JP3345551B2 - Ｓ−フェニル−ｌ−システインの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はＳ−フェニル−Ｌ−
システインの製造法に関する。詳しくは、チオフェノー
ルとＬ−セリンとをトリプトファンシンターゼの作用に
より反応させ、Ｓ−フェニル−Ｌ−システインを生成さ
せる方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｓ−置換システイン誘導体は、医薬、農
薬の中間体としての用途が期待され、その合成法も検討
されているが、工業化された例はなく、安価な製造法が
望まれている。その中でも、Ｓ−フェニル−Ｌ−システ
インは、アスパラテックプロテアーゼのヒドロキシエチ
ルアミンジペプチドアイソスターの構成要素のアミノ酸
として、最近、抗エイズ薬であるＨＩＶプロテアーゼ・
インヒビターの部分構造としての用途が見い出され、そ
の安価で純度の高い製造法が望まれている。

【０００３】Ｓ−フェニル−Ｌ−システインは、Ｌ−セ
リンとチオフェノールとから、システインデスルフヒド
ラーゼの作用による酵素反応によって合成可能なことが
知られている（特公昭５８−１３１５４）。しかしなが
ら、この場合は反応速度が極めて小さく、実用化は困難
である。

【０００４】また、Ｓ−フェニル−Ｌ−システインは、
Ｌ−セリンとチオフェノールとから、トリプトファンシ
ンターゼの作用による酵素反応によっても合成可能なこ
とが知られている（特公平２−５４０７７）。しかし、
この場合においても反応収率が低く、工業化に充分な収
率は得られていない。

【０００５】上記のようにＬ−セリンとチオフェノール
から、システインデスルフヒドラーゼあるいはトリプト
ファンシンターゼを用いてＳ−フェニル−Ｌ−システイ
ンを製造する方法は、実験室レベルを出ておらず、工業
化に耐えられる収率が得られていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、高収
率でＳ−フェニル−Ｌ−システインの製造が可能な方法
を提供することである。本発明者らは、トリプトファン
シンターゼを用いたＳ−フェニル−Ｌ−システインの製
造法について鋭意検討した結果、チオフェノールとＬ−
セリンとをトリプトファンシンターゼの作用により反応
させる際、酵素反応を特定のｐＨの水溶液中において行
うことによって、驚くべきことに、飛躍的にＳ−フェニ
ル−Ｌ−システインの収率を高められることを見い出
し、本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、チオフェノールとＬ
−セリンとをトリプトファンシンターゼの作用により反
応させ、Ｓ−フェニル−Ｌ−システインを生成させる
際、酵素反応をｐＨ９．０〜１０．５の水溶液中におい
て行うことを特徴とするＳ−フェニル−Ｌ−システイン
の製造法である。トリプトファンシンターゼは、工業的
には一般に、インドールとＬ−セリンからＬ−トリプト
ファンを合成する酵素として知られており、この場合は
反応の至適ｐＨは８．０〜８．５であることが一般に知
られている。

【０００８】ところが、同じトリプトファンシンターゼ
を用いる酵素反応でありながら、チオフェノールとＬ−
セリンからＳ−フェニル−Ｌ−システインを合成する酵
素反応の場合には、上記至適ＰＨとは異なるｐＨ９．０
〜１０．５のアルカリ性下で反応を行うことにより高い
反応速度と収率が得られないことを、本発明者らは見い
出したのである。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明方法に用いられるトリプト
ファンシンターゼの生産菌としては、エシェリヒア・コ
リなど原核細胞の微生物あるいは該酵素の生産性を高め
たＤＮＡ組み替え技術の応用により創成された形質転換
微生物であっても良い。また、トリプトファンシンター
ゼがサッカロミセス・セレヴィシエ、あるいはカビなど
真核細胞の微生物から得られたものであってもよく、そ
れら真核細胞微生物の該酵素の生産性を高めるためＤＮ
Ａ組み替え技術の応用により創成された形質転換微生物
であっても良い。

【００１０】好ましくは、エシェリヒア・コリ ＭＴ−
１０２４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２０）、ノイロスポラ・
クラッサ ＡＴＣＣ １４６９２などが挙げげられる。
より好ましくは微生物乾燥菌体１ｇ当たり１時間に１ｇ
以上のトリプトファンを合成できるトリプトファンシン
ターゼ活性を有する微生物である。

【００１１】トリプトファンシンターゼ生産菌を培養す
るための培地としては、炭素源、窒素源、無機物および
必要に応じて少量の微量栄養素を含むものであれば、合
成培地または天然培地のいずれも使用可能である。しか
し、一般には、微量のトリプトファン、アントラニル酸
またはインドールを培地に添加することが好ましい。培
地に使用する炭素源および窒素源は使用菌の利用可能な
ものならばいずれの種類を用いてもよい。炭素源として
は、グルコ−ス、グリセロール、フラクトス、シュクロ
ース、マルトース、マンノース、澱粉、澱粉加水分解
物、糖蜜など種々の炭水化物が使用できる。窒素源とし
ては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニ
ム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種の
無機および有機アンモニウム塩類、または肉エキス、酵
母エキス、コーン・スティープ・リカー、カゼイン加水
分解物、フィッシュミールあるいはその消化物、脱脂大
豆粕あるいはその消化物などの天然有機窒素源が使用可
能である。天然有機窒素源の多くの場合は窒素源である
とともに炭素源にもなり得る。無機物としては、燐酸一
水素カリウム、燐酸二水素カリウム、塩化カリウム、硫
酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄などが必
要に応じて使用できる。

【００１２】培養は、振とう培養あるいは通気撹拌深部
培養などの好気的条件下で行う。培養温度は好ましくは
２０〜５０℃、特に好ましくは３０〜３７℃の範囲であ
る。培養中の培地のｐＨは中性付近に維持することが望
ましい。培養時間は通常１〜３日間である。

【００１３】エシェリヒア・コリの培養菌体からのトリ
プトファンシンターゼの抽出法は、ザ・ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ）（Ｖ ｏｌ．２５２，Ｎｏ．１９， ｐ．６５９
４〜６５９９（１９７７））、ノイロスポラ・クラッサ
の培養菌体からの抽出法は同誌Ｖｏｌ．２５０， Ｎ
ｏ．８，２９４１〜２９４６（１９７５）に記載されて
いるが、本発明に使用されるトリプトファンシンターゼ
は、必ずしも純粋である必要はない。すなわち、トリプ
トファンシンターゼ生産菌の培養物、培養物から遠心分
離などの方法によって採取した生菌体、その乾燥菌体、
あるいは菌体を破砕、自己消化、超音波処理などによっ
て得られた菌体処理物、さらにはこれらの菌体よりの抽
出物ならびに該抽出物より得られる酵素の粗精製物であ
っても利用可能である。また、これらの固定化酵素また
は固定化菌体でもよい。

【００１４】本発明における、酵素反応によるＳ−フェ
ニル−Ｌ−システインの合成原料はＬ−セリンとチオフ
ェノールであり、いずれも市販されており容易に入手で
きる。反応液中のＬ−セリンの濃度は特に制限ないが、
好ましくは１〜１０重量％である。

【００１５】反応液中のチオフェノールの濃度は、酵素
反応を阻害しない範囲でなければならず好ましくは１０
重量％以下の濃度で使用される。なお、反応中にチオフ
ェノールを逐次添加してもよい。また、反応に際して、
基質の他に補酵素であるピリドキサルリン酸を０．１〜
１００ｐｐｍの範囲で添加することが望ましい。反応液
に添加するトリプトファンシンターゼの量は、基質濃
度、反応時間、その他の条件によって適時変更し得る。

【００１６】本発明のＳ−フェニル−Ｌ−システイン合
成酵素反応はｐＨ９．０〜１０．５のアルカリ性下で行
われる。好ましくはｐＨ９．０〜１０．０の範囲であ
る。用いるアルカリとしては水酸化ナトリウム、水酸化
カリウム、アンモニア水などが使用可能である。

【００１７】ｐＨが９．０より低いと、Ｓ−フェニル−
Ｌ−システインを合成する酵素反応速度が極めて小さい
ため、原料であるＬ−セリンは充分にＳ−フェニル−Ｌ
−システインに転換されない。特にトリプトファンシン
ターゼを純粋でない状態で使用する場合、微生物にはＬ
−セリン分解活性を持つ酵素が存在するので、ｐＨが
９．０より低い場合は Ｓ−フェニル−Ｌ−システイン
の合成速度に比して、Ｌ−セリンの分解速度が大きいた
め、原料であるＬ−セリンの分解が優先的に進行し、Ｓ
−フェニル−Ｌ−システインの収率は低くなる。なお、
アンモニウム塩を添加すると、Ｌ−セリンの分解活性が
抑制されるが、ｐＨが９．０より低ければＳ−フェニル
−Ｌ−システインを合成する酵素反応速度が小さいの
で、効果は少ない。

【００１８】ｐＨ９．０〜１０．５においてはＳ−フェ
ニル−Ｌ−システインを合成する酵素反応速度が飛躍的
に増加し、一方、都合のよいことにＬ−セリンの分解速
度は低下し、Ｓ−フェニル−Ｌ−システインの生成が優
先的となる。したがって、ｐＨ９．０〜１０．５での反
応においてはＳ−フェニル−Ｌ−システインの反応収率
が飛躍的に向上する。ｐＨが１０．５を超えるとＳ−フ
ェニル−Ｌ−システインを合成する酵素反応速度は再び
低下し、収率は減少する。

【００１９】ｐＨ９．０以上で酵素反応を行う場合で
も、Ｌ−セリンの分解酵素活性を抑制する目的でアンモ
ニウム塩を添加することは、反応収率を高める上で好ま
しい。アンモニウム塩としては、塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
などが使用できる。

【００２０】本発明の酵素反応の温度は好ましくは２０
〜６０℃で行われるが、酵素の安定性と反応速度の点
で、特に好ましくは、３０〜４０℃である。なお、反応
はチオフェノールの酸化を防止するため、窒素雰囲気下
で行うことが好ましい。

【００２１】また、反応は、バッチ法もしくは固定化酵
素を用いた連続法により、静置もしくは撹拌下に行われ
る。５％以上のチオフェノール濃度で反応する場合は、
攪拌は、ゆるやかに行う方が反応収率がよい。

【００２２】５重量％〜１０重量％のチオフェノール濃
度で反応する場合は、反応液の攪拌動力を、２０ＫＷ／
ｍ³以下にて行うことが望ましい。反応時間は通常５〜
４０時間である。

【００２３】Ｓ−フェニル−Ｌ−システインは水に対す
る溶解度が低く、通常、酵素反応の進行にともない、Ｓ
−フェニル−Ｌ−システインが反応液中で結晶となって
析出する。酵素反応の終了した反応液からＳ−フェニル
−Ｌ−システインを精製するには、反応液のｐＨを塩酸
または硫酸などの適当な酸によって酸性に調整し、反応
液中に析出した結晶を溶解させた後、活性炭吸着処理な
どにより微生物細胞もしくは酵素と未反応のチオフェノ
ールを除去し、その後、適当なアルカリで中和すれば、
Ｓ−フェニル−Ｌ−システインの結晶が析出するので、
濾過等の手段で容易に単離できる。逆に、反応終了液を
強アルカリ性に調整してＳ−フェニル−Ｌ−システイン
の結晶を溶解させ、微生物細胞もしくは酵素を除去した
後に、適当な酸で中和して結晶を得ることも可能である
が、微生物細胞の破壊によって細胞成分が不純物となる
可能性がある。

【００２４】反応終了液を酸性にしてＳ−フェニル−Ｌ
−システイン結晶を溶解させる場合、ｐＨは１．５以下
に調整することが好ましい。Ｓ−フェニル−Ｌ−システ
インは、水溶液のｐＨが１．５以下でないと１重量％以
上の濃度で溶解させることができず、容積効率が悪くな
るためである。

【００２５】反応液中に析出したＳ−フェニル−Ｌ−シ
ステイン結晶を強酸性で溶解した後、酵素または微生物
細胞あるいは微生物細胞由来成分と未反応チオフェノー
ルを除去するためには、活性炭吸着処理を行うが、この
場合は、Ｓ−フェニル−Ｌ−システインを強酸性で溶解
させた溶液に活性炭を添加して好ましくは４０〜９０
℃、特に好ましくは４０〜６０℃に加熱し、酵素または
微生物細胞あるいは微生物細胞由来成分と未反応チオフ
ェノールを活性炭に吸着させて濾過を行えば、Ｓ−フェ
ニル−Ｌ−システイン溶液から、酵素または微生物細胞
あるいは微生物細胞由来成分および未反応のチオフェノ
ールを除去できる。活性炭としては、ＰＭ−ＳＸ、ＰＭ
−ＰＡ、ＰＭ−ＫＩ、ＰＭ−ＫＳ、ＰＭ−ＡＡ（以上、
三井製薬）、ＷＰＨ、ＰＣＢ−Ｇ、ＡＤＰ（以上、東洋
カルゴン）、白鷺Ａ、白鷺Ｍ、白鷺Ｃ、カルボラフィン
（以上、武田薬品工業）、太閤Ｓタイプ、太閤Ｋタイプ
（以上、二村化学）などを用いることができる。活性炭
の添加量は、通常、溶液の質量に対して０．５〜６％の
量を添加するが、酵素反応のトリプトファンシンターゼ
源として用いた酵素または微生物細胞の量および未反応
チオフェノールの量によって、活性炭の添加量は変更し
得る。

【００２６】酵素反応液中に析出したＳ−フェニル−Ｌ
−システイン結晶を強酸性で溶解した溶液中には、未反
応のチオフェノールが残存するが、未反応チオフェノー
ルの一部は活性炭処理の際、活性炭に吸着されるが、充
分には吸着除去されない。しかしながら、活性炭処理を
行う際、同時に、溶液に空気あるいは酸素を通気する
と、残存する未反応チオフェノールを除去することが可
能である。活性炭未吸着のチオフェノールが酸化され、
不溶性の固体となって濾過除去されるためである。４０
℃以上の温度での通気処理は、チオフェノールを酸化す
る効果が特に高い。通気量は、好ましくは０．０１〜
６．０倍容積比／Ｈｒである。

【００２７】また活性炭処理を行う際の温度は、Ｓ−フ
ェニル−Ｌ−システインのラセミ化防止の観点から６０
℃以下が好ましい。活性炭処理は４０〜６０℃で行うこ
とが特に好ましい。特に、活性炭存在下での加熱によっ
てラセミ化が促進されるので、加熱下での活性炭との接
触時間は不必要に長くしないことが必要である。以上の
理由から活性炭との接触時間は１２時間以内が好まし
い。

【００２８】酵素または微生物細胞あるいは微生物細胞
由来成分と、未反応チオフェノールが除去されたＳ−フ
ェニル−Ｌ−システインの酸性溶液から、Ｓ−フェニル
−Ｌ−システインを結晶として得るためには、適当なア
ルカリを加えて中和晶析を行えばよい。中和晶析を行う
際、ｐＨは２．５〜５に調整すると、純白の結晶が得ら
れる。ｐＨ６〜７で晶析を行うと結晶は得られるが結晶
の色が灰色から黄色みがかったものとなる場合がある。
中和に用いるアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水
酸化カリウム、アンモニア水などが使用可能である。

【００２９】

【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明す
る。なお、Ｓ−フェニル−Ｌ−システインおよびＬ−セ
リンの定量はＨＰＬＣによって行った。

【００３０】Ｓ−フェニル−Ｌ−システインのＨＰＬＣ
分析条件 カラム；Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２（ＧＬサイエン
ス製） 移動相；８．６ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ４リン酸で調
整）：ＭｅＯＨ＝７：３ 温 度；４０℃ 流 速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ 検 出；ＵＶ ２５４ｎｍ Ｌ−セリンのＨＰＬＣ分析条件 カラム；Ｓｈｏｄｅｘ ＲＳｐａｋ ＮＮ−８１４（昭
和電工製） 移動相；１０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄ ＋ １．２ｍＭ リ
ン酸 温 度；４０℃ 流 速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ 検 出；ＯＰＡ試薬 Ｅｘ＝３６５ｎｍ Ｅｍ＝４５５
ｎｍ

【００３１】実験例１ トリプトファンシンターゼ生産菌であるエシェリヒア・
コリ ＭＴ−１０２４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２０）を、
第１表に示す組成の培地１５０ｍｌ が入った５００ｍ
ｌ容の坂口フラスコに接種し、３０℃で２４時間振とう
培養した。この培養液６００ｍｌ（フラスコ４本分）を
第２表に示す組成の培地１０ｌを仕込んだ２０ｌのジャ
ーファーメンターに接種し、３０℃、ｐＨ６．８（濃ア
ンモニア水でコントロール）で、グルコースを逐時添加
しながら４０時間通気培養した。培養終了後、遠心分離
により菌体を集菌し、得られた湿菌体をトリプトファン
シンターゼ源とした。菌体のＬ−トリプトファン合成活
性、Ｓ−フェニル−Ｌ−システイン合成活性、Ｌ−セリ
ン分解活性について、それぞれ反応液のｐＨを変化させ
て測定した。各ｐＨにおけるそれぞれの活性を第１図に
示す。

【００３２】Ｌ−トリプトファン合成活性測定方法 調製試薬１；Ｌ−セリン溶液 Ｌ−セリン１０．６ｇを約４５０ｍｌの純水に溶解し、
水酸化カリウム水溶液でｐＨを７〜１１の各ｐＨに調整
した後、純水で５００ｍｌにしたもの。 調製試薬２；ＰＬＰ溶液 ピリドキサルリン酸５０ｍｇを約９５０ｍｌの純水に溶
解し、水酸化カリウム水溶液でｐＨを７〜１１の各ｐＨ
に調整した後、純水で１０００ｍｌにしたもの。 菌体懸濁液 湿菌体１ｇを１０ｍｌのＰＬＰ溶液（ｐＨ８．５に調整
したもの）に懸濁したもの。

【００３３】インドール０．４ｇを１００ｍｌ容の三角
フラスコに秤量し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ １ｍｌを
加え、加温してインドールを溶解する。これに、Ｌ−セ
リン溶液１８ｍｌとＰＬＰ溶液０．５ｍｌを加えて３５
℃で５分間インキュベートした後、菌体懸濁液０．５ｍ
ｌを加えて６０分間振とうしながらインキュベートす
る。６０分後、５Ｎ−ＮａＯＨ １０ｍｌを加えて反応
を停止した後、リン酸０．５ｍｌを加えて中和する。こ
の溶液の１ｍｌをマイクロチューブに分取し、ジクロロ
メタン１ｍｌを加えてよく混和させる。その後、遠心分
離を行って水相と有機相に分液し、水相中のＬ−トリプ
トファン濃度をＨＰＬＣで定量する。Ｌ−トリプトファ
ンのＨＰＬＣ分析条件はＳ−フェニル−Ｌ−システイン
のＨＰＬＣ分析条件と同様である。乾燥菌体１ｇ当たり
１時間に生成するＬ−トリプトファンの量（ｇ）をＬ−
トリプトファン合成活性と定義した。

【００３４】Ｓ−フェニル−Ｌ−システイン合成活性測
定方法 調製試薬１；Ｌ−セリン溶液 Ｌ−セリン１５．５ｇ、塩化アンモニウム５．６ｇを約
４５０ｍｌの純水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液で
ｐＨを７〜１１の各ｐＨに調整した後、純水で５００ｍ
ｌにしたもの。 調製試薬２；ＰＬＰ溶液 ピリドキサルリン酸５０ｍｇを約１５ｍｌの純水に溶解
し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを７〜１１の各ｐＨ
に調整した後、純水で２０ｍｌにしたもの。 菌体懸濁液 湿菌体１ｇを１０ｍｌのＰＬＰ溶液（ｐＨ８．５に調整
したもの）に懸濁したもの。

【００３５】１００ｍｌ容の三角フラスコにＬ−セリン
容液１９ｍｌとＰＬＰ溶液０．２ｍｌを取り、チオフェ
ノール０．５ｍｌを加えて３５℃で５分間インキュベ−
トした後、菌体懸濁液０．５ｍｌを加えて６０分間振と
うしながらインキュベ−トする。６０分後、３５％塩酸
１ｍｌを加えて反応を停止し、溶液中のＳ−フェニル−
Ｌ−システイン濃度をＨＰＬＣで定量する。乾燥菌体１
ｇ当たり１時間に生成する Ｓ−フェニル−Ｌ−システ
インの量（ｇ）をＳ−フェニル−Ｌ−システイン合成活
性と定義した。

【００３６】Ｌ−セリン分解活性測定方法 調製試薬１；Ｌ−セリン溶液 Ｌ−セリン１５．５ｇを約４５０ｍｌの純水に溶解し、
水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを７〜１１の各ｐＨに調
整した後、純水で５００ｍｌにしたもの。 調製試薬２；ＰＬＰ溶液 ピリドキサルリン酸５０ｍｇを約１５ｍｌの純水に溶解
し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを７〜１１の各ｐＨ
に調整した後、純水で２０ｍｌにしたもの。 菌体濁液 湿菌体１ｇを１０ｍｌのＰＬＰ溶液（ｐＨ８．５に調整
したもの）に懸濁したもの。

【００３７】１００ｍｌ容の三角フラスコにＬ−セリン
容液１９ｍｌとＰＬＰ溶液０．２ｍｌを取り、３５℃で
５分間インキュベートした後、菌体懸濁液０．５ｍｌを
加えて６０分間振とうしながらインキュベートする。６
０分後、３５％塩酸１ｍを加えて反応を停止し、溶液中
のＬ−セリン濃度をＨＰＬＣで定量する。乾燥菌体１ｇ
当たり１時間に分解するＬ−セリンの量（ｇ）をＬ−セ
リン分解活性と定義した。

【００３８】

【表１】

【００３９】

【表２】

【００４０】実施例１ 実験例１と同様の方法でエシェリヒア・コリＭＴ−１０
２４２の集菌体を得た。得られた菌体は、乾燥菌体１ｇ
当たり１時間に５ｇのトリプトファンを合成できるトリ
プトファンシンターゼ活性を有していた。Ｌ−セリン３
％、チオフェノール３．１％、塩化アンモニウム１％、
ピリドキサルリン酸２５ｐｐｍを含むｐＨ９．０（ Ｎ
ａＯＨで調整）の水溶液５００ｇに上記遠心菌体を乾燥
菌体換算で０．７％濃度となるように加えた。３５℃で
１５時間、窒素雰囲気下で撹拌した。生成したＳ−フェ
ニル−Ｌ−システインのＬ−セリンに対するモル収率は
８５％であった。

【００４１】反応終了後、反応液に濃塩酸を加えてｐＨ
０．５とし、活性炭（ＰＭ−ＳＸ三井製薬製）を１０ｇ
加えて５０℃にて３時間加熱した。この際、液中に空気
を通気しながら攪拌した。その後、濾過を行い、濾液を
ＮａＯＨでｐＨ３に調整し、１０℃に冷却後、濾過を行
ってＳ−フェニル−Ｌ−システインの結晶を分離した。
結晶を乾燥後、２０ｇのＳ−フェニル−Ｌ−システイン
を得た。得られた結晶の元素分析を行ったところ、Ｃ；
５４．４８％、Ｈ；５．６９％、Ｎ；７．６４％、Ｓ；
１５．５７％であった（理論値 Ｃ；５４．８２％、
Ｈ；５．５８％、Ｎ；７．１１％、Ｓ；１６．２４
％）。ＭＳスペクトル分析の結果、親イオンピークとし
てｍ／ｚ＝１９７が検出された。ＩＲスペクトル分析で
は、２９００ｃｍ^-1以上にＮＨ ⁺ ₃、ＣＯＯＨの伸縮振
動が見られた。１６２０〜１２００ｃｍ^-1付近にアミノ
酸特有の ＮＨ ⁺ ₃、ＣＯＯ^~、アルキルの伸縮および変
角振動が見られた。７３５、６８９ｃｍ^-1にモノ置換ベ
ンゼンの面外変角振動が見られた。ＮＭＲスペクトルの
シグナル帰属結果は、Ｓ−フェニル−Ｌ−システインの
構造を満足した。また、Ｒａｍａｎスペクトル分析によ
り、Ｃ−Ｓ結合の存在を確認した。

【００４２】さらに、光学分割クロマトグラフィー用カ
ラム ＴＳＫｇｅｌ Ｅｎａｎｔｉｏ Ｌ１（東ソー
製）を用いたＨＰＬＣ分析により、結晶の光学活性はＬ
−体であり、光学純度は１００％であることを確認し
た。以上の機器分析結果から、得られた結晶はＳ−フェ
ニル−Ｌ−システインであることを確認した。

【００４３】実施例２ 実験例１と同様の方法でエシェリヒア・コリ ＭＴ−１
０２４２の集菌体を得た。Ｌ−セリン６％、チオフェノ
ール６．２％、ピリドキサルリン酸２５ｐｐｍを含むｐ
Ｈ９．５（ＮａＯＨで調整）の水溶液５００ｇに菌体を
乾燥菌体換算で０．８％濃度となるように加え、３５℃
で２０時間、窒素雰囲気下で撹拌した。この際、反応液
１ｌ当たりの攪拌動力を１６Ｗに制御した。生成したＳ
−フェニル−Ｌ−システインの仕込みＬ−セリンに対す
るモル収率は８７％であった。

【００４４】反応終了後、反応液に濃塩酸を加えてｐＨ
０．５とした後、純水５００ｇを加えてＳ−フェニル−
Ｌ−システインの析出結晶を完全に溶解させた。活性炭
（ＰＭ−ＳＸ 三井製薬製）を１０ｇ加えて５０℃にて
３時間加熱した。この際、液中に空気を通気しながら攪
拌した。その後、濾過を行い、濾液を ＮａＯＨでｐＨ
３に調整し、１０℃に冷却後、濾過を行ってＳ−フェニ
ル−Ｌ−システインの結晶を分離した。結晶を乾燥後、
４０ｇのＳ−フェニル−Ｌ−システインを得た。光学純
度は１００％であった。

【００４５】実施例３ 実験例１と同様の方法でエシェリヒア・コリ ＭＴ−１
０２４２の集菌体を得た。Ｌ−セリン１０％、チオフェ
ノール１０％、ピリドキサルリン酸２５ｐｐｍを含むｐ
Ｈ１０．０（ＮａＯＨで調整）の水溶液５００ｇに菌体
を乾燥菌体換算で０．９％濃度となるように加え、３５
℃で２０時間、窒素雰囲気下で撹拌した。この際、反応
液１ｌ当たりの攪拌動力を１０Ｗに制御した。生成した
Ｓ−フェニル−Ｌ−システインの仕込みＬ−セリンに対
するモル収率は８５％であった。

【００４６】実施例４ 実験例１と同様の方法でエシェリヒア・コリ ＭＴ−１
０２４２の集菌体を得た。Ｌ−セリン３％、チオフェノ
ール３．１％、ピリドキサルリン酸２５ｐｐｍを含むｐ
Ｈ１０．５（ＮａＯＨで調整）の水溶液５００ｇに菌体
を乾燥菌体換算で０．７％濃度となるように加え、３５
℃で１５時間、窒素雰囲気下で撹拌した。生成したＳ−
フェニル−Ｌ−システインの仕込みＬ−セリンに対する
モル収率は７０％であった。

【００４７】

【発明の効果】本発明によればＳ−フェニル−Ｌ−シス
テインを高収率で得ることができ、工業的規模での製造
が可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】反応液のｐＨを変化させて測定した、菌体のＬ
−トリプトファン合成活性、Ｓ−フェニル−Ｌ−システ
イン合成活性、Ｌ−セリン分解活性である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭58−146287（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−111694（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−100691（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−134992（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 13/00 - 13/24 C12N 9/00 - 9/99 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 チオフェノールとＬ−セリンとをトリプ
   トファンシンターゼの作用により反応させ、Ｓ−フェニ
   ル−Ｌ−システインを生成させる際、酵素反応をｐＨ
   ９．０〜１０．５の水溶液中において行うことを特徴と
   するＳ−フェニル−Ｌ−システインの製造法。
2. 【請求項２】 ｐＨ９．０〜１０．０の水溶液中におい
   て反応させる請求項１の方法。
3. 【請求項３】 ２０〜６０℃で反応させる請求項１〜２
   の方法。
4. 【請求項４】 トリプトファンシンターゼがエシェリヒ
   ア・コリから得られたものである請求項１〜３の方法。
5. 【請求項５】 エシェリヒア・コリがＭＴ−１０２４２
   （ＦＥＲＭ ＢＰ−２０）である請求項４の方法。
6. 【請求項６】 トリプトファンシンターゼがノイロスポ
   ラ・クラッサから得られたものである請求項１〜３の方
   法。
7. 【請求項７】 ノイロスポラ・クラッサがＡＴＣＣ１４
   ６９２である請求項６の方法。
8. 【請求項８】 Ｌ−セリン濃度を１〜１０重量％として
   反応させる請求項１の方法。
9. 【請求項９】 チオフェノールの濃度を１０重量％以下
   で反応させる請求項１の方法。
10. 【請求項１０】 ピリドキサルリン酸を０．１〜１００
    ｐｐｍ存在させて反応させる請求項１の方法。