として、この反応でのめるアミノ酸ＡＡｄの収率は用いるＡＡ　量から考えると、決して５％をこえるこＨ２とはない。

不完全転化の問題は、生成したＫＡｐｒｏｄを他のケト酸やアミノ酸や酵素から除去することにより本発明では解決できる。例を示すと、ＫＡｐｒｏｄは酵素作用により、例えば次の様な方法により、連続的に減少していく。マクリイアレアスーキリアコス（Ｍａｋｒｙａｌｅａｓ−Ｋｙｒｌａｋｏｓ）等のケム、イング、チク（Ｃｈｅａｐ、　ｌｏｇ。

（１９８１）号、バックマン（Ｂｕｃｋｍａｎ）等の米国特許第４，３０４．８５８号（１９８５）などである。あるいは’　ＫＡｐｒｏｄは、種々の酵素系、水素ガス及び窒素源即ち、アンモニウム塩、有機アンモニウム塩、水酸化アンモニウム、アンモニウム塩、尿素の存在下で、連続的に減少する。米国特許第３．１８３．１７０号を参照のこと。この様な方法によりＫＡ　は、ＡＡ　に転化されるという意味−ｐｒｏｄ　ＮＨ２で、その反応系から除去される。あるいは、ＫＡ、ｒｏｄは、これが合成されると対応するα−ハイドロキシカルボン酸を与えるので、ＫＡｐｒＯｄが連続的に減少する。これは、バックマン（Ｂｕｃｋｍａｎ）等の米国特許第４．３２６．０３１号（１９８５）の方法によるものである。しかし、むしろ、ＫＡｐｒｏｄが２−ケトカルボン酸となる場合に、ＫＡｐ、。ｄは脱炭酸反応により反応系から除かれる。

脱炭酸反応は、基本的に特別な反応条件下では、不可逆である。

例えば、ＡＡ　がＬ−アスパラギン酸とするとＫＡｐｒｏｄすＨ２なわちオキサロ酢酸は、基本的に不可逆的に脱炭酸されてピルビン酸となる。

アラニンがアミノ基のドナー、ＡＡ　として用いられるＨ２アセトアルデヒドとなる。この反応は、シアナイド、チアミン、チアミンピロフォスフエイトの様な化合物によって触媒されるか、あるいは、酵素パイルベイトデカルボキシラーゼにより触媒される。（Ｅ、　Ｃ，４，１，１，１）ウタア（ｔｌｔｔｅｒ）、　Ｍ、　Ｆ、ザ・エンザイムズ（Ｔｈｅ　ＥｎｚｙＩＩｌｅｓ）、　５　：　３２０　（１９８１）。

同様にして、グルタミン酸をアミノ基のドナーＡＡ　とＨ２して用いると、副生成物の２−ケトグルタレイトは、脱炭酸されてスクシニック　セミアルデヒドとなる。再び、この反応は、化学的あるいは酵素的に触媒される。酵素は、パイルベイトに加えて２−ケトグルタレイトを脱炭酸する小麦の胚（パイルベイト脱炭酸酵素）　（Ｅ、　Ｃ，４，１，１，１）から得られる。シンサー（Ｓｉｎｃｅｒ）、　Ｔ、　Ｒ，とペンスキー（Ｐｅｎｓｋｙ）、　Ｊ、のジャーナ１９６　：　３７５　（１９５２）を参照のこと。

ＫＡｐｒｏｄを不可逆的に除去してこれを結合アミノ酸転換反応に連結させることによって、ＫＡ　のアミノ酸転化は、以下ρｒｅに示す様にして完了する。

ＫＡｐ、。θ脱炭酸は、この技術で知られている方法で起こる。

例えば、ＡＡ　がアスパラギン酸である場合、オキサロ酢Ｈ２酸の脱炭酸は、色々な金属イオンやアミンや酸を用いて、熱化学的に触媒されるか、又は、これらの方法を適当に組み合わせて、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（ＯＡＤ）　Ｅ、　Ｃ，４，１，１，３により触媒される。どんなソースから得られるオキサロ酢酸脱炭酸酵素でも使用することができる。本発明を実際行うにあたり役立つオキサロ酢酸脱炭酸酵素のソースの例をあげると、ミクロコカス　リソディクチカスＣＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉｙｓｏｄｉｋｔｉｃｕｓ）から改名したミクロコ　カス　ルテアス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　１ｕｔｅｕｓ）。

エンザイモロジイ（Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　１−７５３−７　（１９５５）の方法が７、・マ開示されている。さらにチナ争トモナス　プチダ（Ｐｓｅｕｄｏ［ｏｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）　、バイオケミ力　エト　バイオフィズカ　アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）　８９　：　３８１−３　（１９８４）及びアゾトバクタ−ビネランデイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｌ）　、ジャーナ、ル拳オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｆｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）１８０　：　１３　（１９４９）を参照されたい。これらの文献は本明細書のしてみとめられていないオキサロ酢酸脱炭酸酵素活性をもつ他の酵素、例えば、ピルベートキナーゼ、マリツク酵素などが用いられる。オキサロ酢酸脱炭酸酵素の活性は、マンガンイオン、カドミウムイオン、コバルトイオンは、ニッケルイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、カルシウムイオンの様な金属イオンを加えることにより発現する。

ＫＡｐｒｏｄを除く為に、特別な酵素的方法又は他の方法を選択する場合の１つの制限は、その方法がＫＡｔ　：ＡＡｔの転化あるいはＫＡｔ：ＡＡｔの転化あるいはＡＡｄの集積妨害してはいけないということである。よって、ＡＡ　がＬ −アスパＨ２ラギン酸である場合、脱炭酸酵素は、ＫＡｔ又はＫ　Ａ　ｐｒｅをほとんど脱炭酸しないだけの、オキサロ酢酸に対する特異性をもっていなければならない。

ＫＡｐ、。、の脱炭酸では、下図に示す様に、連続的にＫＡｐｒ。

を与える。

例えば、アミノドナー（ＡＡ　）としてアスパラギン酸Ｈ２を用いて、アラニンを合成する場合、ＫＡｐ、。ｄ（オキサロ酢酸）は、脱炭酸してパイルベイトを与える。これは、また請求めるアラニンに対応するＫ　Ａ　、、ｅでもある。

他の多数の例がこの開示の利益をもつ本技術において熟練した技術者により認められる。この発表というのは請求めるアミノ酸が、最後のアミノドナーＡＡ　から直接あるいは間接Ｈ２的に誘導されるＫＡ、、８のアミノ酸転化により合成されるというものである。

これらの例においてＫＡｐｒ８は、ＫＡｐｒｏｄの脱炭酸により間接的に合成される。従って、反応混合物に独立して加える必要はない。よって、上述の例で、ＫＡ　すなわちｐｒｅピルビン酸は、連続して合成され、反応混合物に単独で加える必要はない。

本発明の方法は、適当な２−ケト酸前駆体の選択により、また、ＡＡ　からではなくＡＡ、からアミノ基をケト酸前駆Ｈ２体へ酵素によって転移可能なことより、多種のＤ−アミノ酸あるいはＬ−アミノ酸を合成し、この回収に利用できる。その工程ハ１４Ｃ，１３ｔ、２Ｈ，３Ｈ，１７ｏ、　１８０．１５Ｎノ様な１つあるいはそれ以上の安定な放射性同位体を含むアミノ酸合成に、適当に同位体標識したＫＡ　ＡＡ　、水を用いて簡単ｐｒｅ’　ＮＨ２に適用される。

本発明の例をさらにあげると、Ｌ−バリンは２−ケトイソペンタノツクアシッドとＬ−アスパラギン酸とＬ−グルタミン酸から高収率で得られる。ニジエリシア　コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）がら単離された技分かれ鎖をもつトランスアミナーゼ、エシエリシアゾトバクター　ビネランディ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）あるいはミクロコカス　ルテアス（Ｍｌｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉｕｔｅｕｓ）から単離されたオキサロ酢酸デカルボキシラーゼを用いることによって得られる。同様に、これらの同じ酵素を用いて、２−ケトイソカプロイックアシッドは、Ｌ−ロイシンに転化され、２−ケト−３−メチルペンタノツクアシッドは、Ｌ−イソロイシンに変換される。色々な特異性をもったトランスアミナーゼ類を用いることにより、フェニルピルビン酸は、Ｌ−フェニルアラニンに、３−ハイドロキンピルベートはＬ−セリンに、３−インドリルピルベートはＬ −トリプトファンに、２−ケトアゾビックアシッドはＬ−２−アミノアゾピックアシッドに、２−ケト−３−メルカプトプロピオニックアシッドはＬ−システィンに、グリオキシリックアシッドはグリシンと２−オキソ−４−チオメチルブタノツクアシッドあるいはＬ−メチオニンにアミノ酸転化される。

アミノ酸ＡＡ　、ＡＡ、、ＡＡ、のＲ基と対応するケトＨ２酸ＫＡ　ＫＡ　ＫＡ　のＲ基は、幅広い置換基から選ｐｒｏｄ’　ｔ　’　ｐｒｅぶことができる。これらの置換基は、例えば水素、置換あるいは置換されていない低級アルキル、置換あるいは無置換の低級エチル、ヘテロサイクリック基である。

ここで用いられている低級アルキルという言葉は、１から約１０までの原子をもつ直鎖アルキル基と枝分かれ鎖のアルキル基の両方を意味する。置換低級アルキル基は、ハイドロキシ、アルコキシ、メルカプト、カルバモイル、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、アミノ、アミジノ　Ｒ／　−チオ（Ｒ’　は低級アれらの基は非天然アミノ酸と同様に天然で生成するアミノ酸に含まれる。

ジル、フェニルエチル、フェニルプロピルや他の同質の基を意味する。置換低級アｌ亦基は上述の低級アルカリと同じ基で置換されたフェニル、ベンジル、フェニルエチル、フェニルプロピルや他の同質の基である。

ここで用いられるヘテロサイクリック基は、４−イミダゾイルメチル、３−インドリルメチルや同質の基や他の同じへテロサイクリック基を意味する。

ある場合には、Ｋ　Ａ　ｐｒｏθ除去の際に生成する副生成物は、営利的に価値のあるものであり、先述の技術の方法、酸性化や蒸留やイオン交換や溶媒抽出などによって、生成物から回収される。ＫＡｐ、。、がオキサロ酢酸である場合、脱炭酸によりピルビン酸も与える。

本発明の酵素反応は、約４℃から約８０℃の範囲で行われる。

約２０℃から約６５℃の範囲が最も好ましい。反応の最適ｐｌは、約、２．０から約１２．０の範囲であるが、約４．０から約９．５までが最も好ましい。低分子のピリドキサールリン酸は、トランスアミナーゼのコファクターとしてむしろ用いられ、約０．０１ミリモラーから約１．０ミリモラーの濃度で加えられる。

本発明で用いられる酵素は、一部精製された酵素あるいは完全に精製された酵素として、そのままの細胞すなわち、未精製の細胞の状態で反応混合物に加えられる。重量当たりの変換速度あるいは酵素の変換速度が速いので、なるべく、精製又は一部精製された酵素が固定化状態で又は溶液で用いられる。酵素は技術の熟練した人によく知られているテクニックによって精製される。ミクロコカス　ルテアス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉｕｔｅｕｓ）とプソイドモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）からのオキサロ酢酸デカルボキシラーゼの精製例は、バーバード（Ｈｅｒｂｅｒｔ）のメリーズ　インエンザイモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　１．７５３−５７頁（１９５５）とモルトン（Ｍｏｒｔｏｏ）等のバイオケミ力　エト　バイオフィズカ　アクタ（ＢｉｏｃｈｅｒＡ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、）　８９．３８１ −８３頁（１９６４）がある。

本発明を実際行う場合に用いられる固定化方法は、ポリメリックゲル、共有的付着、交差結合、吸着作用及びカプセルにつめることである。これらの方法については、Ａ、　Ｍ、クリバッフ（Ｋｌｉｈａｎｏｖ）のサイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２１９　：　７２２−７２７　（１９８３）とメリーズ　イン　エンザイモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）４４　（Ｋ、　Ｍｏ５ｂａｃｈ　モスバッハ）の参照がある。固定化酵素系に関する１例は、ライ− タル（Ｗｅｅｔａｌ　ｌ）等のメリーズ　インエンザイモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　３４．５９−７２頁（１９７４）の参照がある。ライ−タル（Ｗｅｅｔａｌｌ）等はゲルタールアルデヒド活性制御細孔ガラス粒子で酵素を固定化する方法を発表している。

この方法に関して、トランスアミナーゼは活性ガラス粒子と酵素とが０″から５ ℃で２時間、ｐＨ７，０のリン酸緩衝液中で反応することによりそのガラス粒子に結合する。この結合酵素は、直接又は最初に１％炭酸水素ナトリウムと反応してその酵素と活性ガラスの共有結合を安定化させる。

もう１つの具体例では、アルミナとシリカの粒子は、最初にポリエチレンイミンで飽和され、ゲルタールアルデヒドで活性化される。その酵素は、共有結合で、活性支持体に結合する。

本発明を実践するにあたり酵素を安定化させる他の適当な基質には、細孔セラミック、細孔シリカ、ベントナイト、ダイアトマセアス上類、セファロース、セルロースとセルロースの誘導体、ポリアクリルアミド、ポリアゼチデン、カラゲーナン、クロモシーブなどがある。もし必要ならこれらの基質はこの技術でよく知られているテクニックによって活性化される。

反応系からＫＡｐｒｏｄを除くために用いられる酵素も同様に処理される。例えば、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼは、分離して固定化されるか、あるいは、トランスアミナーゼと固定化混合物が最初に混合される。この様な方法により、酵素が共有的に付着したその表面の細孔シリカ粒子は、次のものを含む溶液中で漂っている。この溶液の組成は、１００　ＩｅＭの２−ケトグルタレイト、１００　ｍＭのＬ−アスパラギン酸、２００１Ｈのし一グルタミン酸、０．１畦のピリドキサールリン酸、１１０ｆｆ１のＭｇＣｇ２、又はＭｎＳＯ４でｐＨを４．０から１０，０の範囲、最適な範囲は５．５から、この溶液を固定化酵素からろ過し、生成したバリンとピルビン酸は、決まった方法で単離され、精製される。

反応は、固定化酵素をつめると連続的に進行し、バイオリアクターを与える。この様なバイオリアクターの多くの形状がこの技術でわかる。例えば、固定化Ｅ、　ｃｏｌｔアスパラギン酸と枝分かれ鎖のトランスアミナーゼ類を含む細孔シリカ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）　２グラムをｌＸ１０ｃｍのカラムにつめ、２−ケトグルタレイト（１００ａ＋Ｍ）　、Ｌ−アスパラギン酸（ｌｏｏ＋ｎＭ）　、Ｌ−グルタミン酸（２００ｍＭ）　、ピリドキサールリン酸（０，１ｍＭ）から成る溶液をペリスタポンプでカラムを引張りながら流す。カラムの溶出を分析すると、反応生成物はＬ−バリンとピルビン酸であった。

もし、必要ならし一アミノ酸の合成をモニターすることができる。例えば、一般的分析法は、２−ケト酸の前駆体を無視してアミノドナーとしてアスパラギン酸を用いるあらゆるアミノ酸転化の分析に応用でき、その内容は次の様なものである。Ｌ−アスパラギン酸、２−ケト酸、トランスアミナーゼ、ＮＡＤＨ，及びマリツク　デヒドロゲナーゼ（市販）は、ｐＨ６，０から９．０のリン酸緩衝液に溶解する。そして時間の経過で３４０　ｎｍでの吸収変化を測定する。

別の方法としてＬ−フェニルアラニンへのフェニルプルベイトの転化は、次の様にしてアッセイできる。例えば、トランスアミナーゼ、フェニルプルベイト、Ｌ −アスパルテイト、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ及び金属イオンを含む反応混合物から一部を取出し、これらを２．５％水酸化ナトリウム溶液に入れて希釈し３２０　ｎｍでの吸収を測定する。水酸化ナトリウム溶液で希釈すると、フェニルプルベイトのケト、エノール型の平衡が迅速に起こる。平衡混合物の３２０　ｎａ＋での消失係数は、１７５００ｙ１−１　ｃｍ−１である。従って、フェニルビルベイトのし一フェニルアラニンへの転化は、迅速に定量できる。このアッセイは、ベーパークロマトグラフィーによるし一フェニルアラニンの定性的測定とアミノ酸アナライザーによる定量的測定によって確実になる。

他の２−ケト酸を対応するＤ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸への変換をアッセイするために同じ様な技術が用いられる。ｐ−ヒドロキシ−フェニル−パイルベイトのＬ−チロシンへのアミノ酸転換は、反応混合物から除去されたものを２．５％水酸化ナトリウム溶液で希釈して、３３１止での吸収（消失係数１９９００Ｍ　 −’　ｃ＋ｎ−’　）を測定することによりモニターできる。また、インドール −３−バイルベイトのＬ−）リブトファンへの変換も同様であり、３２８　ｎｍでの吸収（消失係数Ｌ　００００　Ｍ　−’　ｃｍ　−’　）を測定する。

本発明は、以下の実施例でさらに説明される。これらの実施例はここでは説明のためのみに記載されているもので、本発明の範囲を制限しているという意味ではない。

Ｌ−アスパラギン酸（２０ｍＭ）　、２−ケトグルタレイト（５ｍＭ）　、Ｌｅｅ　５ｃｉｅｎｔ１ｆｉｃ　Ｓｔ、　Ｌｏｕｌｓ　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ　（１００ユニツト）から購入した豚の心臓から得たグルタミックーオキサロアセテックトランスアミナーゼ（１００ユニツト）、プソイドモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏａ＋ｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）ＡＴＣＣ９５０（１００ユニツト）から単離したオキサロ酢酸デカルボキシラーゼ、Ｍｇ　ＣＤ　２　（１０ａ＋Ｍ）、ピリドキサールリン酸（０，２１℃Ｍ）　、ホウ酸ナトリウム（１０＋＋＋Ｍ）を含む溶液から５ｍＭをとり、これをロータリーシェーカーで２５℃、１２時間インキュベートした。最後にこの反応は、アミノ酸分析（Ｂｅｃｌｖａｎ　Ｍｏｄｅｌ　６３００）により全てのアミノ酸について分析された。

この反応混合物は、１ｇ、ｈＭのＬ−アラニンと１　、１ｍＭのＬ−グルタミン酸を単独のアミノ酸として含んでいた。Ｌ−アスパラギン酸は検出されなかった。Ｌ−アスパラギン酸からのＬ−アラニンの質量収率は、９５％であった。

実施例　２　Ｌ−アラニンの製造Ｌ−アスパラギン酸の濃度が４２０　ｓＭで２−ケトグルタレイトの濃度が１７ａ＋Ｍであるということを除いて、酵素反応は、実施例１と同じ条件で行った。

アミノ酸分析による生成物の分析では、Ｌ−アスパラギン酸が完全に変換してＬ −アラニンとＬ−グルタミン酸を合成することがわかった。

実施例３　Ｌ−アラニンの別途合成Ｌ−アスパラギン酸（１００ｍＭ）　、２−ケトグルタレイト（５ｍＭ）、ピリドキサールリン酸（０，４社）　、ＭｇＣＮ　２　（１０ｍＭ）　、ＧＯＴ（４，２−Ｌ−ケト；　Ｌｅｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　、ＧＰＴ　（４，２ユニツト）　、０ＡＤ（４，２Ｌニット；Ｐ、　Ｐｕｔｉｄａ）、ソデウム　ボレイト（５０ｍＭ）を含む５ｍｌ溶液を最初にｐＨ７，０にして、２４℃で１２時間、インキュベーションを行った。アミノ酸分析により、先述の実施例と同様にＬ −アスパラギン酸が完全に変換した。Ｌ−アラニンとＬ−グルタミン酸は、それぞれ９５．６ａ＋Ｍと４．４ｍＭの濃度で単独に存在した。

実施例　４　固定化酵素を用いたし一アラニンの製造ダルタミックーオキサロアセティックトランスアミナーゼ（ＧＯＴ　；　Ｌｅｅ　５ｃｆｅｎｔｉｆ１ｃ）は、ライ−タル（Ｗｅｅｔａｌ　１）により説明されたトリエトキシ−３−アミノプロピルシランで活性化した細孔ガラス（Ｐｌｅｒｃｅ）に固定した。固定化パラメターのサンプル一式は、以下の内容である。１．０ｇアミノプロピルガラス、真空凍結乾燥されたＧＯＴ　１８．２ユニット／ｍｇ、　１００　ｍｇエチルジメチルアミノブロビルカルボジイシド、２０ｍＭ　２−ケトグルタレイト、０．５１ピリドキサールリン酸、１０ＩＩ＋Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ７，２である。グルタミツクーピルベイトトランスアミナーゼ（ＧＰＴ　；　Ｌｅｅ　５ｃｆｅｎｔ１ｆ１ｃ）　、即ちタンパク１＋ｇ中４．９ユニットは、同じ方法で固定化された。オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（Ｐ、　Ｐｕｔｌｄａ）は、１０ｍＭホウ酸ナト酸中トリウム中ＭＭｇ　Ｃｆｌ　２の存在下、ｐＨ８，０でＣＮＢｒ活性化セファ０−ス（Ｐｈａｒｍａｃｌａ）に固定化した。Ｌ−アスパラギン酸（１０軸Ｍ）　、２−ケトグルタレイ）　（５ｍＭ）　、塩化マグネシウム（１ｈＭ）ホウ酸ナトリウム（２０軸Ｍ）　、ピリドキサールリン酸（０，４ａ＋Ｍ）を含むｐＨ７，２の溶液は、ＧＯＴ、　ＯＡＤ、あるいはＧＰＴの固定化酵素を各々１．Ｏｇずつ含む３つの小カラムを使って流した。このフラクションのアミノ酸分析によりＬ−アラニンの収率は、Ｌ−アスパラギン酸から９４％であった。

実施例　５　ニジエリチア、コリから得られた枝分かれ鎖をもつトランスアミナーゼの固定化Ｅ、　ｃｏｉｌ枝分かれ鎖のトランスアミナーゼ１００　ｔｎｇは、ピリドキサールリン酸（０，２ｉＭ）を含む５ｈＭカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）の５０ｍ１に溶解した。アミノプロピルシリカ（ライ−タル（νｅｅｔ　ａｕ）によって説明された方法で調製されたもので、２．０　ｇ）を加えて、次にエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミドハイドロクロライド（ＬＯＯｍｇ）を加えた。

この反応は、２２℃、１時間行った。そのシリカは０．５ｍＭ塩化ナトリウムを含む２００ａ＋Ｍカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）の２００ｍ１で洗浄し、次に０．２ｍＭピリドキサールリン酸（ｐＨ０，７）を含む５０ｍＭリン酸カリウム２００　ｍｌで洗浄した。固定化された酸素は、室温で、次回の使用に保存した。

Ｋ　Ａ　ｐｒｏｅ脱炭酸によって効率よく反応が完了することを説明するために、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼを２つの反応の一方のみに加えて、２つの同一の反応を行った。１つの反応は、Ｌ−アスパラギン酸（１００ｍＭ）　、Ｌ− グルタミン酸（２０１ＯＭ）、２−ケトイソペンタノイックアシッド（１００ｍＭ）　、ピリドキサールリン酸（０，２ｍＭ）　、塩化マグネシウム（１０ｍＭ）、ニジエリチアコリ（Ｅ、　ｃｏｉｌ）から得られたアスパルテイトトランスアミナーゼ（５ユニツト）、ニジエリチア　コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）から得られた枝分かれ鎖をもつトランスアミナーゼ（５ユニツト）、プソイドモナス　プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）から得られたオキサロ酢酸デカルボキシラーゼを含むｐＨ７，５の５ｍｌ溶液を用いた。

オキサロ酢酸デカルボキシラーゼを含まないもう一方の反応も平行して行った。

この反応は、各々の場合に合成されたオキサロ酢酸とパイルベイトの量を定量することによってモニターした。定量は、メリーズ　オブ　エンザイマティック　アナリシス（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）に説明されている酵素法によって行った。

実施例　７　Ｌ−ロイシンの製造Ｌ−アスパラギン酸（１０軸Ｍ）、Ｌ−グルタミン酸（２ｈＭ）、２−ケトイソカプロイック　アシッド（ｌｏＯｍＭ）　、ピリドキサールリン酸（０，２ａ＋Ｍ）　、塩化マグネシウム（１０ｍＭ）　、ニジエリチアコリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）から得られたアスパルテイト　トランスアミナーゼ（５０ユニツト）、ニジエリチア　コリ（Ｅ、　ｅｏｌｉ）から得られた枝分れ鎖をもつトランスアミナーゼ（５０ユニツト）、プソイドモナス　プチダ（Ｐｓｅｕｄｏ　５ｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）力〜ら得られたオキサロ酢酸デカルボキシラーゼを含み、水酸化ナトリウムでｐＨ７，５に調整したＬＯｍ！溶液を２５℃、３時間インキュベートした。

この反応の最後に、上記で述べた方法とまた、アミノ酸分析により、全オキサロ酢酸とパイルベイトについて、この反応混合物を分析した。２−ケトイソカプロエイトからのロイシンの収率は８５％であった。

実施例　８　イソロイシンの製造Ｌ−アスパラギン酸（１００ｍＭ）　、Ｌ−グルタミン酸（２０ｍＭ）、２−ケト−３−メチルペンタノイックアシッド（１００ｍＭ）　、ピリドキサールリン酸（０，２ｍＭ）　、塩化マグネシウム（１０ｍＭ）、ニジエリシア　コ１バＥ、　ｃｏｌｌ）から得られたアスパルテイト　トランスアミナーゼ（５０ユニツト）、ニジエリシア　コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）から得られた枝分かれ鎖をもつトランスアミナーゼ（５０ユニツト）、プソイドモナス　プチダ（Ｐｓｅｕｄｏａ＋ｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）から得られたオキサロ酢酸デカルボキシラーゼを含み、水酸化ナトリウムでｐＨ７，５に調整した溶液１０ｍ１を２５℃、３時間インキュベートした。反応の最後に、上記の方法で全オキサロ酢酸とパイルベイトについて、反応混合物を分析した。２−ケト酸からのし一ロイシンの収率は８８％であった。

実施例　９　Ｌ−システィンの製造Ｌ−システィンは次の様にして製造する。Ｌ−アスパラギン酸（１００ｍＭ）　、Ｌ−グルタミン酸（２，０ｍＭ）　、３−メルカプトパイルベイト（ｌｏＯ＋ａＭ）　、ピリドキサールリン酸（０，２ｍＭ）　、塩化マグネシウム＜ｌｏｍＭ）、アスバルティック　グルタミック　アミノトランスフェラーゼ（Ｅ、　Ｃ，２，６，１，１，５０ユニツト）、　シスら得られたオキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（５０ユニツト）を含み、水酸化ナトリウムでｐＨ７，５に調整した溶液１０ｍ１を２５℃、３時間インキュベートした。この反応の最後に、上記の方法とまた、アミノ酸分析により、全オキサロ酢酸とパイルベイトについて、この反応混合物を分析した。

実施例　１０　Ｌ−トリプトファンの製造り一トリブトファンは、実施例９の３ −メルカプトパイルベイトとシスティンアミノトランスフェラーゼをそれぞれ、３−インドリルパイルベイトとトリプトフシンアミノトランスフエラーゼ（Ｅ、　Ｃ，２，８，１，２７）に変えて実施例９をくり返すことで合成できる。

実施例　１１　Ｌ−フェニルアラニンの製造Ｌ−フェニルアラニンは、実施例９の３−メルカプトパイルベイトとシスティンアミノトランスフェラーゼをそれぞれ、フェニルパイルベイトとアロマティックアミノトランスフエラーゼ（Ｅ、　Ｃ，２，６，１，５７）に変えて、実施例９をくり返すことで合成できる。

実施例　１２　Ｌ−バリンの別途合成Ｌ−／（リンは、次の様にして製造する。Ｌ−アラニン（１００ｍＭ）　、Ｌ− グルタミン酸（２０ｍＭ）　、２−ケトイソカプロイックアシッド（１００ａ＋Ｍ）　、ピリドキサールリン酸（０，２ｍＭ）　、塩化マグネシウム（１軸Ｍ）、グルタミック　ピルビック　トランスアミナーゼ（Ｅ、　Ｃ，２，６，１，２，５ユニツト）、枝分かれ鎖のトランスアミナーゼ（Ｅ、　Ｃ，２，６，１−４２，５ユニツト）、パイルベイトデカルボキシラーゼ（Ｅ、　Ｃ，４，１，１，１，５ユニツト）を含み、水酸化ナトリウムでｐＨ７，５に調整した溶液１０ｍ１を２５℃、３時間インキュベートする。この反応の最後に、上記の方法とアミノ酸分析により全一ケトグルタレイトとパイルベイトについて、この反応混合物を分析する。

実施例１３　Ｌ−フェニルアラニンの別途合成Ｌ−フェニルアラニンは、次の様にして製造する。Ｌ−グルタミン酸（１００ｍＭ）　、Ｌ−アラニン（２０ａ＋Ｍ）、２−ケト−３−メチルペンタノイック　アシッド（１００ｍＭ）　、ビリードキサールリン酸（０，２ｍＭ）　、塩化マグネシウム（１０ａ＋Ｍ）、グルタミック　ピルビック　トランスアミナーゼ（Ｅ、　Ｃ，２，６，１，５８，５０ユニツト）フェニルアラニン−パイルベイト　アミノトランスフェラーゼ（Ｅ、　Ｃ，２，６，１，５ｇ、　ユニット）を含み、水酸化ナトリウムでｐＨに調整した溶液１０ｍ１を２５℃、３時間インキュベートする。

この反応の最後に、上記の通りにして全オキサロ酢酸とパイルベイトについて、この反応混合物を分析する。

実施例　１４　Ｄ−メチオニンの製造Ｄ−メチオニンは次の様にして製造する。Ｄ−グルタミン酸（１００ｄ）　、Ｄ −アラニン（２０ａ＋Ｍ）　、４−チオメチル−２−ケトブタノエイト（１００ｍＭ）　、ピリドキサールリン酸（０，２ｍＭ）　、塩化マグネシウム（ｌｏｎ＋Ｍ）　、Ｄ−アラニン　アミノトランスフェラーゼ（Ｅ、　Ｃ，２，６，１，２１，５０ユニツト）、Ｄ−メチオニン−パイルベイト　アミノトランスフェラーゼ（Ｅ、　Ｃ，２゜６、１．４１．５ユニツト）を含み、水酸化ナトリウムでｐＨ７，５に調整した溶液１０ｍ１を２５℃、３時間インキュベートする。この反応の最後に、上記の方法とアミノ酸分析により全２−ケトグルタレイトとパイルベイトについて、その反応混合物を分析する。

実施例　１５　タウリンの製造タウリンは次の様にして製造する。Ｌ−アスパラギン酸（１００ｍＭ）　、Ｌ− グルタミン酸（２０ｍＭ）　、スルホアセトアルデヒド（１００ｍＭ）　、ピリドキサールリン酸（０，２ｍＭ）　、塩化マグネシウム（１０ｍＭ）　、アスパルティック　グルタミック　アミノトランスフェラーゼ（Ｅ、　Ｃ，２，６，１，１，５０ユニツト）、タウリンアミノ　トランスフェラーゼ（Ｅ、　Ｃ，２，８，１，５５，５ユニツト）を含み、水酸化ナトリウムでｐＨ７，５に調整した溶液の１０ｍ１を２５℃、３時間インキュベートした。この反応の最後に、先述の様にして全オキサロ酢酸とパイルベイトについてこの反応混合物を分析する。

実施例　１６　Ｌ−フェニルアラニンの別途合成Ｌ−フェニルアラニンは、次の様にしてＬ−アラニンから製造する。Ｌ−アラニン（１００ｍＭ）　、Ｌ−グルタミン（２０ｍＭ）、フェニルパイルベイト（１０ｈＭ）　、ピリドキサールリン酸（０，２１ｉ１Ｍ）、塩化マグネシウム（１０ｍＭ）　、グルタミン　パイルベイトトランスアミナーゼ（Ｅ、　Ｃ，２，６，１，５，５０ユニツト）、グルタミン−フェニルパイルベイト　トランスアミナーゼ（Ｅ、　Ｃ。

２、８．　Ｌ、　６４．　５ユニツト）、パイルベイト　デカルボキシラーゼ（Ｅ、　Ｃ，４，１，１，１，５０ユニツト）を含み、水酸化ナトリウムでｐＨ７、５に調整した溶液の１０ｍ１は２５℃、３時間インキュベートする。この反応の最後に、先述の方法で全２−ケトグルタレイトとパイルベイトについて、その反応混合物を分析する。

実施例　１７５−アミルバリネイトの製造５−アミルバリネイトは次の様に製造する。Ｌ−アラニン（２（ｌｎＭ）　、Ｌ−グルタミン酸（１００畦）　、４．５−ジケトペンタノエイト（１００ｍＭ）　、ピリドキサールリン酸（０，２ｍＭ）　、塩化マグネシウム（ｌＯＩａＭ）、グルタミック　ピルビック　トランスアミナーゼ（Ｅ、　Ｃ，２，６，１，２，５ユニツト）、アミルバリネイト　トランスアミナーゼ（Ｅ、　Ｃ，２，６，１，４３，５０ユニツト）、パイルベイト　デカルボキシラーゼ（Ｅ、　Ｃ，４，１，１，１，５０ユニツト）を含み、水酸化ナトリウムでｐＨ７、５に調整したｉ６液の１０＋ｎｌを２５℃、３時間インキュベートした。この反応の最後に、上記の方法とアミノ酸分析により全２−ケトグルタレイトとパイルベイトについて、その反応混合物を分析する。

国際調査報告＋ａ＋ｖＮ−ドー＾帥−−−１１ａ、ＰＣ丁／υ５８６１０工９９フ

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）第一のトランスアミナーゼと第二のトランスアミナーゼの存在下、第一のα−アミノ酸ＡＡＮＨ２を第一のα−ケト酸ＫＡｔ及び第二のケト酸ＫＡｐｒｅと反応させ、（ｉ）求めるα−アミノ酸ＡＡｄ及び（ｉｉ）第三のα−ケト酸ＫＡｐｒｏｄを生成し、（ｂ）ＫＡｐｒｏｄをその他ケト酸、アミノ酸、酵素から除去すること〔ここで、ＡＡｄとＫＡｐｒｅ、ＡＡｔとＫＡｔ、ＡＡＮＨ２とＫＡｐｒｏｄはそれぞれアミノ基転移により相互転化可能である。また、上記の第一のトランスアミナーゼは、反応（１）を効果的に触媒するが、反応（ｉｉ）は触媒しない。上記の第二のトランスアミナーゼｉは反応（ｉｉ）を効果的に触媒するが反応（ｉ）は触媒しない。（ｉ）▲数式、化学式、表等があります▼（ｉｉ）▲数式、化学式、表等があります▼を特徴とする初期のα−アミノ酸ＡＡｄあるいはその誘導体を合成する方法。
２．その他のアミノ酸、ケト酸、酵素からのＡＡｄの回収を更に特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
３．その他のアミノ酸、ケト酸、酵素から、ＫＡｐｒｏｄの脱炭酸によりＫＡｐｒｏｄを除去する請求の範囲第１項に記載の方法。
４．ＫＡｐｒｅやＫＡｔではなくＫＡｐｒｏｄの脱炭酸を効果的に触媒する酵素を使用し脱炭酸を行う請求の範囲第１項に記載うを行う請求の範囲第１項に記載う請求の範囲第１項に記載の方法。
５．ＫＡｐｒｏｄの還元的アミノ化により、ＫＡｐｒｏｄがその他のケト酸、アミノ酸及び酵素から除去されてＡＡＮＨ２を生成する請求の範囲第１項に記載の方法。
６．適当な酵素や窒素源の存在下で、ＫＡｐｒｏｄの還元的アミノ化を酵素的に行う請求の範囲第５項に記載の方法。
７．酵素を精製するか、あるいは一部精製するか、あるいはまたそのままの状態の細胞に含んでいる請求の範囲第１項に記載の方法。
８．各々の酵素を不溶性の支持体に固定する請求の範囲第７項に記載の方法。
９．上記の固定支持体が制御された気孔を持つ細孔セラミック粒子あるいは細孔ガラス粒子である請求の範囲第８項に記載の方法。
１０．酵素を同じ支持体で固定する請求の範囲第８項に記載の方法。
１１．酵素がポリエチレンイミン処理した粒子で固定されている請求の範囲第８項に記載の方法。
１２．ＫＡｐｒｏｄを直接的あるいは間接的にＫＡｐｒｅに転化することによりＫＡｐｒｏｄを除去する請求の範囲第１項に記載の方法。