DE3341763A1

DE3341763A1 - Verfahren zur synthese von l-serin sowie reinkultur zur durchfuehrung des verfahrens

Info

Publication number: DE3341763A1
Application number: DE19833341763
Authority: DE
Inventors: David Martin Rockville Anderson, Md.; Klaus Manfred Prof. West Lafayette Ind. Herrmann; Humg-Yu Gaithersburg Hsiao, Md.; Ronald Lamont Prof. West Lafayette Ind. Somerville
Original assignee: Genex Corp
Current assignee: Genex Corp
Priority date: 1982-11-19
Filing date: 1983-11-18
Publication date: 1984-10-04
Also published as: DK529583A; BE898261A; AU2149383A; FI834231A; IT8368213A0; DK529583D0; NL8303978A; GB8330859D0; LU85096A1; SE8306351D0; PL244608A1; GB2130216A; IL70271A0; CA1217158A; FR2536415B1; ES8602128A1; CH657373A5; JPS59109187A; SE8306351L; FI834231A0

Description

HOFFMANN · EITLE & PARTNER

PATENTANWÄLTE DR. ING. E. HOFFMANN {1930-1976) . Dl PL-IN G. W. EITLE . D R. R E R. NAT. K.HOFFMANN · DI PL.-1N G. W. LEHN

Dl PL.-ING. K. FOCHSLE · DR. RE R. N AT. B. H AN S E N ARABELLASTRASSE 4 · D-BOOO M 0 N CHEN 81 . TELEFON (089) 911087 · TELEX 05-29ί19 (PATHE)

- 6 - 39 402 m/fg

Genex Corporation, Rockville / USA

Verfahren zur Synthese von L-Serin sowie Reinkultur zur Durchführung des Verfahrens

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von L-Serin sowie Reinkultur zur Durchführung des Verfahrens.

Die Aminosäure L-Serin stellt ein wertvolles Handelsprodukt dar, das bei der Hyperalimentation und in Nährstoffzusammensetzungen sowie als Zwischenprodukt oder Ausgangsmaterial bei verschiedenen Syntheseverfahren verwendet wird. Es besteht somit ein Bedarf nach L-Serin; mehrere Verfahren zur Herstellung desselben sind bisher entwickelt worden. Einige dieser Verfahren betreffen die fermentative Herstellung von L-Serin. In diesem Zusammenhang wird z.B. auf Morinaga, Y. et al., Agric. Biol. Chem. 45(6)1419-24 (1981); Morinaga, Y., et al., Agric. Biol. Chem. 45(6)1425-1430 (1981) verwiesen. Auch US-PS 3, 616,224 (Shiio et al, 1971) offenbart ein Verfahren zur lermentativen Herstellung von Aminosäuren, einschliesslich Serin, wobei bestimmte Bakterienstämme auf einem Medium gezüchtet werden, welches als assimilierbare Kohlenstoffquelle Methanol enthält. Hierzu wird auch auf US-PS 3,943,038 (Morinaga et al, 1976) verwiesen; diese Druckschrift offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Serin und anderen Aminosäuren

durch Züchten spezifischer Bakterienstäirune in einem wässrigen Kulturmedium in Gegenwart von Sauerstoff, Wasserstoff und Kohlendioxid.

Diese bekannte! fermentativen Methoden zur Herstellung von Serin weisen den gemeinsamen Nachteil auf, dass die in der Kulturbrühe produzierte L-Serin-Konzentration und der aus dieser Brühe gewonnene L-Serin-Gehalt relativ niedrig sind, und zwar auch nach relativ langen Permentationszeiten.

Serin kann auch mittels chemischer Syntheseverfahren hergestellt werden. Hierzu wird z.B. auf Kanedo(Herausgeber)"Synthetic Production and Utilizationof Amino Acids", Halsted Press Books (1974) verwiesen. Diese chemischen Verfahren produzieren Serin häufig als eine racemisches Gemisch von optischen D- und L-Isomeren oder als das weniger bevorzugte D-Isomer. DL-Gemische müssen aufgetrennt werden, wobei man sich folgender Methoden bzw. Mittel bedient: D-Serin-abbauende Bakterien, Serihracemase, L-Aminosäureacylase, fraktionierte Kristallisation von Serinderivaten etc.; diese zusätzlichen Verfahren komplizieren die Serinherstellung und erhöhen die Kosten des Produktes.

Es ist bekannt, dass L-Serin aus Glycin hergestellt werden kann. Die biologische Herstellung von L-Serin aus Glycin ist mit mehreren Mikroorganismen erzielt worden. Hier wird z.B. auf Tanaka, Y., et al., J. Ferment. Technol. 59:447 (1981) verwiesen. Ebenso wie bei den fermentativen Verfahren hat dieses Verfahren den Nachteil, dass die Ausbeute an L-Serin typischerweise nicht sehr hoch ist.

Es besteht somit ein Bedarf nach einem Verfahren zur Synthese von L-Serin in hohen Ausbeuten.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Synthese von L-Serin zu entwickeln, bei welchem das Serin

in hohen Konzentrationen in einer Lösung produziert wird, aus welcher Serin gut gewonnen werden kann.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines enzymatisehen Mittels zur Herstellung von L-Serin, wobei die Reaktion in einem absatzweisen oder immobilisierten System ausgeführt werden kann.

Es wurde nunmehr gefunden, dass L-Serin in effizienter Weise TO aus Glycin und Formaldehyd in Gegenwart biokatalytischer Me'ngen des Enzyms Serinhydroxymethy!transferase und dem Co-Faktor Tetrahydröfolat unter Serin-produzierenden Bedingungen synthetisiert werden kann. Das Enzym kann in ganzen Zellen, als Rohextrakt oder als gereinigtes Enzym vorliegen; es kann in immobilisierter oder nicht-immobilisierter Form eingesetzt werden.

Es ist bekannt, dass das Enzym Serinhydroxymethyltransferase ( im folgenden als SHMT bezeichnet) die Spaltung von Serin zu Glycin in einer Reaktion katalysiert, die von den Co-Faktoren Pyridoxal-5'-phosphat und Tetrahydröfolat abhängig ist. Die Reaktion ergibt Glycin und Methylentetrahydrofolat. In diesem Zusammenhang wird auf Schirck, L., Advances in Enzymology 5j3:83 (1982) verwiesen. Es wurde nun gefunden, dass das Enzym SHMT in effizienter Weise als Biokatalysator zur Herstellung von L-Serin aus Glycin und Formaldehyd verwendet werden kann. Die Reaktion erfolgt in Gegenwart des Co-Faktors Tetrahydröfolat (THF). Die THF-Quelle kann die SHMT-Quelle darstellen, denn THF wird in Mikroorganismenzellen, die SHMT enthalten, gefunden; oder THF kann in Form einer exogenen Quelle zugefügt werden. Ein Vorteil dieser Methode besteht darin, dass dabei nur das optische Isomer L-Serin gebildet wird. Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass nach Beendigung der Reaktion der Reaktorinhalt nur Glycin und L-Serin enthält, anstelle eines komplexen Gemisches, das man in einer Fermentationsbrühe oder als Ergebnis einer chemischen Synthese erwarten würde.

Es ist überraschend, dass L-Serin aus Glycin und Formaldehyd synthetisiert werden kann, denn es ist bekannt, dass Formaldehyd chemisch mit Proteinen reagiert und dabei Enzyme inaktiviert (French, D., et al., Advances of Protein Chemistry 2:277-335 (1945)). In der Tat wird SHMT schnell durch Formaldehyd inaktiviert. Es ist jedoch gefunden worden, dass das Enzym durch Zugabe von überschüssigem Tetrahydrofolat zu dem Reaktionsgemisch geschützt werden kann. THF reagiert mit dem Formaldehyd, wobei es das Enzym schütz-t.

Durch.chemische Modifizierung von SHMT lässt sich ebenfalls eine Stabilisierung und ein Schutz vor Formaldehydinaktivierung erzielen. So wurde z.B. festgestellt, dass eine Umsetzung von Iiciidoestern mit Aminogruppen ( siehe Means, G., et al., Chemical Modifications of Proteins, Holden-Day, Inc., 1971) auf der Enzymoberfläche gewährleistet, dass das Enzym in Gegenwart höherer Formaldehydkonzentrationen als das nichtmodifizierte Enzym aktiv ist.

Der enzymatiSche Stoffwechselschritt, von dem angenommen wird, dass danach die Synthese von L-Serin aus Glycin verläuft, ist nachfolgend angegeben:

Formaldehyd + THF '"** Methylen-THF

SHMT

Methylen-THF + Glycin <!!? L-Serin + THF

Es ist" bevorzugt, die Reaktion unter anaeroben Bedingungen, wie z.B. in Stickstoffatmosphäre, durchzuführen, um eine Oxidation des THF zu verhindern.

Die Substrate, i.e. SHMT, und der Co-Faktor, THF, können zusammen in verschiedener Weise umgesetzt werden. Obwohl die Reihenfolge, in welcher die Reaktanten und Katalysatoren zugegeben werden,'nicht kritisch ist, ist es bevorzugt, dass

das Glycin und Formaldehyd langsam zu SHMT in Gegenwart von THF zugegeben werden. Die Reaktionsführung erfolgt unter L-Serin-produzierenden Bedingungen. Wenn das E. coli SHMT-Gen (glyA) als SHTM-Quelle verwendet wird, so sehen diese Bedingungen im allgemeinen eine Reaktionstemperatur von ca. 4 bis ca. 60⁰C und einen pH-Wert im Bereich von ca. 4 bis ca. 11 vor. Bevorzugte Reaktionsbedingungen sehen eine Reaktion bei einer Temperatur von ca. 20 bis ca. 45°C und einen pH-Wert von ca. 6 bis 8,5 vor. Wenn die Temperatur unterhalb ca. 4⁰C liegt, so verlangsamt sich die Reaktion deutlich, und wenn die Temperatur über ca. 60⁰C liegt, wird das Enzym denaturiert. In ähnlicher Weise kann bei einem pH-Wert von unterhalb ca. 4 oder höher als ca. 11 das Enzym denaturiert werden. SHMT stellt ein zentrales Enzym im Metabolismus von Mikroorganismen und höheren Organismen dar. Somit gibt es viele potentielle Quellen für dieses Enzym. Die jeweiligen Bedingungen, bei welchen die Reaktion zur Herstellung von L-Serin durchgeführt wird, stehen in Beziehung zur jeweils eingesetzten Enzymquelle. Z.B. könnten Enzyme, die aus thermophilen Mikroorganismen erhalten wurden, bei einer höheren Temperatur eingesetzt werden, als dies bei Enzymen aus E. coli der Fall ist.

Die Serinhydroxymethy!transferase kann in Form ganzer Zellen, in Form eines Rohextraktes oder als gereinigtes Enzym vorliegen. Das Enzym kann in immobilisierter oder nicht-immobilisierter Form eingesetzt werden. Das Enzym wird in ausreichenden Mengen verwendet, um die Reaktion zu katalysieren.

Das Enzym kann aus Mikroorganismen erhalten werden, die unter Anwendung konventioneller gentechnologischer Methoden modifiziert worden sind, um hohe Ausbeuten zu ergeben (siehe Stauffer, G., et al., Gene 15:63-72 (1981)). Das SHMT-Gen (glyA) kann isoliert und in ein Plasmid kloniert werden, welches dann dazu dienen kann, geeignete Wirtszellen zu

transformieren, um ein hohes Niveau der SHMT-Expression zu ergeben. Mutierte Mikroorganismen, die in ihrem Methionin-Metabolismus modifiziert worden sind, werden ebenfalls SHMT in einer Überproduktion bilden (Stauffer, G.V., und Brenchley, J.E., Genetics 88, 221 (1978) und Stauffer, G.V., und Brenchley/ J.E., J. Bacteriol. 129, 740 (1977)). Unter Einsatz von Genklonierungstechniguen wurde die Enzymaktivität bis auf das 20-fache erhöht; auf diese Weise kann die Enzymaktivität mehr als 10 % des löslichen Proteins in der Zelle darstellen.

"10 Ein E. coli-Stamm (Gx1703) , der mit einem derartigen Plasmid transformiert wurde, insbesondere ein Derivat von pBR322 in welches das glyA-Gen kloniert wurde, pGx122, wurde im Northern Regional Research Laboratory in Peoria, Illinois, unter der NRRL Nr. B-1.5215 hinterlegt. Ein Klebsiella aerogenes-Stamm (Gx1704), transformiert mit einem ähnlichen, jedoch kleineren·. Plasmid mit einer Änderung, die eine Hohe Kopierzahl bewirkt, pGX139, wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland unter der Nr."ATCC 39214 und ein Salmonella typhimurium-Stamm' (Gx1682), transformiert mit pGX139, wurde unter der Nr. ATCC 39 215 bei dem vorstehenden Institut hinterlegt.

Wenn ausserdem das Gen aus einer Quelle, wie z.B. E. coli stammt, kann es durch ungezielte Mutagenese oder durch orts-

25' orientierte Mutagenese modifiziert werden, um ein Enzym mit verbesserter Stabilität zu bilden. Alternativ kann das Gen vollständig chemisch mit verschiedenen Änderungen synthetisiert werden, um die Enzymstabilität bei dem offenbarten Verfahren zu verbessern.

Ganze Zellen können eine Quelle für THF darstellen. Sofern dies gewünscht wird, kann zusätzlich THF bis zur Sättigung zugegeben werden; das jeweilige Sättigungsniveau hängt vom pH-Wert und der Temperatur ab. Bei einem pH-Wert von ca. 7,5 und einer Reaktionstemperatur von ca. 37⁰C kann THF in

wässriger Lösung z.B. bis zu einer Konzentration von über 50 itiM zugegeben werden. Der pH muss während der Auflösung des THF eingestellt werden. Wenn SHMT entweder als Rohextrakt oder als gereinigtes Enzym zugegeben wird, so ist eine unabhängige THF-Quelle erforderlich. Die zugegebene THF-Menge variiert mit der Temperatur, den Bedingungen des Lösungsmittels und dem pH, bei welchem die Reaktion durchgeführt wird.

Es wurde gefunden, dass THF seine Aktivität gegenüber SHMT behält, wenn es immobilisiert ist. Die Immobilisierung von THF durch Aufbringen desselben auf einen Träger, der in einem Bioreaktor zur Durchführung der Reaktion angebracht werden kann, ist vorteilhaft, da dadurch die wiederholte Verwendung des Co-Faktors nach Beendigung der L-Serin-Synthese möglich ist. THF kann z.B. mit löslichen Polymeren, wie Dextran, Polyethylenglycol oder Polyethylenimin, immobilisiert werden. Die Immobilisierung erfolgt mittels kovalenter Bindung in den ersten beiden Fällen und mittels ionischer Wechselwirkung im dritten Fall. Eine kovalente Bindung erfolgt im allgemeinen durch die Carboxygruppen des THF mit einer Aminogruppe des -Trägers. In alternativer Weise kann THF auch an einen unlös-. liehen Träger gebunden werden, wobei ähnliche Bindungsmethoden angewendet werden.

Wenn andererseits Serin in einem chargenweisen Verfahren synthetisiert wird, ist es möglich, THF zu recyclisieren. Nach der Synthese von L-Serin kann die Reaktionslösung z.B. über Aktivkohle oder ein Ionenaustauschharz gegeben werden, die THF aus der L-Serin-Lösung zurückhalten und abtrennen. Das THF kann dann freigesetzt und neutralisiert werden. Alternativ kann THF durch kovalente Bindung an ein kleines Molekül modifiziert werden, wie z.B. einem Glucosamin, um die Wiedergewinnung des Co-Faktors zu erleichtern. Nach der Synthese von L-Serin wird die Reaktorlösung über eine Boratsäule

gegeben. Das Borat bindet nur das THF-Glucosamin, und das modifizierte THF kann freigesetzt und recyclisiert werden. Glycin und Formaldehyd werden vorzugsweise zu dem Tetrahydrofolat-SHMT-Gemisch zugegeben. Die Glycinmenge, die zugegeben werden kann, variiert in Abhängigkeit vom pH-Wert, der Temperatur, den Lösungsmittelbedingungen der Reaktion; im allgemeinen kann es bis zur Erreichung des Sättigungsgrades zugegeben werden .

Wie vorstehend bereits ausgeführt, kann Formaldehyd gegenüber SHMT sehr toxisch sein. Das Formaldehyd wird deshalb im allgemeinen langsam zu den anderen Komponenten zugegeben; seine Zugabe wird reguliert. Das Formaledhyd wird in einer Menge zugegeben, um die enzymatische Aktivität aufrechtzuerhalten, im allgemeinen bis zu einer Konzentration, die weniger als 10 mM über der eingesetztenTHF-Konzentration beträgt; dennoch kann das Formaldehyd in einer Konzentration zugegeben werden, die bis zu ca. 50 mM höher ist als die eingesetzte THF-Konzentration. Je höher die THF-Konzentration in dem System ist, umso höher kann die Formaldehyd-Konzentration eingestellt werden, denn das THF reagiert bevorzugt mit dem Formaldehyd, wodurch ein Schutz des Enzyms erfolgt. Der Reaktionsmechanismus von THF und Formaledehydwird von Kallen, R.G., et al., J_^ Biol. Chem. 241(24)5851-5863 (1966) beschrieben. Je höher die ' Enzymaktivität in dem Reaktor ist, umso schneller wird das Formaldehyd zugegeben, um die gewünschte Konzentration aufrechtzuerhalten.

Es wurde auch gefunden, dass es vorteilhaft sein kann, einen zweiten SHMT-Co-Faktor, i.e. Pyridoxal-5'-phosphat, zu den Reaktanten zuzugeben. Pyridoxal-5'¹-phosphat ist fest an das

Enzym gebunden'. Wenn L-Serin in einem Reaktor über einen länge-. ren Zeitraum synthetisiert wird, kann das PyridoJfcalphosphat verloren gehen oder es kann inaktiviert werden, so dass in diesem Falle zusätzliches Pyridoxa!phosphat zugegeben werden kann.

Ein Verlust des Co-Faktors während der Synthese wird durch das Verschwinden der gelben Farbe der Reaktionslösung und einen Verlust der Serinhydroxymethyltransferase-Aktivität angezeigt. Die Konzentration des zu der Reaktion zugegebenen Pyridoxalphosphats kann von 0 bis ca. 20 mM schwanken, vorzugsweise liegt die Konzentration im Bereich von ca. 0,1 mM bis ca. 1 mM.

Die Zugabe von überschüssigem Pyridoxalphosphat kann einem weiteren Zweck dienen. Es wurde gefunden, dass in einigen Mikroorganismen, die durch Plasmide transformiert worden sind, welche das gIyA-Gen enthalten und welche hohe SHMT-Gehalte exprimieren, die Zugabe von Pyridoxal-5¹-phosphat erforderlich ist, um die vorliegende SHMT zu sättigen und die beobachtete Enzymaktivität zu steigern. Ein solcher Mikroorganismus ist Klebsiella aerogenes, welcher das vorstehend angegebene Plasmid pGx13 9 enthält.

Die Synthesereaktion kann in Gegenwart beliebiger, die Reaktion nicht nachteilig beeinflussender Lösungsmittel durchgeführt werden. Beispiele derartiger Lösungsmittel umfassen Ethanol, Methanol, Isopropanol und Dioxan.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne diese zu beschränken.

Beispiel 1

Bakterienstämme mit und ohne dem Plasmid pGx139 wurden in LB-Medium (10g/l Bacto-tryptone, 5 g/l Hefeextrakt, 5g/l Natriumchlorid) oder Minimal-Medium (10,5 g/l K₃HPO₄, 4,5 g/l KH₂PO₄, 1,0 g/l (NH₄)₂ SO₄ und 0,5 g/l Natriumeitrat.2H₂O), ergänzt durch 0,4 % Glucose oder Lactose, gezüchtet. Aminsäuren wurden bis zu 20 μg/ml und Vitamine bis zu 1 μ^/ΐηΐ, wenn angezeigt, zugegeben. Die spezifische Aktivität von Serinhydroxymethyl-

transferase wird ausgedrückt als nMol ß-Phenylserin, das pro Minute pro mg extrahierbarem Protein nach Ultrabeschallung der Zellen zu Benzaldehyd und Glycin umgewandelt wird.

Die Bestimmungen erfolgten in 50 mM phosphatpuffer bei pH 7,3 mit 0,1 mM Pyridoxalphosphat und 35 mM ß-Phenylserin bei 20⁰C, Die Bildung von Benzaldehyd wurde bei 270nm in einem aufzeichnenden Spektralfotometer registriert.

- Vtr-

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SHMT Spezifische Aktivität (nMol/Min./mg)

Stamm	Plasmid	LB-Medium	-	28	Klebsiella aerogenes	pGxl39	36 590 223	Minimal- Medium	Ergänzung
E.coli					GX1704 GX1704
GX1698	-	39	pGxl39	152	N.D.*
GX1671 GX1703	pGxl39 pGxl39	221 141			N.D. 533	Glucose, Phenylalanin ., Thiamin,.
GX1703	pGxl22	218	682	glucose, Phenylalanin , Thiamin.
salmonella tvphimurium LT2
GX1682	10	Glucose Tryptophan
	17	Lactose, Tryptophan
GX1682	133	Glucose, Tryptophan
	306	Lactose, T.ryptophan

- N.D. 114 108	Glucose Lactose

Stamm E.coli GX1698 GX1671

GX1703

Genotyp

trpEA , tna2, serB , laclq ts

thi, ara, strR, glyA, [serB trpR] , laclql, lacZ::tn5

glyA, pheA, thi, Iac , ara, strR

Salmonella Typhimurium LT2

GX1682 trpBEDC43 F¹ laclg ts420 pro Klebsiella aerogenes

GX1704 lsd (L-Serin-desaminase-Mutante) * nicht bestimmt.
5

E. coli-Stamm GX 1671, der das Plasmid pGx139 enthält, ist ein zusätzlicher repräsentativer Stamm, der als SHMT-Quelle bei dem erfindungsgemässen Verfahren verwendet wurde.

Beispiel 2 ·

Eine Kolonie Escherichia coli-Stamm GX 1703 (welcher pGx122 enthielt), die unter der Nr. NRRL B-15215 hinterlegt worden war, wurde in 100 ml Kulturmedium I, wie es nachstehend beschrieben wird, inokuliert und über Nacht bei 37⁰C geschüttelt.

Kulturmedium I:	10,5 g/l
K₂HPO₄	4,5 g/l
KH₂PO₄	1 g/l
20 (NH₄)₂SO₄	0,5 g/l
Natriumzitrat . 2H₂O	20 ug/ml
Phenylalanin	1 μ9/πι1
Vitamin B-	100- yg/ml
• Ampicillin	2 mM
25 MgSO₄ ■	5 mg/ml
FeSO₄

Die Zellen.wurden durch Zentrifugieren des Zellkulturmediums gesammelt und ..als Enzymquelle verwendet. Glycin (12 rnM, Endkonzentration) wurde mit Tetrahydrofolat (5 mM, Endkonzentration) , Pyridoxalphosphat (1 mM) und Formaledehyd (10 mM, Endkonzentration) unter einer Stickstoffdecke vermischt. Der pH wurde mit 0,1M Kaliumphosphatpuffer auf 7,6 gehalten; das

NACHGEREtCHTj

Endvolumen des Reaktionsgemisches betrug 100 ml. Die Reak- ' · tion wurde durch Vermischen der vorstehend genannten Reaktionslösung und der Zellen bei 37°C unter Schütteln gestartet. Nach 8 h hatten sich 5 mM Serin gebildet (die Ausbeute betrug 45 %, bezogen auf Glycin). Die gesamte Enzymaktivität wurde aufrecht erhalten. Glycin- und Serinkonzentration wurden unter Anwendung von Hochleistungs-Flüssigchromatografie bestimmi

■Beispiel 3

Eine Kolonie von Klebsiella aerogenes-Stamm GX1704 (welcher pGX139 enthielt), die unter der Nr. ATCC 39214 hinterlegt worden war, wurde, in 100 ml Kulturmedium II, wie es nachfolgend beschrieben wird, inokuliert und bei 3O⁰C über Nacht geschüttelt.

Kulturmedium II	10 g/l
Trypton	10 g/l
NaCl	5 g/l
Hefeextrakt	10 g/l
Glucose

Die Zellen wurden durch ' Zentrifugation des Zellkulturmediums gesammelt und als Enzymquelle verwendet.

Es wurde nach dem Verfahren von Beispiel 2, zur Serinherstellunq verfahren mit der Ausnahme, dass Klebsiella aerogenes anstelle von E. coli verwendet wurde. Nach 8 h hatten sich 7 mM Serin gebildet (Ausbeute 64 %, bezogen auf Glycin). Die gesamte ■ Enzvmaktivität wurde beibehalten.

COPf

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Beispiel 4

Es wurde nach dem Verfahren von Beispiel 2 verfahren mit der Ausnahme, dass teilweise gereinigte Serinhydroxymethyltransferase aus E. coli ,(Stamm GX1703) verwendet wurde. Die Zellen wurden dazu durch Ultrabeschallung bei 4⁰C aufgebrochen. Der überstand wurde nach Zentrifugation gesammelt und mit Ammoniumsulfat (50%ige Sättigung) bei 4°C und pH 7,5 vermischt. Nach Entfernen der Feststoffe durch Zentrifugation wurde das

10. Enzym durch Erhöhung der Ammoniumsulfatkonzentration auf 100%ige Sättigung ausgefällt. Das Enzym wurde durch Zentrifugation gesammelt und dialysiert. Nach 4-stündiger Reaktion hatten sich 10 mM Serin gebildet. Die Ausbeute betrug 90 %, bezogen auf Glycin. Die gesamte Enzymaktivität wurde beibe-5 halten.

Beispiel 5

Es wurde nach dem Verfahren von Beispiel 3 gearbeitet mit der Ausnahme, dass die ursprüngliche Glycinkonzentration 34 0 mM betrug und Formaldehyd (ursprüngliche Konzentration 2 M) mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/h zugegeben wurde. Nach 12h matten sich 119 mfl Serin gebildet.

Beispiel 6

Es wurde nach dem Verfahren von Beispiel 3 gearbeitet mit der Ausnahme, dass Glycin (ursprüngliche Konzentration 2 M) und Formaledehyd (ursprüngliche Konzentration 2 M) mit der aleichen Geschwindigkeit von 1 ml/h zugegeben, wurde. Nach 5 h hatten sich 57 mM Serin gebildet.

Beispiel 7

Es wurde nach'dem Verfahren von Beispiel 3 gearbeitet mit der ■ Ausnahme, dass THF modifiziert wurde. Dextran (5 g, Pharmacia T40) wurde in Wasser bis zu einer Endkonzentration von 5 %

©AD ORIGINAL

Ίχ>ρυ1

aufgelöst. Die Dextranlösung wurde durch Zugabe von 0,1 M NaIO. während 1 h bei Raumtemperatur oxidiert. Das oxidierte Dextran wurde durch Zugabe von Ethanol bis 60 % (V/V) ausgefällt. Dieser Schritt wurde zweimal wiederholt. Das oxidierte Dextran wurde in 100 ml 0,2 M 1,6-Hexandiamin (HMD) bei pH 9,0 aufgelöst. Natriumborhydrid (0,2 g) wurde jeweils nach 30 und 60 Minuten zugegeben. HMD-Dextran wurde über Nacht gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert. THF (5 mM) wurde mit 10 mM i-Ethyl-S-O-dimethylaminopropyD-carbodiimid und 0,5 % HMD-Dextran bei pH 7,0 unter Stickstoffatmosphäre vermischt. Der sich bildende Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt und zweimal mit 0,5 M NaCl-Lösung gewaschen. Das feste THF wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, mit dem Reaktionsgemisch vermischt. Nach 3-stündiger Reaktion hatten sich 7 mM Serin gebildet.

Claims

HOFFMANN · EITLE <£ PARTNER PATENTANWÄLTE DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) . Dl PL-IN G. W. EITLE · D R. RE R. NAT. K. H OFFMAN N · Dl PL-I NG. W. LEHN DIPL.-ING. K. FDCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 · D-8000 M D N CH EN 81 . TELEFON (089) 911087 . TELEX 05-29619 (PATHE) 39 402 m/fg Genex Corporation, Rockville / USA Verfahren zur Synthese von L-Serin sowie Reinkultur zur Durchführung des Verfahrens Patentansprüche

1. Verfahren zur Synthese von L-Serin, dadurch gekennzeichnet , dass man Glycin und Formaldehyd in Gegenwart biokatalytischer Mengen von Serinhydroxymethyltransferase und Tetrahydrofolat unter L-Serin-produzierenden Bedingungen umsetzt.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeich η e t , dass die Temperatur auf ca. 4° bis ca. 6O⁰C und der pH-Wert im Bereich von ca. 4 bis ca. 11 gehalten wird.

3. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeich net-, dass die Temperatur im Bereich von ca. 20° bis ca. 45⁰C und der pH-Wert im Bereich von ca. 6 bis ca. 8,5 gehalten wird.

4. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, dass die Serinhydroxymethyltransferase in ganzen Zellen enthalten ist.

5. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Serinhydroxymethyltransferase in Form eines Rohextraktes vorliegt.

6. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Serinhydroxymethyltransferase in Form eines gereinigten Enzyms vorliegt.

7. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch g e k e η η -

zeichnet, dass die Serinhydroxymethyltransferase immobilisiert ist.

8. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Reaktion im Chargensystem durchgeführt wird.

9. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Reaktion in kontinuierlicher Weise durchgeführt wird.

10. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Quelle für Tetrahydrofolat ganze Mikrobenzellen darstellen, welche Serinhydroxymethyltransferase enthalten.

11. Verfahren gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , dass zusätzliches Tetrahydrofolat zu dem Reaktionssystem zur Erhöhung der Tetrahydrofolatkonzentration bis auf ein Maximum des Sättigungsniveaus zugegeben wird.

12. Verahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Tetrahydrofolatkonzentration im Bereich von ca. 0,15 bis ca. 50 mM liegt.

13. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass ein immobilisiertes Tetrahydrofolat verwendet wird.

14. Verfahren gemäss Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , dass das Tetrahydrofolat mit einem löslichen Polymer immobilisiert wird.

15. Verfahren gemäss Anspruch 13, dadurch g e k e η η TO zeichnet, dass das Tetrahydrofolat durch Bindung an einen festen Träger immobilisiert wird.

16. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass man das Tetrahydrofolat in einer Weise modifiziert, dass es recyclisiert werden kann.

17. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass Glycin zugegeben wird, bis die Reaktionslösung mit Glycin gesättigt ist.

18. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass Formaldehyd bis zu einer Maximalkonzentration zugegeben wird, die ca. 30 mM bis ca. 50 mM

■ grosserals die THF-Konzentration ist. 25

19. Verfahren gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet , dass die Formaldehydkonzentration auf einen stationären Zustand gebracht wird, wonach sie 10 mM höher ist als die THF-Konzentration.

20. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zu den Reaktanten Pyridoxalphosphat in einer Konzentration von 0 bis 2 0 mM zugegeben wird.

21. Verfahren gemäss Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet , dass die Pyridoxalphosphat-Konzentratlon im Berich von ca. 0,1 bis 1,0 mM liegt.

-A-

22. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass als Quelle für SHMT Escherichia coli Stamm GX1703 dient, welcher das Plasmid pGx 122 enthält, und in Northern Regional Research Laboratory unter der Nr. NRLL B-15215 hinterlegt ist.

23. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass als Quelle für SHMT Salmonella thyphimurium Stamm Gx1682 dient, welcher das Plasmid pGx139 enthält, und bei der American Type Culture Collection unter der Nr. ATCC 39 215 hinterlegt ist.

24. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet, dass als Quelle für SHMT Klebsiella aerogenes Stamm GX 1704 dient, welcher das Plasmid pGX139 enthält, und bei der American Type Culture Collection unter der Nr. ATCC 39214 hinterlegt ist.

25. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Aktivität der Serinhydroxymethyltransferase in den Zellen durch genetische Manipulation verstärkt worden ist.

26. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Aktivität der Serinhydroxymethyltransferase in den Zellen durch Klonieren des Serinhydroxymethyltransferase-Gens in ein Plasmid und Transformieren der Wirtszelle mit diesem Plasmid zur Überproduktion von Serinhydroxymethyltransferase verstärkt worden ist.

27. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Serinhydroxymethyltransferase aus einer beliebigen biologischen Quelle erhalten wird. 35

28. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das Serinhydroxymethyltransferase-Gen durch ungezielte Mutagenese oder durch ortsorientierte Mutagenese zur Erhöhung der Enzymstabilität geändert worden ist.

29. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das Serinhydroxymetyltransferase-Enzym chemisch modifiziert wird.

30. Verfahren gemäss Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet , dass das Enzym durch Reaktion mit einem Imidoester modifiziert wird.

31. Im wesentlichen biologisch reine Kultur von Escaerichia coli Stamm GX 1703, welcher das Plasmid pGx 122 enthält.

32. Im wesentlichen biologisch reine Kultur von Salmonella typhimurium Stamm GX 1682, welcher das Plasmid pGx 139 enthält.

33. Im wesentlichen biologisch reine Kultur von Klebsiella arogenes StamnGX 1704, welcher das Plasmid pGx 139

• enthält.
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