JPS6112297A - Ｌ‐フエニルアラニンの製造方法 - Google Patents
Ｌ‐フエニルアラニンの製造方法Info
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- JPS6112297A JPS6112297A JP12525985A JP12525985A JPS6112297A JP S6112297 A JPS6112297 A JP S6112297A JP 12525985 A JP12525985 A JP 12525985A JP 12525985 A JP12525985 A JP 12525985A JP S6112297 A JPS6112297 A JP S6112297A
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- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
一般に、トランス−ケイ皮酸をＬ−フェニルアラニンに
転化するためにＬ−フェニルアラニンアンモニア−リア
ーゼを使用する酵素法は、（ａ）多量のフェニルアラニ
ンアンモニア−リアーゼ（以下、ＰＡＬという）が製造
されるまで、ＰＡＬ−生産微生物を水性栄養培地で好気
的に垢殖さぜる段階、（ｂ）段階（ａ）で作られたＰＡ
Ｌ−生産微生物の細胞を流体培養基全体あるいはその分
離細胞として、または単離酵素として、アンモニウムイ
オンおよびｌ・ランスルケイ皮酸塩イオンに接触させ、
Ｌ−フェニルアラニンへの転化が平衡に達するまで温度
およびｐＨを制限した条件下で反応させる段階、および
（Ｃ）その反応溶液からＬ−フェニルアラニンを分離、
回収する段階から成る。
転化するためにＬ−フェニルアラニンアンモニア−リア
ーゼを使用する酵素法は、（ａ）多量のフェニルアラニ
ンアンモニア−リアーゼ（以下、ＰＡＬという）が製造
されるまで、ＰＡＬ−生産微生物を水性栄養培地で好気
的に垢殖さぜる段階、（ｂ）段階（ａ）で作られたＰＡ
Ｌ−生産微生物の細胞を流体培養基全体あるいはその分
離細胞として、または単離酵素として、アンモニウムイ
オンおよびｌ・ランスルケイ皮酸塩イオンに接触させ、
Ｌ−フェニルアラニンへの転化が平衡に達するまで温度
およびｐＨを制限した条件下で反応させる段階、および
（Ｃ）その反応溶液からＬ−フェニルアラニンを分離、
回収する段階から成る。
上記の方法は、例えば、英国特許第１，４８９゜４６８
号（１９７７年１０月１９日）に記載されている。
号（１９７７年１０月１９日）に記載されている。
この方法を商業的生産に使用する際の欠点は、ＰＡ Ｌ
が比較的不安定であること、および、基質、ｔ−ケイ皮
酸によってＰＡＬが抑制されることであった。Ｌ−フェ
ニルアラニンを製造するよう反応を進めるため、そして
基質による抑制の影響を消すために、上記英国特許には
、多量のＰＡＬ含有細胞と過剰濃度のアンモニウムイオ
ンを使用する方法が記載されている。
が比較的不安定であること、および、基質、ｔ−ケイ皮
酸によってＰＡＬが抑制されることであった。Ｌ−フェ
ニルアラニンを製造するよう反応を進めるため、そして
基質による抑制の影響を消すために、上記英国特許には
、多量のＰＡＬ含有細胞と過剰濃度のアンモニウムイオ
ンを使用する方法が記載されている。
ニス・ヤマダら〔「微生物の応用および環境」。
（Ａｐｐ４ ａｎｄ Ｅｌｌｖｉｒｏｎ、 Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏ４４２ 、７８７３−７７８（１９８１）］は、
ＰＡＬ含有 Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｔａ ｇｔｕｔｉｎｉ
ｓ細胞を使ってｔ−ケイ皮酸からＬ−フェニルアラニン
を製造することを述べた。彼らはこの方法が従来実用的
に応用でき々かったのは微生物性ＰＡＬの低活性と不安
定さによるものであると推測した。
ｂｉｏ４４２ 、７８７３−７７８（１９８１）］は、
ＰＡＬ含有 Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｔａ ｇｔｕｔｉｎｉ
ｓ細胞を使ってｔ−ケイ皮酸からＬ−フェニルアラニン
を製造することを述べた。彼らはこの方法が従来実用的
に応用でき々かったのは微生物性ＰＡＬの低活性と不安
定さによるものであると推測した。
山田氏らは、Ｌ−イソロイシンがＰＡＬを安定させる効
果を有し、酵素の活性の有効期間を延ばすことを見出し
た。これらの著者らはさらに、基質の抑制効果を観察し
て、ｔ−ケイ皮酸の濃度を実際的濃度（１５０ｍＭ）に
すると、Ｌ−フェニルアラニンの転化速度は最高速度の
半分に低重することに注目した。得られた最大収率は約
７０％の範囲であったが、著名らは非常に過剰の細胞を
使用した場合でも高収率が認められなかったことを記し
ている。
果を有し、酵素の活性の有効期間を延ばすことを見出し
た。これらの著者らはさらに、基質の抑制効果を観察し
て、ｔ−ケイ皮酸の濃度を実際的濃度（１５０ｍＭ）に
すると、Ｌ−フェニルアラニンの転化速度は最高速度の
半分に低重することに注目した。得られた最大収率は約
７０％の範囲であったが、著名らは非常に過剰の細胞を
使用した場合でも高収率が認められなかったことを記し
ている。
本発明によると、Ｌ−フェニルアラニンの改良された製
造方法は、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼの存
在下、約３０℃以下の温度でトランス−ケイ皮酸とアン
モニウムイオンを反応させ、Ｌ−フェニルアラニンを回
収することを含む。
造方法は、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼの存
在下、約３０℃以下の温度でトランス−ケイ皮酸とアン
モニウムイオンを反応させ、Ｌ−フェニルアラニンを回
収することを含む。
Ｌ−フェニルアラニンの収率は、少くとも反応過程の最
終段階で反応温度を下げることにより、実質的に増加さ
せることができることが判明した。
終段階で反応温度を下げることにより、実質的に増加さ
せることができることが判明した。
本発明の実施において、Ｌ−フェニルアラニンアンモニ
ア−リアーゼの存在下、トランス−ケイ皮酸とアンモニ
ウムイオンを反応させることにより、Ｌ−フェニルアラ
ニンを製造する方法が改良されたため、Ｌ−フェニルア
ラニンが高収率で得られる。
ア−リアーゼの存在下、トランス−ケイ皮酸とアンモニ
ウムイオンを反応させることにより、Ｌ−フェニルアラ
ニンを製造する方法が改良されたため、Ｌ−フェニルア
ラニンが高収率で得られる。
本改良は、従来使用してきた温度よシ低い温度で酵素転
化反応を行うことを含む。本発明者らは、約３０℃以下
の温度で反応を進めると、Ｌ−フェニルアラニンの収率
が増すことを発見した。低温では平衡は生成物Ｌ−フェ
ニルアラニンに有利であるが、反応速度は速度論によシ
遅くなる。そのため、高い収率を得るためには長い時間
が必要である。３０℃以下の温度では９０％以上の収率
が得られるのに対し、温度が上昇すると、同様の条件下
で収率はかなシ低くなる。低温操作を行うことによシ、
酵素の安定性が増すという利点が加わシ、酵素含有細胞
を何度も再利用できるようになる。
化反応を行うことを含む。本発明者らは、約３０℃以下
の温度で反応を進めると、Ｌ−フェニルアラニンの収率
が増すことを発見した。低温では平衡は生成物Ｌ−フェ
ニルアラニンに有利であるが、反応速度は速度論によシ
遅くなる。そのため、高い収率を得るためには長い時間
が必要である。３０℃以下の温度では９０％以上の収率
が得られるのに対し、温度が上昇すると、同様の条件下
で収率はかなシ低くなる。低温操作を行うことによシ、
酵素の安定性が増すという利点が加わシ、酵素含有細胞
を何度も再利用できるようになる。
所望ならば、転化反応を二段階で行うことができ、その
第一段階は、反応速度を高めるのに有利な比較的高い温
度で実施される。はるかに低温で実施される第二段階は
Ｌ−フェニルアラニンの収率を高めるのに最適である。
第一段階は、反応速度を高めるのに有利な比較的高い温
度で実施される。はるかに低温で実施される第二段階は
Ｌ−フェニルアラニンの収率を高めるのに最適である。
転化の大部分は第一段階において急速に起こるが、第一
段階では温度依存反応速度論が優勢である。約７０％の
転化で平衡に達するので、第二反応段階の低い値まで温
度を下けるのが有利であシ、第二段階では９０％のＬ−
フェニルアラニン転化で平衡に達する。しかし、初期の
反応温度を高くすると酵素の有用な寿命を組めるかもし
れないことを認識しなければならない。
段階では温度依存反応速度論が優勢である。約７０％の
転化で平衡に達するので、第二反応段階の低い値まで温
度を下けるのが有利であシ、第二段階では９０％のＬ−
フェニルアラニン転化で平衡に達する。しかし、初期の
反応温度を高くすると酵素の有用な寿命を組めるかもし
れないことを認識しなければならない。
一般に、その転化には、あらかじめ好気性の成長促進条
件下で培養したＰＡＬ生産微生物をオリ用する。細胞の
増殖には従来法を使用する。細胞は炭素および窒素の吸
収源、必須ビタミン類、鉱物、およびその他の成長要因
を含む栄養培地へ接種される。適切な炭素源としては、
グルコース、スクロース、糖みつ、デンプン、穀粒など
の様々な精製あるいは粗製炭水化物が挙けられる。好ま
しい炭素源はグルコースである。窒素源と゛しては、リ
ン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ム、クエン酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無
機アンモニウム塩、および大豆粉、肉煎じ汁、アミノ酸
、トウモロコシの漬は汁、蛋白質氷解物、酢母抽出物な
どの有機望素物質がある。本発明の方法に好ましい窒素
源は酵母抽出物であり、この栄養物は窒素とリンの両方
を供給するリン酸水素ニアンモニウムと結合させると有
利である。
件下で培養したＰＡＬ生産微生物をオリ用する。細胞の
増殖には従来法を使用する。細胞は炭素および窒素の吸
収源、必須ビタミン類、鉱物、およびその他の成長要因
を含む栄養培地へ接種される。適切な炭素源としては、
グルコース、スクロース、糖みつ、デンプン、穀粒など
の様々な精製あるいは粗製炭水化物が挙けられる。好ま
しい炭素源はグルコースである。窒素源と゛しては、リ
ン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ム、クエン酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無
機アンモニウム塩、および大豆粉、肉煎じ汁、アミノ酸
、トウモロコシの漬は汁、蛋白質氷解物、酢母抽出物な
どの有機望素物質がある。本発明の方法に好ましい窒素
源は酵母抽出物であり、この栄養物は窒素とリンの両方
を供給するリン酸水素ニアンモニウムと結合させると有
利である。
ビタミン類、鉱物、およびその他の成長要因は炭素およ
び窒素源によって（例えば、酵母抽出物を通して）供給
されるか、あるいは別個に供給される。これらの成分は
使用する特定微生物によって変えることができる。典型
的例として、亜鉛、マンガン、鉄、コバルト、カルシウ
ムのような痕跡金ハを無機塩として、成長促進量を供給
することができる。これらの鉱物を、例えば、水道水、
？１σ水等の処理加工した水と共に供給してもよい。
び窒素源によって（例えば、酵母抽出物を通して）供給
されるか、あるいは別個に供給される。これらの成分は
使用する特定微生物によって変えることができる。典型
的例として、亜鉛、マンガン、鉄、コバルト、カルシウ
ムのような痕跡金ハを無機塩として、成長促進量を供給
することができる。これらの鉱物を、例えば、水道水、
？１σ水等の処理加工した水と共に供給してもよい。
上記した型の栄養培地は周知のものでアシ、組成を広範
に変えることができる。
に変えることができる。
ａｌ胞は、好気性条件下で所望の細胞濃度に増殖された
後、好気性のＰＡＬ生産条件下でＰＡＬを製造するよう
誘導される。ＰＡＬｉ導は一般に、ＰＡＬの基質として
作用する化合物を少量加えることによって達成される。
後、好気性のＰＡＬ生産条件下でＰＡＬを製造するよう
誘導される。ＰＡＬｉ導は一般に、ＰＡＬの基質として
作用する化合物を少量加えることによって達成される。
Ｌ−フェニルアラニンはＰＡＬの優秀な誘導物であυ、
Ｌ−フェニルアラニンの多くの類縁体もこの酵素の合成
を８４する。例エバ、Ｄ、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−
チロシンおよびり、Ｌ−チロシンがこの目的で使用でき
る。さらに、様々な粗製窒素源がＰＡＬ銹導に使用でき
ることがわかった。かかる粗Ｗ’ｌ素源には、多量のＬ
−フェニルアラニンまたはＬ−チロジノを含む加水分解
蛋白質がある。カゼインおよび血液水解物は、ＰＡＬ合
成訪導の粗製窒素源として有利に使用することができる
。
Ｌ−フェニルアラニンの多くの類縁体もこの酵素の合成
を８４する。例エバ、Ｄ、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−
チロシンおよびり、Ｌ−チロシンがこの目的で使用でき
る。さらに、様々な粗製窒素源がＰＡＬ銹導に使用でき
ることがわかった。かかる粗Ｗ’ｌ素源には、多量のＬ
−フェニルアラニンまたはＬ−チロジノを含む加水分解
蛋白質がある。カゼインおよび血液水解物は、ＰＡＬ合
成訪導の粗製窒素源として有利に使用することができる
。
ｐＡＬｓ＝ｓ物はＰＡＬ誘導量で細胞に添加されるが、
その範囲は一般に、醗酵培地の約０．１〜１０ｙ７ｔで
ある。好ましくは、ＰＡＬ誘ｚ与物は、醗酵培地の約４
・〜約８ ？／ｌの濃度で使用される。この工程中、温
度とｐＨのＰＡＬ＠導茶件、通気および撹拌を持続する
。一般に、ＰＡＬ誘導中、温度とｐＨは生理学的な適合
範囲内に保たれる。やや低い温度では酵素の安定性が改
善され、またＰＡＬ誘導物の消費割合が低下するため、
こうした低い温度、例えば約り５℃〜約２５℃が好まし
い。ＰＡＬ訪導の好ましいｐＨは約５．５〜７．５であ
シ、その範囲内では比較的高いＰＡＬレベルが達成され
る。
その範囲は一般に、醗酵培地の約０．１〜１０ｙ７ｔで
ある。好ましくは、ＰＡＬ誘ｚ与物は、醗酵培地の約４
・〜約８ ？／ｌの濃度で使用される。この工程中、温
度とｐＨのＰＡＬ＠導茶件、通気および撹拌を持続する
。一般に、ＰＡＬ誘導中、温度とｐＨは生理学的な適合
範囲内に保たれる。やや低い温度では酵素の安定性が改
善され、またＰＡＬ誘導物の消費割合が低下するため、
こうした低い温度、例えば約り５℃〜約２５℃が好まし
い。ＰＡＬ訪導の好ましいｐＨは約５．５〜７．５であ
シ、その範囲内では比較的高いＰＡＬレベルが達成され
る。
使用する細胞がＰＡＬ合成の異化抑制に敏感である場合
、誘導する前に、異化物質およびその前駆物質を培地か
ら削減あるいは排除するための手段を講じりければなら
ない。この場合、培地から細胞を分離して洗浄し、異化
物質のない培地にそれを懸濁せてもよい。あるいは、Ｐ
ＡＬ誘導を開始する前に、栄養物が実質的に消費されて
しまうまで細胞を増殖させておくこともできる。
、誘導する前に、異化物質およびその前駆物質を培地か
ら削減あるいは排除するための手段を講じりければなら
ない。この場合、培地から細胞を分離して洗浄し、異化
物質のない培地にそれを懸濁せてもよい。あるいは、Ｐ
ＡＬ誘導を開始する前に、栄養物が実質的に消費されて
しまうまで細胞を増殖させておくこともできる。
ＰＡＬ活性が少くとも−当り約０．５単位、好ましくは
少くとも一３ｊ）約２．０単位に達するまで、細胞をＰ
ＡＬ誘導条件下で培養するのが有利である。ＰＡＬ活性
の１単位は、２２℃で秒車、９０．８３μｍｏｌｅある
いは３０℃で秒車９１μｍｏｌｅのｔ−ケイ皮酸を触媒
作用で生み出す酵素の量として定義する。こうした条件
下では、ＰＡＬ活性はある点までは増加し、その後減少
しはじめることが観察された。これらの手順によって製
造されたＰＡＬは、ｔ−ケイ皮酸とアンモニアからＬ−
フェニルアラニンを製造するために使用される。これら
の反応物は水性培地のＰＡＬ含有細胞に直接添加するこ
とができるし、また、そこから分離した細胞あるいは酵
素を、酵素活性が持続している間は再利用することので
きる固型支持体上に周知の方法で固定することができる
。
少くとも一３ｊ）約２．０単位に達するまで、細胞をＰ
ＡＬ誘導条件下で培養するのが有利である。ＰＡＬ活性
の１単位は、２２℃で秒車、９０．８３μｍｏｌｅある
いは３０℃で秒車９１μｍｏｌｅのｔ−ケイ皮酸を触媒
作用で生み出す酵素の量として定義する。こうした条件
下では、ＰＡＬ活性はある点までは増加し、その後減少
しはじめることが観察された。これらの手順によって製
造されたＰＡＬは、ｔ−ケイ皮酸とアンモニアからＬ−
フェニルアラニンを製造するために使用される。これら
の反応物は水性培地のＰＡＬ含有細胞に直接添加するこ
とができるし、また、そこから分離した細胞あるいは酵
素を、酵素活性が持続している間は再利用することので
きる固型支持体上に周知の方法で固定することができる
。
Ｌ−フェニルアラニンは、Ｌ−フェニルアラニン製造条
件下で、この方法によ、？Ｗ造される。これらの条件は
、使用する特定の微生物菌株、細胞全体あるいは無細胞
酵素製造のどちらを使うが、そして、固定システムを使
うかどうか、にょって異なる。Ｌ−フェニルアラニンを
製造するためのｔ−ケイ皮酸とアンモニアのＰＡＬ触媒
反応は可逆的であり、実際に平衡はＬ−フェニルアラニ
ンの破壊を助ける。そのため、温度以外で反応に影響を
及ぼすもう１つの要素は反応物の濃度である。
件下で、この方法によ、？Ｗ造される。これらの条件は
、使用する特定の微生物菌株、細胞全体あるいは無細胞
酵素製造のどちらを使うが、そして、固定システムを使
うかどうか、にょって異なる。Ｌ−フェニルアラニンを
製造するためのｔ−ケイ皮酸とアンモニアのＰＡＬ触媒
反応は可逆的であり、実際に平衡はＬ−フェニルアラニ
ンの破壊を助ける。そのため、温度以外で反応に影響を
及ぼすもう１つの要素は反応物の濃度である。
有利な反応速度とするためには、反応混合液中のｔ−ケ
イ皮酸の濃度を比較的高いレベルで保つのが有利である
。一方、ｔ−ケイ皮酸の濃度が過剰だとＰＡＬの活性は
抑制される。従って、ｔ−ケイ皮酸の濃度を上記の範囲
内に保つため姉、この反応物を反応の後期段階以外のす
べての段階で反応混合液に定期的にあるいは連続して供
給することができる。アンモニウムイオンのＰＡＬｉＣ
対−７−る抑制効果はｔ−ケイ皮酸よシやや少く、その
ため、多くの先行技術の転化方法におけるアンモニウム
イオンの濃度は、Ｌ−フェニルアラニンの収率を高める
ために実質的に化学量以上である。しかし、本発明のは
るかに低い反応温度では、大幅に過剰のアンモニウムイ
オンは不必要である。一般に、ｔ−ケイ皮酸とアンモニ
ア水（−！たけ可溶性アンモニア塩）ｉｌ′ｉ、アンモ
ニアがモル基準でｔ−ケイ皮酸以上であるような量で供
給される。を−ケイ皮酸は、約０．０１Ｍ〜約１．０
Ｍ、好ましくは約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの濃度で反応培
地に供給される。
イ皮酸の濃度を比較的高いレベルで保つのが有利である
。一方、ｔ−ケイ皮酸の濃度が過剰だとＰＡＬの活性は
抑制される。従って、ｔ−ケイ皮酸の濃度を上記の範囲
内に保つため姉、この反応物を反応の後期段階以外のす
べての段階で反応混合液に定期的にあるいは連続して供
給することができる。アンモニウムイオンのＰＡＬｉＣ
対−７−る抑制効果はｔ−ケイ皮酸よシやや少く、その
ため、多くの先行技術の転化方法におけるアンモニウム
イオンの濃度は、Ｌ−フェニルアラニンの収率を高める
ために実質的に化学量以上である。しかし、本発明のは
るかに低い反応温度では、大幅に過剰のアンモニウムイ
オンは不必要である。一般に、ｔ−ケイ皮酸とアンモニ
ア水（−！たけ可溶性アンモニア塩）ｉｌ′ｉ、アンモ
ニアがモル基準でｔ−ケイ皮酸以上であるような量で供
給される。を−ケイ皮酸は、約０．０１Ｍ〜約１．０
Ｍ、好ましくは約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの濃度で反応培
地に供給される。
このｔ−ケイ皮酸濃度に対し、アンモニアの濃度は一般
に、約０．１〜約１０．０モル、好ましくは約１．０〜
約８．０モルの範囲である。
に、約０．１〜約１０．０モル、好ましくは約１．０〜
約８．０モルの範囲である。
１９８４年６月１１日出願の我々の同時係属米国出願第
６１９ 、１８３号には、制限された濃度でｔ−ケイ皮
酸を反応に供給する別法が記載されている。
６１９ 、１８３号には、制限された濃度でｔ−ケイ皮
酸を反応に供給する別法が記載されている。
非水相にケイ皮酸エステル、例えばケイ皮酸メチル、そ
して水相にアンモニウムイオンを含む二相生物反応混合
液を調整する。この生物反応混合液を少量のケイ皮酸エ
ステルが所望の濃度で水相に溶解する温度および溶媒条
件下に保つ。アンモニウムイオンが水相でｔ−ケイ皮酸
と反応してＬ−フェニルアラニンを製造するように、水
相を溶解したエステルを再エステル化する酵素およびフ
ェニルアラニンアンモニア−リア・−ゼと接触させる。
して水相にアンモニウムイオンを含む二相生物反応混合
液を調整する。この生物反応混合液を少量のケイ皮酸エ
ステルが所望の濃度で水相に溶解する温度および溶媒条
件下に保つ。アンモニウムイオンが水相でｔ−ケイ皮酸
と反応してＬ−フェニルアラニンを製造するように、水
相を溶解したエステルを再エステル化する酵素およびフ
ェニルアラニンアンモニア−リア・−ゼと接触させる。
ケイ皮酸エステルは、再エステル化されて水相でＬ〜フ
ェニルアラニンに転化するため、このエステルは非水相
から溶液に入るケイ皮酸エステルで補充される。
ェニルアラニンに転化するため、このエステルは非水相
から溶液に入るケイ皮酸エステルで補充される。
好寸しいアンモニウム塩はハロゲンイオンを含まないも
のである。基質溶液中にハロゲンが存在するとＰＡＬの
触媒活性が抑制されることがわかった。そのため、好ま
しいアンモニウム塩には、炭酸アンモニウム、硫酸アン
モニウム、硝酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、
酢酸アンモニウム、およびリン酸アンモニウムがある。
のである。基質溶液中にハロゲンが存在するとＰＡＬの
触媒活性が抑制されることがわかった。そのため、好ま
しいアンモニウム塩には、炭酸アンモニウム、硫酸アン
モニウム、硝酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、
酢酸アンモニウム、およびリン酸アンモニウムがある。
特に好捷しいアンモニウム塩は炭酸アンモニウムである
。
。
基質溶液を製造する便利な方法は、アンモニア水溶液に
ｔ−ケイ皮酸を溶解し、その後二酸化炭素の散布あるい
は硫酸などの鉱酸の添加によシ溶液のｐＨを所望される
ように調整するものである。
ｔ−ケイ皮酸を溶解し、その後二酸化炭素の散布あるい
は硫酸などの鉱酸の添加によシ溶液のｐＨを所望される
ように調整するものである。
ｔ−ケイ皮酸とアンモニアの酵素によるＬ−フェニルア
ラニンへの転化は、好ましくは生物反応器の中で実施さ
れる。有利には、この方法はろ過あるいは遠心分離によ
って醗酵培地から細胞を分離し、ｔ−ケイ皮酸とアンモ
ニウムの基質溶液中にそれを懸濁させることを含む。あ
るいは、細胞またはＰＡＬを固型支持体上に固定して、
転化反応を連続的に行うことができる。
ラニンへの転化は、好ましくは生物反応器の中で実施さ
れる。有利には、この方法はろ過あるいは遠心分離によ
って醗酵培地から細胞を分離し、ｔ−ケイ皮酸とアンモ
ニウムの基質溶液中にそれを懸濁させることを含む。あ
るいは、細胞またはＰＡＬを固型支持体上に固定して、
転化反応を連続的に行うことができる。
生物反応混合液は、少くとも転化過程の最終部分を通じ
て約り℃〜約３０℃の温度に保たれる。
て約り℃〜約３０℃の温度に保たれる。
好ましくは、温度は約り℃〜約２５℃である。所望なら
ば、反応速度を増加させるために、反応を反応の初期段
階でやや高い温度、たとえば約２５℃で行うことができ
る。その後、収率を増加させるために反応の最終段階で
は温度を好ましくけ約り℃〜約２５℃に低下させる。典
型的には、転化が約７０チに達するまで反応を高い温度
で行う。
ば、反応速度を増加させるために、反応を反応の初期段
階でやや高い温度、たとえば約２５℃で行うことができ
る。その後、収率を増加させるために反応の最終段階で
は温度を好ましくけ約り℃〜約２５℃に低下させる。典
型的には、転化が約７０チに達するまで反応を高い温度
で行う。
生物反応は、多量のし一フェニルアラニンが反応混合液
中に蓄積するまで続ける。適切な方法であればどんな方
法ででもＬ−フェニルアラニンを反応混合液から回収す
ることができる。例えば、固体をろ過あるいは遠心分離
によって除外して清浄液とＬ、ｐＨをＬ−フェニルアラ
ニンの等電子点、すなわち約５．５調整することによっ
てその溶液からＬ−フェニルアラニンを沈澱させること
ができる。
中に蓄積するまで続ける。適切な方法であればどんな方
法ででもＬ−フェニルアラニンを反応混合液から回収す
ることができる。例えば、固体をろ過あるいは遠心分離
によって除外して清浄液とＬ、ｐＨをＬ−フェニルアラ
ニンの等電子点、すなわち約５．５調整することによっ
てその溶液からＬ−フェニルアラニンを沈澱させること
ができる。
以下の実施例は本発明をさらに説明するものであり、転
化反応中の温度を低下させることの有利な効果を証明す
るものである。しかし、本発明はこの実施例によって限
定されるとは解釈されない。
化反応中の温度を低下させることの有利な効果を証明す
るものである。しかし、本発明はこの実施例によって限
定されるとは解釈されない。
実施例中、略字／ ｃ、 Ａ、／はｔ−ケイ皮酸の代わ
υに使用する。
υに使用する。
実施例１
連続的、単一流路のＬ−フェニルアラニン転化反応を、
バーミキュライト上に固定されたＲ、ｒｕｂｒａの細胞
全体を含むプラグ流カラム生物反応器を使って行った。
バーミキュライト上に固定されたＲ、ｒｕｂｒａの細胞
全体を含むプラグ流カラム生物反応器を使って行った。
以下に示す反応条件を使って実施した：
反応条件
ｐＩ（１０，３
温度 ２０℃１流量（ｓ
ｖ”） ０．０４ ＰＡＬ活性（ｕ／ｇｍ細胞の乾燥重量→ ９゜供給
流 総アンモニア（炭酸アンモニウム ７．５Ｍお
よびアンモニウム水酸化物 として） Ｃ，Ａ、 （４１，、１ｇｍ／ｌ ）
０．２７８ Ｍ流出液流 ２Ｃ，ｈ、 （紫外ｍ吸光度） ０
．０３３６Ｍ”ｒ、−ＰＲＥ（Ｌ−ＡＡＯ検定）
０．２６６７ ＭＩ ＳＶ”＝時間当シ
の反応物体積 ２ 連続４日間の平均値 Ｌ−フェニルアラニン２２６．７ｍＭおよびケイ皮酸３
３．６ ｍＭの流出液測定は８８．８％の転化率を与え
た。カラム中の支持物質は反応の初期段階ではケイ皮酸
に対してわずかに親和性であるため、転化は、供給流で
のケイ皮酸の濃度よυむしろ流出液での濃度に基づいて
いた。従って、供給流の濃度は反応に役立つ基質の正確
な測定ではない。供給流のケイ皮酸濃度に基づいていた
なら、見かけの転化率ははるかに高くなったであろう（
９５，９％）。
ｖ”） ０．０４ ＰＡＬ活性（ｕ／ｇｍ細胞の乾燥重量→ ９゜供給
流 総アンモニア（炭酸アンモニウム ７．５Ｍお
よびアンモニウム水酸化物 として） Ｃ，Ａ、 （４１，、１ｇｍ／ｌ ）
０．２７８ Ｍ流出液流 ２Ｃ，ｈ、 （紫外ｍ吸光度） ０
．０３３６Ｍ”ｒ、−ＰＲＥ（Ｌ−ＡＡＯ検定）
０．２６６７ ＭＩ ＳＶ”＝時間当シ
の反応物体積 ２ 連続４日間の平均値 Ｌ−フェニルアラニン２２６．７ｍＭおよびケイ皮酸３
３．６ ｍＭの流出液測定は８８．８％の転化率を与え
た。カラム中の支持物質は反応の初期段階ではケイ皮酸
に対してわずかに親和性であるため、転化は、供給流で
のケイ皮酸の濃度よυむしろ流出液での濃度に基づいて
いた。従って、供給流の濃度は反応に役立つ基質の正確
な測定ではない。供給流のケイ皮酸濃度に基づいていた
なら、見かけの転化率ははるかに高くなったであろう（
９５，９％）。
これらの反応条件のもとで、ｋｅｑは１．１９と算定さ
れた。
れた。
実施例２
連続的、単一流路のし一フェニルアラニン転化反応を、
供給流中のケイ皮酸とアンモニアの濃度をやや高くして
、実施例１と同様の方法で行った。
供給流中のケイ皮酸とアンモニアの濃度をやや高くして
、実施例１と同様の方法で行った。
反応条件は以下の通り：
反応条件
ｐＨ１０，３
温度 ２０℃”流ｉ （Ｓ
Ｖ”） ０．０１５Ｐ
ＡＬ活性（ｕ／ｇｍ細胞の乾燥重量）９０供給流 炭酸アンモニウムとして添加 ２．２５
Ｍしたアンモニア アンモニウム水酸化物として ５．６０
Ｍ添加したアンモニア 総アンモニア ７．８５
ＭＣ，Ａ、 （５３，９８ｇｍ／／−）
０．３６５Ｍ流出液流 ”Ｃ，Ａ、 （ｆＪ［ｒ［光度）
０．０４３Ｍ２Ｌ−ＰＨＥ （Ｌ−ＡＡＯ検定）
０．３５６ＭＩ ５Ｖｈ−１＝＝時
間当シの反応物の体積２ 連続４日間の平均値 Ｌ−フェニルアラニン３５６ｍＭおよびケイ皮酸４３ｍ
Ｍの流出液測定は、これらの反応条件のもとて転化率８
９．２％、 ｋｅｑｌ、１３を与えた。
Ｖ”） ０．０１５Ｐ
ＡＬ活性（ｕ／ｇｍ細胞の乾燥重量）９０供給流 炭酸アンモニウムとして添加 ２．２５
Ｍしたアンモニア アンモニウム水酸化物として ５．６０
Ｍ添加したアンモニア 総アンモニア ７．８５
ＭＣ，Ａ、 （５３，９８ｇｍ／／−）
０．３６５Ｍ流出液流 ”Ｃ，Ａ、 （ｆＪ［ｒ［光度）
０．０４３Ｍ２Ｌ−ＰＨＥ （Ｌ−ＡＡＯ検定）
０．３５６ＭＩ ５Ｖｈ−１＝＝時
間当シの反応物の体積２ 連続４日間の平均値 Ｌ−フェニルアラニン３５６ｍＭおよびケイ皮酸４３ｍ
Ｍの流出液測定は、これらの反応条件のもとて転化率８
９．２％、 ｋｅｑｌ、１３を与えた。
実施例３
転化率に与える反応温度の影響を説明するために、一連
のバッチ反応を温度を変えて行った。各りの例では、６
Ｍアンモニア、ｐＨ１０，２，４２ｍＭｔ−ケイ皮酸お
よび５０ｃｃの基質当りＩＰ（乾燥重量）のＲ，ｒｕｂ
ｒａ 細胞を使って反応を２日間行った。２日間の間
に試料を採取して、Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ａ人Ｏ
検定）とｔ−ケイ皮酸（紫外線吸光度）の両方を分析し
た。２４時間終了までにすべての反応器で平衡が認めら
れた。各反応温度ごとに転化率とｋｅｑ’、ｃ算定した
。以下に挙げる表は、各温度での転化率、ｋｅｑ、およ
びＬ−フェニルアラニンとｔ−ケイ皮酸の平衡濃度を示
している。データから温度が低下すると転化率が増加す
ることが明らかである。
のバッチ反応を温度を変えて行った。各りの例では、６
Ｍアンモニア、ｐＨ１０，２，４２ｍＭｔ−ケイ皮酸お
よび５０ｃｃの基質当りＩＰ（乾燥重量）のＲ，ｒｕｂ
ｒａ 細胞を使って反応を２日間行った。２日間の間
に試料を採取して、Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ａ人Ｏ
検定）とｔ−ケイ皮酸（紫外線吸光度）の両方を分析し
た。２４時間終了までにすべての反応器で平衡が認めら
れた。各反応温度ごとに転化率とｋｅｑ’、ｃ算定した
。以下に挙げる表は、各温度での転化率、ｋｅｑ、およ
びＬ−フェニルアラニンとｔ−ケイ皮酸の平衡濃度を示
している。データから温度が低下すると転化率が増加す
ることが明らかである。
温度℃ｍＭＬ−ＰＨＥ ｍＭ ＣＡ 転化％ ｋ
ｅｑｌ２．３ ３７．７７ ４．３２ ８９．９
３ １．４７１７．９ ３７．３９ ５Ｌ１９
８９．０２ １．２１２１．１ ３７．０３ ５．
８０ ８８．１７ ＬＯ７２６，３３５，２７６，
３６８３，９８０，９３３０，３３４，３６６，８５８
１，８１０，８４３２，９３３，８２８，２１８０，５
２０，６９実施例４ ８つのパッチ反応器を使って、４つづつ１５℃と３０℃
でｐＨ９，７５、１０，００、１０，２５、１０，５０
で反応を行った。５０ｃｃの基質当り １． ｆ （乾
燥重量）のＲ，ｒｕｂｒａ細胞（９Ｑ ｕ／ｇｍ ）と
４０ ｍＭ ＣＡおよび７．５Ｍアンモニアを使って反
応を進めて平衡にした。Ｌ−フェニルアラニンとｔ−ケ
イ皮酸の平衡濃度は、それぞれＬ −ＡＡＯ検定と紫外
線吸光度によって測定し、それを使ってｋｅｑを算定し
た。結果ヲ表１に示す。Ｌ−フェニルアラニンへの転化
（ｋｅｑ ）は温度に依存しておシ、基本的にはｐＨと
は無関係である。
ｅｑｌ２．３ ３７．７７ ４．３２ ８９．９
３ １．４７１７．９ ３７．３９ ５Ｌ１９
８９．０２ １．２１２１．１ ３７．０３ ５．
８０ ８８．１７ ＬＯ７２６，３３５，２７６，
３６８３，９８０，９３３０，３３４，３６６，８５８
１，８１０，８４３２，９３３，８２８，２１８０，５
２０，６９実施例４ ８つのパッチ反応器を使って、４つづつ１５℃と３０℃
でｐＨ９，７５、１０，００、１０，２５、１０，５０
で反応を行った。５０ｃｃの基質当り １． ｆ （乾
燥重量）のＲ，ｒｕｂｒａ細胞（９Ｑ ｕ／ｇｍ ）と
４０ ｍＭ ＣＡおよび７．５Ｍアンモニアを使って反
応を進めて平衡にした。Ｌ−フェニルアラニンとｔ−ケ
イ皮酸の平衡濃度は、それぞれＬ −ＡＡＯ検定と紫外
線吸光度によって測定し、それを使ってｋｅｑを算定し
た。結果ヲ表１に示す。Ｌ−フェニルアラニンへの転化
（ｋｅｑ ）は温度に依存しておシ、基本的にはｐＨと
は無関係である。
表１
手続補正書（自発）
昭和６０・年７・３見 ８
Claims (4)
- （１）フェニルアラニンアンモニア−リアーゼの存在下
、約３０℃以下の温度でトランス−ケイ皮酸とアンモニ
ウムイオンを反応させ、Ｌ−フェニルアラニンを回収す
ることから成るＬ−フェニルアラニンの製造方法。 - （２）該温度が５℃〜２５℃である特許請求の範囲第１
項に記載の製造方法。 - （３）フェニルアラニンアンモニア−リアーゼの存在下
、トランス−ケイ皮酸とアンモニウムイオンを二段階反
応で反応させ、その第一段階を反応速度を最適化するた
めに比較的高温で実施し、第二段階を収率を最適化する
ために３０℃以下の低温で実施するものとし、Ｌ−フェ
ニルアラニンを回収することから成るＬ−フェニルアラ
ニンの製造方法。 - （４）反応の第一段階を約２５℃の温度で実施し、第二
段階を約５℃〜約２５℃の温度で実施することから成る
、特許請求の範囲第３項に記載の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61911784A | 1984-06-11 | 1984-06-11 | |
| US619117 | 1984-06-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6112297A true JPS6112297A (ja) | 1986-01-20 |
Family
ID=24480529
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12525985A Pending JPS6112297A (ja) | 1984-06-11 | 1985-06-11 | Ｌ‐フエニルアラニンの製造方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0165757A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6112297A (ja) |
| BR (1) | BR8502781A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60133893A (ja) * | 1983-10-31 | 1985-07-17 | ジェネックス・コーポレイション | Ｌ−フエニルアラニンの製造方法 |
| GB8630009D0 (en) * | 1986-12-16 | 1987-01-28 | Rizla Ltd | Machine for making paper booklets |
| DE69300712T2 (de) * | 1992-02-17 | 1996-07-25 | Mitsui Toatsu Chemicals | Verfahren zur Reinigung von L-Phenylalanin. |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1206435A (en) * | 1982-10-01 | 1986-06-24 | Wayne E. Swann | Method for the production of l-phenylalanine through the reuse of phenylalanine ammonia lyase |
| US4584269A (en) * | 1983-10-31 | 1986-04-22 | Genex Corporation | Method for stabilizing the enzymatic activity of phenylalanine ammonia lyase during L-phenylalanine production |
| US4584273A (en) * | 1983-10-31 | 1986-04-22 | Genex Corporation | Method for the production of phenylalanine ammonia-lyase by fermentation |
| JPS6143993A (ja) * | 1984-08-08 | 1986-03-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | α−アミノ酸の製造法 |
-
1985
- 1985-06-11 JP JP12525985A patent/JPS6112297A/ja active Pending
- 1985-06-11 EP EP85304128A patent/EP0165757A3/en not_active Withdrawn
- 1985-06-11 BR BR8502781A patent/BR8502781A/pt unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0165757A2 (en) | 1985-12-27 |
| EP0165757A3 (en) | 1987-07-22 |
| BR8502781A (pt) | 1986-02-18 |
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