KR100345847B1 - 고정화효소에의한세파졸린의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물 유래의 부분정제된 페니실린 지 아미다제를 고정화시킨 고정화 효소를 이용하여 3-[5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일]-7-아미노세팔로스포란산(이하 MMTD-7-ACA)과 테트라졸-1-아세트산(이하 TzAA)의 에스테르 화합물을 원료로 사용하는 유가식 반응법에 의하여 세파로스포린계 화합물의 일종인 세파졸린을 고농도 및 고생산성으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

고정화효소에 의한 세파졸린의 제조방법

본 발명은 미생물 유래의 부분정제된 페니실린 지 아미다제를 고정화시킨 고정화 효소를 이용하는 효소적 합성법에 의해 3-[5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일]-7-아미노세팔로스포란산(이하 MMTD-7-ACA)과 테트라졸-1-아세트산(이하 TzAA)의 에스테르 화합물을 원료로 사용하는 유가식 반응법에 의하여 세파로스포린계 화합물의 일종인 세파졸린을 고농도 및 고생산성으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

현재까지 세파졸린을 제조하기 위하여 산업적으로 채택하고 있는 방법은 화학적 합성법 뿐이다. 반면에 아직까지 산업적으로 채택되고 있지는 못하지만 미생물 유래의 효소를 이용하여 세파졸린을 제조하는 방법이 1970 년대 초 일본의 협화발효(協和醱酵)에서 최초로 보고되었는데, 이 보고에 따르면 클루이베라 논시트로필라 ATCC 14239 를 배양하여 수득한 균체를 촉매로 사용하고, MMTD-7-ACA 및 METzAA(테트라졸-1-아세트산의 메틸에스테르)를 원료로 사용하여 37℃ 에서 5 시간 반응시킴으로써 세파졸린 4.0 g/ℓ를 수득하였다고 기술하고 있다(참조문헌: 일본특허 공개 제 74-134893 호). 이 기술은 비록 경제성면에서는 화학적 합성법과 비견될 수 없으나 생물전환 기술에 의한 고부가가치 의약품의 새로운 제조방법의 발견이라는 측면에서는 의의가 크다고 할 수 있다.

한편, 1992 년 불가리아의 M. kostadinor 등도 생물전환 기술에 의한 세파졸린의 합성법을 개발하고 이를 발표하였는데, 이들은 촉매로서 페니실린 아미다제의 고정화효소인 Eupergit PcA(Rohm Pharma GmbH, Germany) 를 사용하고, 상기 선행 기술과 동일한 원료를 사용하면서 MMTD-7-ACA 10 g/ℓ, pH 6.8, 및 35℃ 의 조건하에 165 분간 반응시킴으로써 55%의 전이율로 세파졸린을 수득하는 개선된 결과를 발표하였다(참조문헌: M. Kostadinor, et al., Appl. Biochem. Biotech., 33, 177(1992)).

세파졸린을 제조하기 위해 효소적 합성법을 시도한 상기 두가지의 선행 기술 중에서, 협화발효(일본특허 공개 제 74-134893 호)의 경우에는 생촉매로서 균체 그 자체를 사용하였고, M. Kostadinov 등의 경우에는 생촉매로서 고도로 정제된 페니실린 지 아미다제의 고정화 효소를 사용하였다는 점에 차이가 있는데, 이중 페니실린 지 아미다제를 함유하고 있는 균체 자체를 생촉매로서 사용한 경우는 균체를 파쇄한 후 페니실린 지 아미다제를 정제·회수하는 공정이 필요없어 간편한 장점이 있으나 1 회 밖에 사용할 수 없으므로 많은 양의 균체가 소요되고 반응 완료액으로 부터 균체를 분리하기가 용이하지 않으며 반응완료액 중에 파쇄된 균체찌꺼기가 남아 있어 세파졸린 정제를 어렵게 한다는 단점들을 지니고 있는 반면에, 정제된 페니실린 지 아미다제의 고정화효소를 생촉매로서 이용하는 경우는 단위 고정화효소량 당 세파졸린 합성 활성이 매우 높아 고정화효소 사용량이 적으며 반응 완료액으로 부터 고정화 효소의 분리가 용이하고 고정화 효소로 부터 불순물의 유출이 거의없다는 장점이 있으나 페니실린 지 아미다제의 순수 분리·정제 공정이 까다로우며 수율이 낮아 생촉매 제조비용이 많이 든다는 단점이 있다.

그러나, 이와 같이 미미하게나마 새로이 개발되기 시작한 생물전환 기술에 의해 세파졸린을 포함한 세팔로스포린계 화합물을 제조하는 방법들은 거의 수십년간 축적된 화학적 합성기술에 비하여 하기 표 1 에 나타낸 바와 같이 원료농도 및 생산성 측면에서 비교가 되지 않아 아직까지 산업적으로는 적용이 어려운 기술로 인식되어 왔다.

표 1. 화학적 합성법 및 효소적 합성법의 세파졸린 합성상의 생산성 비교

그러나, 이러한 결점에도 불구하고 효소적 합성법은 화학적 합성법이 가진 근본적인 문제점인 유기용매 및 유독성 화학약품의 사용에 의한 환경오염 문제, 최종 제품에 이러한 유독성 화학약품이 잔류하는 문제, 그리고 비선택적 반응에 의한 품질 저하 문제 등을 일시에 해결할 수 있는 대안으로서 이에 대한 관심이 최근 현격히 증가되고 있다.

따라서, 본 발명자들도 이러한 관심에 부응하여 효소적 합성법이 화학적 합성법을 대체할 수 있을 정도의 경제성을 가질 수 있기 위해서는 우선 해결되어야 할 과제가 첫째, 높은 전환율과 장기 운전 안정성을 가진 생촉매를 저렴한 가격으로 공급할 수 있는 기술의 개발이 선행되어야 하며, 둘째, 생산성을 높이고 정제 회수율을 높이기 위하여 고농도 반응기술이 확보되어야 하고, 셋째, 고가의 원료인 미반응 MMTD-7-ACA 및 TzAA의 에스테르 화합물의 회수 시스템 개발이 중요함을 인식하고, 이러한 여러가지 문제점을 해결하고자 다년간에 걸쳐 광범위한 연구를 수행한 결과, 고효율이면서도 저가인 생촉매의 개발 및 고농도의 반응 시스템 개발에 성공함으로써 상기 세가지의 문제점중 첫번째 및 두번째의 문제점을 해결하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 종국적으로, 본 발명은 기존의 화학적 합성법에 비하여 산업적 경쟁력이 있는 기술로서의 효소적 합성법을 개발하는 것을 목적으로 하며, 이러한 목적을 달성하기 위한 구체적인 수단으로서 본 발명에서는 페니실린 지 아미다제 생산 균주로부터 부틸아세테이트에 의한 효소추출 및 암모늄설페이트에 의한 효소침전의 두가지 정제 단계만을 거쳐 부분정제된 상태로 획득된 페니실린 지 아미다제를 생촉매로 사용하고, 이 생촉매를 이용하여 세파졸린을 합성하는 경우에 반응 물질중의 하나인 MMTD-7-ACA가 반응진행중에 소모되는 속도에 맞추어 단계적으로 MMTD-7-ACA를 추가 공급해주는 유가식 반응법을 개발하였다.

이하, 본 발명을 좀더 자세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서, 페니실린 지 아미다제 생산 균주란 야생주 자체로서 페니실린 지 아미다제를 생산할 수 있는 균주 뿐아니라 이러한 균주의 변이주로서 이 효소의 생산능이 특벽히 향상되어 동일량의 균주로 부터 다량의 효소를 수득할 수 있는 것도 포함하는데, 바람직하게는 효소 생산능이 향상된 변이주를 사용하는 것이 좋다.

특히, 페니실린 지 아미다제 생산 균주의 일종인 에스케리치아 콜리 ATCC 9637을 NTG (N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘) 을 사용하여 여러차례 화학적인 인공돌연변이를 일으키고 이로부터 획득된 변이주의 선별 및 활성확인 과정을 통해 에스케리치아 콜리 ATCC 9637을 모균주로 하여 제 4 차에 걸친 변이주를 유도하고 선별한 결과, 본 발명에서 바람직하게 이용될 수 있는 페니실린 지 아미다제 활성이 높을 뿐아니라 안정된 특성을 지니는 인공변이주를 획득하였다. 그중에서도, 4 차 인공변이주의 경우에는, 측정된 배양액 활성 및 균체 활성이 각각 1.8 U/㎖, 140 U/g 함습균체 (702 U/g 건조균체)로서 모균주인 에스케리치아 콜리 ATCC 9637 의 배양액 활성 및 균체활성이 각각 0.5 U/㎖, 22 U/g 함습균체 (109 U/g 건조균체)인 것을 감안하면 4 차에 걸친 인공돌연변이의 결과로서 배양액활성 및 균체활성이 각각 3.6 배 및 6.4 배 증가된 고활성의 인공변이주가 획득된 것이므로 본 발명에서는 에스케리치아 콜리 ATCC 9637 을 NTG 로 4 차에 걸쳐 변이처리한 결과 획득된 제 4 차 변이주 에스케리치아 콜리 CFC 04017 (기탁번호 : KFCC 10832) 을 페니실린 지 아미다제 생산 균주로서 가장 바람직하게 사용하였다.

또한, 본 발명에서는 상기의 페니실린 지 아미다제 생산 균주로 부터 고도로 정제되지 않고 부분정제된 효소를 생촉매로서 사용하였으나, 페니실린 지 아미다제 생산능이 향상된 변이주를 바람직하게 사용함으로써, 고도로 정제된 효소를 고정화한 생촉매와 마찬가지로 높은 비활성도(specific activity), 선택적 반응성, 우수한 장기운전 안정성 등의 장점을 유지하면서도 효소 정제과정의 생략으로 이에 관련된 설비투자를 할 필요가 없고 또한 효소정제시의 손실을 피할 수 있기 때문에훨씬 저렴한 가격으로 우수한 생촉매를 확보할 수 있게 되었다.

부분정제된 상태로 사용되는 본 발명에 따른 생촉매가 고도로 정제된 선행의 생촉매와 마찬가지로 높은 비활성도를 지니고 있음은 하기 표 2 의 결과로 부터 명확히 확인되는 바와 같다.

표 2.

한편 세파졸린의 효소적 합성법의 실용화에 있어서, 또 하나의 장해요인은 낮은 반응농도이다. 화학적 합성법은 유기용매상의 반응으로서 이러한 반응계에서 MMTD-7-ACA의 용해도는 40 g/ℓ 이상으로서 매우 높으나, 효소적 합성법은 수상계 반응이므로 이때의 반응농도는 주원료인 MMTD-7-ACA의 낮은 용해도에 의해서 제한을 받는다. 즉, 기존의 연구에서 통상적으로 선정한 온도 및 pH 인 30℃, pH 7.5 에서의 MMTD-7-ACA 용해도가 10 g/ℓ에 불과하므로 더 이상의 고농도에서 반응을 수행시킬 수가 없었다. 그러나, 반응농도가 낮게 되면 그만큼 설비 규모가 대형화하고 또한 생성된 세파졸린의 회수율도 떨어지게 되므로 가능한 한 높은 농도에서 반응을 수행하는 것이 매우 중요하며, 이러한 문제점을 해결하기 위하여 본 발명에서는 반응이 진행됨에 따라 MMTD-7-ACA가 소모되는 점에 착안하여 소모속도에 맞추어 단계적으로 MMTD-7-ACA를 추가 공급해주는 유가식 반응법을 개발함으로써 일반적인 회분식 반응에 비하여 최고 3 배 이상의 세파졸린을 제조할 수 있었다.

본 발명에 따라, 균체로 부터 페니실린 지 아미다제 함유 조효소를 수득하고 이를 고정화하여 세파졸린 합성에 사용하는 과정을 상세히 설명하면 하기와 같다.

먼저, 페니실린 지 아미다제 생산 균주를 배양한 배양액을 원심분리하여 상등액을 제거한 후 균체를 얻는다. 획득된 균체의 건조균체 중량을 측정한다. 수분대 건조균체 중량이 14 ℓ대 1 kg 이 되도록 증류수를 가하고 상온에서 교반하여 완전히 혼합한다. pH를 8.0 으로 조정하고 부틸아세테이트를 건조균체 1kg 당 75 g 이 되게 가하여 40℃ 로 온도를 올린 후 pH의 변화가 없을 때까지 반응을 시켜 효소를 추출한다. 6℃ 로 냉각하여 pH를 6.5로 조정하고 응집제를 0.15%가 되게 가한 후 4℃ 에서 1 일간 방치한다. 추출액을 원심분리하여 침전물인 균체 파쇄 찌꺼기는 버리고 상등액을 취한 다음, 이 상등액이 든 용기를 얼음중탕에 넣고 pH 를 6.8 로 조정한다. 이 수용액에 대해 암모늄설페이트를 0.39 g/ℓ가 되게 조금씩 가하여 전부 용해시킨다. 4℃ 에서 1 일간 방치한다. 이를 원심분리하여 부분정제된 상태로 침전된 페니실린 지 아미다제를 함유하는 조효소를 획득한다.

이 페니실린 지 아미다제 함유 조효소를 고정화함으로써 효소의 반복 재사용이 가능하게 되는데, 고정화에 있어서는 기존의 여러가지 페니실린 지 아미다제 고정화법을 사용할 수 있고, 여기서는 하나의 예로서 폴리아크릴아미드법에 의한 고정화를 설명한다.

앞에서 획득한 조효소의 건조 중량을 측정한 후, 수분 대 건조중량이 1:1이되게 증류수를 가한다. 여기에 0.3 M, pH 7.5 인산완충용액을 증류수량과 동일 부피로 가하여 잘 혼합한다. 33% 아크릴아미드, 2.5% N,N'-메틸렌비스아크릴아미드 혼합수용액을 조효소 수용액에 대해 0.25배의 부피비로 가하여 교반하고, 25% 글루타르 알데히드를 조효소 수용액에 대해 0.1 배의 부피비로 가하여 잘 혼합하며, 여기에 25% 암모늄퍼설페이트 수용액을 조효소 수용액에 대해 0.05 배의 부피비로 가하여 수초간 격렬히 교반한 다음 냉각된 스테인레스스틸판에 깔아 조효소가 함유된 폴리아크릴아미드 겔을 제조한다. 표준망을 이용하여 상기 겔을 직경 0.5 mm 의 알갱이로 제조하여 페니실린 지 아미다제의 고정화효소로서 하기와 같이 MMTD-7-ACA로 부터 세파졸린을 제조하는데 이용한다.

세파졸린 합성반응 준비를 위한 기질 용액은 0.1 M, pH 7.5의 인산완충용액에 MMTD-7-ACA와 TzAA의 에스테르 화합물, 바람직하게는 메틸에스테르 화합물을 각각 10 g/ℓ 및 30내지 35 g/ℓ가 되도록 용해시킴으로써 제조한다. 반응계의 온도를 20 내지 40℃, 바람직하게는 30℃ 로 유지하고 반응계의 pH를 6.5 내지 8.5, 바람직하게는 7.5 로 유지시킨 다음, 반응기에 페니실린 지 아미다제의 고정화 효소를 세파졸린 합성활성 6 Unit/㎖ 가 되도록 가하고 교반하면서 50 내지 60분간 반응시킨다. 이때 반응 개시 후 매 10분 마다 MMTD-7-ACA 분말을 5내지 6 g 씩 추가로 가입하는 유가식 반응법을 실시한다. 그 결과, 총투입량 70% 이상의 MMTD-7-ACA가 반응에 참여하여 세파졸린으로 전환이 되었으며 미반응 원료들은 적절한 방법으로 회수하여 재사용이 가능할 수도 있을 것으로 생각된다.

본 명세서에서 고정화효소의 세파졸린 합성 활성 1 단위(Unit)의 정의는 pH7.5, 0,1 M 인산완충용액중의 MMTD-7-ACA 30 mM, METzAA 180mM 이 되게한 기질용액중에서 30℃ 에서 1 분간 반응시켜 1 ㎛ol 의 세파졸린을 생성할 수 있는 효소량을 의미한다.

또한, 세파졸린, MMTD-7-ACA, TzAA의 에스테르화합물등은 고속액체크로마토그래피를 이용하여 분석하였는데, 이때 분석조건은 pH 3.6, 0.01 M 의 구연산인산 완충용액과 아세토니트릴을 9:1 로 혼합한 것을 이동상으로 하고 10 ㎛ole의 μBonda pak C18(Waters)를 충진한 4.0 mm x 30 cm 컬럼을 사용하였으며 유속은 2 ㎖/분으로 하고 254 nm 의 자외선 측정기를 사용하였다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명은, 정제 페니실린 지 아미다제의 고정화효소와 동일한 효과를 나타내는 부분정제된 고정화효소를 생촉매로서 사용하고, 유가식 반응법을 개발하여 세파졸린을 고농도로 회수할 수 있도록 함으로써 지금까지 산업화되기에는 어려운 점이 많았던 효소적 합성법이 세파졸린 합성에 실용화될 수 있는 터전을 마련하는 효과를 달성하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 고정화효소의 제조

에스케리치아 콜리 ATCC 9637 의 변이주인 에스케리치아 콜리 CFC 04017 을 침전물이 제거된 옥수수 침지액 4%(고형분 함량), 페닐아세트산 0.1%로 구성된 PH 7.5의 배양배지 80ℓ가 들어있는 120ℓ배양조에서 24℃, 180 rpm 의 조건하에 18 시간동안 배양하였다. 이때 접종량은 3% 로 하였다. 배양액 80ℓ를 원심분리하여함습균체 1.87 ㎏ 을 획득하고, 이 균체의 건조균체함량을 측정하였더니 393 g 이었다.

상기 함습균체를 교반기가 달린 반응조에 넣고 증류수 5.5ℓ 를 가한 후 상온에서 완전히 혼합될 때까지 교반하였다. 혼합액의 pH를 8.0으로 조정한 다음 부틸아세테이트 29.5 g 을 가하고 40℃ 로 온도를 올린 후 pH의 변화가 없을 때까지 반응시켜 효소를 추출하였다. 다시 6℃ 로 냉각시키고 pH를 6.5로 조정한 다음, 응집제를 0.15% 가 되게 가하고 4℃ 에서 1 일간 방치하였다. 추출액을 원심분리하여 침전물인 균체 파쇄찌꺼기는 버리고 상등액을 취하였다. 상등액을 다시 반응기에 넣고 6℃ 로 냉각시킨 후 pH를 6.8로 조정하였다. 여기에 암모늄설페이트를 0.39 g/ℓ가 되게 조금씩 가하여 용해시킨 다음, 4℃ 에서 1 일간 방치하여 충분히 침전시키고, 이것을 원심 분리하여 71.1 g의 페니실린 지 아미다제 함유 조효소를 획득하였다. 이 조효소의 고형분 함량은 47% 이었다.

수득한 조효소에 0.3 M, pH 7.5 의 인산완충용액 33.4 ㎖를 가하여 잘 혼합하였다. 여기에 아크릴아미드 및 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드가 각각 33% 및 2.5% 로 용해되어 있는 혼합용액을 28.5 ㎖ 가하여 교반하고, 25% 글루타르알데히드를 11.5㎖ 가하여 잘 혼합하며, 25% 암모늄퍼설페이트 수용액 5.8 ㎖ 를 급속히 가하여 수초간 격렬히 교반한 다음 냉각된 스테인레스스틸판에 두께가 1 cm 미만으로 얇게 깔아 조효소가 함유된 폴리아크릴아미드 겔을 만들었다. 이 겔을 0.5 mm의 스테인레스스틸 표준망에 2 회 통과시켜 직경 0.5 mm 의 고정화효소 알갱이들을 제조하였다. 획득한 페니실린 지 아미다제 고정화효소는 140 g 이었고, 이들의 세파졸린 합성 활성은 352 Unit/g 이었다.

실시예 2: 고정화효소를 이용한 세파졸린의 합성

2ℓ용량 반응기에 MMTD-7-ACA 10 g, METzAA 32 g 을 넣고 0.3 M, pH 7.5의 인산완충용액을 1 ℓ가 되도록 가하여 용해시켰다. 여기에 실시예 1에서 제조한 고정화효소 17 g을 가하고 온도 및 pH를 각각 30℃ 및 7.5로 유지하면서 50분간 300 rpm으로 교반하며 반응시켰다. 이때, 반응 개시 후 매 10분 마다 4회에 걸쳐 MMTD-7-ACA 분말을 6 g 씩 추가로 가하였다. 반응액을 여과지로 여과하여 생촉매를 분리시킴으로써 반응을 중지시켰다. 회수된 생촉매는 재사용을 위하여 4℃에 보관하였다. 반응완료액을 고속액체크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과 세파졸린이 32.2 g/ℓ가 생성되었다.

Claims (6)

1. 페니실린 지 아미다제 활성을 갖는 균주 에스케리치아 콜리(Escherichia coli)를 부틸아세데이트로 처리하여 효소를 추출하고, 계속하여 암모늄설페이트로 효소를 침전시켜서 수득한 부분정제된 페니실린 지 아미다제를 고정화시킨 고정화 효소를 이용하여 유가식 반응법으로 MMTD-7-ACA(3-5-[메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일] -7-아미노세팔로스포란산) 및 TzAA(테트라졸-1-아세트산)의 에스테르 화합물로부터 세파졸린을 제조하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, TzAA의 에스테르 화합물이 METzAA(테트라졸-1-아세트산의 메틸에스테르) 임을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 페니실린 지 아미다제 활성을 갖는 균주가 에스케리치아 콜리 ATCC 9637(Escherichia coli ATCC 9637) 임을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 균주가 에스케리치아 콜리 CFC 04017 (기탁번호 : KFCC 10832) 임을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 반응계의 온도가 20 내지 40℃ 임을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 반응계의 pH가 6.5 내지 8.5 임을 특징으로 하는 방법.