KR970010133B1 - D-α-아미노산의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용없음.

Description

D-α-아미노산의 제조방법

본 발명은 D-α-아미노산의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 5-치환 히단토인을 가수분해하여 D-N-카르바모일-α-아미노산으로 전환시킬 수 있는 효소(이하 D-히단토이나제라 합니다)와 D-N-카르바모일-α-아미노산으로부터 카르바모일기를 제거하여 D-α-아미노산으로 전환시킬 수 있는 효소(이하 D-카르바모일라제라 합니다)를 고정화한 다음 이들 고정화효소를 사용하여 D-α-아미노산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

D-α-아미노산은 약제의 중간물질로서 중요한 화합물인데, 특히 D-페닐글리신이나 D-파라히드록시페닐글리신은 산업적으로 유용한 화합물이다. 따라서 이러한 D-α-아미노산을 제조하기 위한 방법으로서 미생물 균체 또는 수용성 효소를 사용하여 상응하는 5-치환 히단토인을 부제적으로 가수분해시켜서 직접 D-α-아미노산을 제조하는 방법(영국 특허 2022581호)과 미생물 균체 또는 수용성 효소를 사용하여 5-치환 히단토인으로부터 D-N-카르바모일-α-아미노산을 얻을 후, 화학적 방법이나 미생물 균체 또는 수용성 효소를 카르바오일기를 제거하므로써 목적하는 D-α-아미노산을 수득하는 방법(일본국 특허 공개 공보 소 55-104890호)이 공지되어 있다.

상술한 바와 같이 5-치환 히딘토인으로부터 D-α-아미노산을 직접 얻는 방법에서는, 미생물 균체를 직접 사용하는 경우 사용하는 기질의 세포막에 대한 투과성이 낮아서 반응 시간이 길며, 또한 미생물 균체의 온도 및 pH에 대한 안정성이 매우 낮아서 장시간 운전하는데 어려움이 있게 되는 문제점이 있으며, 수용성 효소를 사용하는 경우에도 마찬가지로 온도 및 pH에 대한 안정성이 낮고, 반응물이나 생성물과의 분리가 어려워 반복사용에 문제점이 있게 된다. 한편, 5-치환 히단토인으로부터 D-N-카르바모일-α-아미노산을 경유하여 D-α-아미노산을 얻는 방법에 있어서는 상술한 바와같이 미생물 균체 및 수용성 효소를 직접 사용하는데서 야기되는 문제점이 있을 뿐만 아니라, 카르바모일기를 제거하기 위해 사용되는 화학적 방법의 경우에는 염산과 같은 무기산이 다량 사용되므로 그의 폐기 처분 등과 관련된 심각한 환경문제가 야기될 수도 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위한 수단으로 D-히단토이나제를 고정화하여 5-치환 히단토인으로부터 D-N-카르바모일-α-아미노산을 제조하는 방법(영국 특허 제0261836호)과 D-N-카르바모일라제를 고정화하여 D-N-카르바모일-α-아미노산으로부터 D-α-아미노산을 얻는 방법(국제 공개 특허 WO92/22643호)이 각각 공지되어 있으나 이와 같은 2단게 효소공정으로 제조하는 경우에는 첫번째 단계가 가역반응이므로 D-N-카르바모일-α-아미노산으로의 전환이 완전하게 이루어지지 못하여 5-치환 히단토인이 잔존하게 되며, 비전환 5-치환 히단토인의 산화로 인한 생성물이 고정화효소의 안정성에 영향을 미치게 되어 목적하는 D-α-아미노산을 분리, 정제하는데 어려움이 있게 된다. 또한 5-치환 히단토인으로부터 D-N-카르바모일-α-아미노산이 생성됨에 따라 pH가 감소되므로 이를 조절하기 위해서는 염기가 필요하고, D-N-카르바모일-α-아미노산으로부터 D-α-아미노산의 생성시에는 암모니아가 생성되게 되어 pH가 상승하므로 이를 조절하기 위해서는 산이 필요하게 되므로, 다량의 산과 염기를 첨가시켜야 하므로 경제적으로도 유효하지 못하며 생성되는 염에 의해 D-α-아미노산의 결정화가 곤란하게 된다.

따라서, 본 발명에서는 이러한 문제점을 해결하기 위하여 5-치환 히단토인 용액 혹은 슬러리에 고정화한 D-히단토이나제 및 고정화한 D-카르바모일라제를 동시에 넣고 반응시켜서 고순도의 D-α-아미노산을 고수율로 제조하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

이하 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서는 5-치환 히단토인 용액 혹은 슬러리에 고정화한 D-히단토이나제 및 고정화한 D-카르바모일라제를 동시에 넣고 반응시켜서 상응하는 D-α-아미노산을 제조한 다음, 이때 생성된 D-α-아미노산을 수집하는데, 상기 반응은 컬럼법 또는 반응기중에서 현탁시켜서 수행하며, 컬럼법의 경우에는 고정화한 D-히단토이나제 및 고정화한 D-카르바모일라제를 혼합한 후 컬럼에 채운다음 5-치환 히단토인 용액을 분당 1-5ml의 유속으로 통과시키고 반응유출액을 재순환시키는 방법으로 수행하며, 반응기중에서 현탁시키는 방법의 경우에는 배취반응이 일반적으로 이용되며 통상 1배취당 6~72시간 정도 반응시킨다. 이때 반응은 질소가스를 연속적으로 투입하면서 20-60℃에서 수행하고 1N 가성소다 또는 1N 염산 용액을 사용하여 pH를 6.0-10.0으로 조절한다. 또한 5-치환 히단토인을 반응이 진행됨에 따라 소량씩 나누어 첨가할 수도 있으며 생성된 D-α-아미노산은 통상의 방법으로 분리 및 정제할 수 있다.

본 발명의 효소반응기질로 사용되는 5-치환 히단토인은 다음의 식으로 표시될 수 있으며, 특히 약제의 중간물질과 같이 산업적으로 유용한 화합물을 제공하기 위해서는 R이 페닐, 히드록시로 치환된 페닐, 알킬, 치환된 알킬, 아랄킬 또는 티에닐인 것이 바람직하다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 좀더 상세하게 설명하겠는데, 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

(D-히단토이나제의 제조)

박토트립톤 20g, 효모추출물 10g, 염화나트륨 20g이 함유된 발효배지 2L를 pH 7.0으로 조절한 다음 2.5L 발효조에 넣고 121℃에서 30분간 고압 멸균시켰다. D-히단토이나제 생산능력을 가진 형질전환균주(에스케리키아 콜리 KCTC 8554P)를 접종한 후 30℃, 500rpm, 0.5VVM의 조건에서 20시간 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 균체를 수확하고 세척한 다음 0.1M 봉산 완충용액(pH 8.5)에 40W/V%가 되도록 현타시킨후 초음파 처리하여 파쇄하였다. 파쇄액에 20mM의 농도가 되도록 MnSO₄를 첨가하고 60℃에서 30분간 열처리한 다음 밤새동안 4℃에서 정치시켜 불순물을 침전시켰다. 원심분리로 침전물을 제거하여 효소용액 200ml을 얻었으며 효소용액의 활성도는 93.25단위/ml이었다. D-히단토이나제 활성도 1단위는 40℃, pH 8.5에서 1분간에 D,L-파라히드록시페닐히단토인으로부터 1μmol의 D-N-카르바모일-파라히드록시페닐글리신을 생성하는 효소의 양으로 정하였다.

[실시예 2]

(고정화 담체의 제조)

다이아이온 CR-20(상품명, 미쓰비시(주)) 50g을 300ml의 증류수로 2회 세척한 후 500ml 삼각플라스크에 넣은 다음 증류수 60ml, 6N NaOH 32.5ml, 에피클로로히드린 22.5ml를 넣고 40℃ 항온조에서 2시간동안 천천히 교반하면서 활성화시켰다. 담체를 요과한 후 300ml의 증류수를 사용하여 2회 세척한 다음 밀폐된 용기에 넣어 4℃에서 보관하였다.

[실시예 3]

(D-히단토이나제의 고정화)

실시예 1에서 얻은 D-히단토이나제 효소용액 60ml에 실시예 2에서 얻은 활성화된 담체 30g을 넣고 실온에서 천천히 저어주면서 24시간 동안 고정화를 수행하였다. 용액을 여과한 후 1M 염화나트륨이 포함된 0.1M 붕산완충용액(pH 8.5) 100ml와 0.1M 붕산완충용액(pH 8.5) 100ml로 각각 2회 세척한 후 밀폐된 용기에 넣어 4℃에서 보관하였다. 고정화된 D-히단토이나제의 활성도는 45단위/g이었다.

[실시예 4]

(D-카르바모일라제의 제조)

KH₂PO₄225g, MgSO₄·5H₂O 6g, FeSO₄·7H₂O 0.15g, (NH₄)₂SO₄20g 이 함유된 발효배지 14L를 pH 7.3으로 조절한 다음 20L 발효조에 넣고 121℃에서 30분간 고압멸균하였다. 15W/V% 포도당용액 1L는 따로 고압멸균하여 발효조에 첨가하였다. D-카르바모일라제 생성균주인 아그로박테리움 라디오박터 NRRLB11291을 접종한 후 30℃, 700rpm, 0.5VVM의 조건에서 pH를 7.3으로 조절하면서 24시간 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 균체를 수확하고 세척한 다음 0.1M 붕산완충용액(pH 7.0)에 30W/V%가 되도록 현탁시킨 후 초음파처리하여 파쇄하였다. 파쇄액에 1mM의 농도가 되도록 2-메르캅토에탄올을 첨가하고 50℃에서 30분간 열처리한 다음 밤새동안 4℃에서 정치시켜 불순물을 침전시켰다. 원심분리로 침전물을 제거하여 효소용액 450ml를 얻었으며, 효소용액의 활성도는 0.83단위/ml이었다. D-카르바모일라제 활성도 1단위는 40℃, pH 7.0에서 1분간에 D-N-카르바모일-파라히드록시페닐글리신으로부터 1μmol의 D-파라히드록시페닐글리신을 생성하는 효소의 양으로 정하였다.

[실시예 5]

(D-카르바모일라제의 고정화)

실시예 4에서 얻은 D-카르바모일라제 효소용액 400ml에 실시예 2에서와 동일한 방법으로 활성화한 다이아이온 CR-20 180g을 넣고 실온에서 천천히 저어주면서 24시간동안 고정화를 수행하였다. 용액을 여과한후 1M 염화나트륨이 포함된 0.1M 붕산완충용액(pH 7.0) 500ml와 0.1M 붕산완충용액(pH 7.0) 500ml로 각각 2회 세척한 후 밀페된 용기에 넣어 4℃에서 보관하였다. 고정화된 D-카르바모일라제의 활성도는 1.17단위/g이었다.

[실시예 6]

(D-파라히드록시페닐글리신의 제조)

1L 반응조에 실시예 3에서 얻은 고정화 D-히단토이나제 5g과 실시예 5에서 얻은 고정화 D-카르바모일라제 90g, 증류수 400ml 밍 D,L-파라히드록시페닐히단토인 2g을 넣은 다음, MnSO₄의 농도가 0.5mM 2-메르캅토에탄올의 농도가 1mM이 되도록 첨가하였다. 반응은 질소가스를 연속적으로 투입하면서 40℃에서 수행하고 1N 가성소다 또는 1% 염산용액을 사용하여 pH를 7.0으로 조절하였다. 48시간 반응을 수행한 후 생성되는 D-파라히드록시페닐글리신의 양을 HPLC로 분석한 결과 전환율은 95.17%이었다. 반응액을 농축한 후 진한 염산을 사용하여 pH를 5.2로 맞추어 결정화하였다. 결정을 여과한 후 물로 세척한 다음 백색분말 1.57g(수율 : 90.25%)을 얻었다. 결정을 키랄 HPLC 컬럼(Crownpak Cr, 다이셀화학(주))으로 분석한 결과 순도는 100%이었다.

[실시예 7]

(D-페닐글리신의 제조)

D,L-파라히드록시페닐히단토인 대신 D,L-페닐히단토인 2.0g을 첨가하는 것을 제외하고는 상기 실시예 6과 동일하게 실시하여 D-페닐글리신분말 1.54g(수율 : 89.30%)을 얻었고, 이때 결정의 순도는 99.5%이었다.

[실시예 8]

(D-발린의 제조)

D,L-파라히드록시페닐히단토인 대신 D,L-이소프로필히단토인 1.5g을 첨가하는 것을 제외하고는 상기 실시예 6과 동일하게 실시하여 D-발린분말 1.06g(수율 : 85.4%)을 얻었고, 이때 결정의 순도는 99.6%이었다.

[실시예 9]

D,L-파라히드록시페닐히단토인 대신 D,L-메틸티오에틸히단토인 2.0g을 첨가하는 것을 제외하고는 상기 실시예 6과 동일하게 실시하여 D-메티오닌분말 1.47g(수율 : 85.49%)을 얻었고, 이때 결정의 순도는 99.6%이었다.

[실시예 10]

(D-페닐알라닌의 제조)

D,L-파라히드록시페닐히단토인 대신 D,L-벤질히단토인 2.0g을 첨가하는 것을 제외하고는 상기 실시예 6과 동일하게 실시하여 D-페닐알라닌 분말 1.45g(수율 : 82.65%)을 얻었고, 이때 결정의 순도는 99.0%이었다.

[실시예 11]

(D-티에닐글리신의 제조)

D,L-파라히드록시페닐히단토인 대신 D,L-2-티에닐히단토인 2.0g을 첨가하는 것을 제외하고는 상기 실시예 6과 동일하게 실시하여 D-2-티에닐글리신 1.50g(수율 : 86.42%)을 얻었고, 이때 결정의 순도는 99.4%이었다.

[비교예 1]

1L 반응조에 실시예 3에서 얻은 고정화 D-히단토이나제 5g과 증류수 400ml 및 D,L-파라히드록시페닐히단토인 2g을 넣고 MnSO₄의 농도가 0.5mM이 되도록 첨가하였다. 반응은 질소가스를 연속적으로 투입하면서 40℃에서 수행하고 1N 가성소다를 사용하여 pH를 8.5로 조절하였다. 24시간 반응을 수행한 후 생성되는 D-N-카르바모일-파라히드록시페닐글리신의 양을 HPLC로 측정한 결과 전환율은 96.12%이었다.

[비교예 2]

1L 반응조에 비교예 1에서 얻은 반응액 400ml를 넣고 염산용액을 사용하여 pH를 7.0으로 맞춘 다음 실시예 5에서 얻은 고정화 D-카르바모일라제 90g을 넣은 후 2-메르캅토에탄올의 농도가 1mM이 되게 첨가하였다. 반응은 질소가스를 연속적으로 투입하면서 40℃에서 수행하고 1N 염산용액을 사용하여 pH를 7.0으로 조절하였다. 48시간 반응을 수행한 후 생성되는 D-파라히드록시페닐글리신의 양을 HPLC로 측정한 결과 전환율은 90.61%이었다. 실시예 6과 동일한 방법으로 결정화를 수행하여 백색분말 1.49g(수율 : 85.46%)을 얻었으며, 그것의 순도는 99.77%이었다.

상기 실시예에서 HPLC 분석은 0.1% 초산(w/v)과 메탄올을 이동상으로 하고, 미국 Waters사의 μBondapakC₁₈(300×3.9mm)칼럼을 사용하여 225nm 또는 274nm에서 이동상의 농도 및 유속을 하기 표 1과 같이 변화시켜가며 수행하였다.

상기 실시예 및 비교예로부터 알 수 있듯이, 본 발명의 제조방법에 따르면 pH 조절에 필요한 산, 염기의 사용량을 줄일 수 있어 경제적으로도 유효할 뿐만 아니라 결정화 공정에도 문제점이 없게 되며, 반응 평형을 최종산물인 D-α-아미노산으로 이동시킴으로써 잔존하는 5-치환 히단토인 없이 D-α-아미노산으로의 전환이 가능하도록 하므로써 통상의 방법으로 결정화하여 고순도 및 고수율의 D-α-아미노산을 성공적으로 제조할 수 있게 된다.

Claims (4)

1. 5-치환 히단토인을 D-히단토이나제와 반응시켜 D-N-카르바모일-α-아미노산을 얻은 다음, D-카바모일라제를 이용하여 D-아미노산을 제조하는 방법에 있어서, 5-치환 히단토인 용액 또는 슬러리에 고정화 D-히단토이나제와 고정화 D-카바모일라제를 동시에 첨가하여 20~60℃에서 1N 가성소다 또는 1N 염산용액으로 pH를 6.0~10.0으로 조절하면서 반응시켜 상응하는 D-α-아미노산으로 전환시킨 다음, 생성된 D-α-아미노산을 분리하는 것을 특징으로 하는 D-α-아미노산을 분리하는 것을 특징으로 하는 D-α-아미노산의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 5-치환 히단토인이 하기 일반식의 화합물인 것을 특징으로 하는 D-α-아미노산의 제조방법.

   상기 일반식에서 R은 페닐, 히드록시로 치환된 페닐, 알킬, 치환된 알킬, 아랄킬, 도는 티에닐이다.
3. 제1항에 있어서, 상기 고정화효소의 반응은 컬럼법 또는 반응기중에서 현탁하여서 이루어지는 것을 특징으로 하는 D-α-아미노산의 제조방법
4. 제3항에 있어서, 컬럼범은 고정화한 D-히단토이나제 및 고정화 D-카르바모일라제를 혼합후 컬럼에 채운 다음 5-치환 히단토인 용액을 분당 1~5ml의 유속으로 통과시키고 반응유출액을 재순화시키는 것을 특징으로 하는 D-α-아미노산의 제조방법.