DE3017861A1 - Verfahren zur enzymatischen herstellung von l-tryptophan - Google Patents
Verfahren zur enzymatischen herstellung von l-tryptophanInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung
von L-Tryptophan, bei dem Indol mit Serin in Gegenwart
von Tryptophansynthetase oder Tryptophanase umgesetzt wird, wobei DL-Serin oder D-Serin eingesetzt wird und für die Anwesenheit
eines Serin-racemisierenden Enzyms im Reaktionssystem gesorgt und dieses mit dem Serin umgesetzt wird.
Ersichtlich betrifft die Erfindung also eine Verbesserung beim Verfahren zur enzymatischen Herstellung von L-Tryptophan
aus Indol und Serin, insbesondere eine Verbesserung bei dem Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan durch Umsetzen von
Indol mit Serin in Gegenwart von Tryptophansynthetase oder Tryptophanase.
Als ausgezeichnetes Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan unter Einsatz von Enzymen sind mehrere Verfahren bekannt,
bei denen Tryptophan aus Indol und Serin unter Ausnutzung der Einwirkung von Tryptophansynthetase oder Tryptophanase hergestellt
wird. Beispielsweise ist das Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan unter Ausnutzung der Einwirkung von Trypophansynthetase
in "The Journal of Biological Chemistry", 249, Seiten 7756 bis 7763 (1974) offenbart, und das Verfahren zur
Herstellung von L-Tryptophan unter Ausnutzung eines Tryptophanase-produzierenden
Mikroorganismus ist in "Vitaminologica et Enzymologica", V*_, Seiten 248 bis 251 (1975), offenbart.
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Indol, das als eines der Ausgangsmaterialien bei diesen .
bekannten Verfahren eingesetzt wird,, wird industriell bei
verhältnismäßig niedrigen Kosten hergestellt. Als Verfahren zur Herstellung von Serin, dem anderen Ausgangsmaterial, sind
ein Proteinextraktionsverfahren, ein Fermentationsprozeß, ein enzymatischer Prozeß und ein organisches Syntheseverfahren bekannt.
Derzeit wird Serin bei niederen Kosten nach dem organischen Syntheseverfahren angeboten. Das organische Syntheseverfahren
jedoch hat den Nachteil, daß so hergestelltes Serin DL-Serin ist. Nur auf L-Serin vermag Tryptophansynthetase oder
Tryptophanase einzuwirken, nicht aber auf D-Serin. Daher besteht bei der Verwendung von DL-Serin als Ausgangsmaterial ein industrielles
Problem.
Als enzymatisches Verfahren für die Synthese von Tryptophan
aus Indol und Serin, bei dem DL-Serin als Ausgangsmaterial verwendet
wird, ist ein Verfahren bekannt, das in "Agricultural and Biological Chemistry", ^a, Nr. 7, Seiten 1343 bis 1349
(1974) offenbart ist. Nach diesem Verfahren werden Indol und L-Serin in L-Tryptophan umgewandelt, nicht umgesetztes D-Serin
wird abgetrennt und aus dem Reaktionsprodukt gewonnen, bei hoher Temperatur unter hohem Druck in wässriger Lösung zwecks Racemisierung
behandelt, und das Racemisierungsprodukt wird als Substrat für d^ie enzymatische Reaktion verwendet. Diese Racemisierung
erfolgt z.B. durch Behandeln von D-Serin unter hohem Druck bei so hoher Temperatur wie 1600C für etwa 4 h. Durch alternierende
Wiederholung der enzymatischen Reaktion und der Racemisierung kann DL-Serin schließlich praktisch vollständig in L-
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Tryptophan umgewandelt werden. Dieses Verfahren jedoch hat
verschiedene, später beschriebene Nachteile.
(1) Die Racemisierungsbedingungen sind viel schärfer als die der enzymatischen Reaktion, und daher können beide Reaktionen
nicht gleichzeitig vorgenommen werden.
(2) Wenn L-Tryptophan bei der Racemisierung zugegen ist, wird nicht nur Serin, sondern auch L-Tryptophan racemisiert,
und daher sollte die Racemisierung nach vollständiger Abtrennung von L-Tr-yptophan erfolgen.
(3) Da das Enzym unter den Racemisierungsbedingungen desaktiviert wird, muß, um das Enzym kontinuierlich zu verwenden,
dieses abgetrennt und vor der Racemisierung gewonnen werden.
(4) Ein Nebenprodukt bildet sich durch die Wärmebehandlung unter Druck zur Racemisierung und verursacht Produktverfärbung,
und deshalb sollte nach der Umsetzung eine Reinigung erfolgen.
(5) Für die Wärmebehandlung unter Druck zur Racemisierung wird eine große Energiemenge verbraucht, und ferner sollte nach
der Racemisierung das flüssige Reaktionsgemisch auf die Temperatur für die enzymatische Reaktion gekühlt werden.
Wie sich aus dem Vorstehenden ergibt, bringt die Verwendung von nach dem organischen Syntheseverfahren erhaltenem DL-Serin
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alsAusgangsmaterial für die enzymatische Reaktion von Haus
aus ein ernsthaftes Problem mit sich, und es ist leicht verständlich, daß, wenn dieses Problem wirksam gelöst wird,
die Synthese von L-Tryptophan sehr vorteilhaft erfolgen kann.
Hauptziel der Erfindung ist daher die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung von Tryptophan durch Umsetzen von
Indol mit L-Serin in Gegenwart von Tryptophansynthetase oder
Tryptophanase, wobei DL-Serin oder D-Serin wirksam für die Herstellung von L-Tryptophan eingesetzt werden kann. Die Erfindung
soll ferner ein Verfahren schaffen, bei dem D-Serin in L-Serin übergeführt werden kann, ohne eine Hochtemperatur/
Hochdruck-Behandlung durchzuführen, und als Ausgangsmaterial
für die L-Tryptophansynthese eingesetzt werden kann. Ferner soll die Erfindung ein vorteilhaftes Verfahren schaffen, bei
dem DL-Serin oder D-Serin in L-Tryptophan durch Racemisierung übergeführt werden kann, ohne die aufeinanderfolgenden Schritte
der Racemisierung von DL-Serin oder D-Serin und der Umwandlung des gebildeten L-Serins in L-Tryptophan aufzugreifen.
Schließlich soll die Erfindung ein wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan schaffen, bei dem die Produktqualität
stark verbessert und die Reaktion zur Synthese von L-Tryptophan unter Kontrolle der Zersetzung von Serin erfolgen
kann.
Erfindungsgemäße Ziele können durch ein Verfahren zur Herstellung
von L-Tryptophan erreicht werden, bei dem Indol mit
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L-Serin in Gegenwart von Tryptophansynthetase oder Tryptophanase umgesetzt wird, wobei Indol und DL-Serin oder D-Serin
eingesetzt werden und ein Serin racemisierendes Enzym im
Reaktionssystem vorgelegt wird, um wenigstens einen Teil des
D-Serins in L-Serin umzuwandeln.
Sorgt man dafür, daß ein Serin racemisierendes Enzym
gleichzeitig mit Tryptophansynthetase oder Tryptophanase beim oben genannten Verfahren vorliegt und wenigstens ein Teil
des D-Serins in DL-Serin umgewandelt wird, ist dies ebenfalls im Sinne des Erreichens erfindungsgemäßer Ziele.
Wenn Tryptophansynthetase oder Tryptophanase und/oder ein Serin racemisierendes Enzym bei dem oben erwähnten Verfahren
fixiert wird und im Reaktionssystem für die Anwesenheit von Ammoniumionen gesorgt wird, kann die Qualität des erhaltenen
L-Tryptophans stark verbessert und L-Tryptophan wirtschaftlich vorteilhaft unter Kontrolle der Zersetzung von Serin hergestellt
werden.
Der hier verwendete Begriff "Serin racemisierendes Enzym" wird nachfolgend als "Serinracemase" bezeichnet. Als Serinracemase-produzierende
Mikroorganismen können folgende erwähnt werden, z.B. Pseudomonas putida IFO 12996, Brevibacterium
leucinophagum MT-10072, Pseudomonas desmolytica MT-10170,
Pseudomonas fragi MT-10173 und Pseudomonas taetorolens
MT-10186.
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Unter diesen Serinracemase-produzierenden Mikroorganismen,
ist Pseudomonas putida IFO 12996 ein·Stamm, der zuerst als
Pseudomonas striata identifiziert wurde. Eigenschaften dieses
Stammes, Extraktionsweisen der Racemase aus Kulturzellen dieses Stamms und Eigenschaften der extrahierten Racemase
sind in "Agricultural and Biological Chemistry", 3J_, Nr. 9,
Seiten 1097-1099 (1967), ebenda 33_, Nr. 3, Seiten 424-429
(1969), ebenda 22' Nr· 3' Seiten 430-435 (1969), "Biochemidal
and Biophysical Research Communications", ^_5, Nr. 3, Seiten
363-368 (1969) und in der Doktorarbeit mit dem Titel "Studies on Amino Acid of Racemase of Pseudomonas striata" von
Takaharu Osumi an der Kyoto Universität, Abteilung Landwirtschaft (Japan) offenbart. Der vorstehende japanische Bericht
lehrt, daß diese Racemase als "Aminosäureracemase mit geringer Substratspezifität" bezeichnet wird und daß 20 Arten von Aminosäuren,
einschließlich Lysin, ε-N-Acetyl-lysin und Serinsubstrate
für diese Racemase und 13 Arten von Aminosäuren, einschließlich
a-N-Acetyl-lysin, keine Substrate für diese Racemase
sein können. Angegeben wird auch, daß, wenn Serin ein Substrat für diese Racemase ist, die relative Aktivität von Serin
8,7 und damit viel niedriger ist als (100) für Lysin oder ε-N-Acetyl-lysin. Das Verhalten dieser Racemase gegenüber
Tryptophan ist jedoch nicht offenbart worden.
Es wurden nun Untersuchungen der Eigenschaften dieser
Racemase mit geringer Substratspezifität vorgenommen und gefunden,
daß diese Racemase Tryptophan nicht racemisiert, kei-
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ne enzymatische Hemmung durch L-Tryptophan erfährt, wirksame
Aktivität unter optimalen Reaktionstemperatur- und pH-Bedingungen zur Herstellung von L-Tryptophan aus Indol und L-Serin
in Gegenwart von Tryptophansynthetase oder Tryptophanase ausübt und für die Synthese von L-Tryptophan geeignete Eigenschaften
aufweist. Auf der Grundlage dieser Erkenntnisse wurde nach Mikroorganismen gesucht, die Serinracemase zu
produzieren vermögen, und dabei wurden die oben genannten Stämme gefunden.
Das Extrahieren der Aminosäureracemase mit niederer Substratspezifität
aus Pseudomonas putida IFO 12996, einem der Serinracemase-erzeugenden Stämme, erfolgt z.B. nach dem
sechs Stufen umfassenden Verfahren: 1) Rohextraktion, 2) Ammoniumsulfat-Fällung, 3) erste Chromatographie mit Diäthylaminoäthylcellulose,
4) zweite Chromatographie mit Diäthylaminoäthy!cellulose,
5) Chromatographie mit Sephadex G-200 und 6) Kristallisation. Die Extraktion und Reinigung sind im
einzelnen in "Biochemical and Biophysical Research Communications", J35, Nr. 3, Seiten 363-368 (1969) beschrieben.
Als erfindungsgemäß verwendeter, Tryptophansynthetase
produzierender Stamm kann z.B. Escherichia coli MT-10231,
Escherichia coli MT-10232, Escherichia coli MT-10238 und
Neurospora crassa ATCC 14692 erwähnt werden. Das Verfahren zum Extrahieren von Tryptophansynthetase aus Kulturzellen
von Escherichia coli ist in "The Journal of Biochemistry", 252, Nr. 19, Seiten 6594-6599 (1977) beschrieben, und das
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Verfahren zum Extrahieren von Tryptophansynthetase aus Kulturzellen von Neurospora crassa ist in "The Journal
of Biological Chemistry", 2_5_0, 8, Seiten 2941-2946 (1975)
beschrieben.
Als erfindungsgemäß verwendeter Stamm, der Tryptophanase
zu produzieren vermag, kann z.B. Proteus vulgaris IFO 3167, Escherichia coli IAM 1268, Aerobacter aerogenes IFO
12019, Klebsiella pneumoniae ATCC 8724 und Bacillus alvei
ATCC 6 348 erwähnt werden. Das Verfahren zum Extrahieren von Tryptophanase aus Kulturzellen ist in "Amino Acid and
Nucleic Acid", Nr. 31, Seiten 102-112 (1975) beschrieben. Als Reagens im Handel erhältliche Tryptophanase kann erfindungsgemäß
eingesetzt werden.
Jedes synthetische oder natürliche Kulturmedium kann zum Züchten von Tryptophansynthetase, Tryptophanase oder Serinracemase
produzierenden Stämmen verwendet werden, sofern es eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, eine anorganische
Substanz und, wenn nötig, eine geringe Menge eines Nährstoffs enthält. Beim Züchten des Tryptophansynthetase-produzierenden
Stamms muß gewöhnlich eine winzige Menge Tryptophan, Anthranilsäure oder Indol einem Kulturmedium zugesetzt
werden. Beim Züchten des Tryptophanase-produzierenden Stammes können, da Tryptophanase ein induzierendes Enzym ist, wenn
Tryptophan in einer Menge von etwa 0,1 bis etwa 0,5 Gew.-% dem Kulturmedium zugesetzt wird, Kulturzellen mit hoher
Tryptophanaseaktivitat erhalten werden. Jede Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, die vom eingesetzten Stamm verwertet werden
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kann, kann eingesetzt werden. Beispielsweise können als Kohlenstoffquelle Kohlenhydrate, wie Glukose, Glyzerin,
Fructose, Saccharose, Maltose, Mannose, Stärke, hydrolysierte Stärke und Molassen verwendet werden. Als Stickstoffquelle
können z.B. verschiedene organische und anorganische Ammoniumsalze verwendet werden, wie Ammoniak, Ammoniumchiorid,
Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumacetat, und natürliche organische Stickstoffquellen, wie
Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit, hydroIysiertes
Kasein, Fischmehl, verdautes oder aufgeschlossenes Fischmehl, entfettete Sojabohne und aufgeschlossene entfettete Sojabohne. Die meisten natürlichen organischen Stickstoff
quellen können nicht nur als Stickstoffquelle, sondern
auch als Kohlenstoffquelle wirken. Werden anorganische Substanzen,
wie Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Kaliumchlorid, Natriumchlorid, Magnesiumsulfat
und Eisen(II)sulfat je nach Bedarf verwendet, können gute
Ergebnisse erzielt werden.
Das Kultivieren erfolgt unter aeroben Bedingungen nach der Schüttelkulturmethode oder nach der belüftet bewegten
Submerskulturmethode. Die Kultivierungstemperatür liegt im
Bereich von 20 bis 5O0C. Vorzugsweise wird der pH-Wert des
Kulturmediums bei neutralem oder schwach alkalischem Wert während des Kultivierens gehalten. Gewöhnlich, beträgt die
Kulturdauer 1 bis 7 Tage.
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Sowohl die Tryptophansynthetase, Tryptophanase als auch die Serinracemase, durch Kultivieren nach den oben genannten
Arbeitsweisen erhalten, kann in Form lebender, aus dem Kulturmedium des enzymproduzierenden Stamms gewonnener, getrockneter,
durch Pulverisieren, Autolyse oder Schallbehandlung erhaltener behandelter Zellen, von Extrakten aus
diesen Zellen, in Form eines aus solchen Extrakten erhaltenen Rohenzyms oder eines reinen Enzyms verwendet werden. Erfindungsgemäß
können die oben erwähnten Enzyme verwendet werden, nachdem sie nach bekannten, zum Fixieren von Enzymen gewöhnlich
gewählten Methoden fixiert worden sind, z.B. durch Binden an einen Träger, nach der Vernetzungs- und der Einschlußmethode.
Bei der Methode des Bindens an einen Träger wird das Enzym an einen Träger, wie ein natürliches Polymerisat,
dessen Derivat, ein synthetisches Polymerisat oder eine anorganische Substanz über eine kovalente Bindung gebunden,
z.B. nach der Diazomethode, der Peptidmethode, der Alkylierungsmethode
oder Acylierungsmethode, durch Ionenbindung, durch physikalische Adsorption, biologische Adsorption oder
durch Adsorption unter Ausnutzung der biochemischen Affinität. Bei der Vernetzungsmethode wird das Enzym durch Verwendng
eines bifunktionellen Reagens fixiert. Als Einschlußmethode kann die sogenannte Gittermethode gewählt werden,
bei der ein Molekül des lebenden Enzyms in ein durch Polymerisation
von Acrylamid oder dgl. gebildetes Gel eingeschlossen wird, oder die sogenannte Mikrokapselmethode,
bei der das Enzym in eine Mikrokapsel einer semi-permeablen Membran eines natürlichen oder synthetischen Polymerisats
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eingeschlossen wird.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden diese Enzymfixierungsmethoden
geeignet ausgewählt und gemäß verschiedenen, nachfolgend beschriebenen Reaktionsweisen durchgeführt. Im
allgemeinen jedoch wird die Einschlußmethode unter Verwendung eines Monomeren des Acrylamidtyps häufig als bevorzugtes Verfahren
angewandt. Als Monomer des Acrylamidtyps können z.B. Acrylamid, N,N' -Methylen-bis-acrylamid und Diacrylamid-methyläther
verwendet werden. Die Polymerisation eines solchen Monomeren erfolgt in Gegenwart eines Polymerisationsstarters,
wie Kaliumpersulfat, Ammoniumpersulfat, Vitamin B. oder
Methylenblau, und eines Polymerisationsförderers, wie ß-(Dimethylamino)-propionitril
oder Ν,Ν,Ν1,N'-Tetramethyläthy
lendiamin .
Wenn Tryptophansynthetase oder Tryptophanase und/oder Serinracemase nach der oben erwähnten Fixiermethode fixiert
und im fixierten Zustand zur Reaktion eingesetzt wird, kann
L-Tryptophan in vorteilhafter Weise hergestellt werden. Insbesondere enthält nach dem enzymatischen Verfahren gebildetes
L-Tryptophan unvermeidlich Verunreinigungen, wie Zellen, zum Kultivieren verwendete Materialien und verschiedene Proteine,
und L-Tryptophan mit hoher Reinheit kann kaum erhalten werden, und da es verhältnismäßig schwierig ist, das Enzym vom gebildeten
L-Tryptophan abzutrennen, ist es schwierig, das Enzym wiederholt zu verwenden. Demgegenüber wird, wenn das
fixierte Enzym verwendet wird, die Elution von aus dem Enzym stammenden Verunreinigungen in die wässrige Lösung des ge-
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bildeten Tryptophans bemerkenswert kontrolliert, und damit kann die Reinheit des erhaltenen L-Tryptophans merklich
verbessert werden. Ferner kann das Enzym wiederholt verwendet und die Freiheit des Verfahrens zur Herstellung von L-Tryptophan
erheblich gesteigert werden.
Als spezielle Maßnahme zur Umwandlung wenigstens eines Teils des D-Serins in L-Serin durch die Einwirkung der Serinracemase
und zur Herstellung von L-Tryptophan beim erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem Indol und DL-Serin oder D-Serin
als Ausgangsmaterialien verwendet werden, wird die Reaktion der Umwandlung von L-Serin in L-Tryptophan durch Einwirkung
von Tryptophansynthetase oder Tryptophanase und die Reaktion des Racemisierens von Serin durch die Einwirkung
der Serinracemase gewählt. Die beiden Reaktionen können gleichzeitig
in einem Reaktionsbehälter oder unabhängig voneinander in verschiedenen Reaktionsbehältern durchgeführt werden. Doch
ist das Verfahren, bei dem die Serinracemase zugleich mit der Tryptophansynthetase oder Tryptophanase vorgelegt und L-Tryptophan
in einer Stufe hergestellt wird, unter wirtschaftlichem Gesichtspunkt von Vorteil, und die Reaktionsarbeitsweisen
können bei diesem Verfahren vereinfacht werden. Wird DL-Serin verwendet und dieses Verfahren gewählt, kann, da L-Serin in
L-Tryptophan und gleichzeitig D-Serin nach und nach zu DL-Serin racemisiert und in L-Tryptophan umgewandelt wird, das
Ausgangs-DL-Serin in L-Tryptophan in hoher Ausbeute durch eine einfache Ausrüstung umgewandelt werden. Auch wenn D-Serin ver-
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wendet wird, erfolgt, da die Umwandlung in L-Tryptophan gleichzeitig mit der Racemisierungsreaktion verläuft, die
Umwandlung praktisch in gleicher Weise wie im Falle der Verwendung von DL-Serin.
Wie zuvor beschrieben, kann beim erfindungsgemäßen Verfahren die Umwandlungsreaktion zu L-Tryptophan und die
Racemisierungsreaktion von Serin unabhängig voneinander oder gleichzeitig erfolgen. Wird das Enzym im fixierten Zustand
verwendet, können geeignete Fixiermethoden gemäß den oben genannten Reaktionsweisen gewählt werden. Im einzelnen
kann beim erfindungsgemäßen Verfahren eine Methode gewählt werden, bei der nur Tryptophansynthetase oder Tryptophanase
fixiert wird, sowie ein Verfahren, bei dem Tryptophansynthetase oder Tryptophanase und Serinracemase fixiert werden,
und diese beiden Methoden können mit der oben erwähnten Methode kombiniert werden, bei der sowohl die Enzyme getrennt
als auch gleichzeitig wirken. Weiter kann eine Methode gewählt werden, bei der sowohl die fixierten Enzyme in Kombination
oder separat verwendet werden, eine Ansatzmethode und eine kontinuierliche Methode unter Verwendung einer Säule
oder dgl.
Die Enzymkonzentrationen, die Mengen an Substraten, wie Indol, DL-Serin und D-Serin, und die Mengen an an Trägern
fixierten Enzymen können entsprechend den oben genannten Reaktionsweisen geeignet geändert werden.
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Die Mengen der Substrate, wie Indol, DL-Serin und D-'
Serin im Reaktionssystem und das Verhältnis der Menge des Indols zu den Mengen von DL-Serin und D-Serin sind nicht besonders
kritisch beim erfindungsgemäßen Verfahren, aber die Substratkonzentration in der Flüssigkeit liegt gewöhnlich
bei 0,01 bis 20 Gew.-%, und gegebenenfalls kann das vorerwähnte
Mengenverhältnis der Substrate gewählt werden. Die Konzentration an in der Reaktionsflüssigkeit gelöstem Indol
ist jedoch gewöhnlich bevorzugt niedriger als 500 ppm, insbesondere
etwa 100 ppm. Daher wird, wenn L-Tryptophan in hoher Konzentration angesammelt werden soll, häufig eine Methode
gewählt, bei der Indol nach und nach und kontinuierlich so zugesetzt wird, daß die Indolkonzentration nicht auf einmal
erhöht wird. Wird diese Methode der kontinuierlichen Zugabe nicht gewählt, kann die Konzentration an gelöstem Indol
auf etwa 10 Gew.-% durch Einbringen eines grenzflächenaktiven
Mittels, z.B. eines nichtionischen Tensids des Polyoxyäthylenalkylphenoläthertyps
(im Handel unter Triton X-100 erhältlich) in das Reaktionssystem erhöht werden. Die Menge des zugesetzten
grenzflächenaktiven Mittels ist vorzugsweise 1 bis 10 Gew.-%, insbesondere etwa 5 Gew.-%, in der wässrigen Lösung,
wenngleich die Menge des zugesetzten grenzflächenaktiven Mittels in gewissem Ausmaß je nach der Indolkonzentration
variiert..Die Löslichkeit des DL-Serins in der wässrigen Lösung ist etwa 6 Gew.-% bei 300C, und die Löslichkeit von
D-Serin oder L-Serin in der wässrigen Lösung beträgt etwa
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25 Gew.-% bei 300C. Es ist jedoch festzustellen, daß, wenn
die Serinkonzentration in der wässrigen Lösung bis zu 10 Gew.-% beträgt, die. Reaktionsgeschwindigkeit um so größer
ist, je höher die Konzentration ist.
Die Mengen an im Reaktionssystem vorhandener Tryptophansynthetase,
Tryptophanase und Serinracemase werden gemäß den oben genannten Methoden der Trennung, Reinigung und Behandlung der Enzyme geändert, sind aber nicht besonders kritisch
und können in Abhängigkeit von dem gewünschten Mengenverhältnis
der Substrate, den Aktivitäten der Enzyme und anderen Faktoren geeignet bestimmt werden. Wenn jedoch die Menge an Serinracemase
viel kleiner ist als die Menge an Tryptophansynthetase
oder Tryptophanase, ist die Menge an L-Serin in der Reaktionsflüssigkeit
gering und die Reaktionsgeschwindigkeit niedrig. Ist andererseits die Menge an Tryptophansynthetase
oder Tryptophanase viel kleiner als die Menge an Serinracemase, beträgt das Mengenverhältnis von D-Serin zu L-Serin etwa 1,
aber die Bildungsgeschwindigkeit von L-Tryptophan wird niedrig. Daher sollten die Konzentrationen an Tryptophansynthetase
oder Tryptophanase und das Mengenverhältnis je nach den gewählten Bildungsbedingungen für L-Tryptophan geeignet bestimmt
werden.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren können mit fortschreitender
Reaktion frische Substrate zugesetzt werden. Ferner kann
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ein Teil oder das gesamte gebildete L-Tryptophan aus dem Reaktionssystem mit fortschreitender Reaktion abgezogen
werden. Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Reaktion kann in die Reaktionsflüssigkeit Pyridoxalphosphat, das
ein Coenzym ist, in winziger Menge, z.B. in einer Konzentration von 1 bis 100 ppm, zusätzlich zu den Substraten eingebracht
werden.
Wenn Tryptophansynthetase oder Tryptophanase in Form von enzymhaltigen Kulturzellen des enzymproduzierenden Mikroorganismus
oder eines Extrakts aus solchen Zellen verwendet wird, werden, da ein L-Serin und/oder D-Serin zersetzendes
Enzym gewöhnlich in solchen Zellen oder im Extrakt enthalten ist, Ammoniumionen, die eine solche Zersetzung zu hemmen
vermögen, in die Reaktionsflüssigkeit mit eingebracht.
Verschiedene enzymatische Reaktionen, die Serin als eine Reaktionskomponente verwenden, sind bekannt. Doch ist
eine Zersetzung von Serin in diesen Reaktionssystemen oder eine Hemmung dieser Zersetzung in keiner Literaturstelle
beschrieben. Als ein Grund kann die Tatsache erwähnt werden, daß die Zersetzung bei diesen Reaktionen kaum beobachtet
wird oder vernachlässigbar ist, wenn reine Enzyme verwendet werden. Wenn jedoch kultivierte Zellen von Mikroorganismen
oder Extrakte aus solchen kultivierten Zellen als Enzyme verwendet werden, kann die Zersetzung von Serin nicht vernachlässigt
werden.
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Es wurden Untersuchungen im Hinblick auf die Entwicklung einer Methode angestellt, bei der die Zersetzung von L-Serin
und/oder D-Serin durch kultivierte Zellen von Mikroorganismen oder deren Extrakte wirksam gehemmt wird, und
es wurde gefunden, daß, wenn für die Anwesenheit von Ammoniumionen in der Reaktionsflüssigkeit gesorgt wird, die Zersetzung
von Serin wirksam gehemmt werden kann. Die Konzentration des Ammoniumions in einer serinhaltigen wässrigen Lösung
differiert mit der Temperatur und dem pH-Wert der wässrigen Lösung und den Eigenschaften der für die Reaktion verwendeten
Enzyme, und es ist unmöglich, die Konzentration einfach zu definieren. Doch ist die Ammoniumionenkonzentration gewöhnlich
0,01 bis 2 Mol pro 1 der wässrigen Lösung, vorzugsweise 0,1 bis 2 Mol pro 1 der wässrigen Lösung. Eine höhere Ammoniumionenkonzentration
wird bevorzugt, um eine Hemmung der Zersetzung von Serin zu erreichen. Ist jedoch die Ammoniumionenkonzentration
zu hoch, wird selbst die beabsichtigte Reaktion gehemmt, oder die Trennung des gewünschten Reaktionsp^rodukts
von der Reaktionsflüssigkeit wird sehr schwierig. Daher
wird die Ammoniumionenkonzentration bevorzugt auf einem niedrigen Wert innerhalb des die Hemmung der Zersetzung von Serin
ermöglichenden Bereichs gehalten. Daher wird die Obergrenze der Ammoniumionenkonzentration auf 2 Mol/l der wässrigen Lösung
festgesetzt, und die Ammoniumionenkonzentration wird gewöhnlich auf 0,1 bis 0,5 Mol/l der wässrigen Lösung eingestellt.
Dieses Merkmal, daß die Zersetzung von Serin bei so niedriger
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Ammoniumionenkonzentration spezifisch gehemmt werden kann,'
ist unter industriellem Gesichtspunkt sehr vorteilhaft. Jede Verbindung, die in wässriger Lösung Ammoniumionen liefert,
kann als Verbindung, die im Reaktionssystem Ammoniumionen zugegen sein läßt, verwendet werden. Beispielsweise können
verschiedene anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat,
Ammoniumcarbonat und Ammoniumacetat sowie Ammoniak erwähnt werden.
Die Reak-tionstemperatur für die Bildung von L-Tryptophan unter Verwendung von Tryptophansynthetase oder Tryptophanase
und Serinracemase liegt gewöhnlich bei 20 bis 600C, vorzugsweise
bei 30 bis 45°C. Der pH-Wert für die Reaktion ist gewöhnlich 6,0 bis 11,0 und insbesondere 7,5 bis 9,0. Diese
Reaktionsbedingungen werden je nach der gewählten Reaktionsmethode geeignet eingestellt, z.B. der Methode, bei der die
Substrate durch ein Suspensoid oder ein Festbett von fixierter Tryptophansynthetase oder Tryptophanase und fixierter
Serinracemase geführt werden, der Methode, bei der Tryptophansynthetase oder Tryptophanase und die Substrate durch ein
Festbett von fixierter Serinracemase geführt werden, und der Methode, bei der Serinracemase und die Substrate durch ein
Festbett von fixierter Tryptophansynthetase oder Tryptophanase geführt werden.
Die Isolierung des gebildeten L-Tryptophans aus der Reaktionsflüssigkeit
kann leicht durch Adsorptions/Desorptions-
030064/0593
Behandlung unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes, von Aktivkohle oder dgl., erfolgen. Insbesondere wird, wenn
L-Tryptophan in kristalliner Form in der Reaktionsflüssigkeit
ausfällt, wird Wasser zugesetzt, um die Kristalle zu lösen, die unlöslichen Substanzen, wie Zellen, werden aus
der Reaktionsflüssigkeit abzentrifugiert oder abfiltriert,
und L-Tryptophan wird gewöhnlich nach irgendeiner der folgenden Methoden gewonnen: 1) Nach einer Methode, bei der der
pH-Wert der Reaktionsflüssigkeit auf den isoelektrischen Punkt eingestellt wird, um L-Tryptophan auszufällen, und
das ausgefallene L-Tryptophan wird gewonnen, 2) nach einem Verfahren, bei dem L-Tryptophan an ein Ionenaustauscherharz
adsorbiert wird, von dem es dann desorbiert wird, 3) nach einem Verfahren, bei dem L-Tryptophan in Form eines schwerlöslichen
Metallsalzes ausgefällt und das ausgefällte Metallsalz gewonnen wird, 4) nach einer Methode, bei der ein wasserlösliches
organisches Lösungsmittel zum Filtrat gegeben wird, um Kristallisation zu bewirken, und die erhaltenen
Kristalle werden gewonnen, und 5) nach einer Methode, bei der das Filtrat der Elektrodialyse unterworfen und das abgetrennte
L-Tryptophan gewonnen wird.
Die Erfindung wird nachfolgend im einzelnen unter Bezugnahme
auf die folgenden Beispiele beschrieben, die keineswegs den Umfang der Erfindung einschränken sollen.
030064/0593
Bei diesen Beispielen erfolgte die qualitative Feststellung der Bildung von L-Tryptophan auf der Grundlage des
R -Werts des L-Tryptophans auf dem Papierchromatogramm, der UV-Absorptionswerte und des Farbtests mit Ehrlich 1S
Reagens. Die quantitative Bestimmung erfolgte, auf der Grundlage des Wertes des Absorptionsvermögens des Fleckenextrakts
auf dem Papierchromatogramm bei 280 nm und nach dem Biotest. In den Beispielen beziehen sich alle Prozentangaben auf das
Gewicht.
Eine Platinschleife mit Escherichia coli MT-10232 wurde
auf 50 ml eines Kulturmediums nachfolgend beschriebener Zusammensetzung I aufgeimpft, und es wurde 20 h bei 300C schüttelkultiviert.
Kulturmediumzusammensetzung I:
Fleischextrakt: 1,0 %
Pepton: 0,5 %
Hefeextrakt: 0,1 %
KH2PO4: 0,2 %
Anfangs-pH: 7,0
Dann wurde 1 1 der Kulturflüssigkeit zur Abtrennung und
Gewinnung von Zellen zentrifugiert, und die gesammelten Zellen wurden als Enzymquelle für Tryptophansynthetase verwendet.
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Eine Platinschleife mit Pseudomonas putida IFO 12996
wurde auf 50 ml eines Kulturmediums der Zusammensetzung II, wie nachfolgend beschrieben, aufgeimpft und 1 1 der Kultur flüssigkeit
wurde zur Abtrennung und Gewinnung der Zellen zentrifugiert. Die gesammelten Zellen wurden als Enzymquelle
für Serinracemase verwendet.
Kulturmediumzusammensetzung II:
Fleischextrakt: ' 1,0 %
Pepton: 1,0 %
NaCl: 0,5 % ■
In 50 g Triton X-100 wurden 20 g Indol und 36 g DL-Serin,
1 g Na3SO3, 100 mg Pyridoxalphosphat gelöst, und die oben
genannten beiden Zellarten, durch Zentrifugieren abgetrennt und gewonnen, wurden zu der Lösung gegeben, so daß ein Gesamtvolumen
von 1 1 entstand. Die Reaktionsflüssigkeit wurde bei einer Temperatur von 300C und einem pH von 8,5 72 h zur
Reaktion geschüttelt. Nach der Reaktion waren 28,5 g L-*
Tryptophan entstanden und in der Reaktionsflussigkeit angesammelt
(die Ausbeute betrug 41 %, bezogen auf Serin).
Zum Vergleich wurde die Reaktion in gleicher Weise wie oben
beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahmer daß die kultivierten
Zellen des Serinraeemase-produzierenden Stammes nicht zugesetzt wurden. Nach der Reaktion lag" das angesammelte
L-Tryptophan in einer Menge von 23,5 g vor (die Ausbeute be-
&300614/0593
trug 34 %, bezogen auf Serin), und die Menge an angesammelten L-Tryptophan war um 5,0 g kleiner als bei dem Ansatz, bei dem
beide Enzyme, d.h. Serinracemase und Tryptophansynthetase, für die Reaktion verwendet worden waren.
Der Versuch wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Escherichia
coli MT-10238 anstelle von Escherichia coli MT-tO231, wie in
Beispiel 1 verwendet, verwendet wurde. Es wurde gefunden, daß sich 27,8· g L-Tryptophan in der Reaktionsflüssigkeit angesammelt
hatten (die Ausbeute betrug 40 %, bezogen auf Serin). Bei einem Vergleichsansatz, bei dem Serinracemase nicht zugesetzt
worden war, wurde keine L-Tryptophan-Anhäufung beobachtet.
Der Versuch wurde ebenso durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, daß Aerobacter aerogenes
IFO 3317, ein Tryptophanase-produzierender Stamm, anstelle
von Escherichia coli MT-10231, wie in Beispiel 1 verwendet,
und ein Kulturmedium einer nachfolgend beschriebenen Zusammensetzung III anstelle des Kulturmediums der Zusammensetzung I
verwendet wurde. Es wurde gefunden, daß sich 22,2 g L-Tryptophan in der Reaktionsflüssigkeit angesammelt hatten. Bei
einem Vergleichsansatz, dem Serinracemase nicht zugesetzt wor-
030064/0593
den war, betrug die Menge des angesammelten L-Tryptophans
19,3 g (die Ausbeute betrug 28 %, bezogen auf Serin).
Kulturmediumzusammensetzung III.
| L-Tryptophan: | 0,2 % | |
| KH2PO4: | 0,5 % | |
| MgSO4-TH2O: | 0,05 % | |
| Maisquell flüssigkeit: |
6,00 % | |
| Casaminosäure: | 2,0 % | |
| Anfangs-pH: | 8,0 | |
| Beispiel 4 |
Kulturzellen des Tryptophansynthetase-produzierenden
Stamms und solche des Serinracemase-produzierenden Stamms, ·
abgetrennt nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode, wurden separat in reinem Wasser zu jeweils 100 ml Suspensionen
suspendiert. Jede Suspension wurde mit 15 g Acrylamid, 1g'
Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid, 15 ml 4%igem ß-(Dimethylamine)-propionitril
und 10 ml 2%igem Kaliumpersulfat gemischt, und das Gemisch konnte bei Raumtemperatur 15 min still stehen.
Das Reaktionsprodukt wurde pulverisiert und mit reinem Wasser gewaschen. So wurden jeweils 150 g der fixierten Enzyme
erhalten.
Dann wurden jeweils 150 g der fixierten Enzyme, 1,0 g
Indol, 2,0 g DL-Serin, 1 g Natriumsulfat und 100 mg Pyridoxal-
030064/05 93 -
phosphat zu Wasser gegeben, so daß das Gesamtvolumen 1 1 betrug. Die Reaktionsflüssigkeit wurde 72 h bei 300C zur
Reaktion geschüttelt. Es wurde gefunden, daß sich 1,14 g L-Tryptophan in der Reaktionsflüssigkeit nach der Reaktion
angesammelt hatten (Ausbeute 29 %, bezogen auf Serin).
Die fixierten Enzyme wurden nach der Reaktion aus der
Reaktionsflüssigkeit abgetrennt, und gebildetes L-Tryptophan wurde aus der Restflüssigkeit abgetrennt, und gleichzeitig wurde
eine Indol, DL-Serin und andere Zusätze darin gelöst enthaltende
Substratlösung zu den abgetrennten fixierten Enzymen gegeben. Die Reaktion wurde in der gleichen Weise wie oben beschrieben
wiederholt. Selbst nachdem die fixierten Enzyme so 30mal wiederholt verwendet wurden, war die Menge an gebildetem
L-Tryptophan überhaupt kaum verringert.
Im übrigen war die Abtrennung der fixierten Enzyme durch Filtrieren sehr leicht.
Zum Vergleich wurde die Reaktion in gleicher Weise wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die
Kulturzellen des Serinracemase-produzierenden Stamms nicht verwendet wurden. Nach der Reaktion hatte sich L-Tryptophan
nur in einer Menge von 0,94 g in der Reaktionsflüssigkeit
angesammelt (die Ausbeute betrug 24 %, bezogen auf Serin).
030064/0593
Der Versuch erfolgte in der gleichen Weise, wie in Beispiel 4 beschrieben, mit der Ausnahme, daß Aerobacter aerogenes
IFO 3317, ein Tryptophanase-produzierender Stamm, anstelle von Escherichia coli MT-10231, wie in Beispiel 4 verwendet,
und das Kulturmedium der Zusammensetzung III verwendet wurde. Es wurde gefunden, daß sich 0,89 g L-Tryptophan angesammelt
hatten (die Ausbeute betrug 23 %, bezogen auf Serin). Bei einem Vergleichsansatz, dem Serinracemase nicht zugesetzt
worden war,- betrug die Menge an angesammeltem L-Tryptophan 0,77 g (die Ausbeute betrug 20 %■_, bezogen auf Serin).
Bezugsbeispiel 1
Escherichia coli W wurde bei 300C und einem pH von 7,2
bei einer Belüftungsrate von 10 l/min für 21,5 h in einem Fermentator mit einer Kapazität von 20 1 kultiviert, der mit
■v
10 1 eines Kulturmediums nachfolgend beschriebener Zusammen- '
setzung beschickt war. Als Ergebnis wurden 315 g Zellen mit
einem Wassergehalt von 80 % erhalten.
Kulturmediumzusammensetzung:
| Glukose: | 2,00 |
| (NH4I2SO4J | ■ 0,50 |
| KH2PO4: | 0,10 |
| MgSO4: | ■Pt 05. |
| Indol: | ο,στ |
| Casaminosäurer | 0,025 |
Q30a64/05ä3
Dann wurden 0,16 g der so gesammelten Zellen in ein mit einer Reaktionsflüssigkeit nachfolgend beschriebener Zusammensetzung
beschicktes Testrohr gebracht und das Gemisch bei 300C geschüttelt.
Zusammensetzung der Reaktionsflüssigkeit: L-Serin: 1,91 %
Na2SO3: 0,10 %
Pyridoxalphosphat: 0,01 % (NH4J2SO4: 0 bis 2,46 % (verschieden)
Nach 48-stündiger Reaktion wurde der Inhalt auf L-Serin durch Hochgeschwindigkeits/Flüssig-Chromatographie analysiert,
um die in Tabelle I aufgeführten Ergebnisse zu erzielen:
| Tabelle I | Ansatz | i' | 2 |
| (NH4)2S04-KDnzentration (%) | 0 | 0,615 | |
| (Ammoniumionenkonzentration, | (0) | (0,10) | |
| Hol/l) | |||
| L-Serin-Konzentration (g/l) | 3,8 | 8,5 | |
| L-Serin-Zersetzungsverhältnis | |||
| 79,3 | 55,5 | ||
1,23 2,46
(0,19) (0,37)
15,4 19,1 19,4
Wie aus den Ergebnissen der Tabelle I zu ersehen ist, betrug das L-Serin-Zersetzungsverhältnis 79,3 %, wenn die
Ammoniumionenkonzentration 0 Mol/l war, wurde aber die Ammoniumionenkonzentration erhöht, sank das L-Serin-Zersetzungsverhältnis,
und wenn die Ammoniumionenkonzentration
030064/05 93
0,37 Mol/l war, wurde das L-Serin-Zersetzungsverhältnis auf
0 % herabgesetzt.
Bezugsbeispiel 2
Die in Beispiel 1 erhaltenen Zellen wurden lange bei -15°C aufbewahrt, und 0,32 g der Zellen wurden in ein Testrohr
gebracht, das mit 10 ml Reaktionsflüssigkeit mit nachfolgend
angegebener Zusammensetzung beschickt wurde. Das Gemisch wurde bei 300C 48 h geschüttelt, und D-Serin wurde
wie im Bezugsbeispiel· 1 analysiert.
Zusammensetzung der Reaktions flüssigkeit::
D-Serin: 2,03 %
Na3SO3: 0,10 %
Pyridoxalphosphat: 0,01 % NH4Cl: 0 bis 2 % (variabel)
Na3SO3: 0,10 %
Pyridoxalphosphat: 0,01 % NH4Cl: 0 bis 2 % (variabel)
Die erzielten Ergebnisse zeigt Tabe^e II.
030064/0593
| Tabelle II | η, | (O) | 2 | 1 | 3 | ,0 |
| 1 | ) 1,2 | 0, | 2 | |||
| O | 02) | ,37) | ||||
| (0, | 5 | (0 | ,9 | |||
| 11/ | 17 | |||||
Ansatz
NH4C1-Konzentration (%)
NH4C1-Konzentration (%)
(Ammoniumionenkonzentration,
Mol/l)
Mol/l)
D-Serin-Konzentration (g/1)
D-Serin-Zersetzungsverhältnis
D-Serin-Zersetzungsverhältnis
(%) 94,0 43,3 11,8
Aus den Ergebnissen der Tabelle II wurde gefunden, daß nicht nur L-Serin, sondern auch D-Serin zersetzt und das D-Serin-Zersetzungsverhältnis
mit steigender Ammoniumionenkonzentration herabgesetzt wird.
Bezugsbeispiel 3
Pseudomonas putida IFO 12996 wurde in 150 ml eines Kulturmediums
nachfolgend beschriebener Zusammensetzung eingeimpft, das in einen Sakaguchi-Kolben mit einem Fassungsvermögen
von 500 ml gebracht wurde, und es wurde bei 3O0C 24 h schütte
lkultiviert.
Zusammensetzung des Kulturmediums:
| Fleischextrakt: | 0,3 |
| Polypepton: | 0,5 |
| Glukose: | 3,0 |
| pH: | 7,0 |
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Nach dem Kultivieren wurden Zellen durch Zentrifugalabscheidung
gesammelt. Durch Verwendung der so gesammelten Zellen in einer Menge entsprechend 20 ml Kulturflüssigkeit wurde
der Einfluß des Ammoniumions auf die Zersetzung von Serin untersucht. Die Versuche wurden für L-Serin und D-Serin
getrennt durchgeführt.
Die erzielten Ergebnisse zeigt Tabelle III.
Ansatz 1 2 3
NH4C1-Konzentration (%) 0 0,5 .2,0
(Ammoniumionenkonzentration,
Mol/l) (0) (0,10) (0,38)
L-Serin-Konzentration 1 (g/l) 0 13,3 18,9
L-Serin-Zersetzungs-
verhältnis (%) 100 30,0 O
D-Serin-Konzentration 2 (g/l) 3,8 8,7 17,5
D-Serin-Zersetzungsverhältnis (%) 81,3 · 57,1 13,8
1) Die L-Serin-Anfangskonzentration war 19,0 g/l
2) Die D-Serin-Anfangskonzentration war 20,3 g/l
030064/0593
In 1 1 einer Reaktionsflüssigkeit nachfolgend beschriebener
Zusammensetzung wurden 31,5 g der in Bezugsbeispiel 1 erhaltenen nassen Zellen gebracht, und die Reaktion wurde bei
350C 10 h durchgeführt. Gebildetes L-Tryptophan und L-Serin
wurden nach der Hochgeschwindigkeits/Flüssigkeits-Chromatographie analysiert.
Zusammensetzung der Reaktionsflüssigkeit:
Indol: 2,0 %
L-Serin: 3,0 %
Na2SO3: 0,10 %
L-Serin: 3,0 %
Na2SO3: 0,10 %
Pyridoxalphosphat: 0,01 %
(NH4KSO4: ' 0 oder 2,5 %
(Ammoniumionenkonzentration: (0 oder 0,19
Mol/l)
Das Indol wurde allmählich über 10h bei weiterlaufender
Reaktion zugesetzt.
Nach 10-stündiger Reaktionsdauer wurden die Mengen des L-Tryptophans*und
L-Serins in der Reaktionsflüssigkeit bestimmt, um die in Tabelle IV wiedergegebenen Ergebnisse zu erhalten.
030064/0593
gebildetes L- restliches L-Tryptophan (%) Serin (%)
ohne (NH.)2SO4-Zusatz
mit 2,5 % (NH4J2SO4
2,51 3,49
< 0,1 1 ,18
Den Ergebnissen der Tabelle IV ist zu entnehmen, daß, wenn 2,5 % (NH4J3SO4 zugesetzt wurden, L-Tryptophan in
100%iger Ausbeute, bezogen auf zugesetztes Indol, gebildet
und restliches L-Serin kaum zersetzt wurde, während ohne Ammoniumsulfatzusatz die Ausbeute an L-Tryptophan niedrig
war und restliches L-Serin wesentlich zersetzt wurde.
030064/0-593
Claims (11)
1. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von L-Tryptophan,
dadurch gekennzeichnet* daß Indol mit L-Serin
in Gegenwart von Tryptophansynthetase oder Tryptophanase umgesetzt wird, wobei DL-Serin oder D-Serin als Ausgangsmaterial
verwendet und dieses mit Serinracemase zur Umwandlung wenigstens eines Teils des D-Serins in L-Serin umgesetzt
wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß DL-Serin oder D-Serin zuerst mit Serinracemase zur Umwandlung
wenigstens eines Teils des D-Serins in L-Serin und dieses dann mit Indol umgesetzt wird.
030064/0593
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß DL-Serin oder D-Serin mit durch Tryptophansynthetase
oder Tryptophanase gleichzeitig vorliegend gemachter Serinracemase zur Umwandlung eines Teils des D-Serins in L-Serin
und dieses gleichzeitig mit Indol umgesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einer Temperatur von 20 bis 600C und
einem pH von 6,0 bis 11,0 durchgeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einer Temperatur von 30 bis 45°C und
einem pH von 7,5 bis 9,0 durchgeführt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß Tryptophansynthetase oder Tryptophanase oder Serinraceraase
fixiert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß Tryptophansynthetase oder Tryptophanase und Serinracemase
fixiert werden.
8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß gezüchtete Zellen eines Tryptophansynthetase oder Tryptophanase oder Serinracemase enthaltenden Mikroorganismus
oder dessen Extrakte verwendet werden.
03006Α/Ό593
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
daß es in Gegenwart eines Ammoniumions in der Reaktionsflüssigkeit in einer Menge von 0,01 bis 2 Mol/l durchgeführt
wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
daß es in Gegenwart eines Ammoniumions in der Reaktionsflüssigkeit in einer Menge von 0,1 bis 0,5 Mol/l durchgeführt
wird.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Ammoniumion ein anorganisches oder organisches
Ammoniumion verwendet wird.
030064/0593
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| EP0073381A1 (de) * | 1981-08-31 | 1983-03-09 | Schering Aktiengesellschaft | Verfahren zur Extraktion von aromatischen Aminosäuren aus wässriger Phase |
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