JPH0272891A - Ｓ−カルボキシメチル−ｌ−システイン誘導体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、トリプトファンシンターゼの存在下に、し−
セリンとチオグリコール酸エステルとを反応させてＳ−
力ルボキシメチル−し−システィン誘導体を製造する方
法に関する。

より詳細には、トリプトファンシンターゼの存在下に、
Ｌ−セリンと一般式（Ｉ） ％式％（Ｉ） （ただし、Ｒはアルキル基を示す）で表されるチオグリ
コール酸エステルとを反応させて一般式（（ただし、Ｒ
は一般式（Ｉ）の場合と同じ意味を示す、）で表される
Ｓ−カルボキシメチル−し−システィン誘導体を製造す
る方法に関する。

Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システィン誘導体は、医薬
品などの原料として有用な物質であり、エステル部分を
加水分解すれば、去痰剤として有用なＳ−カルボキシメ
チル−Ｌ−システィンを得ることができる。

〔従来の技術〕

トリプトファンシンターゼは、種々の反応を触媒する多
機能酵素としてよく知られている（例えば、Ａｄｖａｎ
ｃｅｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｒｅ１
ａｔｅｄ　Ａｒｅａｓｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、４９．ｐ、１２７−１８５（Ｉ９
７９））、また、トリプトファンシンターゼが、β−ク
ロロアラニンまたはセリンとチオグリコール酸からＳ−
カルボキシメチル−Ｌ−システィンを合成する反応を触
媒することが知られている（特開昭５８−１８７１９８
　）　。

（発明が解決しようとする課題〕 本発明の課題は、トリプトファンシンターゼの新しい酵
素機能の開発を目的とする新規な酵素反応を提供するこ
とである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は上記課題解決のため種々研究を重ねた結果
、トリプトファンシンターゼの存在下に、Ｌ−セリンと
前記一般式（Ｉ）で表されるチオグリコール酸エステル
とを反応させると、前記−般式（ｎ）で表されるＳ−カ
ルボキシメチル−し−　システィン誘導体が生成するこ
とを見出した。更に、驚くべき事には、このトリプトフ
ァンシンターゼによるセリンとチオグリコール酸エステ
ルからのＳ−力ルボキシメチルーＬ−ソステイン誘導体
合成の酵素反応速度は、従来公知のトリプトファンシン
ターゼによるセリンとチオグリコール酸からのＳ−カル
ボキンメチル−Ｌ−システィン合成の酵素反応速度に比
べ著しく大きいことを見出した。

本発明は、このような知見に基づいて完成したものであ
る。

トリプトファンシンターゼは、インドール−３グリセロ
燐酸とＬ−セリンからＬ−）リプトファンを合成する反
応のほかに、種々の反応を触媒する多機能酵素であるこ
とは良く知られている（例えばＡｄｖａｎｃｅｓ　　ｉ
ｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　　ａｎｄ　　Ｒｅ１ａｔ
ｅｄ　　Ａｒｅａｓ　　ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、４９．ｐ、１２７−１８５（Ｉ９
７９））。

しかしながら、トリプトファンシンターゼによる本発明
の反応は、本発明者らが初めて見出したものである。

本願発明の方法で使用するトリプトファンシンターゼは
、微生物、高等植物などに広く存在していることが知ら
れており（例えば、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ＋ｃａｌ　
Ｒｅｖｉｅｗｓ、　Ｖｏｌ、３９．　Ｎｏ、２．ｐ、８
７−１２０　（Ｉ９７５））、酵素源が特に限定されな
いが、通常は微生物起源のものであればよい。

トリプトファンシンターゼを生産する菌株としては、た
とえば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　ｃｏｌｉ）　ＭＴ−１０２３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１
９）　、エシェリヒア・コリＭＴ−１０２４２（ＦＥＲ
門ＢＰ−２０）、ノイロスポラ・クラノサ（Ｎｅｕｒｏ
ｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）ＡＴＣＣ−１４６９２、サ
ツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＣＣ−２６７８７など
がある。

エシェリヒア・コリの培養菌体からのトリプトファンシ
ンターゼの抽出法については、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ
　　ｏｆ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｃｈｅ＋５ｉｓ
ｔｒｙ、Ｖｏｌ、２４９．ＮＯ，２４，ｐ、７７５６−
７７６３（Ｉ９７４年）、ノイロスポラ・クラッサの培
養菌体からの抽出法については、同Ｖｏ１．２５０．Ｎ
。

８、ｐ、２９４１−２９４６（Ｉ９７５年）、サツカロ
ミセス・セレビシェの培養菌体からの抽出法については
、Ｅｕｒ。

ｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、Ｖｏｌ、１０２．ｐ、１５９〜１６５（Ｉ９７
９年）に記載され知られている。しかし、本発明に使用
されるトリプトファンシンターゼは、必ずしも抽出され
た純粋な物である必要はない、すなわち、トリプトファ
ンシンターゼ生産菌の培養物、培養物から遠心分離など
の方法によって採取した生菌体、その乾燥菌体、あるい
は菌体を磨砕、自己消化、超音波処理などをすることに
よって得られる菌体処理物、更には、これらの菌体より
の抽出物並びに該抽出物より得られる酵素の粗製物であ
っても利用できる。もちろん、これらの固定化物でもよ
い。

トリプトファンシンターゼ生産菌を培養するための培地
としては、炭素源、窒素源、無機物および必要に応じて
少量の微量栄養素を含むものであれば、合成培地または
天然培地の何れも使用可能である。培地へ微量のトリプ
トファンまたはインドールを添加することが有効なこと
もある。また、培地へ微量のインドールアクリル酸を添
加することによりトリプトファンシンターゼ生産量が高
まることもある。

培養は、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件
下で行う。培養温度は通常は２０〜４０°Ｃ１好ましく
は、２５〜３７°Ｃの範囲である。壇養液のｐ）Ｉは５
〜８の範囲である。

反応基質であるセリンとしては、通常はＬ体が用いられ
る。ＤＬ−セリンも用いることができるが、この場合は
Ｌ体のみが反応の基質となる。

もう一方の反応基質であるチオグリコール酸アルキルエ
ステルのエステル部分の炭素数は、特に制限はないが、
通常は１〜８程度のものが用いられる。

本発明においては、トリプトファンシンターゼの存在下
、通常ｐＨ６〜１０の水性媒質中で、Ｌ−セリンとチオ
グリコール酸エステルとを反応させる、反応温度は２０
〜６０°Ｃが適当である。

反応時間は、酵素力価、基質濃度、その他の条件により
異なるが、回分反応では通常１〜１００時間である。

反応は、静置または屍拌下に行われる。特に、チオグリ
コール酸アルキルエステルはエステル部分の炭素数が多
（なると水に対する溶解度が小さくなるので、反応は攪
拌下で行なうことが望ましい 基質であるし一セリンとチオグリコール酸エステルの濃
度は特に制限はないが、通常は、０．１〜３０重量％程
度である。基質は反応開始時に全量を反応液に添加して
も良いし、反応の進行にともない分割添加することも可
能である。反応に際しては、基質の他に補酵素であるピ
リドキサール燐酸を微量添加することが望ましい。

このようにして反応を行うと、反応液中にはＳカルボキ
シメチル−し−システィン誘導体が生成する。

反応液からＳ−カルボキシメチル−し−システィン誘導
体を回収するには、通常の方法を用いることができる。

特に、反応基質のチオグリコール酸アルキルエステルと
してエステル部分の炭素数の多いものを用いた場合は、
生成するＳ−力ルボキシメチルーＬ−システィン誘導体
は水に対する溶解度が小さいので、反応液から濾過など
により容易に回収できる。

このようにして得られたＳ−カルボキンメチル−しシス
ティンｍ８体は、エステル部分を常法により加水分解す
れば、Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−シスナインを得るこ
とができる。

〔実施例〕

以下、本発明の方法を実施例により具体的に説明する。

なお、Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システィンとＳカル
ボキシメチル−し−システィン誘導体の定量は、液体ク
ロマトグラフィーで行った。生成したＳカルボキシメチ
ル−し−システィンとＳ−カルボキンメチル−Ｌ−シス
ティンがＬ体であることは、光学異性体分離用カラムを
用いた液体クロマトグラフィーにより確認した。

実施例−１ 肉エキス１％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．１χ
、Ｋ）１．ＰＯ，０，２Ｘ　、　ｐ）！　１．０ｔｌ）
液体培地ニエシエリヒア・コリＭＴ−１０２４２（ＦＥ
ＲＭ　ＩＩＰ−２０）を接種し、３０°Ｃにて２０時間
振盪培養した。培養終了後、遠心分離して菌体を集め、
Ｏ，Ａｄａｃｈｉらの方法（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏ
ｌ、　２４９．ＮＯ。

２４、ｐ、７７５６−７７６３　（Ｉ９７４年））に従
って精製湿作を行い、比活性が９．２単位／ｍｇの力価
のトリプトファンシンターゼを取得し、この酵素を用い
て以下の反応を行った。

トリプトファンシンターゼの活性は、Ｃ，’１ａｎｏｆ
ｓｋｙらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
１ｏｇｙ＋Ｖｏ１．５．ｐ、８０１−８０７（Ｉ９６２
）　）により測定し、ｐＨ７，８，３７’Ｃニおいて１
μｍｏｌ／ｗｉｎのトリプトファンをＬ−セリンとイン
ドールから合成する酵素量を１単位とした。

Ｌ−セリン１００ｍＭ、第１表に示したチオグリコール
酸エステル１００ｍＭ、ピリドキサール燐酸０，１１、
トリプトファンシンターゼ０．９単位を含みｐＨ８，５
に調整した反応液１１を、３５°Ｃで３０分間マグネチ
ックスクーラーを用いて攪拌した。

生成したＳ−カルボキンメチル−Ｌ−システィン誘導体
の濃度を第１表に示した。

参考例−１ 実施例１におけるチオグリコール酸エステルの代りに、
チオグリコール酸を用いる他は、実施例１と同様に反応
を行なった０反応液中に生成したＳ−カルボキシメチル
−し−システィンは、僅が０．１７１１Ｉ？Ｉであった
。

実施例−２ ノイロスポラ・クラッサ　ＡＴＣＣ−１４６９２を用い
、Ｗ、　Ｈ，Ｍａ　Ｌｃｈｅ　ｔ　ｔらの方法（Ｔｈｅ
　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ旧ｏ１ｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ、２５０．Ｎｏ、８．ｐ、２９４１
−２９４６（Ｉ９７５年））に従い、培養および酵素精
製を行い、比活性が１．３単位／ｍＨの力価のトリプト
ファンシンターゼを取得し、この酵素液を用いて以下の
反応を行った。

し−セリン５０ＩＩＭ、チオグリコール酸ブチル５０１
１門、ピリドキサール燐酸０．１ｍＭ、ピロリン酸カリ
ウム緩衝ン夜５０１、トリプトファンシンターゼ０．２
単位を含む反応ｉ’＆（ｐＨ８，５）１ｍｌを、４０’
Ｃテ５時間振盪した０反応液中には、４４ｍＭのＳ−力
ルボキシメチルーし−　システィンが生成した。

実施例−３ ペプトンｌχ、酵母エキス０．５χ、グルコース２χ、
インドールアクリル酸０．０１χ、ｐＨ６，０の液体培
地にサツカロミセス・セレビシェ　ＡＴＣＣ−２６７８
７を接種し、３０°Ｃにて２０時間振盪培養した。培養
終了後、遠心分離して菌体を集め、Ｍ、Ｄｅｔｔｗｉｌ
ｅｒらの方法（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ。

１０２、ｐ、１５９−１６５　（Ｉ９７９年））に従い
酵素精製を行い、比活性が１．２単位／ｍｇの力価のト
リプトファンシンターゼを取得し、この酵素液を用いて
以下の反応を行った。

Ｌ−セリン５０１、チオグリコール酸エチル５０ｍ門、
ピリドキサール燐酸０．ｌｎＭ、ピロリン酸カリウム緩
衝液５０１、トリプトファンシンターゼ０．２単位を含
む反応液（ｐＨ８，５）　１ｍｌを、３０°Ｃで５時間
振盪した０反応液中には、１６１のＳ−力ルポキシメチ
ル−し−システィンが生成した。

実施例−４ 肉エキス１χ、ペプトン０．５χ、酵母エキス０．１χ
、ＫＨｚＰＯ＜　０．２χ、ｐＨ７，０の液体培地にエ
シェリヒア・コリ門Ｔ−１０２４２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−
２０）を接ｍし、３５°Ｃにて１５時間振盪培養した。

培養終了後、遠心分離して菌体を集め、これをトリプト
ファンシンターゼの酵素源として用いた。この湿菌体１
ｇ当たりのトリプトファンシンターゼ活性は、２３０単
位であった。

し−セリン３００ＩｘＭ、チオグリコール酸２−エチル
ヘキシル３００ｍＭ、ピリドキサール燐酸０．５ｍＭ、
ピロリン酸カリウム１０１００Ｉを含む水溶液に２ｇの
湿菌体を添加した１００ｍＩＯ）反応液（ｐＨ８，０）
を、６００ｒｐｍで攪拌しながら、４０℃で４時間反応
した。

反応液中には、２７４ｍＨの５−（２−エチルへキシル
オキシカルボニルメチル）−Ｌ−システィンと３１のＳ
−力ルボキシメチル−し−システィンが生成した。

実施例−５ 実施例４におけるし一セリンの代りに、ＤＬ−セリン６
００ｍＭを用い、他は実施例４と同様に反応を行なった
。

反応液中には、２６８１の５−（２−エチルへキシルオ
キソカルボニルメチル）−シーシスティンと３ｍＭのＳ
−カルボキシメチル−Ｌ−システィンが生成した。

参考例−２ 実施例４の反応終了液から濾過により、５−（２エチル
へキンルオキシ力ルポニルメチル）−Ｌ−システィンを
回収し、これを３規定の塩酸３００ｍ１中で５０°Ｃ１
３０分間加熱した。次いで、水酸化ナトリウムにより、
溶液のｐＨを２．５に調整し、生した結晶を濾別、乾燥
することにより３．６ｇのＳ−カルボキシメチル−し−
システィンを得た。

特許出願人　　三井東圧化学株式会社 手続主甫正書　（自発） 昭和６３年１２月１％日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 ■、事件の表示 昭和６３年特許願第２２１３５８号 ２、発明の名称 Ｓ−カルボキシメチル−し−システィン誘導体の製造方
法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　東京都千代田区霞が関三丁目２番５号名称（３１
２）　　三井東圧化学株式会社４、補正により増加する
発明の数　　零５、補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄および発明の詳細な説明の
欄 ６、補正の内容 する。

（２）明細書、第２頁、第８行目に るのを 正する。

（３）明細書、第１２頁、第２０行目に「Ｓ−カルボキ
シメチル−Ｌ−システィン」とあるのを「Ｓ−ブトキシ
カルボニルメチル−し−システィン」と訂正する。

（４）明細書第１３頁第１６〜１７行目に「Ｓ−カルボ
キシメチル−し−システィン」とあるのを「Ｓ−エトキ
シカルボニルメチル−し−システィン」と訂正する。

別紙 「２、特許請求の範囲 １）トリプトファンシンターゼの存在下に、Ｌ−セリン
と一般式（Ｉ） ％式％（Ｉ） （ただし、Ｒはアルキル基を示す）で表されるチオグリ
コール酸エステルとを反応させることを特徴とする一般
式（Ｉ［） （ただし、ＲＬｌ：般式（Ｉ）の場合と同じ意味を示３
つ−で表されるＳ−カルボキシメチル−し−システィン
誘導体の製造方法。」 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）トリプトファンシンターゼの存在下に、Ｌ−セリン
   と一般式（ I ） ＨＳ−ＣＨ＿２−ＣＯＯＲ（ I ） （ただし、Ｒはアルキル基を示す）で表されるチオグリ
   コール酸エステルとを反応させることを特徴とする一般
   式（II） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （ただし、ＲはＨＳ一般式（ I ）の場合と同じ意味を
   示す。）で表される５−カルボキシメチル−Ｌ−システ
   イン誘導体の製造方法。