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pour Synthèse enzymatique de la L-sérine.
La présente invention concerne un procédé pour synthétiser la L-sérine. La L-sérine est un aminoacide commercialement intéressant utilisé pour l'alimentation et l'hyperalimentation et aussi comme intermédiaire ou matière première dans certaines synthèses. Il existe
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donc un débouché pour la L-sérine pour la production de laquelle différents procédés ont été mis au point. Un certain nombre de ces procédés consistent à produire la L-sérine par fermentation. On peut se référer, par exemple à Morinaga, Y., et al., Agric. Biol. Chem.
45 (6) 1419-24 (1981) ; Morinaga, Y., et al., Agric.
Biol. Chem. 45 (6) 1425-1430 (1981). De plus, le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3. 616.224 (Shiio et al., 1971) a pour objet un procédé pour produire différents aminoacides, notamment la sérine, par fermentation, suivant lequel on cultive certaines souches de bactéries sur des milieux contenant du méthanol comme source de carbone assimilable. On peut se référer aussi au brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3. 943.038 (Morinaga et al. 1976) décrivant un procédé pour produire la sérine et d'autres aminoacides par culture de souches spécifiques de différentes bactéries dans un milieu de culture aqueux en présence d'oxygène, d'hydrogène et de dioxyde de carbone.
Un inconvénient commun aux procédés de fermentation décrits est que la concentration en L-sérine atteinte dans le bouillon et recueillie est relativement faible, même après des durées de fermentation assez longues.
La sérine peut être produite aussi par synthèse chimique. On peut se référer, par exemple à Kanedo, Synthetic Production and Utilization of Amino Acids, Halsted Press Books (1974). Souvent, ces procédés chimiques donnent la sérine sous la forme d'un mélange racémique des isomères optique D et L ou sous la forme de l'isomère D moins intéressant. Les mélanges DL doivent être dédoublés suivant des procédés mettant en jeu des bactéries qui catabolisent la D-sérine, la sérine racémase, une acylase pour les L-aminoacides, la cristallisation fractionnée des dérivés de la sérine ou
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des moyens analogues, ce qui augmente le coût du produit.
On sait que la L-sérine peut être produite à oartir de la qlycine. La oroduction biologinue de la Lsérine à partir de la glycine a déjà été effectuée au moyen de différents micro-orqanismes. Voir, par exemple, Tanaka, Y., et al., J. Ferment. Technol. 59 : 447 (1981). Comme dans les procédés par fermentation, un inconvénient de ce mode opératoire est que le rendement en L-sérine n'est normalement pas fort élevé.
Il serait donc intéressant de disposer d'un procédé pour synthétiser la L-sérine avec des rendements élevés.
La présente invention a donc pour but de procurer un procédé de synthèse de la L-sérine, suivant lequel la sérine est produite en concentrations élevées dans une solution d'où elle peut être recueillie efficacement.
L'invention a aussi pour but de procurer un procédé enzymatique de production de la L-sérine, suivant lequel la réaction peut être conduite en système discontinu ou immobilisé.
La Demanderesse a en effet découvert que la Lsérine peut être synthétisée efficacement à partir de glycine et de formaldéhyde en présence de quantités biocatalytiques de la sérine hydroxyméthyltransférase, qui est l'enzyme, et de tétrahydrofolate, qui est le cofacteur, dans les conditions de la production de la sérine. L'enzyme peut être présente dans des cellules entières ou dans un extrait brut ou bien sous la forme de l'enzyme purifiée et peut être présentée sous forme immobilisée ou non immobilisée.
On sait que la sérine hydroxyméthyltransférase (dite ci-après SHMT) catalyse la scission de la sérine en glycine au cours d'une réaction qui dépend de
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cofacteurs, à savoir le pyridoxal-5'-phosphate et le tétrahvdrofolate. La réaction donne de la glycine et du
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m On peut se r'férer à méthylènetétrahydrofolate.
On peut se référer àSchirck, L., Advances in Enzymology 53 : 83 (1982). La Demanderesse a découvert à présent que la SHMT peut être utilisée avec succès comme biocatalvseur pour
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produire la L-sérine à partir de glycine et de formaldéhvde. La réaction se fait en présence folate (THF) comme cofacteur. La source du THF peut être la source du SHMT, le THF existant dans les microorganismes contenant du SHMT, ou bien le THF peut être ajouté au moyen d'une source exogène. Un avantage de ce mode opératoire est qu'il donne uniquement la L-sérine optiquement active. Un autre avantage est qu'après l'exécution de la réaction, le mélange du réacteur contient uniquement de la glycine et de la L-sérine plutôt qu'un mélange complexe auquel on pourrait s'attendre dans un bouillon de fermentation ou à la suite d'une synthèse chimique.
Il est surprenant que la L-sérine puisse être synthétisée à partir de glycine et de formaldéhyde, du fait qu'on sait que le formaldéhyde réagit chimiquement avec les protéines et inactive les enzymes. On peut se référer à ce propos à French, D., et al., Advances in Protein Chemistry 2 : 277-335 (1945). En fait, la SHMT est rapidement inactivée par le formaldéhyde. La Demanderesse a néanmoins découvert que l'enzyme peut être protégée par addition d'un excès de tétrahydro- folate au mélange de réaction. Le THF réagit avec le formaldéhyde et protège ainsi l'enzyme.
La modification chimique de la SHMT assure également la stabilité et la protection contre l'inactivation par le formaldéhyde. Par exemple, il a été observé que la réaction des imidoesters avec les radicaux amino (voir Means, G., et al., Chemical
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Modification of Proteins, Holden-Day, Inc., 1971) à la surface de l'enzyme permet à l'enzyme d'agir en présence de formaldéhyde en concentrations plus élevées que celles tolérées par l'enzyme non modifiée.
La voie enzymatique envisagée pour la synthèse
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de la L-sérine à partir de la glycine est la suivante :
EMI5.2
formaldéhyde + THF===1méthylène-THF SH, méthylène THF + glycine L-sérine + THF
EMI5.3
Il est préféré que la réaction soit exécutée en milieu anaérobie, par exemple en atmosphère d'azote, pour empêcher l'oxydation du THF.
Les substrats, la SHMT et le THF peuvent être mis à réagir ensemble de différentes façons. Bien que l'ordre dans lequel les réactifs et les catalyseurs sont introduits ne soit pas critique, il est préférable que la glycine et le formaldéhyde soient ajoutés lentement à la SHMT en présence du THF. La réaction est conduite dans les conditions de la production de la Lsérine. Lorsque le gène SHMT de E. coli (glyA) est utilisé comme source de SHMT, ces conditions comprennent généralement une température de réaction d'environ 40e à environ 60 C et un pH d'environ 4 à environ 11. Des conditions de réaction préférées comprennent une température d'environ 20 C à environ 45 C et un pH d'énviron 6 à 8,5.
Lorsque la température est infé-
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rieure à environ 4 C, la durée de réaction augmente beaucoup et lorsque la température excède environ 60 C, l'enzyme peut être dénaturée. De même, à un pH inférieur à environ 4 ou supérieur à environ 11, l'enzyme peut être inactivée. La SHMT est une enzyme centrale pour le métabolisme des micro-organismes et des orga-
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nismes supérieurs et il existe, par conséquent, de nombreuses sources possibles pour cette enzyme. Les gammes de conditions dans lesquelles la réaction produisant la L-sérine peut être effectuée dépendent de l'origine de l'enzyme utilisée. Par exemple, les enzymes provenant des micro-organismes thermophiles pourraient être utilisés à une température plus élevée que celle admissible lorsque l'enzyme est apportée par E. coli.
La sérine hydroxyméthyltransférase peut être présentée sous forme de cellules entières ou d'extrait brut ou bien sous forme d'enzyme purifiée. L'enzyme peut être utilisée sous forme immobilisée ou non immobilisée. L'enzyme est utilisée en quantités suffisantes pour catalyser la réaction.
L'enzyme peut être obtenue à partir de microorganismes qui ont été modifiés suivant les techniques habituelles de l'ingénierie génétique pour la produire avec des rendements élevés. On peut se référer à Stauffer, G., et al., Gene 15 : 63-72 (1981). Le gène SHMT (glyA) peut être isolé et cloné dans un plasmide, qui peut être utilisé ensuite pour transformer des cellules hôtes appropriées conduisant à une expression élevée de la SHMT. Des micro-organismes mutants, dont le métabolisme de la méthionine a été modifié, produisent également de la SHMT en surabondance. Voir Stauffer, G. V. et Brenchley, J. E., Genetics 88,221 (1978), de même que Stauffer, G. V. et Brenchley, J. E., J. Bacteriol. 129,740 (1977).
Suivant les techniques de clonage des gènes, l'activité enzymatique a pu être augmentée jusqu'à vingt fois et peut représenter plus de 10% de la protéine soluble que contient la cellule. Une souche de E. coli (Gx1703) transformée à l'aide d'un tel plasmide, spécifiquement un dérivé de pBR322 dans lequel le gène glyA a été cloné, pGx122, a été
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déposée au Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, sous le n NRRL B-15215.
Une souche de Klebsiella aerogenes (Gx1704) transformée à l'aide d'un plasmide semblable, mais plus petit, avec une modification induisant un nombre de copies élevé, pGX139, a été déposée à l'American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, sous le n ATCC 39214, et une souche de Salmonella typhimurium (Gx1682) transformée par pGx139 a été déposée sous le n ATCC 39215.
En outre, lorsque le gène est prélevé sur une source telle que E. coli, il peut être modifié par mutagénèse statistique ou mutagénèse avec orientation sur le site pour produire une enzyme ayant une meilleure stabilité. En variante, le gène peut être synthétisé par voie entièrement chimique avec des modifications multiples améliorant la stabilité de l'enzyme pendant la conduite du procédé décrit.
Des cellules entières peuvent être utilisées pour apporter une source de THF. Si la chose est désirée, un supplément de THF peut être ajouté pour atteindre les concentrations de saturation, qui dépendent du pH et aussi de la température. Par exemple, à un pH d'environ 7,5 et à une température de réaction
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d'environ 37 C, en solution aqueuse, du THF peut être ajouté pour atteindre une concentration beaucoup supérieure à 50 mM. Le pH doit être ajusté pendant la dissolution du THF. Si la SHMT est ajoutée sous forme d'extrait brut ou sous forme d'enzyme purifiée, une source indépendante de THF est nécessaire. La quantité de THF qui peut être ajoutée varie avec la température, la nature du solvant et le pH appliqués pour la conduite de la réaction.
La Demanderesse a découvert que le THF conserve son activité à l'égard de la SHMT lorsqu'il est immobilisé. L'immobilisation du THF par fixation sur un
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support qui peut être retenu à l'intérieur d'un bioréacteur utilisé pour la conduite de la réaction est avantageuse, parce qu'elle favorise l'utilisation répétée du cofacteur, après achèvement de la synthèse de la L-sérine. Par exemple, le THF peut être immobilisé avec des polymères solubles, comme le dextranne, le polyéthylèneglycol ou la polyéthylèneimine. L'immobilisation se fait au moyen d'une fixation covalente dans les deux premiers cas et d'une interaction ionique dans le troisième. La fixation covalente se fait généralement à l'intervention des radicaux carboxyle du THF avec un radical amino du support.
En variante, des techniques de fixation analogues permettent aussi de fixer le THF sur un support insoluble.
En variante, si la sérine est synthétisée par un procédé à marche discontinue, il est possile de recycler le THF. Par exemple, après que la L-sérine a été synthétisée, la solution de réaction peut être amenée à passer sur du charbon activé ou une colonne échangeuse d'ions qui collecte et sépare le THF hors de la solution de L-sérine produite. Le THF peut être ensuite dégagé et neutralisé. En variante, le THF peut être modifié par fixation covalente sur une petite molécule, par exemple une glucosamine, facilitant l'isolement du cofacteur. Après que la L-sérine a été synthétisée, la solution de réaction est passée sur une colonne de borate. Le borate fixe uniquement la THFglucosamine et le THF modifié peut ensuite être dégaqé et recyclé.
La glycine et le formaldéhyde sont, de préférence, ajoutés au mélange de tétrahydrofolate et de SHMT. La quantité de glycine qui peut être ajoutée varie avec les conditions de pH, de température et de solvant pour la réaction, mais peut généralement atteindre la saturation.
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Comme déjà indiqué, le formaldéhyde peut être hautement toxique pour la SHMT. Par conséquent, le formaldéhyde est généralement ajouté lentement aux autres constituants et son addition est régulée. Le formaldéhyde est ajouté en une quantité suffisante pour maintenir l'activité enzymatique, généralement de manière à maintenir une concentration supérieure de moins d'environ 10 mM à la concentration en THF, bien que le formaldéhyde puisse être ajouté pour entretenir une concentration s'élevant jusqu'à environ 50 mM audelà de la concentration en THF. Plus la concentration en THF du système est élevée, plus la concentration en formaldéhyde peut être maintenue élevée, parce que le THF réagit favorablement avec le formaldéhyde et protège ainsi l'enzyme. Le mécanisme de réaction du THF et du formaldéhyde a été décrit par Kallen, R. G., et al., J.
Biol. Chem. 241 (24) 5851-5863 (1966). Le formaldéhyde peut être ajouté d'autant plus vite nour le maintien de la concentration désirée que l'activité de l'enzyme est plus élevée dans le réacteur.
La Demanderesse a découvert aussi qu'il peut être avantageux d'ajouter un second cofacteur de la SHMT, en l'occurrence du pyridoxal-5'-phosphate, aux réactifs. Le pyridoxal-5'-phosphate est énergiquement lié à l'enzyme. Lorsque de la L-sérine est synthétisée pendant une longue durée dans un réacteur, le pyridoxalphosphate peut se perdre ou être inactivé, auquel cas un supplément de pyridoxalphosphate peut être ajouté. La perte du cofacteur pendant la synthèse se traduit-par la disparition de la couleur jaune de la solution de réaction et par la perte d'activité de la sérine hydroxyméthyltransférase. La concentration en pyridoxalphosphate ajouté au milieu de réaction peut s'échelonner de 0 à environ 20 mM, suivant les besoins, et de préférence d'environ 0,1 à environ 1 mM.
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L'addition du pyridoxalphosphate en excès peut assurer une fonction supplémentaire. La Demanderesse a en effet découvert que dans certains micro-organismes qui ont été transformés par des plasmides contenant le gène glyA et qui expriment des concentrations élevées en SHMT, l'addition du pyridoxal-5'-phosphate est nécessaire pour saturer le SHMT en présence et améliorer l'activité enzymatique observée. Un tel microorganisme est Klebsiella aerogenes contenant le plasmide pGx139 identifié ci-dessus.
La synthèse peut être conduite en présence de tout solvant non nuisible. Des exemples de tels solvants sont l'éthanol, le méthanol, l'isopropanol et le dioxanne.
Les exemples ci-après illustrent davantage l'invention.
EXEMPLE 1. -
On cultive des souches de bactéries avec et sans le plasmide pGx139 dans du milieu LB (10 g par litre de Bacto tryptone, 5 g par litre d'extrait de levure et 5 g par litre de NaCL) ou dans du milieu minimal (10,5 g par litre de K2HP04, 4,5 g par litre de KH2P04, 1, 0 g par litre de (NH4)2SO4 et 0,5 g par litre de citrate de sodium dihydraté) additionné de 0, 4% de glucose ou de lactose. On ajoute des aminoacides jusqu'à 20/ug par ml et des vitamines jusqu'à 1/ug par ml, suivant les indications. On exprime l'activité spécifique de la sérine hydroxyméthyltransférase en nanomoles de 3-phénylsérine convertie en benzaldéhyde et glycine par minute et par mg de protéine extractible après exposition des cellules aux ultrasons.
On exécute les expériences dans du tampon au phosphate 50 mM à pH 7,3 en présence de 0,1 mM de
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¯A-ph'nylsérine à 20'C. pyridoxalphosphate et à 35 mM enp-phénylsérine e On surveille l'apparition du benzaldéhyde à 279 nm à
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l'aide d'un spectrophotomètre enregistreur.
SHMT
Activité spécifique (nanomoles/minute/mg)
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<tb>
<tb> Souche <SEP> Plasmide <SEP> Milieu <SEP> LB <SEP> Milieu <SEP> Supplément
<tb> minimal
<tb> E. <SEP> coli
<tb> GX1698-39 <SEP> N. <SEP> D. <SEP> *
<tb> GX1671 <SEP> pGx139 <SEP> 221 <SEP> N. <SEP> D.
<tb>
GX1703 <SEP> pGxl39 <SEP> 141 <SEP> 533 <SEP> glucose,
<tb> phénylalanine
<tb> thiamine
<tb> GX1703 <SEP> pGx122 <SEP> 218 <SEP> 682 <SEP> glucose,
<tb> phénylalanine
<tb> thiamine
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> LT2
<tb> GX1682-28 <SEP> 10 <SEP> glucose
<tb> tryptophane
<tb> 17 <SEP> lactose,
<tb> tryptophane
<tb> GX1682 <SEP> pGxl39 <SEP> 152 <SEP> 133 <SEP> glucose
<tb> tryptophane
<tb> 306 <SEP> lactose
<tb> tryptophane
<tb> Klebsiella <SEP> aerogenes
<tb> GX1704-36 <SEP> N. <SEP> D.
<tb>
GX1704 <SEP> PGx139 <SEP> 590 <SEP> 114 <SEP> glucose
<tb> 223 <SEP> 108 <SEP> lactose
<tb>
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EMI12.1
<tb>
<tb> Souche <SEP> Génotype
<tb> E. <SEP> coli
<tb> GX1698 <SEP> trpEA, <SEP> tna <SEP> 2, <SEP> serB, <SEP> lacIq <SEP> ts <SEP> 402
<tb> GX1671 <SEP> thi, <SEP> ara, <SEP> strR, <SEP> glyA, <SEP> LI-serB <SEP> trp <SEP> laciql, <SEP>
<tb> lacZ <SEP> : <SEP> :
<SEP> tn5
<tb> GX1703 <SEP> glyA, <SEP> pheA, <SEP> thi, <SEP> lac, <SEP> ara, <SEP> strR
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> LT2
<tb> GX1682 <SEP> trpBEDC43 <SEP> F'lacIq <SEP> ts420 <SEP> pro
<tb> Klebsiella <SEP> aerogenes
<tb> GX1704 <SEP> lsd <SEP> (mutant <SEP> L-sérine <SEP> désaminase)
<tb>
EMI12.2
<tb>
<tb> K2HP04 <SEP> 10,5 <SEP> g/litre
<tb> KH2P04 <SEP> 4,5 <SEP> g/litre
<tb> (NH4) <SEP> 2SO4 <SEP> 1 <SEP> g/litre
<tb> Citrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> dihydraté <SEP> 0,5 <SEP> g/litre
<tb> Phénylalanine <SEP> 20/ug/ml
<tb>
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<tb>
<tb> Vitamine <SEP> B1 <SEP> 1 <SEP> /ug/ml
<tb> Ampicilline <SEP> 100 <SEP> /ug/ml
<tb> MgSO4 <SEP> 2 <SEP> nM
<tb> FeSO4 <SEP> 5 <SEP> mg/ml
<tb>
EMI13.2
On du milieu de culture et on les utilise comme source de l'enzyme.
On mélange de la glycine (12 mM en concentration finale) avec du tétrahydrofolate (5 mM en
EMI13.3
Salmonella typhimurium LT2 concentration finale), Klebsiella aerogenes du formaldéhyde * non déterminé atmosphère
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tampon au phosphate du mélange de réaction étant de 100 réaction en dessus à 370e sous agitation. Après 8 heures, on obtient de la sérine 5 mM (rendement de 45 sur base de la glycine). détermine les concentrations en glycine et sérine par chromatographie liquide à haute performance.
EXEMPLE 3.On introduit une colonie de la souche GX1704 de (contenant pGx139), qui a été déposée sous le n dans 100 ml d'un milieu de culture II décrit ci-après et on l'agite à 300e jusqu'au lendemain.
EMI13.5
<tb>
<tb> du <SEP> pyMilieu <SEP> de <SEP> culture <SEP> II
<tb> Tryptone <SEP> 10 <SEP> g/litre
<tb> NaCl <SEP> 10 <SEP> g/litre <SEP>
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 5 <SEP> g/litre <SEP>
<tb> Glucose <SEP> 10 <SEP> gjlitre
<tb>
On recueille les cellules par centrifugation du milieu de culture et on les utilise comme source de l'enzyme.
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On suit le mode opératoire décrit dans l'exemple 1 pour la production de la sérine, mais au moyen de Klebsiella aerogenes au lieu de E. coli. Après 8 heures, on obtient de la sérine 7 mM (rendement de 64% sur base de la glycine). Toute l'activité enzymatique persiste.
EXEMPLE 4.-
On suit le mode opératoire de l'exemple 1, mais en utilisant de la sérine hydroxyméthyltransférase partiellement purifiée de E. coli (souche GX1703). On provoque la rupture des cellules par exposition aux ultrasons à 4 C. On mélange le liquide qui surnage après centrifugation avec du sulfate d'ammonium (50% de la saturation) à 4 C et à pH 7,5. Après avoir séparé les solides par centrifugation, on extrait l'enzyme de la solution en augmentant la teneur en sulfate d'ammonium jusqu'à 100% de la saturation. On recueille l'enzyme par centrifugation et dialyse. Après 4 heures de réaction, on obtient de la sérine 10 mM. Le rendement est de 90% sur base de la glycine. Toute l'activité enzymatique se conserve.
EXEMPLE 5.-
On applique le mode opératoire de l'exemple 3, la différence étant que la glycine a une concentration initiale de 340 mM et qu'on introduit le formaldéhyde (concentration initiale 2 M) à raison de 1 ml par heure. Après 12 heures, on obtient de la sérine 119 mM.
EXEMPLE 6.-
On suit le mode opératoire de l'exemple 3, la différence étant qu'on introduit la glycine (concentration initiale 2 M) et le formaldéhyde (concentration initiale 2 M) au même débit de 1 ml par heure. Après 5 heures, on obtient de la sérine 57 mM.
EXEMPLE 7.-
On applique le mode opératoire de l'exemple 3
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en modifiant le THF. On dissout du dextranne (5 g, Pharmacia T40) dans de l'eau jusqu'à une concentration finale de 5%. On oxyde le dextranne en solution au moyen de NaI04 0,1 M pendant 1 heure à la température ambiante. On précipite le dextranne oxydé par addition d'éthanol jusqu'à 60% v/v. On répète l'opération deux fois. On dissout le dextranne oxydé dans 100 ml de 1,6hexanediamine (HMD) 0,2 M à pH 9,0. On ajoute du borohydrure de sodium (0,2 g) après 30 et 60 minutes, respectivement. On dialyse le mélange de 1, 6-hexanediamine et de dextranne contre de l'eau jusqu'au lendemain et on le lyophilise. On mélange du THF (5 mM) avec
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10 millimoles de l-éthyl-3- carbodiimide et 0, 5 de HMD-dextranne à pH 7, 0 en atmosphère d'azote.
On recueille par centrifugation le précipité résultant qu'on lave deux fois avec une solution de NaCl 0,5 M. On mélange le THF solide avec le mélange de réaction, comme décrit dans l'exemple 3.
Après 3 heures de réaction, on obtient de la sérine 7 mM.