LU85019A1 - Procede de fabrication de la l-phenylalanine comportant la reutilisation de l'ammonia-lyase de phenylalanine - Google Patents

Description

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PROCEDE DE FABRICATION DE LA L-PHENYLALANINE

COMPORTANT LA REUTILISATION DE L'ΑΜΜΟΝIA-LYASE DE PHENYLALANINE

5 La présente invention concerne un procédé de fabrica tion de la phénylalanine à partir de la réaction, catalysée par 1'airanonia-lyase de phénylalanine (PAL), de l'acide trans-cinna-mique et de l'ammoniac. Plus précisément, la présente invention concerne un procédé de fabrication de la phénylalanine dans le-10 quel on conserve un haut degré de l'activité du catalyseur PAL, et on peut réutiliser le catalyseur.

La phénylalanine est un acide aminé essentiel qui est important pour la nutrition et dans d'autres secteurs alimentaires et médicaux. Elle a été isolée industriellement d' 15 une grande variété de protéines, y compris l'ovalbumine et la lactalbumine. Un procédé de laboratoire permettant de préparer la L-phénylalanine, bien connu dans la technique, fait appel à une enzyme, 1'ammonia-lyase de phénylalanine (ci-après "PAL"), pour catalyser la réaction réversible : 20 L-phénylalanine —> acide trans-cinnamique + am moniac.

(Voir le brevet britannique n° 1.489,468 (19 octobre 1977).

L'équilibre de cette réaction est normalement de 80:20 en faveur de l'acide trans-cinnamique, et divers moyens ,25 ont été expérimentés pour parvenir à un haut degré de transformation en L-phénylalanine. Selon le brevet britannique n° 1.48S. 468, il est possible de parvenir à un rendement approchant les 20 % théoriques de L-phénylalanine en utilisant une grande masse de cellules contenant le catalyseur PAL et un excès d' 30 ions ammonium. Conformément au procédé de ce brevet, la source des ions ammonium est de préférence le chlorure d'ammonium, et on mène de préférence la réaction à un pH compris entre 8,5 et 9,7.

Yamada, S., et al., Appl. Environ. Microbiol.

35 42:773-78 (1981), ont rapporté que l'on pouvait porter le ren dement de la transformation à plus de 70 % en ajustant le pH de la solution du substrat à 10,0 avec de l'acide chlorhydrique. Mais ces conditions sont si sévères que l'activité PAL des cel- *

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Iules récupérées est grandement réduite, à un point tel que la réutilisation de l'enzyme est impraticable. En outre, Yamada et al. affirment que l'immobilisation de l'enzyme cellulaire ne procure aucun avantage par rapport à l'utilisation de cellu-5 les intactes. Ainsi, bien qu'il soit possible d' obtenir initialement par ce procédé une forte concentration de L-phénylalanine, l'impossibilité de réutiliser l'enzyme catalytique rend ce procédé coûteux pour une application à grande é-chelle.

10 On a donc encore besoin d'un procédé de préparation de la L-phénylalanine à partir de l'acide trans-cinnamique et de l'ammoniac dans lequel on parvienne à un rendement élevé = de L-phénylalanine et la PAL conserve une activité catalytique suffisante pour pouvoir être réutilisée.

Ï5 C'est par conséquent un objectif de la présente in- ** ι vention de procurer un procédé de préparation de la L-phénylalanine à partir de l'acide trans-cinnamique, permettant d'obtenir le produit à une concentration élevée et d'utiliser à plusieurs reprises l'enzyme PAL.

20 C'est également un objectif de la présente invention de procurer un moyen de préparation de la L-phénylalanine permettant de mener la réaction, soit dans un système discontinu à cellules libres, soit dans un système à enzyme ou à cellules immobilisées.

25 C'est encore un autre objectif de la présente inven tion de procurer un moyen économique d'utilisation de la PAL pour la fabrication de la L-phénylalanine.

Le procédé de préparation de la L-phénylalanine qui consiste à faire réagir l'acide trans-cinnamique et l'ammoniac 30 en présence d'ammonia-lyase de phénylalanine a été amélioré de façon que l'on obtienne de hauts rendements de L-phénylala- <* nine et que l'on conserve un haut degré de l'activité catalytique de la PAL. Dans des conditions réactionnelles maîtrisées, la stabilité de la PAL est augmentée à un point tel que l'on 35 peut l'utiliser à plusieurs reprises pour produire de la L-phénylalanine à une forte concentration.

Pour parvenir à ce résultat voulu, on prépare une solution de substrat en faisant réagir l'acide avec une source 3 * U ·· * % d'ions ammonium. La source d'ions ammonium peut être n'importe quel sel d'ammonium non halogène. On ajuste le pH de la solution de substrat de telle sorte qu'il se trouve dans l'intervalle de 8,0 à 10,0 environ, en utilisant un acide non halogé-5 né, puis on ajoute cette solution à une source de PAL telle qu'un système à cellules intactes libres ou un système à enzyme ou à cellules immobilisées qui contient de la PAL.

Conformément au procédé de la présente invention, on prépare une solution de substrat avec de l'acide trans-cin-10 namique et une source d'ions ammonium. On peut introduire la source d'ions ammonium soit en ajoutant directement un sel d' ammonium d'un acide organique ou d'un acide minéral à l'acide trans-cinnamique, soit en la préparant dans la solution de substrat, par exemple en mélangeant de l'ammoniaque et un acide non 15 halogéné.

Le brevet britannique n° 1.489.468 révèle qu'une source préférée d'ions ammonium est un mélange de chlorure d' ammonium et d'ammoniaque (p. 3, lignes 25 et 26). Le procédé de Yamada et al. fait lui aussi appel au chlorure d'ammonium.

20 Par opposition à ces enseignements de la technique antérieure, il a été découvert qu'il était avantageux que le sel d'ammonium ne contienne pas d'ions halogènes. Il a été constaté que la présence d'halogènes dans les solutions de substrat inhibait l'activité catalytique de la PAL. Par conséquent, les sels d' ‘25 ammonium préférés comprennent le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le citrate d'ammonium, l'acétate d'ammonium et le phosphate d'ammonium. Un sel d'ammonium que l'on préfère tout particulièrement est le sulfate d'ammonium.

Il est également souhaitable que le sel d'ammonium 30 soit ajouté à la solution de substrat à une forte concentration. La concentration des ions ammonium est généralement de 0,1 à 7,5 M environ, de préférence de 1 à 5 M environ. La forte concentration du sel d'ammonium augmente la concentration de l'ammoniac dans le système et joue également un rôle de tampon pour que 35 l'on puisse maîtriser plus facilement l'ajustement du pH du mélange réactionnel.

Lorsque la concentration des ions ammonium se trouve à l'intérieur des intervalles sus-indiqués, la concentration de JÉ W. - * , ± l'acide trans-cinnamique dans la solution est généralement de 30 à 200 mM environ, et de préférence de 60 à 150 mM environ.

Yamada et al. révèlent que la solution de substrat doit être ajustée à un pH de 10,0. Mais, dans le procédé selon 5 la présente invention, le pH peut être ajusté à l'intérieur de l'intervalle de 8 à 10 environ et se situe de préférence à l'intérieur de l'intervalle de 8,5 à 9,5 environ. La référence Yamada révèle également l'ajustement du pH de la solution de substrat avec de l'acide chlorhydrique. Cela peut avoir pour effet d'ajou-.10 ter une quantité importante de chlorure au substrat. Mais dans le présent procédé, comme indiqué ci-dessus, il est avantageux d'ajuster le pH de la solution de substrat avec un acide non halogène. Les acides préférés pour ajuster le pH sont l'acide sulfurique, l'acide phosphorique et l'acide acétique, encore Î5 que l'on puisse utiliser d'autres acides non halogénés. Un acide que l'on préfère tout particulièrement est l'acide sulfurique, car, ajouté à une solution de substrat contenant de l'ammoniaque, il réagit en formant du sulfate d'ammonium, qui est un agent bien connu de stabilisation des enzymes.

20 On ajoute la solution de substrat à un bouillon de culture contenant de la PAL, aux cellules qui en sont séparées, ou à l'enzyme isolée. La PAL est obtenue conformément à des procédés classiques enseignés par la technique antérieure. La réaction catalysée par la PAL se fait dans des conditions pro-.25 près à produire de la L-phénylalanine, lesquelles comprennent de préférence une température de réaction de 10°C à 45°C environ. Dans les conditions du procédé selon la présente invention, la stabilité de la PAL se trouve accrue au point que l'on peut l'utiliser a plusieurs reprises pour produire de la L-phénylala-30 nine avec une forte concentration.

Le présent procédé de fabrication de la L-phénylalanine peut être utilisé soit dans un système discontinu à cellules libres, soit dans un système à enzyme ou à cellules immobilisées. Le système discontinu peut être soit un simple système 35 discontinu, soit un système discontinu à alimentation continue.

Si la PAL est immobilisée dans une colonne, on peut faire travailler la colonne en une seule passe, avec recyclage ou avec recyclage d'alimentation continue. Un procédé préféré d'immobi- * 5 fr » lisation de l'enzyme PAL ou des cellules contenant cette enzyme est décrit dans la demande de brevet français déposé par la demanderesse le 30 juin· 1983 sous le n° 83 10856. Lorsque l'enzyme PAL ou les cellules contenant cette enzyme sont immobilisées 5 dans une colonne, on peut maintenir la colonne à une température de 10° à 40°C environ, et de préférence de 18° à 30°C environ, tandis que la solution de substrat est pompée à travers la colonne.

On analyse la teneur en phénylalanine du mélange ré-10 actionnel par des méthodes classiques. Lorsqu'on utilise de l'acide sulfurique à la place de l'acide chlorhydrique dans la solution de substrat, la quantité de L-phénylalanine produite représente environ 8 à 10 fois la quantité produite lorsque c'est de 1'acide chlorhydrique que l'on utilise. Lorsque l'en-15 zyme PAL a été immobilisée, elle fait preuve d'une rétention d'activité de 50 % environ après 41 jours de réaction. Cela est à comparer avec la rétention de 20 % au bout de 24 heures, rapportée par Yamada et al.

La L-phénylalanine peut être isolée du mélange réac-20 tionnel par des procédés classiques.

Les exemples suivants sont destinés à illustrer et à mieux définir le procédé selon la présente invention, mais ne doivent pas être considérés comme la limitant.

Exemple 1 25 On a préparé un milieu de culture par le mode opéra toire général suivant : A 1 litre d'eau désionisée, ajouter 10 g de peptone, 10 g d'extrait de levure, 0,5 g de D, L-phénylalanine., 5 g de chlorure de sodium et 5 g de L-isoleucine. Ajuster le pH à 6,0 30 à l'aide d'acide sulfurique et passer à l'autoclave à 120°C pendant 10 minutes sous 1,05 atm. On obtient ainsi un milieu inducteur normalisé pour les tubes de culture et les ballons à secouer.

Exemple 2 35 On a suivi le mode opératoire général de l'exemple 1, excepté que l'on a ajouté au milieu 100 mM d'iodure de potassium (Kl). On a ainsi obtenu un milieu de sélection fortement inducteur.

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Exemple 3

On a suivi le mode opératoire général de l'exemple 1, excepté que l'on a ajouté au milieu 200 mM de Kl. On a ainsi obtenu un milieu de sélection qui est lui aussi fortement indue-5 teur.

Exemple 4

On a suivi le mode opératoire général de l'exemple 1, excepté que l'on a utilisé 15 g d'extrait de levure et qu'on a supprimé la peptone. On a également ajouté 200 mM de Kl. On a 10 ainsi obtenu un milieu de production pour ballons à secouer qui est fortement inducteur.

Exemple 5

On a préparé un milieu de fermentation par le mode opératoire général de l'exemple 4, excepté que l'on n'a ajouté 15 ni chlorure de sodium, ni L-isoleucine. On a ainsi obtenu un milieu de production par fermentation qui est fortement inducteur.

Exemple 6

On a préparé trois milieux de culture comme dans 20 les exemples 1, 2 et 3. On a utilisé une souche de Rhodotorula rubra (ATCC n° 4056) productrice de PAL, que^l'on avait maintenue sur des cultures inclinées de gélose nutritive pour inoculer 4,5 cm3 de chaque culture en tube à essai. On a ensuite placé les tubes sur une secoueuse à 30°C et à 250 tours par mi-25 nute. On a procédé à sept transferts (0,2 cm3) de chaque tube, au bout de'24 ou 48 heures, dans 4,5 ml d'un milieu de culture frais. On a utilisé des tubes de culture pour inoculer 200 cm3 de milieu dans des ballons à secouer de 1 000 ml. On a récolté un ballon de chaque milieu au bout de 30 heures et au bout de 30 54 heures. Le rendement cellulaire au bout de 30 heures s'éta blissait en moyenne à 14 g de pâte par litre et au bout de 54 heures à 29 g de pâte par litre. L'activité PAL de 100 mM de Kl était supérieure de 31 % à celle du témoin. L'activité PAL de 200 mM de Kl était supérieure de 39 % à celle du témoin.

35 Exemple 7

On a suivi le mode opératoire général de l'exemple 6 pour cultiver des cellules de R. rubra dans un milieu fortement inducteur contenant 200 mM de Kl, avec cette exception que l'on 7 » a procédé à 25 transferts de sélection de la culture à 200 mM de Kl. D'autre part, 24 heures après avoir inoculé le ballon à secouer, on a utilisé 2.,5 % du milieu pour inoculer 15 ballons à secouer frais (ballon final) et après 24 heures de culture, on 5 a récolté ces ballons. On a mesuré .les rendements cellulaires et l'activité PAL sur quelques ballons et sur la pâte cellulaire regroupée obtenue comme produit final. La plus forte activité PAL, pour un milieu contenant 28,7 g de pâte par litre, était de 18,4 unités par g de pâte (528 unités PAL par litre).

10 (1 unité = 1 mole de L-phénylalanine transformée en acide trans- cinnamique et en ammoniac par minute à 30°C). On a déterminé 1'activité par modification de la méthode enseignée par Kalghatgi et Subba Rao, Biochem. J. 149: 65-72, 1975. Le produit final constitué par les cellules regroupées contenait 15,0 unités de 15 PAL par gramme de pâte pour un rendement cellulaire moyen de 27 g de pâte par litre (405 unités de PAL par litre).

Exemple 8

On a préparé une solution de substrat de cinnamate d'ammonium par le mode opératoire général suivant. On a ajouté 20 de l'acide cinnamique à de l'ammoniaque (28 %) jusqu'à dissolution. On a ensuite ajouté de l'eau et de l'acide pour ajuster respectivement le volume du substrat et le pH. La concentration de l'acide cinnamique, la concentration de l'ammoniac et le pH (quantité d'acide ajoutée) varieront dans les exemples suivants; 25 par conséquent, les quantités de sels d'ammonium produites varieront elles aussi.

Exemole 9 -

On a exploré l'effet des fortes concentrations d'halogène sur la PAL en utilisant différents acides pour abaisser 30 le pH des solutions de substrat. On a préparé deux substrats par le mode opératoire général de l'exemple 8 (60 mM d'acide cinnamique; ΝΗ^ 7,5 M; pH 10,0) . On a ajusté le pH de la solution A à l'aide d'acide chlorhydrique et le pH de la solution B à l'aide d'acide sulfurique. On a placé les cellules de R. rubra, 35 cultivées comme dans l'exemple 4, dans des bêchers baignant dans l'eau et agités, à 30°C. On a prélevé des échantillons à des intervalles de temps bien déterminés et on a déterminé leurs teneurs en L-phénylalanine par chromatographie en couche mince , d'une part, et par essai enzymatique à l'oxydase de L-amino- - ϋ » acide, d'autre part. Qn a constate que la solution de substrat A (contenant du chlorure d'ammonium) inhibait l'enzyme PAL. Les cellules de la solution de substrat B produisaient 10 fois plus de L-phénylala-nine (après 24 heures de réaction) que les cellules de la solu-5 tion de substrat A.

Exemple 10

On a suivi.le mode opératoire général de l'exemple 9 pour comparer l'acide phosphorique à l'acide sulfurique. Les cellules de R. rubra, dans le substrat dont le pH avait été ajus-10 té avec de l'acide phosphorique, produisaient 90 % de la L-phé-nylalanine que produisait le substrat dont le pH avait été ajusté avec de l'acide sulfurique.

Exemple 11

On a suivi le mode opératoire général de 1'exemple 9 15 pour comparer l'acide acétique à l'acide sulfurique. La quantité de L-phénylalanine produite dans les réacteurs était la même.

Exemple 12

On a préparé des cellules par le mode opératoire général de l'exemple 6. On a utilisé ces cellules pour étudier 20 la possibilité de réutilisation (stabilité) des cellules entières. On a préparé trois substrats, contenant chacun 60 mM d'acide trans-cinnamique, et de l'ammoniac 7,5 M, dont le pH était abaissé à 10,0, 9,0 et 8,0, respectivement, avec de l'acide sulfurique. On a placé les cellules (4,5 g de pâte cellulaire) 25 dans chaque substrat (45 cm3) pendant 16 heures à 30°C. On a déterminé la concentration de la phénylalanine par l'essai à 1'oxydase de L-amino-acide et par chromatographie en couche mince . On a centrifugé les cellules, on les a lavées et on les a placées dans un substrat frais pendant 16 heures. Les ré-30 sultats sont énoncés dans le tableau ci-dessous.

Passe i Passe II % de rétention pH mg/ml de L-PHE mg/ml de L-PHE d'activité 8 0,22 0,12 55 9 0,95 0,78 82 35 10 2,02 0,43 21

Ces résultats montrent que, alors même qu'avec un pH de 10,0 l'activité initiale était deux fois plus grande qu'à pH 9,0, après une passe les cellules à pH 9,0 avaient une activi- t 9 4 t té supérieure de 163 % à celle des cellules à pH 10,0.

Exemple 13

On a procédé à une étude de stabilité sur deux semaines comme dans l'exemple 12. Cependant, les pH du réacteur étaient 5 respectivement de 8,75, 9,00 et 9,25, et la concentration de l'ammoniac était 5,5 M. On a procédé à cet essai de 14 jours avec 6 essais discontinus consécutifs de' cellules de R. rubra libres.

Les résultats sont donnés dans le tableau ci-dessous.

10 mg de L-phénylalanine produits par heure/g de poids sec de cellules (% d'activité initiale conservé) pH de la réaction 15 _

Nombre de jours au pH indiqué 8,75 9,00 9,25 1 5,9 5,7 5,7 20 . 7 3,6 3,8 4,2 (61) (67) (74) 14 3,5 3,5 4,0 (59) (61) (70) 25 Ces résultats montrent que des conditions appropriées peuvent autoriser la réutilisation de la PAL pour produire de la L-phénylalanine, et que les degrés de rétention de l'activité sont importants pour les cellules libres.

Exemple 14 30 On a immobilisé la pâte cellulaire de l'exemple 7 par le mode opératoire général enseigné dans la demande de brevet français n° 83 10856 précitée. On a pcmpë le substrat (80mM d'acide cinna-mique; NH^ 4,8 M; pH 9,23) à travers une colonne garnie de cellules de R. rubra immobilisées, avec écoulement ascendant. Les débits va-35 riaient de 0,10, 0,25 et 0,50 SVh-1 à 22°C, à 0,25 et 0,50 SVh~1 à 28°c. On a analysé la teneur en L-phénylalanine de l'effluent. Les résultats sont énoncés dans le tableau ci-dessous.

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Temp. Débit L-PHE Rendement (°C) (SV*1 *") produite (g/l/h) 0,10 5,4 0,54 5 22 " 0,25 277 Ö7Ö8 ___0 /50__2,1 ~ 1,05 28 0,25 3,8 0,95 __ __ _____ 10 -_____ A 0,1 SV*1 1, on a observé un taux de transformation dé 40 % du substrat, donnant 5,4 g de L-phénylalanine par litre à 22°C.

Exemple 15 15 On a suivi les conditions de culture et d'immobili sation de l'exemple 14. On a utilisé une colonne de cellules de R. rubra immobilisées contenant de la PAL pour déterminer la demi-vie de rendement de la colonne dans certaines conditions.

Le substrat se composait de 75 mil d'acide cinnamique et de NH^ 20 4,5 M et avait un pH de 9,25, et on l'a fait passer en continu h.™ 1 à 23°C avec un débit de 0,25 SV . On a constaté que la demi-vie de rendement était de 41 jours (voir la figure 1). Cet essai démontre que l'on peut utiliser en continu la PAL immobilisée sur une période de temps prolongée pour produire de la L-25 phénylalanine.

Exemple 16A

On a préparé un milieu de fermentation comme dans l'exemple 5 et on l'a utilisé pour cultiver des cellules de B* rubra dans un fermenteur de 10 litres. On a ensemencé le 30 fermenteur comme dans l'exemple 3. On a périodiquement récolté des échantillons de cellules du fermenteur. On a analysé l'activité PAL des cellules pour déterminer le temps optimal de la récolte. On a constaté que 6 heures après l'apparition du pic d'activité, moins de 50 % de l'activité de pic subsistaient. 35 II a également été noté que toute la D, L-phénylalanine avait été épuisée dü milieu avant que le pic d'activité soit atteint.

Exemple 16B

On a repris l'exemple 16A. Cependant, immédiatement » 11 h après l'apparition du pic d'activité, on a introduit de la D, L-phénylalanine (5 g pour 10 litres) dans le fermenteur . La première heure, il s'est'produit une chute de l'activité PAL comme à l'exemple 16A. Cependant, l'activité PAL s'est stabilisée pen-5 dant les trois heures suivantes, avant que l'on procède à la récolte (voir la figure 2).

Exemple 17

On a préparé et immobilisé des cellules selon le mode opératoire de l'exemple 14. Cependant, le substrat utilisé se 10 composait de 75 mM d'acide cinnamique et de NEL 4,5 M et avait

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un pH de 9,43 à 23°C et un débit de SV = 0,50. On a constaté que la colonne produisait 1,9 g de L-phénylalanine par litre de support de volume de lit par heure. La concentration de la phé-nylalanine dans l'effluent était de 3,8 g/litre.

15 Exemple 18

On a préparé et immobilisé des cellules par le mode opératoire général de l'exemple 14. On a garni une colonne des cellules immobilisées et on a recyclé 352 cm2 de substrat (75 mM d'acide cinnamique; NH~ 4,5 M; pH 9,4) à travers la colonne à 20 un débit de 1,0 SVn . On a prélevé des échantillons du substrat regroupé, à intervalles de temps bien déterminés, et on a déterminé la concentration de la L-phénylalanine par essai enzymatique .à l'oxydase de L-amino acide et par chromatographie en couche mince. Les résultats sont rapportés dans le tableau ci-dessous.

25

Temps de recyclage L-phénylalanine % de _(en heures)_(en g/1)_transformation 7 2,8 23 21.5 4,6 37 30 24 5,0 40 44.5 6,8 55

Cet exemple démontre que, dans les conditions de la 35 réaction, il est possible de produire de la L-phénylalanine avec une forte concentration et avec un fort pourcentage de transformation en utilisant des cellules immobilisées qui contiennent de la PAL.

Claims (19)

1. Procédé de fabrication de la L-phénylalanine, dans lequel, (a) on fait réagir de l'acide trans-cinnamique avec 5 une source d'ions ammonium pour former une solution de substrat, (b) on ajuste le pH de ladite solution de substrat, et (c) on met ladite solution de substrat en contact avec de 1'ammonia-lyase de phénylalanine dans des conditions propres à produire de la L-phénylalanine, pour former de la L-phénylalanine; 10 caractérisé en ce que : (i) on utilise comme source d'ions ammonium un sel d' ammonium pratiquement dépourvu d' halogène , et (ii) on ajuste le pH de la solution de substrat en lui ajoutant un acide pratiquement dépourvu d'halogène .

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce ' qu'on ajuste le pH de la solution de substrat de manière qu'il se situe dans l'intervalle de 8 à 10 environ.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on ajuste le pH de la solution de substrat de manière 20 qu'il se situe dans l'intervalle de 8,5 à 9,5 environ.

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la source d'ions ammonium est le sulfate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le citrate d'ammonium, ou l'acétate d'ammonium.

5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la source d'ions ammonium est le sulfate d'ammonium.

6. Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce qu'on ajuste le pK de la solution de substrat à l'aide d'un acide qui est l'acide sulfurique,· l'acide phosphorigue ou 30 l'acide acétique.

7. Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que l'on ajuste le pH de la solution de substrat avec de l'acide sulfurique.

8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce 35 que la concentration des ions ammonium se situe entre 0,1 M et 7,5 M environ.

9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la concentration des ions ammonium se situe entre 1 M et 5M 13 » « « w environ.

10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration de l'acide trans-cinnamique dans la solution se situe entre 30 mM et 200 xnM environ.

11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la concentration de l'acide trans-cinnamique dans la solution se situe entre 60 mM et 150 mM environ.

12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 1'ammonia-lyase de phénylalanine peut être réutilisée.

13. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on produit la L-phénylalanine en ajoutant des cellules intactes contenant de 1'ammonia-lyase de phénylalanine à la solution de substrat dans un réacteur discontinu.

14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en 15 ce que le système discontinu est un simple système discontinu.

15. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce eue le système discontinu est un système à alimentation continue.

16. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en 20 ce que 1'ammonia-lyase de phénylalanine est immobisée sur ou dans un support réutilisable.

17. Procédé selon la revendication 1 ou 16, caractérisé en ce que 1'ammonia-lyase de phénylalanine est immobilisée dans une colonne.

18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'on maintient la colonne à une température de 10° à 40°C * environ, tandis que l'on pompe la solution de substrat à travers la colonne.

19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en 30 ce qu'on maintient la colonne à une température de 18° à 30°C environ tandis que l'on pompe la solution de substrat à travers la colonne.