KR101381002B1 - 글리세롤을 기질로 하여 생물전환공정에 의한 감마-아미노부틸산의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 대장균에 과발현하여 중성 산도에서 글루타메이트가 GABA로 전환될 수 있도록 함으로써 글리세롤을 GABA로 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명을 통해 바이오디젤 생산에서 부산물로 생산되는 글리세롤을 고가의 GABA로 전환함으로써 경제적이고 친환경적인 감마-아미노부틸산의 제조가 가능하다. 또한 이는 바이오디젤 산업의 전반적인 경제성 향상을 도모하여 바이오디젤의 가격 경쟁력을 향상시킬 수 있다.

Description

글리세롤을 기질로 하여 생물전환공정에 의한 감마-아미노부틸산의 제조방법{Method for gamma-aminobutyric acid with glycerol as substrate by biotransformation process}

본 발명은 효소의 활성 pH 범위의 제한을 해결함으로써, 글리세롤을 기질로하여 감마-아미노부틸산(GABA)을 제조하는 방법에 관한 것이다.

감마-아미노부틸산(GABA)은 4개의 탄소로 구성되어 있는 비단백질 구성 아미노산의 억제성 신경전달물질로서 신경안정 작용, 스트레스 해소, 기억력 증진, 혈압강하 작용, 우울증 완화, 중풍과 치매 예방, 불면, 비만, 갱년기 장애 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 뇌졸중 및 결장암, 대장암 세포의 전이 및 증식 억제 효과도 있는 것으로 밝혀진 세계적인 식품소재이다. 또한 최근 바이오매스 유래 소재에 대한 관심이 증가하고 있는데, GABA는 바이오매스로부터 생산될 수 있는 유용한 플라스틱인 폴리아미드 4를 얻기 위한 중요한 단량체이다.

GABA 생산을 위한 공업적 방법은 합성법, 추출법, 생물전환법 등이 있다. 합성법의 경우 사용하는 용매가 주로 유독하고, 추출법의 경우는 폐기물의 발생량이 많고, GABA의 제조단가가 높은 단점이 있다. 생물전환법은 바이오촉매(biocatalyst)인 분리 효소(isolated enzyme)나 효소를 함유한 전세포(whole cell)를 촉매로 사용하여 L-글루타메이트의 탈카르복시화 반응으로 GABA를 생산하는 방법이다. 생물학적으로 생산되는 L-글루타메이트의 가격은 GABA에 비해 상대적으로 높지 않으나, 여전히 값싼 원료로 이해되지는 않는다.

GABA로의 전환 반응에 사용되는 효소는 피리독살 5-포스페이트(PLP)-의존형 글루타메이트 디카르복실라아제(GAD) (EC 4.1.1.15)이며, 이 효소는 유산균, 대장균, 바실러스 등 미생물 유래의 것이 많이 사용된다. 박테리아 글루타메이트 디카르복실라아제가 작용하는 pH 범위는 3.5~6.0이며, 최적 pH는 3.8~4.6에 존재하며, pH가 3.5 이하 이거나 6.0 이상이 되면 반응은 거의 일어나지 않는다. 즉, 일반적인 배양 조건에서는 글루타메이트 디카르복실라아제의 활성이 전혀 없다고 보아도 무방하다.

바이오디젤의 생산에서 부산물로 생산되는 글리세롤은 현재 화장품의 원료로 사용되는 외에 큰 사용처가 발생하지 않아 바이오디젤 산업의 전반적인 발전에 걸림돌이 되고 있다. 이에 글리세롤을 대장균 등의 미생물 배양에 탄소원으로 사용하는 연구가 진행되고 있으며, 이의 성공은 바이오디젤의 상업화에 큰 영향을 미칠 것으로 예상된다.

KR 10-2011-0082052

이에 본 발명자는 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 대장균에 과발현하여 중성 산도에서 글루타메이트가 GABA로 전환될 수 있도록 함으로써 글리세롤을 GABA로 전환하는 방법을 개발하였다.

본 발명은 중성 산도에서도 활성을 갖는 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 이용하여, 글리세롤을 기질로 하여 감마-아미노부틸산(GABA)을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명을 통해 바이오디젤 생산에서 부산물로 생산되는 글리세롤을 고가의 GABA로 전환함으로써 경제적이고 친환경적인 감마-아미노부틸산의 제조가 가능하다. 또한 이는 바이오디젤 산업의 전반적인 경제성 향상을 도모하여 바이오디젤의 가격 경쟁력을 향상시킬 수 있다.

도 1은 글리세롤 배양액에서 각 균주를 배양하며 그 생장곡선을 나타낸 것이다.
도 2는 글리세롤 배양액에서 각 균주를 배양하며 그 배양액에 포함된 GABA를 Gabase로 분석한 결과에 관한 것이다.

본 발명은 글리세롤을 기질로 하여 감마-아미노부틸산(GABA)을 생물전환공정으로 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 중성의 산도에서도 활성을 보이는 글루타메이트 디카르복실라제 변이체를 사용함으로써, 글리세롤에서 글루타메이트로의 전환과 글루타메이트에서 GABA를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 글루타메이트 디카복실라아제(GAD)는 피리독살 5-포스페이트 (PLP)-의존 세포 내 효소로서, L-글루타메이트의 γ-아미노부티레이트로의 비가역적 탈카르복시화 반응을 촉매한다. GAD는 GABA 생성에 관여함으로써 척추동물 중추신경계에서 중요한 역할을 한다. GAD는 신경전달물질 합성에 관여하는 효소 중에서 독특하다고 여겨지며, 이는 GAD의 기질과 생성물이 모두 신경전달물질이고 서로 반대되는 작용을 하기 때문이다. 신경계에서, L-글루타메이트는 흥분제 GABA는 억제제의 작용을 하며, 각각은 글루타민 생성 시냅스 및 GABA 생성 시냅스에 관여한다.

본 발명의 글루타메이트 디카복실라아제는 이에 제한되는 것은 아니나, 대장균, 유산균, 바실러스 등 미생물로부터 유래할 수 있다. 미생물로부터 분리 및 정제된(isolated and purified) 글루타메이트 디카르복실라아제를 이용하여 생물전환공정(bioconversion)에 통하여 GABA를 생산할 수 있다.

상기 미생물로부터 분리 및 정제된 글루타메이트 디카르복실라아제는 미생물이 원래부터 가지고 있는 글루타메이트 디카르복실라아제 단백질을 정제한 경우뿐만 아니라, 상기 미생물이 가지고 있는 글루타메이트 디카르복실라아제 유전자를 적합한 숙주세포에서 클로닝 및 발현시킨 다음 이 숙주세포로부터 글루타메이트 디카르복실라아제 단백질을 정제한 경우까지 포함하는 것이다.

본 발명의 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 중성의 산도에서 활성을 갖는 것이면 이에 제한되는 것은 아니나, 글루타메이트 디카르복실라아제 β의 89번 글루타메이트를 글루타민으로, 카르복시 말단의 15개 아미노산이 제거된 복합 변이체(서열 번호 1), 89번 글루타메이트가 글루타민으로, 465번 히스티딘이 알라닌으로 치환된 복합 변이체(서열 번호 2), 89번 글루타메이트가 글루타민으로, 카르복시 말단의 2개 아미노산이 제거된 복합 변이체(서열 번호3)일 수 있다.

본 발명은 상기 변이체를 대장균 내에 도입하고, 이 대장균을 글리세롤 배양액에서 배양하는 동시에 변이 글루타메이트 디카르복실라아제를 과발현하여 GABA가 생산되도록 하는 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 글리세롤에서 GABA 의 생산

대장균 유래의 글루타메이트 디카르복실라아제(WT)와 89번 글루타메이트 및 카르복시 말단 15개 아미노산 서열에 변형이 있는 변이체 (E89Q/ΔC)를 pET-28b에 클로닝하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하였다. 이와 함께 플라스미드를 갖고 있지 않은 대장균 BL21(DE3)를 대조군으로 사용하여 M9 최소배지에서 배양하였다. 이 때 탄소원으로는 0.4% 글리세롤을 사용하였고, 질소원으로는 황산 암모니움 염을 사용하였다. 각 대장균이 생장하여 mid-log phase에 이른 후 0.1 mM IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 이용하여 12 시간 동안 단백질의 과발현을 유도하였다. 단백질 과발현의 영향을 정확히 측정하기 위하여 12 시간 동안 과발현을 유도한 후 세포들을 회수하여 다시 0.1 mM IPTG가 포함된 동일 배지에 현탁하고 2차 배양하며 세포 생장을 관찰하였다(도 1).

그 결과 중성 산도에서 활성을 지니는 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체(E89Q/ΔC)를 과발현한 대장균이 자연형 글루타메이트 디카르복실라아제(WT)를 과발현 대장균에 비해 현저히 낮은 생장율을 나타내었다. 이는 세포내로 유입된 글리세롤이 글루타메이트로 전환된 후 중성 산도에서 활성을 지니는 E89Q/ΔC에 의해 GABA로 전환됨에 따라 세포 내 글루타메이트 농도가 저하되어 세포 생장에 부정적 영향을 미치기 때문이다. 이는 최소 배지에 글루타메이트를 50 mM 첨가할 경우 자연형과 E89Q/ΔC을 과발현하는 대장균들의 생장속도가 비슷함을 볼 때 더욱 명확해진다.

2차 배양 후 배지를 회수하여 분석한 결과 E89Q/ΔC를 과발현하는 대장균은 글루타메이트의 추가 없이도 GABA를 생산하여 배지로 배출하고 있음을 볼 수 있다(도 2). GABA의 합성은 TLC와 gabase 분석을 통해 다원적으로 검사하였다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 글루타메이트 디카르복실라이제 변이체를 이용하여, 글리세롤을 기질로 하여 감마-아미노부틸산(GABA)을 제조하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 글루타메이트 디카르복실라이제 변이체는 중성의 산도에서 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 감마-아미노부틸산(GABA)을 제조하는 방법.
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서, 상기 글루타메이트 디카르복실라이제 변이체는 대장균, 유산균 또는 바실러스인 유래인 것을 특징으로 하는 감마-아미노부틸산(GABA)을 제조하는 방법.

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