KR101372092B1 - 글루타메이트 디카복실라아제 고정화 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 L-글루타메이트(L-glutamate)로부터 감마-아미노부틸산(gamma/γ-aminobutyric acid, GABA)의 생산에 촉매로 사용되는 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase, GAD)의 고정화 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 L-글루타메이트(L-glutamate)로부터 감마-아미노부틸산(gamma/γ-aminobutyric acid, GABA)의 생산에 촉매로 사용되는 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase, GAD)의 고정화 방법에 관한 것이다.
감마-아미노부틸산(GABA)은 4개의 탄소로 구성되어 있는 비단백질 구성 아미노산의 억제성 신경전달물질로서 신경안정 작용, 스트레스 해소, 기억력 증진, 혈압강하작용, 우울증 완화, 중풍과 치매 예방, 불면, 비만, 갱년기장애 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 뇌졸증 및 결장암, 대장암 세포의 전이 및 증식 억제효과도 있는 것으로 밝혀진 세계적인 식품소재이다. 또한 최근 바이오매스 유래 소재에 대한 관심이 증가하고 있는데, GABA는 바이오매스로부터 생산될 수 있는 유용한 플라스틱인 폴리아미드 4를 얻기 위한 중요한 단량체이다.
감마-아미노부틸산 생산을 위한 여러 가지 방법 중 L-모노소듐 글루타메이트(L-monosodium glutamate, L-MSG)와 같은 바이오매스 유래 값싼 원료로부터 고효율/고선택성 효소 촉매를 사용하여 GABA를 생산하는 환경친화적인 생물전환법은 매우 합리적이고 가치있는 방법이다.
GABA로의 전환 반응에 효소로 사용되는 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase, GAD)는 피리독살 5-포스페이트 (pyridoxal-5'-phosphate)-의존 세포 내 효소로서, L-글루타메이트의 γ-아미노부티레이트로의 비가역적 탈카르복실화 반응을 촉매한다. 이 효소는 미생물, 식물, 동물 등 거의 모든 생물체에 존재하는데 유산균, 대장균 등 박테리아 유래의 것이 많이 사용된다. 이 효소는 글루타메이트의 α-탄소에 결합되어 있는 카르복실 그룹으로부터 이산화탄소(CO2)를 제거하는데, 이 반응 과정에서 양성자(H+)를 소모해 pH가 증가하게 된다.
그러나, 박테리아 글루타메이트 디카복실라아제가 작용하는 pH 범위는 3.5~5.5이며, 최적 pH는 3.8~4.6에 존재하며, pH가 3.0 이하 이거나 6.0 이상이 되면 반응은 거의 일어나지 않는다. 즉, 생물전환법의 경우, 효소 촉매에 의해 감마-아미노부틸산이 생성됨에 따라 pH가 증가하게 되고, 이로 인해 반응은 점점 늦어지다가 결국 반응이 멈추게 된다.
따라서 반응 전환율을 향상시키기 위해서는 중성 및 염기성에서도 활성이 있는 글루타메이트 디카복실라아제(GAD)가 필수적이다.
본 발명은 L-글루타메이트를 기질로 하여 감마-아미노부틸산(GABA)을 제조함에 있어서, 중성 및 염기성에서도 활성이 있는 글루타메이트 디카복실라아제의 고정화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 가교결합을 통해 중성 및 염기성에서도 활성을 갖는 글루타메이트 디카르복실라아제의 고정화 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 고정화 방법에 의해 제조된 중성 및 염기성에서도 활성을 갖는 글루타메이트 디카르복실라아제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 L-글루타메이트를 기질로 하여 상기 글루타메이트 디카르복실라아제를 효소로 하여 감마-아미노부틸산(GABA)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의한 간단한 화학적 가교 결합법을 통해 중성 및 염기성에서도 활성이 있는 글루타메이트 디카르복실라아제를 제조할 수 있다. 고정화된 글루타메이트 디카르복실라아제를 촉매로 사용해 생산 수율을 증가시킬 수 있으며, 재사용도 가능해 경제적인 감마-아미노부틸산 생산 공정이 가능하다.
도 1은 GAD 가교 결합 고정화시 pH의 영향에 관한 것이다.
도 2는 암모늄 설페이트 용액 포화도의 영향에 관한 것이다.
도 3은 글루타알데히드 농도의 영향에 관한 것이다.
도 4는 Free GAD와 고정화 GAD의 pH 의존성 비교에 관한 것이다.
도 5는 Free GAD와 고정화 GAD를 사용한 고농도 GABA 생산에 관한 것이다.
도 6은 효소적 고농도 GABA 생산 중 pH의 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 암모늄 설페이트 용액 포화도의 영향에 관한 것이다.
도 3은 글루타알데히드 농도의 영향에 관한 것이다.
도 4는 Free GAD와 고정화 GAD의 pH 의존성 비교에 관한 것이다.
도 5는 Free GAD와 고정화 GAD를 사용한 고농도 GABA 생산에 관한 것이다.
도 6은 효소적 고농도 GABA 생산 중 pH의 변화를 나타낸 것이다.
본 발명은 가교결합을 통해 중성 및 염기성에서도 활성을 갖는 글루타메이트 디카르복실라아제의 고정화 방법을 제공하는 것이다. 보다 구체적으로,
(a) 생물체로부터 분리 및 정제된 글루타메이트 디카르복실라아제 용액에 완충용액을 혼합하여 pH를 조절하는 단계; (b) 단백질 침전제를 첨가하는 단계; 및 (c) 가교제를 첨가하는 단계를 포함하는 글루타메이트 디카르복실라아제의 고정화 방법화 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 “생물체로부터 분리 및 정제된 글루타메이트 디카르복실라아제”는 상기 생물체가 원래 가지고 있는 글루타메이트 디카르복실라아제 단백질을 정제한 경우뿐만 아니라, 상기 생물체가 가지고 있는 글루타메이트 디카르복실라아제 유전자를 적합한 숙주 세포에서 클로닝 및 발현시킨 다음 이 숙주 세포로부터 글루타메이트 디카르복실라아제 단백질을 정제한 경우까지 포함하는 것이다.
본 명세서에서 “분리 및 정제”는 목적의 단백질을 숙주 세포로부터 분리한 어떠한 형태도 다 포함하는 의미를 갖는다. 예를 들어, 숙주 세포의 추출물 및 추출물의 정제물, 예컨대, 암모늄 설페이트에 의한 용해도 분획화, 크기 분별 여과 및/또는 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제적된 것)에 의한 분비물을 포함하는 의미를 갖는다.
상기 생물체는 이에 제한되는 것은 아니나, 미생물, 식물 또는 동물일 수 있으며, 상기 미생물로는 대장균, 락토바실러스, 스트렙토코코스, 마이코박테리움 또는 아스퍼질러스일 수 있고, 상기 식물로는 토마토, 대두, 페튜니아, 호박일 수 있으며, 상기 동물로는 메뚜기, 나방, 파리, 꿀벌, 바퀴일 수 있다.
상기 (a) 단계의 pH 조절용 완충용액은 이에 제한되는 것은 아니나, 아세테이트 완충용액, PBS 완충용액 또는 카보네이트 완충용액일 수 있다.
상기 완충용액은 글루타메이트 디카르복실라아제의 가교결합 시에 pH의 영향을 알아 보기 위한 것으로서, 상기 아세테이트 완충용액은 pH 4 내지 5일 수 있고, pH 4.6일 수 있다. 또한, 상기 PBS 완충용액은 pH 7 내지 8 일수 있고, pH 7.4일 수 있으며, 카보네이트 완충용액은 pH 9 내지 10일 수 있고, pH 9.5일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 아세테이트 완충용액(0.2M, pH 4.6)에서 제조된 글루타메이트 디카르복실라아제가 모든 pH에서 높은 비활성을 보였고, 염기성에서도 활성을 보여주는 것을 알 수 있었다(도 1참조).
상기 (b) 단계의 단백질 침전제는 이에 제한 되는 것은 아니나, 암모늄 설페이트 등 염, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, tert-부탄올, 아세톤, 아세토니트릴, 디메틸에테르, 디에틸에테르, 에틸락테이트, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 테트라하이드로퓨란, 다이옥산 등 유기용매, 폴리에틸렌글리콜 등 고분자일 수 있다.
상기 암모늄 설페이트의 포화도는 40~80%일 수 있으며, 60%일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 암모늄 설페이트 용액의 포화도에 따른 글루타메이트 디카르복실라아제의 비활성을 측정한 결과 포화도 60%에서 평균적으로 pH에 따라 고른 비활성을 보이는 것을 알 수 있었다(도 2).
상기 (c) 단계의 가교제는 이에 제한 되는 것은 아니나, 글루타알데히드, 글리옥살, 숙신알데히드, 에틸렌 디아민, 헥사메틸렌디아민, 옥탄디아민, 비스이미도 에스테르, 비스숙신이미딜 에스테르, 말레이미드, 이오도아세타미드, 디씨오비이미데이트 또는 덱스트란 폴리알데히드일 수 있다.
상기 글루타알데히드의 농도는 0.5~3% 일 수 있다.
상기 (b) 단계에서 단백질 침전제를 첨가하는 경우 침전된 글루타메이트 디카르복실라아제를 가교결합 시키기 위해 가교제를 첨가한 후 교반해 줄 수 있다. 그 후, 원심분리기를 이용해 상층액을 제거한 후, 얻어진 고정화된 글루타메이트 디카르복실라아제를 완충 용액을 이용해 세척할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 고정화 방법으로 제조된 글루타메이트 디카르복실라아제를 제공하는 것이다.
상기 글루타메이트 디카르복실라아제는 pH 3 에서 9까지 활성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 L-글루타메이트를 기질로 하여 상기 글루타메이트 디카르복실라아제를 효소로 하여 감마-아미노부틸산을 제조하는 방법, 즉, 생물전환 공정에 의한 GABA의 제조방법을 제공하는 것이다. 하기 반응식 1에는 본 발명에 의한 GABA의 제조방법을 나타내었다.
[반응식 1]
생물전환 공정의 경우, 감마-아미노부틸산이 생성됨에 따라 pH가 증가하게 되고, 산성에서만 활성이 있는 효소 촉매로 인해 반응은 점점 늦어지다가 결국 반응이 멈추게 된다. 반응 전환율을 향상시키기 위해서는 중성 및 염기성에서도 활성이 있는 글루타메이트 디카르복실라아제가 필수적이고, 본 발명에 의한 글루타메이트 디카르복실라아제는 pH 3 ~ 9에서 활성을 가질 수 있는 바, GABA의 생산 수율을 증가시킬 수 있게 된다.
본 발명의 생물전환 공정의 반응 온도는 15 ~ 65℃일 수 있으며, 상기 공정의 pH 3 ~ 9에서 실시될 수 있다. 이와 같이 넓은 범위에서 GABA를 생산할 수 있는 장점을 가지게 된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예
1.
글루타메이트
디카복실라아제
효소의 고정화
글루타메이트 디카복실라아제 활성이 우수한 재조합 대장균(E. coli DH5α 유래 GAD를 클로닝한 재조합 E. coli BL21(DE3)::pET28b-GAD)을 통상적인 방법으로 액체 배지에서 배양, 원심 분리기를 이용해 세포를 수집한 후, PBS 완충용액(pH 7.4)으로 두 번 세척하였다. 세척 후 회수된 세포는 0.1 M PBS 완충용액(pH 7.4)내에서 초음파 분쇄기를 이용하여 파쇄되었다(1분씩 5번). 세포 파쇄 후, 상층액에 존재하는 단백질들을 20%, 40%, 60%, 80%로 포화된 암모늄 설페이트(ammonium sulfate) 용액을 이용하여 부분적으로 침전, 분리하였다. 암모늄 설페이트 포화도 40~60% 분획에서 분리한 GAD 효소는 pH 7.4인 PBS 완충용액에 녹여 냉장 보관하였다. 이렇게 분리 정제된 글루타메이트 디카복실라아제 의 활성은 대략 82 U/mg 단백질이었다. 단백질 량은 Micro BCATM Protein Assay Kit(Pierce, USA)를 사용하여 측정하였으며, 글루타메이트 디카복실라아제 기질인 L-모노소듐 글루타메이트(L-MSG)와 반응 생성물인 감마-아미노부틸산(GABA)의 농도는 HPLC를 이용해 분석하였다.
가교 결합법으로 고정화된 효소(Crosslinked enzyme aggregate, CLEA)는 다음과 같이 준비되었다. GAD 용액 0.05 ml 를 0.95 ml 완충 용액(pH 4.6, 7.4 혹은 9.5)에 섞어 주었다. 이 효소 용액에 암모늄 설페이트를 첨가, 30분 동안 교반하여 40%, 60%, 70%, 80%로 포화된 용액을 제조하였다. 염에 의해 침전된 효소를 가교결합 시키기 위해 글루타알데히드 수용액(25%)을 0.5, 1, 2, 3%의 최종 농도로 첨가한 후, 3시간 동안 교반해주었다(50 rpm). 원심분리기(15,000 rpm, 4℃, 10분)를 이용해 상층액을 제거한 후, 얻어진 고정화된 효소를 완충 용액을 이용해 두 번 세척하였다.
실시예
2. 효소
가교결합
고정화시
pH
의 영향
대장균 유래 글루타메이트 디카복실라아제 는 육중체(hexamer)로 존재하는데 pH 6.0 이상에서는 각 서브유닛(subunit)으로 분리되어 활성이 떨어지는 것으로 알려져 있다. 따라서 효소 가교 결합시 pH는 중요한 역할을 하리라 기대되어 우선 pH 영향을 살펴보았다. 아세테이트 완충용액(0.2 M, pH 4.6), PBS 완충용액(0.1 M, pH 7.4) 및 카보네이트 완충용액(0.1 M, pH 9.5)내에서 효소간 가교 결합을 수행하였다. 이때 단백질 농도는 0.186 mg/ml, 암모늄 설페이트 용액의 포화도는 60%, 글루타알데히드 농도는 2%였다. 고정화된 GAD를 사용하여 20 mM의 L-MSG를 기질로 다양한 pH를 가진 완충용액 내에서 반응을 수행하여 그 결과를 도 1에 나타내었다. 기대했듯이 pH 4.6에서 제조된 고정화 효소가 pH 7.4 및 9.5에서 제조된 고정화 효소보다 모든 pH에서 더 높은 비활성을 보였고, 염기성에서도 활성을 보여 주었다. 이후 모든 고정화 실험에서 아세테이트 완충용액(0.2 M, pH 4.6)을 사용하였다.
실시예
3. 암모늄
설레이트
용액
포화도의
영향
암모늄 설페이트 용액의 포화도에 따른 영향을 살펴보았다. 포화도를 40, 60, 70, 80%로 변화시키면서 고정화 효소를 제조한 후, 각 효소의 비활성을 측정하였다. 동일하게 단백질 농도는 0.186 mg/ml, 글루타알데히드 농도는 2%였다. 도 2에서 보듯이 암모늄 설페이트 용액의 포화도는 효소 비활성에 큰 영향을 주지 않았다. 다만 산성인 조건에서는 40% 포화도에서 제조한 고정화 GAD가 다소 높은 비활성을 보였고, 염기성인 조건에서는 오히려 높은 포화도에서 제조한 고정화 GAD가 약간 높은 비활성을 나타내었다. 평균적으로 pH에 따라 고른 비활성을 보인 포화도 60%를 최종 선정하였다.
실시예
4.
글루타알데히드
농도의 영향
글루타알데히드 농도를 0.5, 1, 2, 3% 등으로 바꾸면서 농도 변화에 따른 영향을 조사하였다. 가장 높은 활성을 보이는 pH(4.6) 주변에서는 글루타알데히드 농도 영향이 크지 않는 것으로 보이나, 중성 및 염기성 조건하에서는 비록 2%와 3%는 큰 차이를 보이지 않았지만, 글루타알데히드 농도가 증가할수록 비활성이 증가하는 것으로 나타났다(도 3).
실시예
5.
Free
GAD
와 고정화
GAD
의
pH
의존성 비교
고정화를 하지 않은 free GAD 효소와 가교 결합법으로 고정화된 GAD의 pH 의존성을 비교해 보았다. 20 mM L-MSG를 사용해 37°C에서 pH 에 따른 글루타메이트 디카복실라아제 효소의 활성을 조사하였다. 고정화 GAD는 아세테이트 완충용액(pH 4.6)에 암모늄 설페이트를 넣은 후(포화도 60%), 글루타알데히드를 첨가(최종 농도 2%)하여 제조하였다. 도 4를 보면 free GAD의 경우, 이미 알려진 바와 같이 pH 6 이상에서는 효소 활성이 거의 없는 것을 알 수 있었다. 그러나, 고정화 GAD는 중성에서도 높은 활성을 보였으며, 심지어 염기성에서도 활성을 나타내었다. 이는 육중체(hexamer)인 대장균 유래 GAD가 pH 6.0 이상에서는 각 서브유닛(subunit)으로 분리되어 활성이 떨어지는 데 반해, 고정화 GAD는 글루타알데히드로 서브유닛(subunit)간 가교 결합되어 pH 6.0이상에서도 분리되지 않아 활성을 가지는 것으로 판단된다.
실시예
6.
Free
GAD
와 고정화
GAD
를 사용한 고농도
GABA
생산
Free GAD와 고정화 GAD를 사용해 고농도 감마-아미노부틸산 생산 반응을 수행하였다. 먼저 1 M L-MSG, 0.1 mM PLP, 0.2 mM DTT가 포함된 아세테이트 완충용액(0.2 M, pH 4.6)에 free GAD(1.86 mg)를 첨가하여 37°C에서 전환 반응을 수행하였다. 20 mM의 기질을 사용한 경우와 달리, 고농도의 기질을 사용하였을 때, 48시간 반응 후 최종 전환율은 13 %에 불과하였다(도 5). 그러나, 동일한 조건하에서 CLEA를 촉매로 사용한 경우, 도 5에서 보이듯이 전환율은 크게 향상되어 48시간 반응 후 24%의 전환율을 보여주었다. 이러한 결과는 반응 중 pH 변화에 관련이 있는 것으로 판단된다. Free GAD의 경우, 기질인 L-MSG에 의해 초기 pH는 4.6에서 5.3으로 증가하였고, 반응이 진행함에 따라 pH는 약 7.5까지 증가하였다(도 6). 반응 중 pH 증가에 따라 free GAD의 촉매 활성이 떨어져 반응이 더 이상 진행되지 않은 것으로 생각된다. 그러나 고정화된 GAD(CLEA GAD)는 염기성에서도 활성을 보이므로 반응이 지속적으로 진행되어 전환율이 향상된 것으로 판단된다.
Claims (11)
- (a) 생물체로부터 분리 및 정제된 글루타메이트 디카르복실라아제 용액에 완충용액을 혼합하여 pH를 조절하는 단계; (b) 단백질 침전제를 첨가하는 단계; 및 (c) 가교제를 첨가하는 단계를 포함하는 글루타메이트 디카르복실라아제의 가교 결합 효소 응집체(crosslinked-enzyme aggregate) 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 생물체는 미생물, 식물 또는 동물인 것을 특징으로 하는 글루타메이트 디카르복실라아제의 가교 결합 효소 응집체(crosslinked-enzyme aggregate) 제조 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 미생물은 대장균, 락토바실러스, 스트렙토코코스, 마이코박테리움 또는 아스퍼질러스, 상기 식물은 토마토, 대두, 페튜니아 또는 호박, 상기 동물은 메뚜기, 나방, 파리, 꿀벌 또는 바퀴인 것을 특징으로 하는 글루타메이트 디카르복실라아제의 가교 결합 효소 응집체(crosslinked-enzyme aggregate) 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 pH 조절용 완충용액은 아세테이트 완충용액, PBS 완충용액 또는 카보네이트 완충용액인 것을 특징으로 하는 글루타메이트 디카르복실라아제의 가교 결합 효소 응집체(crosslinked-enzyme aggregate) 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 단백질 침전제는 암모늄 설페이트, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, tert-부탄올, 아세톤, 아세토니트릴, 디메틸에테르, 디에틸에테르, 에틸락테이트, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 테트라하이드로퓨란, 다이옥산 또는 폴리에틸렌글리콜인 것을 특징으로 하는 글루타메이트 디카르복실라아제의 가교 결합 효소 응집체(crosslinked-enzyme aggregate) 제조 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 암모늄 설페이트의 포화도는 40~80%인 것을 특징으로 하는 글루타메이트 디카르복실라아제의 가교 결합 효소 응집체(crosslinked-enzyme aggregate) 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 가교제는 글루타알데히드, 글리옥살, 숙신알데히드, 에틸렌 디아민, 헥사메틸렌디아민, 옥탄디아민, 비스이미도 에스테르, 비스숙신이미딜 에스테르, 말레이미드, 이오도아세타미드, 디씨오비이미데이트 또는 덱스트란 폴리알데히드인 것을 특징으로 하는 글루타메이트 디카르복실라아제의 가교 결합 효소 응집체(crosslinked-enzyme aggregate) 제조 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 글루타알데히드의 농도는 0.5~3%인 것을 특징으로 하는 글루타메이트 디카르복실라아제의 가교 결합 효소 응집체(crosslinked-enzyme aggregate) 제조 방법.
- 제 1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 글루타메이트 디카르복실라아제 가교 결합 효소 응집체(crosslinked-enzyme aggregate).
- 제 9항에 있어서, pH 3에서 9까지 활성을 갖는 글루타메이트 디카르복실라아제인 것을 특징으로 하는 글루타메이트 디카르복실라아제 가교 결합 효소 응집체(crosslinked-enzyme aggregate).
- L-글루타메이트를 기질로 하여 제 1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 글루타메이트 디카르복실라아제 가교 결합 효소 응집체(crosslinked-enzyme aggregate)를 효소로 하여 감마-아미노부틸산을 제조하는 방법.
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Applications Claiming Priority (1)
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| KR20130134084A KR20130134084A (ko) | 2013-12-10 |
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| KR20070014867A (ko) * | 2005-07-29 | 2007-02-01 | (주)바이오벤 | 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체 |
| KR20070014858A (ko) * | 2005-07-29 | 2007-02-01 | (주)바이오벤 | 글루타메이트 디카르복실라아제를 이용한 생물전환공정에의한 ｇａｂａ의 제조방법 |
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