TW201439324A - 導入了二氧化碳固定循環之微生物 - Google Patents

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Abstract

一種乙醯輔酶A生產微生物，係對於下列(a)、(b)、(c)、(d)及(e)中任一者皆無之微生物賦予選自於由蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中之至少1者之酵素活性而獲得：(a)具有由丙二醯輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應的碳酸固定循環;(b)具有由乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應的碳酸固定循環;(c)具有由巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯輔酶A或戊烯二醯輔酶A(glutaconyl CoA)之酵素反應的碳酸固定循環;(d)具有由CO2至甲酸之酵素反應的碳酸固定循環;(e)選自於由蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶構成之群組中之至少1者。

Description

導入了二氧化碳固定循環之微生物
本發明係關於導入了二氧化碳固定循環的微生物、及利用此微生物的物質生產方法。
乙醯輔酶A係在微生物之代謝路徑中極重要的一種中間產物。有各式各樣的代謝產物係經由乙醯輔酶A而生產。如此之經由乙醯輔酶A而生成的物質，例如已知有：L-麩胺酸、L-麩醯胺酸、L-脯胺酸、L-精胺酸、L-白胺酸、L-異白胺酸等胺基酸類；乙酸、丙酸、丁酸、己酸、檸檬酸、3-羥基丁酸、3-羥基異丁酸、3-胺基異丁酸、2-羥基異丁酸、甲基丙烯酸及聚-3-羥基丁酸等有機酸類；異丙醇、乙醇、丁醇等醇類；此外，尚有丙酮、聚麩胺酸等。
乙醯輔酶A在許多微生物係以葡萄糖等糖作為碳源而生產。糖首先經由Embden-Meyerhof路徑、Entner-Doudoroff路徑、五碳糖磷酸路徑等稱為解糖系的代謝路徑變換為丙酮酸。之後，由於丙酮酸去羧酶(pyruvic acid decarboxylase)或丙酮酸-甲酸裂解酶(pyruvic acid-formic acid lyase)等的作用變換為乙醯輔酶A。此時，會產出二氧化碳或甲酸作為副產物，故來自糖的碳並非全部固定成為乙醯輔酶A。已有一些研究係探討將二氧化碳予以再固定而用以增加乙醯輔酶A之產量。
於微生物體內，已知有幾種固定二氧化碳成為碳源的路徑(Applied and Environmental Microbiology,2011；77(6)：1925-1936)。具體而言，可列舉：卡爾文文生循環(Calvin-Benson cycle)、還原性TCA循環、Wood-Ljungdahl 路徑、3-羥基丙酸循環、4-羥基丁酸循環等。Calvin-Benson循環存在於植物或光合成細菌，係由約12種的酵素組成的CO2固定循環，由核酮糖-1,5-雙磷酸羧化酶(RubisCO)固定CO2，且最終生產甘油醛3-磷酸。還原性TCA循環，係在綠色硫細菌等嫌氣性菌或微好氣性菌觀察到的循環，係由11種酵素組成，特徵為以鐵氧化還原蛋白(ferredoxin)作為輔酶之CO2固定酵素(乙醯輔酶A羧化酶、2-側氧基戊二酸合酶(2-oxo-glutaric acid synthase)，利用與通常之TCA循環為反方向的反應，從CO2產生丙酮酸。Wood-Ljungdahl路徑係在乙酸產生菌等嫌氣性微生物觀察到的路徑，由9種酵素組成，利用甲酸去氫酶或CO去氫酶等還原CO2或輔酶上的甲酸，最終變換為乙醯輔酶A。3-羥基丙酸循環係在綠曲撓菌(Chloroflexus)屬菌等觀察到的循環，由13種酵素組成，利用乙醯輔酶A(丙醯基輔酶A)羧化酶的作用固定CO2，並經由丙二醯基輔酶A(malonyl輔酶A)等而產生乙醯輔酶A。4-羥基丁酸循環，係存在於古細菌等之路徑，利用丙酮酸合酶(pyruvic acid synthase)、乙醯輔酶A(丙醯基輔酶A)羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvic acid carboxylase)的反應固定CO2，並經由4-羥基丁醯基輔酶A等而生產乙醯輔酶A。
有人報告一些點子，嘗試將固定二氧化碳之路徑導入有用化合物生產微生物而欲生產有用物質。例國際公開第2009/094485號小冊或國際公開第2010/071697號小冊，揭示以下提議：使用導入有類似於乙酸菌之Wood-Ljungdahl路徑的路徑的微生物從二氧化碳生產乙醯輔酶A。又，國際公開第2009/046929號小冊已揭示：使用導入有氫化酶(hydrogenase)與四氫葉酸裂解酶的微生物嘗試從二氧化碳生產乳酸。又，國際公開第2011/099006號小冊中，提出：經由對於乙醯輔酶A上之碳酸固定反應或丙二醯基輔酶A之還原反應並固定CO2之循環。德國專利申請案公開第102007059248號說明書提出：利用類似於4-羥基丁酸循環之路徑生產乙醯 輔酶A。
但是公知之碳酸固定循環，從固定CO2並生產來自於乙醯輔酶A之有用化學品之觀點，未能稱得上效率一定是良好。比如，卡爾文文生循環在自然界之碳酸固定循環最有名，但是擔任碳酸固定的RubisCO反應速度慢，而且會觀察到氧化性分解此類的副反應，未能稱得上是效率好的酵素(Journal of Bioscience and Bioengineering,2002；94(6)：497-505)。Wood-Ljungdahl路徑、國際公開第2009/094485號揭示之路徑、國際公開第2010/071697號揭示之路徑、及國際公開第2009/046929號揭示之路徑，包括將CO2還原為CO或甲酸的路徑，但是催化如此之強還原反應之酵素時常僅能於還原性環境下作用，此還原反應在通常條件下係難達成，且該酵素不易導入絕對嫌氣性的微生物以外的微生物。還原性TCA循環，於利用丙酮酸合酶之還原反應及利用2-側氧基戊二酸合酶之還原反應，須要將鐵氧化還原蛋白作為電子受體的強大還原力，反應不易進行。4-羥基丁酸循環、3-羥基丙酸循環、國際公開第2009/046929號記載之路徑、及國際公開第2011/099006號記載之路徑，係利用琥珀醯輔酶A之還原或丙二醯輔酶A之還原此種羧酸或其(硫)酯之還原反應，但如此的反應就酵素反應而言一般係為困難，希望作為發酵路徑儘可能避免較理想(Nature,2008；451：86-89、Nature Chemical Biolory,2011；7：445-452)。4-羥基丁酸循環，係經由4-羥基丁醯輔酶A之脫水、或3-羥基丙酸之脫水此種脫水反應，但是如此的反應若在水中時常會有出現與逆反應(水合)競爭的問題。4-羥基丁酸循環、3-羥基丙酸循環、及還原性TCA循環，係利用丙二醯輔酶A合成酵素及丙酮酸合成酵素的作用，將已生產之乙醯輔酶A變換為循環內的其他物質，故從乙醯輔酶A之生產的觀點不能算是有效率。
再者，當將上述循環導入到微生物而嘗試生產某種物質的情形，須考慮構成循環之酵素之數目、或待重新賦予的酵素活性的數目。構成循環之 酵素或賦予酵素之數目愈多，循環之建構及控制變得愈難，而對於微生物的負擔也增大。例如若欲將Wood-Ljungdahl路徑對於大腸菌導入，至少須導入9種基因，要以能控制如此範圍的多數基因的態樣導入並建構物質生產路徑，在現實上可說是極困難的作業。將以少數目的酵素構成之循環以少數目之基因導入來建構，相較來說於建構循環方面、在與微生物原本擁有的物質生產路徑組合方面，明顯上都較有利。
因此為了固定CO2而變換為乙醯輔酶A，宜為：1)構成循環之各酵素之活性足夠高、2)不具含有消耗乙醯輔酶A之酵素的循環、3)重新賦予之酵素之數少，循環簡單較佳。但是至今為止報告的從CO2生產乙醯輔酶A的循環中，不存在滿足1)~3)所有條件的循環，都欠缺實現性。就依據而言，至今為止尚無對於工業上利用之微生物實際上賦予如上述各文獻提案的酵素活性並建構碳酸固定循環，將CO2變換為乙醯輔酶A，進一步將乙醯基輔酶A變換為有用化合物的例子。
本發明係基於上述狀況而生。
第1發明之課題為：提供對於用以利用二氧化碳而有效率地生成乙醯輔酶A為有用的微生物。又，第1發明之課題為：使用前述微生物而以高產率製造乙醯輔酶A及來自乙醯輔酶A之有用代謝產物的方法。
第2發明之課題為：提供能經乙醯輔酶A將二氧化碳以良好效率變換為有用代謝產物的麴菌屬(Aspergillus)菌或貪銅菌(Cupriavidus)屬菌的微生物。又，第2發明之課題為：提供使用前述微生物之有用代謝產物之製造方法。
解決前述課題之第1發明如下。
[A1]一種乙醯輔酶A生產微生物，係對於下列(a)、(b)、(c)、(d)及(e) 皆無之微生物，下列(a)、(b)、(c)及(d)皆不賦予或即使賦予下列(a)、(b)、(c)及(d)中之1者以上也不使其發揮作用，而是藉由賦予選自於由蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中之至少1者之酵素活性而獲得之具有乙醯輔酶A生產循環之微生物；其選自於由丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、蘋果酸去氫酶、蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶、羥基丙酮酸異構酶、羥基丙酮酸還原酶、甘油酸2-激酶、甘油酸3-激酶、磷酸甘油酸變位酶及烯醇酶構成之群組中之至少1者之酵素活性被強化及/或選自於由蘋果酸酵素及富馬酸還原酶構成之群組中之至少1者之酵素活性失活或減活：(a)具有由丙二醯輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應的碳酸固定循環；(b)具有由乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應的碳酸固定循環；(c)具有由巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯輔酶A或戊烯二醯輔酶A之酵素反應的碳酸固定循環；(d)具有由CO2至甲酸之酵素反應的碳酸固定循環；(e)選自於由蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶構成之群組中之至少1者。
[A2]一種乙醯輔酶A生產微生物，係對於下列(a)、(b)、(c)、(d)及(e)皆無之微生物，下列(a)、(b)、(c)及(d)皆不賦予或即使賦予下列(a)、(b)、(c)及(d)中之1者以上也不使其發揮作用，而是藉由賦予選自於由蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中之至少1者之酵素活性而獲得之具有乙醯輔酶A生產循環之微生物；其選自於由丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、蘋果酸去氫酶、蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶、羥基丙酮酸異構酶、羥基丙酮酸還原酶、甘油酸2-激酶、甘油酸3-激酶、磷酸甘油酸變位酶及 烯醇酶構成之群組中之至少1者之酵素活性被強化：(a)具有由丙二醯輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應的碳酸固定循環；(b)具有由乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應的碳酸固定循環；(c)具有由巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯輔酶A或戊烯二醯輔酶A之酵素反應的碳酸固定循環；(d)具有由CO2至甲酸之酵素反應的碳酸固定循環；(e)選自於由蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶構成之群組中之至少1者。
[A3]如[A1]或[A2]之乙醯輔酶A生產微生物，其係被賦予了蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶之酵素活性。
[A4]如[A1]~[A3]中任一項之乙醯輔酶A生產微生物，其中，2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶及甘油酸3-激酶之酵素活性經強化。
[A5]如[A1]~[A4]中任一項之乙醯輔酶A生產微生物，其具有乙醯輔酶A生產循環，該乙醯輔酶A生產循環係將磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸變換為草醯乙酸，將草醯乙酸利用蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶及乙醛酸醛連接酶變換為2-羥基-3-側氧基丙酸，將2-羥基-3-側氧基丙酸變換為2-磷酸甘油酸，將2-磷酸甘油酸變換為磷酸烯醇丙酮酸。
[A6]如[A1]~[A5]中任一項之乙醯輔酶A生產微生物，具有含下列(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)及(m)之乙醯輔酶A生產循環：(f)選自於由丙酮酸激酶及丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、及磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶構成之群組中之至少1者；(g)蘋果酸去氫酶；(h)蘋果酸硫激酶；(i)蘋果醯輔酶A裂解酶；(j)乙醛酸醛連接酶；(k)選自於由2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶、羥基丙酮酸異構酶及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中之至少1者； (l)選自於由甘油酸2-激酶、甘油酸3-激酶及磷酸甘油酸變位酶構成之群組中之至少1者；(m)烯醇酶。
[A7]如[A1]~[A6]中任一項之乙醯輔酶A生產微生物，其中，前述(a)、(b)、(c)、(d)及(e)皆無之微生物係屬於腸內細菌科之微生物或屬於棒桿型菌之微生物。
[A8]如[A1]~[A7]中任一者之乙醯輔酶A生產微生物，其中，前述(a)、(b)、(c)、(d)及(e)皆無之微生物係屬於埃希氏菌屬細菌或泛菌屬細菌之腸內細菌科之微生物、或屬於棒桿菌屬細菌之棒桿型菌之微生物。
[A9]一種乙醯輔酶A生產方法，包含以下步驟：培養步驟，使如[A1]~[A8]中任一項之乙醯輔酶A生產微生物、與碳源材料接觸而進行培養；及回收步驟，回收利用前述接觸獲得之目的生產物。
[A10]如[A9]之乙醯輔酶A生產方法，更包含供給步驟，該供給步驟係將選自於由碳酸離子、碳酸氫離子、二氧化碳氣體及還原劑構成之群組中之至少1者對於用於培養之培養基供給。
[A11]如[A9]或[A10]之乙醯輔酶A生產方法，更包含氣體供給步驟，該氣體供給步驟係回收由於培養產生之含二氧化碳之氣體並將該氣體對於用於培養之培養基供給。
[A12]一種將乙醯輔酶A作為中間產物之代謝產物之生產方法，包含以下步驟：培養步驟，使如[A1]~[A8]中任一項之乙醯輔酶A生產微生物、與碳源材料接觸而進行培養；及回收步驟，回收利用前述接觸獲得之將乙醯輔酶A作為中間產物之代謝產物。
[A13]如[A12]之將乙醯輔酶A作為中間產物之代謝產物之生產方法，更包含供給步驟，該供給步驟係將選自於由碳酸離子、碳酸氫離子、二氧化碳氣體及還原劑構成之群組中之至少1者對於用於培養之培養基供給。
[A14]如[A12]或[A13]之將乙醯輔酶A作為中間產物之代謝產物之生產方法，更包含氣體供給步驟，該氣體供給步驟係回收由於培養產生之含二氧化碳之氣體，並將該氣體對於用於培養之培養基供給。
[A15]如[A12]~[A14]中任一項之將乙醯輔酶A作為中間產物之代謝產物之生產方法，其中，該將乙醯輔酶A作為中間產物之代謝產物，係異丙醇、丙酮、或麩胺酸。
[A16]一種乙醯輔酶A生產方法，包含以下步驟：培養步驟，培養對於下列(a)、(b)、(c)、(d)及(e)皆無之微生物，下列(a)、(b)、(c)及(d)皆不賦予、或即使賦予也不使其發揮作用，而是藉由賦予選自於由蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中之至少1者之酵素活性而獲得之具有乙醯輔酶A生產循環之乙醯輔酶A生產微生物；及供給步驟，將選自於由全部供給量為150mmol/L以上之碳酸離子或碳酸氫離子、平均氣泡徑為100μm以上之二氧化碳氣體、及全部供給量為0.01g/L以上50g/L以下之亞硫酸鈉構成之群組中之至少1者對於用於培養之培養基供給；(a)具有由丙二醯輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應的碳酸固定循環；(b)具有由乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應的碳酸固定循環；(c)具有由巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯輔酶A或戊烯二醯輔酶A之酵素反應的碳酸固定循環；(d)具有由CO2至甲酸之酵素反應的碳酸固定循環；(e)選自於由蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶構成之群組中之至少1者。
[A17]如[A16]之乙醯輔酶A生產方法，更包含氣體供給步驟，該氣體供給步驟係回收由於培養產生之含二氧化碳之氣體，並將該氣體對於用於培養之培養基供給。
[A18]如[A16]或[A17]之乙醯輔酶A生產方法，其中，前述乙醯輔酶A生產微生物具有乙醯輔酶A生產循環，該乙醯輔酶A生產循環係將磷酸烯 醇丙酮酸或丙酮酸變換為草醯乙酸，將草醯乙酸利用蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶及乙醛酸醛連接酶變換為2-羥基-3-側氧基丙酸，將2-羥基-3-側氧基丙酸變換為2-磷酸甘油酸，將2-磷酸甘油酸變換為磷酸烯醇丙酮酸。
[A19]如[A16]~[A18]中任一項之乙醯輔酶A生產方法，其中，前述乙醯輔酶A生產微生物係具有含下列(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)及(m)之乙醯輔酶A生產循環的乙醯輔酶A生產微生物；(f)選自於由丙酮酸激酶及丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、與磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶構成之群組中之至少1者；(g)蘋果酸去氫酶；(h)蘋果酸硫激酶；(i)蘋果醯輔酶A裂解酶；(j)乙醛酸醛連接酶；(k)選自於由2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶、羥基丙酮酸異構酶及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中之至少1者；(l)選自於由甘油酸2-激酶、甘油酸3-激酶及磷酸甘油酸變位酶構成之群組中之至少1者；(m)烯醇酶。
[A20]如[A16]~[A19]中任一項之乙醯輔酶A生產方法，其中，前述(a)、(b)、(c)、(d)及(e)皆無之微生物係屬於腸內細菌科之微生物或屬於棒桿型菌之微生物。
[A21]如[A16]~[A20]中任一項之乙醯輔酶A生產方法，其中，前述(a)、(b)、(c)、(d)及(e)皆無之微生物，係屬於埃希氏菌屬細菌或泛菌屬細菌之腸內細菌科之微生物、或屬於棒桿菌屬細菌之棒桿型菌之微生物。
[A22]一種異丙醇生產方法，係乙醯輔酶A生產微生物將利用如[A16]~[A21]中任一者之乙醯輔酶A生產方法生產之乙醯輔酶A作為中間產物而生產異丙醇。
[A23]一種丙酮生產方法，係乙醯輔酶A生產微生物將利用如[A16]~[A21]中任一者之乙醯輔酶A生產方法生產之乙醯輔酶A作為中間產 物而生產丙酮。
[A24]一種麩胺酸生產方法，係乙醯輔酶A生產微生物將利用如[A16]~[A21]中任一者之乙醯輔酶A生產方法生產之乙醯輔酶A作為中間產物而生產麩胺酸。
[A25]一種異丙醇生產方法，包含以下步驟：培養步驟，使如[A1]~[A8]中任一項之乙醯輔酶A生產微生物、與碳源材料接觸而進行培養；及回收步驟，回收利用前述接觸獲得之異丙醇。
[A26]一種丙酮生產方法，包含以下步驟：培養步驟，使如[A1]~[A8]中任一項之乙醯輔酶A生產微生物、與碳源材料接觸而進行培養；及回收步驟，回收利用前述接觸獲得之丙酮。
[A27]一種麩胺酸生產方法，包含以下步驟：培養步驟，使如[A1]~[A8]中任一項之乙醯輔酶A生產微生物、與碳源材料接觸而進行培養；及回收步驟，回收利用前述接觸獲得之麩胺酸。
解決前述課題之第2發明如下。
[B1]一種麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物，係對於下列(a2)、(b2)、(c2)、(d2)及(e2)中任一者皆無之微生物，下列(a2)、(b2)、(c2)及(d2)均不賦予、或即使賦予下列(a2)、(b2)、(c2)及(d2)中之1者以上也不使其發揮作用，而是藉由賦予選自於由蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶構成之群組中之至少1者之酵素活性而獲得：(a2)具有由丙二醯輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應的碳酸固定循環；(b2)具有由乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應的碳酸固定循環；(c2)具有由巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯輔酶A或戊烯二醯輔酶A之酵素反應的碳酸固定循環；(d2)具有由CO2至甲酸之酵素反應的碳酸固定循環； (e2)選自於由蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶構成之群組中之至少1者。
[B2]如[B1]之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物，具有乙醯輔酶A之生產能力。
[B3]如[B1]或[B2]之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物，係藉由更賦予選自於由乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中之至少1者之酵素活性而獲得。
[B4]如[B1]~[B3]中任一項之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物，具有乙醯輔酶A生產循環，該乙醯輔酶A生產循環係將磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸變換為草醯乙酸，將草醯乙酸利用蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶及乙醛酸醛連接酶變換為2-羥基-3-側氧基丙酸，將2-羥基-3-側氧基丙酸變換為2-磷酸甘油酸，將2-磷酸甘油酸變換為磷酸烯醇丙酮酸。
[B5]如[B1]~[B4]中任一項之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物，具有含下列(f2)、(g2)、(h2)、(i2)、(j2)、(k2)、(l2)及(m2)之乙醯輔酶A生產循環：(f2)選自於由丙酮酸激酶及丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、及磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶構成之群組中之至少1者；(g2)蘋果酸去氫酶；(h2)蘋果酸硫激酶；(i2)蘋果醯輔酶A裂解酶；(j2)乙醛酸醛連接酶；(k2)選自於由2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶、羥基丙酮酸異構酶及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中之至少1者；(l2)選自於由甘油酸2-激酶、甘油酸3-激酶及磷酸甘油酸變位酶構成之群組中之至少1者；(m2)烯醇酶。
[B6]如[B1]~[B5]中任一者之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物，具有包含以下酵素反應的路徑：選自於由下列(a3)及(b3)構成之群組中之至少1者之酵素反應；下列(c3)、(d3)、(e3)、(f3)及(g3)的酵素反應；選自於由下列(h3)的酵素反應、下列(i3)、(j3)、(k3)及(n3)的酵素反應、 及下列(i3)、(j3)、(l3)、(m3)及(n3)的酵素反應構成之群組中之至少1者：(a3)由磷酸烯醇丙酮酸至草醯乙酸之酵素反應；(b3)由丙酮酸至草醯乙酸之酵素反應；(c3)由草醯乙酸至蘋果酸之酵素反應；(d3)由蘋果酸至蘋果醯輔酶A之酵素反應；(e3)由蘋果醯輔酶A至乙醛酸及乙醯輔酶A之酵素反應；(f3)由乙醛酸至甘胺酸之酵素反應；(g3)由甘胺酸至絲胺酸之酵素反應；(h3)由絲胺酸至丙酮酸之酵素反應；(i3)由絲胺酸至3-羥基丙酮酸之酵素反應；(j3)由3-羥基丙酮酸至甘油酸之酵素反應；(k3)由甘油酸至2-磷酸甘油酸之酵素反應；(l3)由甘油酸至3-磷酸甘油酸之酵素反應；(m3)由3-磷酸甘油酸至2-磷酸甘油酸之酵素反應；(n3)由2-磷酸甘油酸至磷酸烯醇丙酮酸之酵素反應。
[B7]如[B1]~[B6]中任一項之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物，具有：選自於由下列(a4)及(b4)構成之群組中之至少1者的酵素；下列(c4)、(d4)、(e4)、(f4)及(g4)的酵素；選自於由下列(h4)的酵素、下列(i4)、(j4)、(k4)及(n4)的酵素、及下列(i4)、(j4)、(l4)、(m4)及(n4)的酵素構成之群組中之至少1者：(a4)選自於由丙酮酸激酶及丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、及磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶構成之群組中之至少1者；(b4)丙酮酸羧化酶；(c4)蘋果酸去氫酶；(d4)蘋果酸硫激酶；(e4)蘋果醯輔酶A裂解酶；(f4)甘胺酸轉胺酶；(g4)甘胺酸開裂系及絲胺酸羥基甲基轉移酶；(h4)絲胺酸脫水酶；(i4)絲胺酸轉胺酶； (j4)羥基丙酮酸還原酶；(k4)甘油酸2-激酶；(l4)甘油酸3-激酶；(m4)磷酸甘油酸變位酶；(n4)烯醇酶。
[B8]如[B1]~[B7]中任一項之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物，其中，該(a2)、(b2)、(c2)、(d2)及(e2)中任一者皆無之微生物係黑麴黴、土麴黴或鉤蟲貪銅菌。
[B9]一種乙醯輔酶A生產方法，包含以下步驟：培養步驟，使如[B1]~[B8]中任一者之微生物與碳源材料接觸而進行培養；回收步驟，回收利用該接觸獲得之目的生產物。
[B10]如[B9]之乙醯輔酶A生產方法，更包含供給步驟，該供給步驟係將選自於由碳酸離子、碳酸氫離子、二氧化碳氣體及還原劑構成之群組中之至少1者對於培養使用之培養基供給。
[B11]如[B9]或[B10]之乙醯輔酶A生產方法，更包含氣體供給步驟，該氣體供給步驟係回收由於培養產生之含二氧化碳之氣體，並將該氣體對於用於培養之培養基供給。
[B12]一種檸檬酸生產方法，包含使用如[B1]~[B8]中任一項之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物由碳源材料生產檸檬酸。
[B13]一種伊康酸生產方法，包含使用如[B1]~[B8]中任一項之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物由碳源材料生產伊康酸。
[B14]一種(聚)3-羥基丁酸生產方法，包含使用如[B1]~[B8]中任一項之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物由碳源材料生產(聚)3-羥基丁酸。
依第1發明，提供對於利用二氧化碳以有效率地生成乙醯輔酶A為有用的微生物。又，依第1發明，提供使用前述微生物而以高產率地製造乙醯輔酶A及來自乙醯輔酶A之有用代謝產物的方法。
依第2發明，提供能經由乙醯輔酶A而以良好效率將二氧化碳變換為有用代謝產物之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌之微生物。又，依第2發明，提供使用前述微生物之有用代謝產物之製造方法。
圖1顯示說明第1發明之二氧化碳固定循環(亦即乙醯輔酶A生產循環)之概要之循環圖。
圖2顯示說明第2發明之甘胺酸路徑之概要之路徑圖。
以下針對本發明之實施形態說明。該等說明及實施例係例示本發明，並非限制本發明之範圍。
本說明書中，用語「步驟」不僅指獨立的步驟，即使無法與其他步驟明確區別，只要能達成該步驟所期待的目的即包括在本用語。
本說明書中，「~」代表的數值範圍，在「~」前後記載之數值各代表包括最小值及最大值之範圍。
本發明中，提及組成物中之各成分之量時，當於組成物中各成分所該當的物質有多數存在時，若無特別指明，則意指組成物中存在之該多數物質之合計量。
<<第1發明>>
第1發明之乙醯輔酶A生產微生物，係對於下列(a)、(b)、(c)、(d)及(e)任一者皆無的微生物，下列(a)、(b)、(c)及(d)中任一者皆不賦予或即使賦予下列(a)、(b)、(c)及(d)中之1者以上但不使其作用發揮，而藉由賦予選自於由蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中之至少1者之酵素活性而獲得之有乙醯輔酶A生產循環之微生物，其選自於由丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、蘋果酸去氫 酶、蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶、羥基丙酮酸異構酶、羥基丙酮酸還原酶、甘油酸2-激酶、甘油酸3-激酶、磷酸甘油酸變位酶及烯醇酶構成之群組中之至少1者之酵素活性經強化，及/或選自於蘋果酸酵素及富馬酸還原酶構成之群組中之至少1者之酵素活性經失活或減活。
(a)具有由丙二醯輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應之碳酸固定循環。
(b)具有由乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應之碳酸固定循環。
(c)具有由巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯輔酶A或戊烯二醯輔酶A之酵素反應之碳酸固定循環。
(d)具有由CO2至甲酸之酵素反應之碳酸固定循環。
(e)選自於由蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶構成之群組中之至少1者。
第1發明之微生物，藉由賦予了給定的酵素活性，具有能將代謝產生之CO2及從外部供給的CO2變換為乙醯輔酶A之二氧化碳固定循環，再者，藉由強化酵素活性，及/或給定酵素活性失活或減活，能將CO2有效率地變換為乙醯輔酶A。
第1發明之乙醯輔酶A生產方法之一態樣，係使用第1發明之微生物而能將CO2以良好效率變換為乙醯輔酶A之乙醯輔酶A生產方法。
第1發明之乙醯輔酶A生產方法之另一態樣，包括以下步驟：培養步驟，培養對於下列(a)、(b)、(c)、(d)及(e)任一者皆無的微生物下列(a)、(b)、(c)及(d)中任一者皆不賦予或即使賦予下列(a)、(b)、(c)及(d)中之1者以上但不使其作用發揮，而藉由賦予選自於由蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中之至少1者之酵素活性而獲得之具乙醯輔酶A生產循環之乙醯輔酶A生產微生物；及 供給步驟，對於用於培養的培養基供給選自於由總供給量為150mmol/L以上之碳酸離子或碳酸氫離子、平均氣泡徑100μm以上之二氧化碳氣體、及總供給量為0.01g/L以上50g/L以下之亞硫酸鈉構成之群組中之至少1者。
依上述另一態樣，藉由使用已建構二氧化碳固定循環之微生物，對於培養基供給選自於由碳酸離子、碳酸氫離子、二氧化碳氣體、及亞硫酸鈉構成之群組中之至少1者，能有效率地生產乙醯輔酶A。
藉由利用第1發明之微生物或生產方法、或利用對於該微生物進一步賦予給定的酵素活性，能以良好效率生產乙醯輔酶A及來自乙醯輔酶A之有用代謝產物(例如：異丙醇、乙醇、丙酮、檸檬酸、伊康酸、乙酸、丁酸、(聚)3-羥基丁酸、3-羥基異丁酸、3-胺基異丁酸、2-羥基異丁酸、甲基丙烯酸、(聚)麩胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、鳥胺酸、瓜胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸等)。
<<第2發明>>
第2發明之微生物，係對於下列(a2)、(b2)、(c2)、(d2)及(e2)任一者皆無的微生物，下列(a2)、(b2)、(c2)及(d2)任一者皆不賦予或即使賦予下列(a2)、(b2)、(c2)及(d2)中之1者以上但不使其發揮作用，而藉由賦予選自於由蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶構成之群組中之至少1者之酵素活性而獲得之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌之微生物。
(a2)具有由丙二醯輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應之碳酸固定循環。
(b2)具有由乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應之碳酸固定循環。
(c2)具有由巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯輔酶A或戊烯二醯輔酶A之酵素反應之碳酸固定循環。
(d2)具有由CO2至甲酸之酵素反應之碳酸固定循環。
(e2)選自於由蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶構成之群組中之至少1者。
第2發明之微生物具有包括給定酵素反應之路徑，所以能有效率地將糖代謝產生之CO2及從外部供給的CO2固定化。又，第2發明之微生物能以良好效率將CO2變換為乙醯輔酶A。
第2發明之乙醯輔酶A生產方法，係使用第2發明之微生物而能以良好效率將CO2變換為乙醯輔酶A之乙醯輔酶A生產方法。
藉由利用第2發明之微生物或生產方法、及藉由對於該微生物進一步賦予給定的酵素活性，能以良好效率生產乙醯輔酶A及來自乙醯輔酶A之有用代謝產物(例如：檸檬酸、伊康酸、(聚)3-羥基丁酸、脯胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、精胺酸、瓜胺酸、鳥胺酸、乙酸、(聚)3-羥基丁酸、伊康酸、檸檬酸、丁酸、聚麩胺酸、4-胺基丁酸、4-羥基丁酸、3-羥基異丁酸、2-羥基異丁酸、3-胺基異丁酸等)。
以下說明本說明書及本發明使用之用語之含意。
本說明書中，「循環」係指從路徑上之任意物質開始，經由路徑而變換為其他物質，最終變換為與開始為相同物質的路徑。
本說明書中，「路徑」係指在發酵槽內中的酵素反應及/或自發性化學反應引起的一連串反應。路徑可為循環、也可不是循環。因此碳酸固定路徑包括碳酸固定循環。
本發明中，「二氧化碳(CO2)固定」係指將糖代謝產生之CO2及/或從外部供給的CO2變換為有機化合物。CO2也可為HCO3 -。本說明書中，有時「二氧化碳(CO2)固定」稱為「碳酸固定」。
本發明中，「酵素」一詞，若未特別指明，也包括單獨時不顯示酵素活性的「因子」。
本發明中，酵素活性之「失活」，係指利用既存的各種測定系測定之酵 素之活性，當令失活前於微生物之酵素活性為100，為其1/10以下之狀態。
本發明中，酵素活性之「減低」，係指對於編碼為酵素之基因利用基因重組技術處理時，比起進行此處理前之狀態，酵素活性顯著下降的狀態。
本發明中，酵素活性之「強化」係廣泛指強化前在微生物之各種酵素活性於強化後提高。強化之方法，只要能提高微生物具有的各種酵素之活性即可，無特別限制，可列舉：利用從細胞外導入到細胞內的酵素基因所為強化、利用細胞內之酵素基因之表現增強所為之強化及該等之組合。
利用將酵素基因從細胞外導入到細胞內所為之強化，具體而言，可列舉：將編碼為比起寄主來源的酵素有更高活性之酵素的基因利用基因重組技術從寄主之細胞外導入到細胞內，利用導入的酵素基因而追加酵素活性或以該酵素活性取代寄主原本具有的酵素活性，及更進一步將寄主來源的酵素基因或從細胞外導入到細胞內的酵素基因的數目增加為2以上，及該等之組合。
利用微生物內之酵素基因之表現增強所為之強化，具體而言可列舉：將增強酵素基因之表現的鹼基序列從寄主微生物之微生物外導入到微生物內、將寄主微生物在基因體上擁有的酵素基因的啟動子強化以使該酵素基因之表現強化、將寄主微生物在基因體上擁有的酵素基因的啟動子取代成其他啟動子以強化酵素基因之表現，及該等之組合。
本發明中，酵素活性之「賦予」，廣泛指對於未找到對象酵素基因的微生物，將酵素基因從細胞外導入細胞內並提供成為對象之酵素之活性。賦予的方法，只要能夠對於微生物提供成為對象之酵素之活性即可，無特別限制，可利用基因重組技術進行。具體而言，可列舉：利用擁有酵素基因之質體進行轉形、將酵素基因導入基因體、及該等之組合。被導入的酵素基因，可對於寄主細胞為同種或異種任一者。
物質代謝之循環或路徑之酵素活性之「賦予」，係指賦予酵素活性的結 果，會功能性地建構物質代謝的循環或路徑，可依寄主選擇賦予的方法。
本說明書中，碳酸固定循環「即使賦予但仍不使其發揮作用」，係指對於未找到成為對象之酵素活性的微生物，雖從外部導入酵素基因並賦予成為對象之酵素活性，但是碳酸固定循環不作用。「碳酸固定循環不作用」，可利用使用經標定的CO2的試驗，而於循環中之代謝產物或來自此等代謝產物之物質中未檢測到來自CO2之標記、或未觀察到來自循環中之代謝產物之物質之對糖產率等上昇等的現象而間接掌握。
酵素活性之「強化」或「賦予」時使用之啟動子，只要能表現基因即可，不特別限制，可使用構成型啟動子或誘導型啟動子。
判斷該微生物是否有成為對象之酵素基因之方法，可參考例如KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes；http：//www.genome.jp/kegg/)或NCBI(National Center for Biotechnology Information；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)登載的各菌株之基因資訊。又，本發明僅使用KEGG或NCBI登載的各菌株之基因資訊。
為了將基因從細胞外導入細胞內時為必要之基因體DNA之製備、DNA之切斷及連結、轉形、PCR(polymerase chain reaction)、作為引子使用之寡核苷酸的設計、合成等的方法，可依該技術領域中具有通常知識者周知的通常方法實施。此等方法記載於Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等。
本發明中，「利用基因重組技術」等的用語，只要是藉由對於天生之基因之鹼基序列插入其他DNA、或將基因的某部分取代、缺失或該等之組合而造成鹼基序列上的改變即全部包括，例如也可為獲得產生突變之結果者。
本發明中，因子或酵素之活性失活的微生物，係指利用某方法而造成因子或酵素天生之活性受損的微生物。該等微生物可利用破壞例如編碼為 該因子或酵素之基因(基因破壞)而製作。
本發明中之基因破壞，係為了使得某基因之機能無法發揮，可列舉：在該基因插入其他DNA、使基因之某部分取代或缺失而於鹼基序列置入變異。基因破壞之結果，例如該基因無法轉錄為mRNA、蛋白質無法被轉譯、或由於被轉錄的mRNA不完整使得轉譯出來的蛋白質的胺基酸序列發生變異或缺失，不能發揮原本的機能。
基因破壞株之製作，只要能獲得不表現該酵素或蛋白質之破壞株的各方法都可採用。基因破壞的方法據報告有各種方法(自然育種、變異劑添加、紫外線照射、放射線照射、隨機突變之導入、轉位子之插入或轉移、部位專一性基因破壞)，但從能僅破壞某特定基因的觀點，宜以利用相同重組之基因破壞為較佳。利用相同重組之方法，記載於Journal of Bacteriology,1985；161(3)：1219-1221、Journal of Bacteriology,1995；177(6)：1511-1519、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2000；97(12)：6640-6645，該技術領域中之技術人士可利用該等方法及其應用輕易實施。
本發明中，「未(生來)具有」，係指在自然界本來不具有寄主微生物。
本發明中，「寄主」係指成為從外部導入1個或多個基因之對象的微生物。
本發明中，「寄主」係指從外部導入1個或多個基因的結果，能發揮此基因之機能的狀態。
本發明中，「寄主」也可具備有用代謝產物之生產路徑。本發明中之「有用代謝產物」，係醇、胺基酸、有機酸、萜烯類等在微生物之代謝路徑中的主要代謝產物的總稱。「寄主」無論原本是否有生產有用代謝產物的能力，只要是藉由使用某方法而具有能生產有用代謝產物之能力的微生物即可。
本說明書提及的酵素分類，係依國際生化學聯盟(International Union of Biochemistry；IUB)酵素委員會報告的分類，「酵素編號」係依據IUB酵素委員會報告的酵素編號。
關於第1發明，「將乙醯輔酶A作為中間產物之代謝產物」及「來自乙醯輔酶A之(有用)代謝產物」，係指在代謝路徑上經由乙醯輔酶A而生產之(有用)代謝產物的總稱。作為醇，例如：異丙醇、乙醇、丁醇。作為胺基酸，例如：L-麩胺酸、L-麩醯胺酸、L-精胺酸、L-鳥胺酸、L-瓜胺酸、L-白胺酸、L-異白胺酸、L-脯胺酸。作為有機酸，例如：3-羥基丁酸、聚-3-羥基丁酸、聚麩胺酸、3-羥基異丁酸、3-胺基異丁酸、2-羥基異丁酸、甲基丙烯酸、檸檬酸、乙酸、丙酸、丁酸、己酸、甲羥戊酸(mevalonic acid)等。萜烯類例如：異戊二烯、鯊烯、類固醇、類胡蘿蔔素等。此外，可列舉例如丙酮等。
關於第2發明，「將乙醯輔酶A作為中間產物之代謝產物」及「來自乙醯輔酶A之(有用)代謝產物」，係指於代謝路徑上經由乙醯輔酶A而生產之(有用)代謝產物之總稱。作為有機酸，例如：檸檬酸、伊康酸、(聚)-3-羥基丁酸。此外，可列舉3-羥基丁酸、聚麩胺酸、3-羥基異丁酸、3-胺基異丁酸、2-羥基異丁酸、甲基丙烯酸、乙酸、丙酸、丁酸、己酸、甲羥戊酸。
本發明之「乙醯輔酶A(之)生產」，係指於代謝路徑上將某物質變換為乙醯輔酶A。乙醯輔酶A為代謝中間產物，在代謝路徑上會迅速地變換成各式各樣的物質，所以，巨觀上乙醯輔酶A量不一定會增加，但可檢測來自於乙醯輔酶A之物質之CO2來源的標記、或來自於乙醯輔酶A之物質之對糖產率等上升等而間接的掌握效果。關於乙醯輔酶A變換為其他物質的要因有各式各樣存在(輔酶量、基質量、回饋抑制等所致之代謝變化等)，所以，乙醯輔酶A之生產量不一定會與所有乙醯輔酶A來源的物質的量成比例，但若強化從乙醯輔酶A生產特定物質之生產路徑、或從乙醯輔酶A生產特定物質之生產路徑原本就強的情形(例如後述生產麩胺酸之微生物的情形)，由於乙醯輔酶A到下游的變換效率不易受外在要因影響，所以該特定物質之生產效率可視為乙醯輔酶A生產效率的指標。
以下針對本發明更詳細說明。
<<乙醯輔酶A生產微生物>>
第1發明之乙醯輔酶A生產微生物，係對於前述(a)、(b)、(c)、(d)及(e)中之任一者皆無的微生物，前述(a)、(b)、(c)及(d)中任一者皆不賦予或即使賦予前述(a)、(b)、(c)及(d)中之1者以上也不使其發揮作用，而具有藉由賦予選自於由蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中之至少1者之酵素活性而得之乙醯輔酶A生產循環的微生物，其選自於丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、蘋果酸去氫酶、蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶、羥基丙酮酸異構酶、羥基丙酮酸還原酶、甘油酸2-激酶、甘油酸3-激酶、磷酸甘油酸變位酶及烯醇酶構成之群組中之至少1者之酵素活性被強化，及/或選自於蘋果酸酵素及富馬酸還原酶構成之群組中之至少1者之酵素活性被失活或減活。
第1發明之微生物，從乙醯輔酶A之生產效率之觀點，宜賦予蘋果酸硫激酶之酵素活性較佳，更佳為賦予了蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶的酵素活性，又更佳為賦予了蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶及乙醛酸醛連接酶的酵素活性，再更佳為賦予了蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶及/或羥基丙酮酸還原酶的酵素活性。
第1發明之微生物具有固定CO2而變換為乙醯輔酶A之簡潔而實用的乙醯輔酶A之生產循環。使用圖1詳細說明該循環。
圖1所示之乙醯輔酶A生產循環，顯示第1發明中之乙醯輔酶A生產循環之理想態樣(以下有時稱為「圖1之循環」)。
如圖1記載，乙醯輔酶A生產循環包括下列(f)~(m)。
(f)選自於由丙酮酸激酶(Pyk)及丙酮酸羧化酶(Pyc)、與磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Ppc)、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(Pck)構成之群組中之至少1者。
(g)蘋果酸去氫酶(Mdh)。
(h)蘋果酸硫激酶(Mtk)。
(i)蘋果醯輔酶A裂解酶(Mcl)。
(j)乙醛酸醛連接酶(Gcl)。
(k)選自於由2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶(GlxR)、羥基丙酮酸異構酶(Hyi)及羥基丙酮酸還原酶(YcdW)構成之群組中之至少1者。
(l)選自於由甘油酸2-激酶(GarK)、甘油酸3-激酶(GlxK)及磷酸甘油酸變位酶(Gpm)構成之群組中之至少1者。
(m)烯醇酶(Eno)。
本發明中，乙醯輔酶A生產循環宜為本質上僅包含前述(f)~(m)較佳，本發明之微生物擁有之乙醯輔酶A生產循環，宜為僅由前述(f)~(m)構成之乙醯輔酶A生產循環較佳。
上述酵素之中，Pyc、Ppc、Pck負責CO2的固定。CO2係利用Ppc、Pck、或Pyc之作用而與磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸結合並且變換為草醯乙酸。草醯乙酸，係利用Mdh的作用而變換為蘋果酸。蘋果酸係以Mtk的作用變換為蘋果醯輔酶A(蘋果酸輔酶A)。蘋果醯輔酶A(蘋果酸輔酶A)係以Mcl的作用變換為乙醯輔酶A與乙醛酸。乙醛酸係以Gcl的作用變換為2-羥基-3-側氧基丙酸。2-羥基-3-側氧基丙酸係以GlxR的作用變換為甘油酸，或以Hyi的作用變換為羥基丙酮酸後以YcdW的作用變換為甘油酸。甘油酸係以GarK的作用變換為2-磷酸甘油酸或以GlxK的作用變換為3-磷酸甘油酸後以Gpm的作用變換為2-磷酸甘油酸。2-磷酸甘油酸係以Eno的作用變換為磷酸烯醇丙酮酸。循環中包括Pyk及Pyc的情形，以Pyk的作用將磷酸烯醇丙酮酸變換為丙酮酸。
第2發明之微生物，係一種麴菌屬菌或貪銅菌屬菌之微生物，藉由對 於前述(a2)、(b2)、(c2)、(d2)及(e2)中之任一者皆無的微生物，不賦予前述(a2)、(b2)、(c2)及(d2)中之任一者或即使賦予前述(a2)、(b2)、(c2)及(d2)中之1者以上也不使其發揮作用，而賦予選自於由蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶構成之群組中之至少1者之酵素活性而獲得。前述(a2)、(b2)、(c2)、(d2)及(e2)各與第1發明中之前述(a)、(b)、(c)、(d)及(e)為同義。
作為第2發明之微生物之一理想態樣，說明具有經由甘胺酸之路徑(以下有時稱為「甘胺酸路徑」)的微生物。該微生物具有選自於由甘胺酸轉胺酶及甘胺酸開裂系構成之群組中之至少1者之酵素活性。使用圖2說明甘胺酸路徑。
如圖2記載，甘胺酸路徑，具有：選自於由下列(a3)及(b3)構成之群中之至少1個酵素反應，及下列(c3)、(d3)、(e3)、(f3)及(g3)的酵素反應，及選自於由下列(h3)的酵素反應、下列(i3)、(j3)、(k3)及(n3)的酵素反應、及下列(i3)、(j3)、(l3)、(m3)及(n3)的酵素反應構成之群組中之至少1者。
(a3)磷酸烯醇丙酮酸至草醯乙酸的酵素反應。
(b3)丙酮酸至草醯乙酸的酵素反應。
(c3)草醯乙酸至蘋果酸的酵素反應。
(d3)蘋果酸至蘋果醯輔酶A的酵素反應。
(e3)蘋果醯輔酶A至乙醛酸及至乙醯輔酶A的酵素反應。
(f3)乙醛酸至甘胺酸的酵素反應。
(g3)甘胺酸至絲胺酸的酵素反應。
(h3)絲胺酸至丙酮酸的酵素反應。
(i3)絲胺酸至3-羥基丙酮酸的酵素反應。
(j3)3-羥基丙酮酸至甘油酸的酵素反應。
(k3)甘油酸至2-磷酸甘油酸的酵素反應。
(l3)甘油酸至3-磷酸甘油酸的酵素反應。
(m3)3-磷酸甘油酸至2-磷酸甘油酸的酵素反應。
(n3)2-磷酸甘油酸至磷酸烯醇丙酮酸的酵素反應。
前述(a3)，例如經由利用磷酸烯醇丙酮酸羧化酶所為之反應、利用磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶所為之反應、利用丙酮酸激酶及丙酮酸羧化酶所為之反應中任一者的酵素反應。
前述(b3)，例如：介由丙酮酸羧化酶之酵素反應。
前述(c3)，例如：介由蘋果酸去氫酶之酵素反應。
前述(d3)，例如：介由蘋果酸硫激酶之酵素反應。
前述(e3)，例如：介由蘋果醯輔酶A裂解酶之酵素反應。
前述(f3)，例如：介由甘胺酸轉胺酶之酵素反應。
前述(g3)，例如：介由甘胺酸開裂系及絲胺酸羥基甲基轉移酶之酵素反應。
前述(h3)，例如：介由絲胺酸脫水酶之酵素反應。
前述(i3)，例如：介由絲胺酸轉胺酶之酵素反應。
前述(j3)，例如：介由羥基丙酮酸還原酶之酵素反應。
前述(k3)，例如：介由甘油酸2-激酶之酵素反應。
前述(l3)，例如：介由甘油酸3-激酶之酵素反應。
前述(m3)，例如：介由磷酸甘油酸變位酶之酵素反應。
前述(n3)，例如：介由烯醇酶之酵素反應。
甘胺酸路徑中，絲胺酸變換為丙酮酸，可為從絲胺酸直接變換的酵素反應(前述(h3)之反應)，也可為經由3-羥基丙酮酸而變換之酵素反應(包括前述(i3)及其下游的反應)。
從絲胺酸變換為丙酮酸，當係經由3-羥基丙酮酸而變換之酵素反應(包括前述(i3)及其下游之反應)的情形，從甘油酸變換為2-磷酸甘油酸，可為由甘油酸直接變換的酵素反應(前述(k3)之反應)，也可為經由3-磷酸甘油酸而變換的酵素反應(包括前述(l3)及(m3)之反應)。
第2發明之微生物之一理想態樣，具有：選自於由下列(a4)及(b4)構成之群組中之至少1個酵素，及下列(c4)、(d4)、(e4)、(f4)及(g4)的酵素，及選自於由下列(h4)的酵素、下列(i4)、(j4)、(k4)及(n4)的酵素、及下列(i4)、(j4)、 (l4)、(m4)及(n4)的酵素構成的群組中之至少1者。
(a4)選自於由丙酮酸激酶及丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、及磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶構成之群組中之至少1者。
(b4)丙酮酸羧化酶。
(c4)蘋果酸去氫酶。
(d4)蘋果酸硫激酶。
(e4)蘋果醯輔酶A裂解酶。
(f4)甘胺酸轉胺酶。
(g4)甘胺酸開裂系及絲胺酸羥基甲基轉移酶。
(h4)絲胺酸脫水酶。
(i4)絲胺酸轉胺酶。
(j4)羥基丙酮酸還原酶。
(k4)甘油酸2-激酶。
(l4)甘油酸3-激酶。
(m4)磷酸甘油酸變位酶。
(n4)烯醇酶。
以下詳細說明圖1之循環及圖2之甘胺酸路徑中之物質變換。
丙酮酸羧化酶(Pyc)及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Ppc)，係碳酸固定酵素之中屬於活性高的類別。例如：植物等光合成利用之RubisCO之比活性為約3~20U/mg(Journal of Biological Chemistry,1999；274(8)：5078-5082、Salvucci M.E.at al.,Analytical Biochemistry,1986；153(1)：97-101)，相對於此，據報告丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶在大腸菌為30U/mg，高者為100~150U/mg(Journal of Biological Chemistry,1972；247(18)：5785-5792、Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,1995；59(1)：140-142、Biochimica et Biophysica Acta,2000；1475(3)：191-206)。
而且，圖1之循環及圖2之甘胺酸路徑不含消耗乙醯輔酶A的酵素。 所以，圖1之循環及圖2之甘胺酸路徑，可說是固定CO2並變換為乙醯輔酶A的理想的循環。
前述消耗乙醯輔酶A的酵素，係指以乙醯輔酶A作為基質而變換為別的物質的酵素，例如乙醯輔酶A羧化酶、丙酮酸合酶。循環中不具有前述消耗乙醯輔酶A的酵素，係指不會成為由於消耗乙醯輔酶A之酵素而使乙醯輔酶A經由循環再度回到乙醯輔酶A的封閉循環。又，由消耗乙醯輔酶A之酵素變換之物質不回到乙醯輔酶A而是變換為別的生產物的情形(例如：於麩胺酸生產路徑最終產物變換為麩胺酸的情形)，由於非封閉循環，所以不包括在「含有消耗乙醯輔酶A之酵素的循環」。封閉循環，係指從循環上之任意物質開始，經由該循環而變換為別的物質，最終變換為與最初為相同物質的循環。
乙醯輔酶A羧化酶分類為酵素編號6.4.1.2，係指由乙醯輔酶A與CO2變換為丙二醯輔酶A之酵素之總稱。
丙酮酸合酶分類為酵素編號1.2.7.1，係指將乙醯輔酶A變換為丙酮酸之酵素之總稱。
再者，做為圖1之循環及圖2之甘胺酸路徑的好處，可列舉由於其和解糖系係獨立，所以可以與其他各種解糖系路徑組合。例如：五碳糖．磷酸路徑的NADPH之生產量高，常用在物質生產(日本特表2007-510411號公報)，與圖1之循環及圖2之甘胺酸路徑係為獨立，能輕易組合。
圖1之循環中，蘋果酸去氫酶(Mdh)、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶(GlxR)及羥基丙酮酸還原酶(YcdW)消耗NADH(或NADPH)作為還原力。蘋果酸硫激酶(Mtk)、甘油酸2-激酶(GarK)、甘油酸3-激酶(G1XK)及丙酮酸羧化酶(Pyc)消耗ATP。丙酮酸激酶(Pyk)生產丙酮酸。
因此圖1之循環之收支，於將磷酸烯醇丙酮酸作為起始物質的情形，為「磷酸烯醇丙酮酸+2輔酶A+CO2+3NAD(P)H+3ATP→2乙醯輔酶A+3NAD(P)++3ADP」。於將丙酮酸作為起始物質的情形，為「丙酮酸+2輔酶A+CO2+3NAD(P)H+4ATP→2乙醯輔酶A+3NAD(P)++4ADP」。
亦即，圖1之循環係固定CO2並變換為乙醯輔酶A時，須供給磷酸烯 醇丙酮酸(或丙酮酸)、NAD(P)H及ATP。
圖2之甘胺酸路徑中，蘋果酸去氫酶(Mdh)及羥基丙酮酸還原酶(YcdW)消耗NADH(或NADPH)作為還原力。乙醛酸變換為甘胺酸時，利用甘胺酸去氫酶而直接地，或利用乙醛酸胺基轉移酶等胺基轉移酶而經由其他之胺基酸間接地，消耗相當於1個NADH(或NADPH)的還原力。甘胺酸開裂系，係消耗NAD+(或NADP+)而變換為NADH(或NADPH)。絲胺酸變換為3-羥基丙酮酸時，係利用絲胺酸去氫酶直接地或利用絲胺酸胺基轉移酶等胺基轉移酶而經由其他胺基酸間接地消耗NAD+(或NADP+)，並變換為NADH(或NADPH)。
蘋果酸硫激酶(Mtk)、甘油酸2-激酶(GarK)、甘油酸3-激酶(GlxK)及丙酮酸羧化酶(Pyc)消耗ATP。氨在納入代謝系時，有時會消耗ATP。丙酮酸激酶(Pyk)生產ATP。
因此圖2之路徑之收支，於將磷酸烯醇丙酮酸作為起始物質的情形，為「磷酸烯醇丙酮酸+2輔酶A+CO2+3NAD(P)H+3~5ATP→2乙醯輔酶A+3NAD(P)++3~5ADP」。於將丙酮酸作為起始物質的情形，為「丙酮酸+2輔酶A+CO2+3NAD(P)H+4~6ATP→2乙醯輔酶A+3NAD(P)++4~6ADP」。
在以乙醯輔酶A作為中間產物的發酵路徑之中，發酵中耗氧的路徑的收支式記載於表1。該等發酵中，假定會發生在發酵路徑上生成NADH等還原型輔酶且其由於氧的作用而回到氧化型輔酶的現象。故若能將生成之還原型輔酶不由氧消耗而是由圖1之循環及圖2之甘胺酸路徑消耗，能將發酵中生成之還原力有效利用於乙醯輔酶A生產循環，能期待固定CO2而變換為生產物。
上述還原型輔酶，例如NADH、NADPH、FADH2、FMNH2、還原型氫醌輔酶等涉及氧化還原的輔酶且其係指還原狀態輔酶。上述還原型輔酶，較佳為指NADH或NADPH，更佳為NADH。上述氧化型輔酶，係還原型輔酶之氧化型，例如NAD+、NADP+、FAD、FMN、氧化型氫醌輔酶等， 較佳為指NAD+或NADP+，更佳為NAD+。
如表1，發酵式的左邊有氧存在的發酵，常需要大量氧，故要求大量通氣、強力攪拌，與設備費或電費增加相關。若導入圖1之循環或圖2之甘胺酸路徑到物質生產系統，能消耗多餘還原力而不是耗氧，所以能緩和過度通氣攪拌，可期待簡省發酵生產的費用。
為了補足圖1之循環或圖2之甘胺酸路徑的還原力，也可藉由加入能產生還原力的物質、或從外部提供能量而給予還原力。例如以下方式：將還原度高的物質(例如：氫、亞硫酸鹽、醇類、石蠟)作為基質利用、以電培養直接提供還原能量、以生物的光化學反應供給還原力等。若能從外部補充還原力，即使不是如表1般會生成還原型輔酶的發酵，也能使本發明之碳酸固定路徑驅動。
以下詳細說明圖1之循環及圖2之甘胺酸路徑所包含之酵素。
丙酮酸激酶(Pyk)，分類為酵素編號2.7.1.40，係指由磷酸烯醇丙酮酸與ADP生成丙酮酸與ATP之酵素之總稱。例如：Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源者。
作為丙酮酸激酶之基因(pyk)，可使用具有編碼為由上述微生物獲得之丙酮酸激酶之基因的鹼基序列的DNA、或依據其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者可列舉具有來自Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌之基因之鹼基序列的DNA。
丙酮酸羧化酶(Pyc)分類為酵素編號6.4.1.1，係指將丙酮酸與二氧化碳變換為草醯乙酸之酵素之總稱。反應時，消耗ATP並生成ADP與磷酸。例如來自Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、Mycobacterium smegmatis(Mycobacterium smegmatis)等分支桿菌(Mycobacterium)屬細菌者。
作為丙酮酸羧化酶之基因(pyc)，可使用具有編碼為由上述微生物獲得之丙酮酸羧化酶之基因的鹼基序列的DNA、或依據其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者可列舉具有來自Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、Mycobacterium smegmatis(Mycobacterium smegmatis)等分支桿菌(Mycobacterium)屬細菌之基因之鹼基序列的DNA。
磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Ppc)分類為酵素編號4.1.1.31，係指將磷酸烯醇丙酮酸與二氧化碳變換為草醯乙酸與磷酸之酵素之總稱。例如來自Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌、Hyphomicrobium methylovorum(Hyphomicrobium methylovorum)等生絲微菌(Hyphomicrobium)屬細菌、Starkeya novella(Starkeya novella)等Starkeya屬細菌、Rhodopseudomonas sp.(Rhodopseudomonas sp.)等紅假單胞菌(Rhodopseudomonas)屬細菌、Streptomyces coelicolor(Streptomyces coelicolor) 等鏈絲菌(Streptomyces)屬細菌者。
作為磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之基因(ppc)，可使用具有編碼為由上述微生物獲得之磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之基因的鹼基序列的DNA、或依據其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者可列舉具有來自Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌、Hyphomicrobium methylovorum(Hyphomicrobium methylovorum)等生絲微菌(Hyphomicrobium)屬細菌、Starkeya novella(Starkeya novella)等Starkeya屬細菌、Rhodopseudomonas sp.(Rhodopseudomonas sp.)等紅假單胞菌(Rhodopseudomonas)屬細菌、Streptomyces coelicolor(Streptomyces coelicolor)等鏈絲菌(Streptomyces)屬細菌之基因之鹼基序列的DNA。
磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(Pck)分類為酵素編號4.1.1.32、酵素編號4.1.1.38、酵素編號4.1.1.49，係指將磷酸烯醇丙酮酸與二氧化碳變換為草醯乙酸之酵素之總稱。此時，酵素編號4.1.1.32伴隨將GDP變換為GTP之反應、酵素編號4.1.1.38伴隨將磷酸變換為焦磷酸之反應、酵素編號4.1.1.49伴隨將ADP變換為ATP之反應。例如來自Actinobacillus succinogenes(Actinobacillus succinogenes)等放線菌(Actinobacillus)屬細菌、Mycobacterium smegmatis(Mycobacterium smegmatis)等分支桿菌(Mycobacterium)屬細菌、Trypanosoma brucei(Trypanosoma brucei)等錐體蟲(Trypanosoma)屬細菌者。
前述磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶之基因(pck)，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者可列舉Actinobacillus succinogenes(Actinobacillus succinogenes)等放線菌屬、Mycobacterium smegmatis(Mycobacterium smegmatis)等分支桿菌屬細菌、Trypanosoma brucei(Trypanosoma brucei)等錐體蟲屬細菌來源者。
蘋果酸去氫酶(Mdh)分類為酵素編號1.1.1.37，係指使用NADH，從草醯乙酸生成蘋果酸之酵素之總稱。例如：來自Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌者。
蘋果酸去氫酶之基因(mdh)，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為蘋果酸去氫酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者例如具有Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
蘋果酸硫激酶(Mtk)分類為酵素編號6.2.1.9，係指使蘋果酸與輔酶A並變換為蘋果醯輔酶A之酵素之總稱。反應時，消耗1分子的ATP，並生成1分子的ADP與磷酸。此酵素由約400個胺基酸的大次單元與300個胺基酸的小次單元構成。基因上通常依序存在大次單元、小次單元。本說明書，為了簡便，稱大次單元為mtkB、小次單元為mtkA。作為此酵素之比活性，據報告有精製酵素為2.5U/mg之例(Analytical Biochemistry,1995；227(2)：363-367)。
蘋果酸硫激酶是主要見於甲烷等C1碳源之利用路徑(Journal of Bacteriology,1994；176(23)：7398-7404)及3-羥基丙酸路徑(Archives of Microbiology,1989；151：252-256)的酵素。基因體上，在蘋果酸硫激酶基因之附近存在蘋果醯輔酶A裂解酶基因，以此方式存在之蘋果酸硫激酶基因較理想。
蘋果酸硫激酶，例如：Methylobacterium extorquens(Methylobacterium extorquens)等甲基桿菌屬來源(序列編號1及序列編號2)、Granulibacter bethesdensis(Granulibacter bethesdensis)等Granulibacter屬來源(序列編號3及序列編號4)、Hyphomicrobium methylovorum(Hyphomicrobium methylovorum)(序列編號5及序列編號6)、Hyphomicrobium denitrificans(Hyphomicrobium denitrificans)(序列編號7及序列編號8)等生絲 微菌(Hyphomicrobium)屬來源、Rhizobium sp.(Rhizobium sp.)NGR234等根瘤菌屬來源(序列編號9及序列編號10)、Nitrosomonas europaea(Nitrosomonas europaea)等亞硝化單胞菌屬來源(序列編號11及序列編號12)、Methylococcus capsulatus(Methylococcus capsulatus)等甲基球菌屬來源(序列編號13及序列編號14)、gammaproteobacteria界來源(序列編號15及序列編號16)者。
作為蘋果酸硫激酶，由經由乙醯輔酶A之有用物質之生產效率之觀點，尤佳可列舉生絲微菌(Hyphomicrobium)屬來源(序列編號5及序列編號6、序列編號7及序列編號8)、根瘤菌屬來源(序列編號9及序列編號10)、亞硝化單胞菌屬來源(序列編號11及序列編號12)、甲基球菌屬來源(序列編號13及序列編號14)、及gammaproteobacteria界來源(序列編號15及序列編號16)者。
生絲微菌(Hyphomicrobium)屬來源(序列編號5及序列編號6、序列編號7及序列編號8)、根瘤菌屬來源(序列編號9及序列編號10)、及亞硝化單胞菌屬來源(序列編號11及序列編號12)之各蘋果酸硫激酶，彼此有65%~80%的相同性。甲基球菌屬來源之蘋果酸硫激酶(序列編號13及序列編號14)，與gammaproteobacteria界來源之蘋果酸硫激酶(序列編號15及序列編號16)有70%~80%的相同性。
本發明揭示之與生絲微菌(Hyphomicrobium)屬來源、根瘤菌屬來源、亞硝化單胞菌屬來源、甲基球菌屬來源、及gammaproteobacteria界來源之各蘋果酸硫激酶之胺基酸序列有70%以上的相同性且具有蘋果酸硫激酶活性之蛋白質，可理想地使用於乙醯輔酶A及來自乙醯輔酶A之有用物質之生產。
作為蘋果酸硫激酶之基因(mtk)，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為蘋果酸硫激酶的基因的鹼基序列的DNA或依據其公知之鹼基序列合成的合成DNA序列。理想者，可列舉具Methylobacterium extorquens等甲基 桿菌屬來源(序列編號17及序列編號18)、Hyphomicrobium methylovorum、Hyphomicrobium denitrificans等生絲微菌(Hyphomicrobium)屬來源、Rhizobium sp.NGR234等根瘤菌屬來源、Granulibacter bethesdensis等Granulibacter屬來源、Nitrosomonas europaea等亞硝化單胞菌屬來源、Methylococcus capsulatus等甲基球菌屬來源、gammaproteobacteria界來源之基因之鹼基序列的DNA。從乙醯輔酶A之生產效率之觀點，較佳為具有生絲微菌(Hyphomicrobium)屬來源(序列編號19及序列編號20、序列編號21及序列編號22)、根瘤菌屬來源(例如：密碼子已最佳化的序列編號23)、Granulibacter屬來源(序列編號24及序列編號25)、亞硝化單胞菌屬來源(序列編號26及序列編號27)、甲基球菌屬來源(序列編號28及序列編號29)、gammaproteobacteria界來源(序列編號30及序列編號31)之基因之鹼基序列之DNA。尤佳為具有生絲微菌(Hyphomicrobium)屬來源(序列編號19及序列編號20、序列編號21及序列編號22)、根瘤菌屬來源(例如：密碼子已最佳化的序列編號23)、亞硝化單胞菌屬來源(序列編號26及序列編號27)、甲基球菌屬來源(序列編號28及序列編號29)、gammaproteobacteria界來源(序列編號30及序列編號31)之基因之鹼基序列之DNA。
又，Methylobacterium extorquens等甲烷利用菌，係生來擁有蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶的微生物。但是適於甲烷利用菌的細菌系及甲烷利用菌之基因體基因的改變技術不發達，相較於大腸桿菌及棒桿菌等工業上利用的微生物，基因操作比較困難。又，甲烷利用菌的增殖時常是緩慢的。因此甲烷利用菌不適於有用代謝產物之生產。
蘋果醯輔酶A裂解酶(Mcl)，分類為酵素編號4.1.3.24，係指由蘋果醯輔酶A生成乙醛酸與乙醯輔酶A之酵素。例如：Methylobacterium extorquens等甲基桿菌屬來源、Hyphomicrobium methylovorum、Hyphomicrobium denitrificans等生絲微菌(Hyphomicrobium)屬來源、Chloroflexus aurantiacus 等綠曲撓菌屬來源、Nitrosomonas europaea等亞硝化單胞菌屬來源、Methylococcus capsulatus等甲基球菌屬來源者。蘋果醯輔酶A裂解酶之比活性，據報告在Methylobacterium extorquens，精製酵素有 28.1U/mg(Biochemical Journal,1974；139(2)：399-405)。
作為蘋果醯輔酶A裂解酶，從乙醯輔酶A之生產效率之觀點，尤佳為例如具有甲基桿菌屬來源(序列編號32)生絲微菌(Hyphomicrobium)屬來源(序列編號33及序列編號34)、亞硝化單胞菌屬來源(序列編號35)、及甲基球菌屬來源(序列編號36)之各胺基酸序列之酵素。
作為蘋果醯輔酶A裂解酶之基因(mcl)，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為蘋果醯輔酶A裂解酶之基因之鹼基序列的DNA或依其公知之鹼基序列合成的合成DNA序列。理想者例如具有Methylobacterium extorquens等甲基桿菌屬來源、Hyphomicrobium methylovorum、Hyphomicrobium denitrificans等生絲微菌屬來源、Chloroflexus aurantiacus等綠曲撓菌來源之基因之鹼基序列之DNA。從乙醯輔酶A之生產效率之觀點，尤佳為例如具有甲基桿菌屬來源之基因、及生絲微菌屬來源之基因之鹼基序列之DNA。
尤佳之甲基桿菌屬來源之基因之鹼基序列之一例，可列舉：Methylobacterium extorquens來源基因之鹼基序列(序列編號37)、生絲微菌屬來源之基因之鹼基序列之一例，可列舉：Hyphomicrobium methylovorum來源基因之鹼基序列(序列編號38)、Hyphomicrobium denitrificans來源基因之鹼基序列(序列編號39)、亞硝化單胞菌屬來源之基因之鹼基序列之一例可列舉：Nitrosomonas europaea來源基因之鹼基序列(序列編號40)、甲基球菌屬來源之基因之鹼基序列之一例可列舉：Methylococcus capsulatus來源基因之鹼基序列(序列編號41)。
乙醛酸醛連接酶(Gcl)，分類為酵素編號4.1.1.47，係指將2分子的乙醛酸變換為1分子的2-羥基-3-側氧基丙酸的酵素的總稱。反應時，伴隨1分子的二氧化碳的脫二氧化碳。例如：大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Rhodococcus jostii等紅球菌屬細菌來源者。
作為乙醛酸醛連接酶之基因(gcl)，可利用從上述微生物獲得之具有編碼 為乙醛酸醛連接酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者例如具有Rhodococcus jostii等紅球菌(Rhodococcus)屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶(GlxR)，分類為酵素編號1.1.1.60，係指使用NADH作為輔酶，將2-羥基-3-側氧基丙酸變換為甘油酸之酵素之總稱。例如：Rhodococcus jostii等紅球菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌來源者。
作為2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶之基因(glxR)，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者例如具有Rhodococcus jostii等紅球菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
羥基丙酮酸異構酶(Hyi)，分類為酵素編號5.3.1.22，係指將2-羥基-3-側氧基丙酸異構化為羥基丙酮酸之酵素之總稱。例如：Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源者。
羥基丙酮酸異構酶之基因(hyi)，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為羥基丙酮酸異構酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者例如具有Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
羥基丙酮酸還原酶(YcdW)，分類為酵素編號1.1.1.81，係指使用NADH或NADPH為輔酶，將羥基丙酮酸變換為甘油酸之酵素之總稱。例如：大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、及Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源者。
羥基丙酮酸還原酶之基因(ycdW)，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為羥基丙酮酸還原酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者例如具有大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、及Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
甘油酸2-激酶(GarK)，分類為酵素編號2.7.1.165，係指將甘油酸變換為2-磷酸甘油酸之酵素之總稱。消耗1分子ATP並生成1分子的ADP與磷酸。例如：Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源者。
作為甘油酸2-激酶之基因(garK)，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為甘油酸2-激酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者例如具有Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
甘油酸3-激酶(GlxK)，分類為酵素編號2.7.1.31，係指將甘油酸變換為3-磷酸甘油酸之酵素之總稱。消耗1分子ATP並生成1分子ADP與磷酸。例如：Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源者。
作為甘油酸3-激酶之基因(glxK)，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為甘油酸3-激酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者例如具有Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
磷酸甘油酸變位酶(Gpm)，分類為酵素編號5.4.2.1，係指將3-磷酸甘油酸變換為2-磷酸甘油酸之酵素之總稱。例如：Corynebacterium glutamicum等 棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源者。
作為磷酸甘油酸變位酶之基因(gpm)，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為磷酸甘油酸變位酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者例如具有Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
烯醇酶(Eno)，分類為酵素編號4.2.1.11，係指將2-磷酸甘油酸變換為磷酸烯醇丙酮酸之酵素之總稱。例如：Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源者。
作為烯醇酶之基因(eno)，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為烯醇酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者例如具有Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
甘胺酸轉胺酶(Gta)，係指由具有胺基之化合物(2級胺或1級胺)將胺基轉移到乙醛酸並變換為甘胺酸的酵素。在分類為酵素編號2.6.1群之酵素之中，可列舉將乙醛酸作為基質之酵素。舉例而言，可列舉2.6.1.＊；＊=4，35，44,45，60，63及73。又，2.6.1.＊；＊=2，7，12，13，14，15，18，19，27，38，40，42，57，64，72，及78的酵素群中，也據報告有同樣活性的情形。例如：Methylococcus capsulatus等甲基球菌屬菌、黑麴黴等麴菌屬菌、鉤蟲貪銅菌(Cupriavidus necator)等貪銅菌屬菌來源者。甘胺酸轉胺酶有時也有後述絲胺酸轉胺酶的活性。本發明中，甘胺酸去氫酶(Gdh)也視為包括於甘胺酸轉胺酶。
甘胺酸轉胺酶之基因(gta)，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為甘胺 酸轉胺酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者可列舉具有Methylococcus capsulatus等甲基球菌屬菌、黑麴黴等麴菌屬菌、鉤蟲貪銅菌等貪銅菌屬菌來源者。本發明中，甘胺酸去氫酶之基因也視為包括於甘胺酸轉胺酶之基因。
作為甘胺酸去氫酶之基因(gdh)，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為甘胺酸去氫酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者可列舉具有結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、Mycobacterium smegmatis等分支桿菌(Mycobacterium)屬細菌、Hyphomicrobium vulgare等生絲微菌(Hyphomicrobium)屬細菌來源之基因之鹼基序列的DNA。
甘胺酸開裂系(Gcs)，係指將甘胺酸、四氫葉酸、及NAD+變換為5,10-亞甲基四氫葉酸、NH3、CO2及NADH之一系列酵素群的總稱。由稱為H-蛋白質、P-蛋白質、L-蛋白質、及T-蛋白質的蛋白質構成(Molecular and Cellular Biochemistry,1973；1(2)：169-187)。P-蛋白質、L-蛋白質及T-蛋白質，分別分類在酵素編號1.4.4.2、1.8.1.4、及2.1.2.10。例如：大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌、黑麴黴等麴菌屬菌、鉤蟲貪銅菌等貪銅菌屬菌來源者。
作為甘胺酸開裂系之基因群(gcs)，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為甘胺酸開裂系的酵素群之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者可列舉具有大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌、黑麴黴等麴菌屬菌、鉤蟲貪銅菌等貪銅菌屬菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
甘胺酸開裂系生產之5,10-亞甲基四氫葉酸，使絲胺酸羥基甲基轉移酶作用而與新的甘胺酸反應反應並變換為絲胺酸。亦即，由於甘胺酸開裂系及絲胺酸羥基甲基轉移酶的作用，將甘胺酸2分子及NAD+變換為絲胺酸、NH3、CO2及NADH。
絲胺酸羥基甲基轉移酶(Shmt)，分類為酵素編號2.1.2.1，係指由5,10-亞甲基四氫葉酸及甘胺酸生成絲胺酸及四氫葉酸之酵素之總稱。例如：Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源者。
作為絲胺酸羥基甲基轉移酶之基因(shmt)，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為絲胺酸羥基甲基轉移酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者可列舉具有Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
絲胺酸脫水酶(Sda)，分類為酵素編號4.3.1.17，係指由絲胺酸生成丙酮酸與氨之酵素之總稱。酵素編號4.3.1.19的酵素中，也有報告有同樣活性的情形。例如：Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌、黑麴黴等麴菌屬菌、鉤蟲貪銅菌等貪銅菌屬菌來源者。
絲胺酸脫水酶之基因(sda)，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為絲胺酸脫水酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者可列舉具有Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌、黑麴黴等麴菌屬菌、鉤蟲貪銅菌等貪銅菌屬菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
絲胺酸轉胺酶(Sga)，係指由絲胺酸將胺基轉移到具有羰基之化合物(酮基或醛基)並變換為3-羥基丙酮酸之酵素。在分類為酵素編號2.6.1群之酵素之中，可列舉將絲胺酸作為基質之酵素。舉例而言，例如2.6.1.51及2.6.1.45,2.6.1.44及2.6.1.35的酵素群中據報告也有同樣活性的情形。又，有時也有前述甘胺酸轉胺酶之活性。例如：Methylococcus capsulatus等甲基球菌屬菌、黑麴黴等麴菌屬菌、鉤蟲貪銅菌等貪銅菌屬菌來源者。本發明 中，絲胺酸2-去氫酶也視為包括在絲胺酸轉胺酶。
作為絲胺酸轉胺酶之基因(sga)，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為絲胺酸轉胺酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者可列舉具有Methylococcus capsulatus等甲基球菌屬菌、黑麴黴等麴菌屬菌、鉤蟲貪銅菌等貪銅菌屬菌來源者。本發明中，絲胺酸2-去氫酶之基因也視為包括在絲胺酸轉胺酶之基因。
絲胺酸2-去氫酶(Sdh)，分類為酵素編號1.4.1.7，係指由絲胺酸生成3-羥基丙酮酸與氨之酵素之總稱。例如：Petroselinum crispum(香芹)等植物來源者。
作為絲胺酸2-去氫酶之基因(sdh)，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為絲胺酸2-去氫酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者可列舉具有Petroselinum crispum(香芹)等植物來源之基因之鹼基序列之DNA。
對於因為未擁有一部分圖1之循環上的酵素，未形成圖1之循環之微生物，只要賦予未擁有的酵素即可。
埃希氏菌屬細菌之中，例如大腸菌(Escherichia coli)未擁有蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶及甘胺酸轉胺酶，所以只要至少賦予蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶及甘胺酸轉胺酶即可。
泛菌屬細菌，例如Pantoea ananatis未擁有蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶及甘胺酸轉胺酶，故只要至少賦予蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶及甘胺酸轉胺酶即可。
棒桿型菌之中，例如Corynebacterium glutamicum未擁有蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶、及羥基丙酮酸還原酶，故只要至少賦予蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、與2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶及/或羥基丙酮酸還原酶即可。
對於因為未擁有一部分圖1之循環上及圖2之甘胺酸路徑上的酵素，圖1之循環及圖2之路徑任一者皆未形成的微生物，只要賦予未擁有的酵素即可。為絲狀菌之1種的黑麴黴，只要賦予蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶，即能形成圖2之路徑。
第1發明之乙醯輔酶A生產微生物，宜將選自於由丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、蘋果酸去氫酶、蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶、羥基丙酮酸異構酶、羥基丙酮酸還原酶、甘油酸2-激酶、甘油酸3-激酶、磷酸甘油酸變位酶及烯醇酶構成之群組中之至少1者之酵素活性強化較佳。藉此，能更以良好效率生產乙醯輔酶A。
能成為強化之對象的丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、蘋果酸去氫酶、蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶、羥基丙酮酸異構酶、羥基丙酮酸還原酶、甘油酸2-激酶、甘油酸3-激酶、磷酸甘油酸變位酶或烯醇酶，係構成圖1之循環之酵素群。
第1發明之乙醯輔酶A生產微生物，宜將選自於由蘋果酸酵素及富馬酸還原酶構成之群組中之至少1者之酵素活性失活或減活較佳。藉此能以更良好效率生產乙醯輔酶A。
蘋果酸酵素，分類為酵素編號1.1.1.38、酵素編號1.1.1.39、酵素編號1.1.1.40，係指將蘋果酸變換為丙酮酸與二氧化碳之酵素之總稱。從乙醯輔酶A生產效率之觀點，宜使蘋果酸酵素之活性失活或減活較佳。
富馬酸還原酶，分類為酵素編號1.3.99.1，係指將富馬酸變換為琥珀酸之酵素之總稱。又，有時屬於酵素編號1.3.99.1之琥珀酸去氫酶具有將富馬酸變換為琥珀酸之富馬酸還原酶活性。因此本發明中，具有富馬酸還原酶 活性之琥珀酸去氫酶也包括在富馬酸還原酶。從乙醯輔酶A生產效率之觀點，宜使富馬酸還原酶活性失活或減活。藉此，能抑制將蘋果酸變換為富馬酸、琥珀酸而致蘋果酸量減少，有助乙醯輔酶A之產率提高。
蘋果酸酵素之基因(多數已賦予sfcA、maeA、maeB或malE的名稱，但不限定於此)，取決於微生物，有時基因體中會存在多數同分異構體(isomer)。Pantoea ananatism擁有sfcA及maeB。Corynebacterium glutamicum擁有malE。
富馬酸還原酶之基因(frd、sdh、yqiG等)取決於微生物，有時基因體中會存在多數同分異構體。Pantoea ananatis擁有yqiG。Corynebacterium glutamicum擁有sdh。
第1發明中作為寄主之微生物，只要是下列(a)、(b)、(c)、(d)及(e)中任一者皆無之微生物即可，無特別限制。
(a)具有從丙二醯輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸的酵素反應的碳酸固定循環。
(b)具有從乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸的酵素反應的碳酸固定循環。
(c)具有從巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯輔酶A或戊烯二醯輔酶A的酵素反應的碳酸固定循環。
(d)具有從CO2至甲酸的酵素反應的碳酸固定循環。
(e)選自於由蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶構成之群組中之至少1者。
本說明書中「(a)具有從丙二醯輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸的酵素反應的碳酸固定循環」，係指下列(1)~(7)之循環。
(1)國際公開第2011/099006號之圖1所示：乙醯輔酶A經由丙二醯輔酶A、3-羥基丙酸、丙醯輔酶A、蘋果酸、蘋果醯輔酶A再變換為乙醯輔酶A之循環。
(2)國際公開第2011/099006號之圖4A所示：乙醯輔酶A經由丙二醯輔酶A、丙二酸半醛、β-丙胺酸、蘋果酸、蘋果醯輔酶A再變換為乙醯輔酶A之循環。
(3)國際公開第2011/099006號之圖4B、16或18所示：乙醯輔酶A經由丙二醯輔酶A、羥基丙酸、(R)-乳酸或(S)-乳酸、蘋果酸、蘋果醯輔酶A再變換為乙醯輔酶A之循環。
(4)國際公開第2011/099006號之圖8所示：乙醯輔酶A經由丙二醯輔酶A、丙二酸半醛或羥基丙酸、丙酮酸、蘋果酸、蘋果醯輔酶A再變換為乙醯輔酶A之循環。
(5)國際公開第2011/099006號之圖9A、9B或9C所示：乙醯輔酶A經由丙二醯輔酶A、羥基丙酸、2-酮基戊二酸、蘋果酸、蘋果醯輔酶A再變換為乙醯輔酶A之循環。
(6)國際公開第2011/099006號之圖9D或9F所示：乙醯輔酶A經由丙二醯輔酶A、羥基丙酸、甲基丙二醯輔酶A、蘋果酸、蘋果醯輔酶A再變換為乙醯輔酶A之循環。
(7)國際公開第2011/099006號之圖17所示：乙醯輔酶A經由丙二醯輔酶A、丙二酸半醛或羥基丙酸、甲基丙二醯輔酶A、丙酮酸、草醯乙酸、蘋果酸、蘋果醯輔酶A再變換為乙醯輔酶A之循環。
上述(1)~(7)之碳酸固定循環共通具有由丙二醯輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸的酵素反應。該等反應，係由丙二酸半醛去氫酶或丙二醯輔酶A還原酶催化(國際公開第2011/099006號)。如此之琥珀醯輔酶A之還原、或丙二醯輔酶A之還原這些羧酸或其(硫)酯的還原反應，一般就酵素反應而言係困難，據說在發酵路徑係儘可能避免為宜(Nature,2008；451：86-89、Nature Chemical Biolory,2011；7：445-452)。
本說明書「(b)具有由乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸的酵素反應的碳酸固定循環」，係指下列(8)~(10)之循環。
(8)國際公開第2011/099006號之圖1所示：乙醯輔酶A經由丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸、草醯乙酸、蘋果酸、蘋果醯輔酶A再變換為乙醯輔酶A之 循環。
(9)國際公開第2011/099006號之圖7C、7D或7E所示：乙醯輔酶A經由丙酮酸、蘋果酸、蘋果醯輔酶A再變換為乙醯輔酶A之循環。
(10)國際公開第2011/099006號之圖9M所示：乙醯輔酶A經由丙酮酸、2-酮基戊二酸、蘋果酸、蘋果醯輔酶A再變換為乙醯輔酶A之循環。
上述(8)~(10)之碳酸固定循環共通具有由乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸的酵素反應。催化此反應的是丙酮酸合酶(國際公開第2011/099006號)。丙酮酸合酶所為之丙酮酸之合成反應，須要鐵氧化還原蛋白媒介的強還原力，反應慢，且對氧不耐，若不在極端的嫌氣條件下則反應不進行。
本說明書中「(c)具有由巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯輔酶A或戊烯二醯輔酶A的酵素反應的碳酸固定循環」，係指國際公開第2011/099006號之圖9H或9J所示：乙醯輔酶A經由巴豆醯輔酶A、乙基丙二醯輔酶A或戊烯二醯輔酶A、草醯乙酸、蘋果酸、蘋果醯輔酶A再變換為乙醯輔酶A之循環。
催化上述由巴豆醯輔酶A與CO2變換為乙基丙二醯輔酶A或戊烯二醯輔酶A的是巴豆醯輔酶A羧化酶-還原酶或甲基巴豆醯輔酶A羧化酶。巴豆醯輔酶A羧化酶-還原酶，對碳酸鹽的Km高(14mM。Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2007；104(25)：10631-10636)，不能期待於低濃度域之活性。又，基質巴豆醯輔酶A可由3-羥基丁醯輔酶A利用脫水反應生產，但如此的酵素通常若於水中環境下，則逆反應的水合反應會是優勢，無法預期有足夠的速度。又，甲基巴豆醯輔酶A羧化酶，據報告的比活性不是如此高(0.2~0.6U/mg。Archives of Biochemistry and Biophysics,1994；310(1)：64-75)，故和上述相同，也會有對於係基質之巴豆醯輔酶A之生產方面無法期待足夠速度的問題。
本說明書中「(d)具有由CO2至甲酸的酵素反應的碳酸固定循環」，係指國際公開第2009/046929號之圖5、6、13或14所示循環，亦即組合以下而得的循環：經CO2、甲酸、5-甲醯基四氫葉酸而生成5,10-亞甲基四氫葉酸之 路徑、及5,10-亞甲基四氫葉酸與甘胺酸反應而生成絲胺酸且此絲胺酸經3-羥基丙酮酸、甘油酸、3-磷酸甘油酸、磷酸烯醇丙酮酸、草醯乙酸、蘋果酸、蘋果醯輔酶A、乙醛酸而回到最初的甘胺酸的循環、及經蘋果酸、蘋果醯輔酶A而生成之乙醯輔酶A經過TCA循環及異檸檬酸裂解酶之反應而回到蘋果酸的循環。
上述由CO2到甲酸的酵素反應須有強還原力，反應慢且不耐氧，故非於極端嫌氣條件下則反應不進行。
丙二酸半醛去氫酶，分類為酵素編號1.2.1.18，係指將丙二醯輔酶A變換為丙二酸半醛之酵素之總稱。
丙二醯輔酶A還原酶，係指將丙二醯輔酶A變換為丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素之總稱。
丙酮酸合酶，分類為酵素編號1.2.7.1，係指將乙醯輔酶A變換為丙酮酸之酵素之總稱。
巴豆醯輔酶A羧化酶-還原酶，分類為酵素編號1.3.1.85，係指將巴豆醯輔酶A變換為乙基丙二醯輔酶A之酵素之總稱。
甲基巴豆醯輔酶A羧化酶，分類為酵素編號6.4.1.4，係指將巴豆醯輔酶A變換為戊烯二醯輔酶A之酵素之總稱。
前述(a)、(b)、(c)、(d)及(e)中任一者皆無之微生物，例如：屬於腸內細菌科之微生物、屬於棒桿型菌之微生物、絲狀菌、放線菌等。
作為屬於腸內細菌科之微生物，可列舉屬於腸桿菌(Enterobacter)屬、歐文氏菌(Erwinia)屬、埃希氏菌屬、克雷伯氏菌(Klebsiella)屬、泛菌屬、普羅威登斯菌(Providencia)屬、沙門氏菌(Salmonella)屬、沙雷氏菌(Serratia)屬、志賀菌(Shigella)屬、摩根氏菌(Morganella)屬等之菌。其中，從有效地生產有用代謝產物之觀點，屬於埃希氏菌屬或泛菌屬之微生物為較佳。埃希氏菌屬細菌與泛菌屬細菌，親緣關係非常近(Journal of General and Applied Microbiology,1997；43(6)：355-361、International Journal of Systematic Bacteriology,1997；47(4)：1061-1067)。
埃希氏菌屬細菌不特別限定，例如大腸桿菌(E.coli)。大腸桿菌具體而言，可列舉原型的野生株B株的大腸桿菌B(ATCC11303)、原型的野生株K12株來源的大腸桿菌W3110(ATCC 27325)、大腸桿菌MG1655(ATCC 47076)等。
泛菌屬細菌之代表菌株，可列舉Pantoea ananatis(Pantoea ananatis)、Pantoea stewartii(Pantoea stewartii)、Pantoea agglomerans、Pantoea citrea(Pantoea citrea)。具體而言，可列舉下列之菌株。
．Pantoea ananatisAJ13355株(FERM BP-6614)(歐洲專利申請案公開0952221號說明書)
．Pantoea ananatisAJ13356株(FERM BP-6615)(歐洲專利申請案公開0952221號說明書)
又，該等菌株在歐洲專利申請案公開0952221號說明書記載為Enterobacter agglomerans，但現在如上述利用16S rRNA之鹼基序列解析等，再分類為Pantoea ananatis。
近年來，有時屬於腸桿菌屬的細菌再分類為Pantoea agglomerans(Pantoea agglomerans)或Pantoea dispersa(Pantoea dispersa)等(International Journal of Systematic Bacteriology,1989；39(3)：337-345)。屬於歐文氏菌(Erwinia)屬之細菌再分類為Pantoea ananas(Pantoea ananas)、Pantoea stewartii(International Journal of Systematic Bacteriology,1993；43(1)：162-173)。
腸桿菌屬細菌，例如Enterobacter agglomerans(Enterobacter agglomerans)、Enterobacter aerogenes(Enterobacter aerogenes)等。具體而言，可使用歐洲專利申請案公開952221號說明書例示之菌株。腸桿菌屬之代表株可列舉Enterobacter agglomeransATCC12287株。
棒桿型菌，係指於Bergey's Manual of Determinative Bacteriology,8th ed., p599(1974)所定義之屬於棒桿菌(Corynebacterium)屬、短桿菌(Brevibacterium)屬、或微桿菌(Microbacterium)屬之微生物等。又，可列舉至今為止係分類為短桿菌屬，但之後再分類為棒桿菌屬之微生物(International Journal of Systematic Bacteriology,1991；41(2)：255-260)、及屬於類緣菌短桿菌屬之微生物。以下列舉棒桿型菌之例。
例如：Corynebacterium acetoacidophilum、Corynebacterium acetoglutamicum、Corynebacterium alkanolyticum、Corynebacterium callunae、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium lilium、Corynebacterium melassecola、Corynebacterium thermoaminogenes、Corynebacterium herculis、Brevibacterium divaricatum、Brevibacterium flavum、Brevibacterium immariophilum、Brevibacterium lactofermentum、Brevibacterium roseum、Brevibacterium saccharolitycum、Brevibacterium thiogenitalis、Corynebacterium ammoniagenes、Brevibacterium album、Brevibacterium selinum、Microbacterium ammoniaphilum。
作為屬於棒桿型菌之微生物，包含以下菌株。
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806、Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511、Corynebacterium callunae ATCC15991、Corynebacterium glutamicum ATCC13020、13032、13060、Corynebacterium lilium ATCC15990、Corynebacterium melassecola ATCC17965、Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340(FERM BP-1539)、Corynebacterium herculis ATCC13868、Brevibacterium divaricatum ATCC14020、Brevibacterium flavum ATCC13826、ATCC14067、AJ12418(FERM BP-2205)、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium lactofermentum(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869、Brevibacterium roseum ATCC13825、Brevibacterium saccharolitycum ATCC14066、Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240、Brevibacterium ammoniagenes ATCC6871、ATCC6872、Brevibacterium album ATCC15111、Brevibacterium selinum ATCC15112及Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354。
第2發明中，係將前述(a)、(b)、(c)、(d)及(e)中任一者皆無之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌作為寄主。麴菌屬菌，例如：黑麴黴(Aspergillus niger。包括Aspergillus awamori、Aspergillus kawachii等變種)、土麴黴(Aspergillus terreus)、Aspergillus itaconicus(Aspergillus itaconicus)等。貪銅菌屬菌，可列舉鉤蟲貪銅菌(Cupriavidus necator；別名Alcaligenes eutropha、Ralstonia eutropha、Wautersia eutropha)等。使用第2發明生產檸檬酸時，宜使用黑麴黴等麴菌屬菌等較佳。實施伊康酸之生產時，宜使用土麴黴、Aspergillus itaconicus等麴菌屬菌等較佳。實施(聚)3-羥基丁酸之生產時，宜使用鉤蟲貪銅菌等貪銅菌屬菌等較佳。
本發明之乙醯輔酶A生產微生物，可具有將乙醯輔酶A作為中間產物而生產代謝產物的各種路徑，或也可將該路徑相關的酵素活性強化。該路徑可列舉：生產異丙醇之路徑、生產丙酮之路徑、生產麩胺酸之路徑等。以下針對具有該等路徑且能生產來自乙醯輔酶A之有用代謝產物的微生物說明。
-生產異丙醇之微生物、生產丙酮之微生物-
本發明之係乙醯輔酶A生產微生物且有異丙醇生產路徑之微生物，例如：係將具有異丙醇生產路徑的微生物作為寄主，建構本發明之乙醯輔酶A生產微生物而得，或將本發明之乙醯輔酶A生產微生物中關連於異丙醇生產路徑之酵素之基因予以賦予或強化而得。以下有時將具有異丙醇生產路徑之微生物稱為「異丙醇生產微生物」，將具有異丙醇生產路徑之大腸菌(Escherichia coli)稱為「異丙醇生產大腸菌」。
異丙醇生產大腸菌係具備異丙醇生產路徑之大腸菌，指擁有利用基因重組技術導入之異丙醇生產能力的大腸菌。如此的異丙醇生產路徑，只要是能在對象大腸菌使異丙醇生產者即可。異丙醇生產大腸菌宜為硫解酶(thiolase)活性、輔酶A轉移酶活性、乙醯乙酸去羧酶活性、及異丙醇去氫酶活性的4種酵素活性被賦予或強化較佳。
使用本發明之乙醯輔酶A生產微生物生產丙酮時，可使用具有異丙醇生產路徑當中之硫解酶活性、輔酶A轉移酶活性及乙醯乙酸去羧酶活性的微生物。該微生物不具有異丙醇生產路徑中之異丙醇去氫酶活性。
本發明之乙醯輔酶A生產微生物，當係以埃希氏菌屬細菌作為寄主而建構之微生物時，宜為以下之態樣較佳。
理想之一例，係對於埃希氏菌屬細菌賦予或強化硫解酶活性、輔酶A轉移酶活性、乙醯乙酸去羧酶活性、及異丙醇去氫酶活性而得之乙醯輔酶A生產微生物。利用該微生物能以良好效率生產異丙醇。
理想態樣之另一例，係對於埃希氏菌屬細菌賦予或強化硫解酶活性、輔酶A轉移酶活性、及乙醯乙酸去羧酶活性而得之乙醯輔酶A生產微生物。利用該微生物能以良好效率生產丙酮。
以下針對異丙醇生產路徑及構成此路徑的酵素詳細說明。
硫解酶，分類為酵素編號2.3.1.9，係指催化由乙醯輔酶A生成乙醯乙醯輔酶A之反應的酵素的總稱。例如：Clostridium acetobutylicum(Clostridium acetobutylicum)、Clostridium beijerinckii(Clostridium beijerinckii)等梭狀芽胞桿菌(Clostridium)屬細菌、大腸桿菌(Escherichia coli)等埃希氏菌屬細菌、Halobacterium種(Halobacterium sp.)細菌、Zoogloea ramigera(Zoogloea ramigera)等動膠菌(Zoogloea)屬細菌、Rhizobium種(Rhizobium sp.)細菌、Bradyrhizobium japonicum(Bradyrhizobium japonicum)等慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)屬細菌、Candida tropicalis(Candida tropicalis)等念珠菌(Candida)屬細菌、Caulobacter crescentus(Caulobacter crescentus)等莖菌(Caulobacter)屬細菌、Streptomyces collinus(Streptomyces collinus)等鏈絲菌屬細菌、Enterococcus faecalis(Enterococcus faecalis)等腸球菌(Enterococcus)屬細菌來源者。
作為前述硫解酶之基因，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為硫解 酶之基因之鹼基序列的DNA或基於其公知之鹼基序列而合成的合成DNA序列。理想者可列舉具有Clostridium acetobutylicum、Clostridium beijerinckii等梭狀芽胞桿菌屬屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Halobacterium種之細菌、Zoogloea ramigera等Zoogloea屬細菌、Rhizobium種之細菌、Bradyrhizobium japonicum等慢生根瘤菌屬細菌、Candida tropicalis等念珠菌屬細菌、Caulobacter crescentus等莖菌屬細菌、Streptomyces collinus等鏈絲菌屬細菌、Enterococcus faecalis等腸球菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。更理想者可列舉梭狀芽胞桿菌屬屬細菌、及埃希氏菌屬細菌等原核生物來源之基因之鹼基序列之DNA，尤佳為具有Clostridium acetobutylicum或大腸桿菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
輔酶A轉移酶，分類為酵素編號2.8.3.8，係指催化由乙醯乙醯輔酶A生成乙醯乙酸之反應的酵素的總稱。例如：Clostridium acetobutylicum(Clostridium acetobutylicum)、Clostridium beijerinckii(Clostridium beijerinckii)等梭狀芽胞桿菌屬屬細菌、Roseburia intestinalis(Roseburia intestinalis)等羅斯氏菌(Roseburia)屬細菌、Faecalibacterium prausnitzii(Faecalibacterium prausnitzii)等Faecalibacterium屬細菌、糞球菌(Coprococcus)屬細菌、Trypanosoma brucei(Trypanosoma brucei)等Trypanosoma、大腸桿菌(Escherichia coli：大腸桿菌)等埃希氏菌屬細菌來源者。
作為輔酶A轉移酶之基因，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為輔酶A轉移酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者可列舉具有Clostridium acetobutylicum等梭狀芽胞桿菌屬屬細菌、Roseburia intestinalis等Roseburia屬細菌、Faecalibacterium prausnitzii等Faecalibacterium屬細菌、糞球菌屬細菌、Trypanosoma brucei等Trypanosoma、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。更理想者可列舉梭狀芽胞桿菌屬屬細菌及埃希氏菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA，尤佳為具有Clostridium acetobutylicum及大腸桿菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
乙醯乙酸去羧酶，分類為酵素編號4.1.1.4，係指催化由乙醯乙酸生成丙酮之反應之酵素之總稱。例如：Clostridium acetobutylicum(Clostridium acetobutylicum)、Clostridium beijerinckii(Clostridium beijerinckii)等梭狀芽胞桿菌(Clostridium)屬細菌、Bacillus polymyxa(Bacillus polymyxa)等芽胞桿菌(Bacillus)屬細菌來源者。
作為乙醯乙酸去羧酶之基因，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為乙醯乙酸去羧酶之基因之鹼基序列的DNA或基於其公知之鹼基序列而合成的合成DNA序列。理想者可列舉具有Clostridium acetobutylicum等梭狀芽胞桿菌(Clostridium)屬細菌、Bacillus polymyxa等芽胞桿菌(Bacillus)屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。特佳為具有Clostridium acetobutylicum來源之基因之鹼基序列的DNA。
異丙醇去氫酶，分類為酵素編號1.1.1.80，係指催化由丙酮生成異丙醇之反應之酵素的總稱。例如：Clostridium beijerinckii(Clostridium beijerinckii)等梭狀芽胞桿菌(Clostridium)屬細菌來源者。
作為異丙醇去氫酶之基因，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為異丙醇去氫酶之基因之鹼基序列的DNA或基於其公知之鹼基序列而合成的合成DNA序列。理想者可列舉具有Clostridium beijerinckii等梭狀芽胞桿菌(Clostridium)屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
由酵素活性之觀點，上述4種酵素分別為選自於由梭狀芽胞桿菌(Clostridium)屬細菌、芽胞桿菌(Bacillus)屬細菌及埃希氏菌屬細菌構成之群組中之至少1者來源較佳，更佳為硫解酶及輔酶A轉移酶係埃希氏菌屬細菌來源，乙醯乙酸去羧酶及異丙醇去氫酶係梭狀芽胞桿菌(Clostridium)屬細菌來源的情形。
由酵素活性之觀點，上述4種酵素各選自於由Clostridium acetobutylicum、Clostridium beijerinckii及大腸桿菌構成之群組中之至少1者來源較佳；硫解酶及輔酶A轉移酶各為Clostridium acetobutylicum或大腸桿菌來源，乙醯乙酸去羧酶為Clostridium acetobutylicum來源，異丙醇去氫酶為Clostridium beijerinckii來源更佳；硫解酶及輔酶A轉移酶為大腸桿菌來源，乙醯乙酸去羧酶為Clostridium acetobutylicum來源，異丙醇去氫酶為Clstridium beijerinckii來源更理想。
大腸菌來源之輔酶A轉移酶基因(atoD及atoA)與硫解酶基因(atoB)，以atoD、atoA、atoB的順序在大腸菌基因體上形成操縱組(operon)(Journal of Bacteriology,1987；169(1)：42-52)。故可藉由改變atoD的啟動子而同時控制輔酶A轉移酶基因與硫解酶基因之表現。
因此輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性係由為寄主之大腸菌之基因體基因獲得者之情形，從獲得充分的異丙醇生產能力的觀點，宜將負責兩酵素基因表現之啟動子取代為其他啟動子等以增強兩酵素基因之表現較佳。作為為了增強輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性之表現而使用之啟動子，可列舉大腸桿菌來源之甘油醛3-磷酸去氫酶(GAPDH)啟動子等。大腸桿菌來源之GAPDH啟動子，在GenBank accession number X02662之鹼基序列資訊中記載於鹼基編號397~440。
作為異丙醇生產大腸菌，可列舉記載於國際公開第2009/008377號之可由植物來源材料生成異丙醇之pIPA/B株或pIaaa/B株為例。此大腸菌包括：輔酶A轉移酶活性與硫解酶活性係強化大腸菌基因體上之各基因之表現且乙醯乙酸去羧酶活性與異丙醇去氫酶活性係以質體導入而強化表現之株(本說明書有時記載為pIa/B：：atoDAB株)。此外，作為異丙醇生產大腸菌，可列舉國際公開第2009/094485號、國際公開第2009/094485號、國際公開第2009/046929號、國際公開第2009/046929號記載之微生物為例。
異丙醇生產大腸菌，也可為轉錄抑制因子GntR之活性被失活，而且具備異丙醇生產路徑、及顯示維持或強化隨著GntR活性之失活而提升之異丙 醇生產能力之酵素活性樣式的輔助酵素群的異丙醇生產大腸菌。藉此，能以更高產量生產異丙醇。
本發明中「輔助酵素群」係指影響異丙醇生產能力之1種或2種以上的酵素。輔助酵素群不須由多數酵素構成，也可由1種酵素構成。輔助酵素群的各酵素活性，被失活、活化或強化，本發明中「輔助酵素群的酵素活性樣式」，係指能使僅藉由使GntR活性失活而獲得之提高的異丙醇生產量維持或增加的各酵素的酵素活性樣式，包括1種或2種以上的酵素的組合。
作為輔助酵素群的酵素活性樣式，較佳可列舉下列(i)~(iii)之樣式。其中，下列(iii)由異丙醇生產能力之觀點較理想。
(i)葡萄糖-6-磷酸異構酶(Pgi)活性、葡萄糖-6-磷酸-1-去氫酶(Zwf)活性及磷酸葡萄糖酸去氫酶(Gnd)活性之野生型之維持。
(ii)葡萄糖-6-磷酸異構酶(Pgi)活性之失活、葡萄糖-6-磷酸-1-去氫酶(Zwf)活性之強化。
(iii)葡萄糖-6-磷酸異構酶(Pgi)活性之失活、葡萄糖-6-磷酸-1-去氫酶(Zwf)活性之強化與磷酸葡萄糖酸去氫酶(Gnd)活性之失活。
前述輔助酵素群及其酵素活性樣式不限於上述，包括GntR活性之失活，且若為能增加在異丙醇生產大腸菌中之異丙醇生產量之輔助酵素群及其酵素活性樣式者，均包括在本發明。
前述GntR，係指Entner-Doudoroff路徑之葡萄糖酸(gluconic acid)代謝相關的控制操縱組為負之轉錄因子。GntR係指抑制負責葡萄糖酸(gluconic acid)之攝入及代謝之二個基因群(GntI與GntII)之作用的GntR轉錄抑制因子的總稱。
葡萄糖-6-磷酸異構酶(Pgi)，分類為酵素號5.3.1.9，係指催化從D-葡萄糖-6-磷酸生成D-果糖-6-磷酸之反應之酵素的總稱。
葡萄糖-6-磷酸-1-去氫酶(Zwf)，分類為酵素號1.1.1.49，係指催化從D-葡萄糖-6-磷酸生成D-葡糖酸-1,5-內酯-6-磷酸之反應之酵素的總稱。例如：Deinococcus radiophilus(Deinococcus radiophilus)等異常球菌(Deinococcus)屬菌、黑麴黴(Aspergillus niger)、Aspergillus aculeatus(Aspergillus aculeatus)等麴菌屬菌、Acetobacter hansenii(Acetobacter hansenii)等醋酸菌屬菌、Thermotoga maritima(Thermotoga maritima)等熱袍菌屬菌、Cryptococcus neoformans(Cryptococcus neoformans)等隱球菌屬菌、Dictyostelium discoideum(Dictyostelium discoideum等)之網柄菌屬菌、Pseudomonas fluorescens(Pseudomonas fluorescens)、Pseudomonas aeruginosa(Pseudomonas aeruginosa等假單胞菌屬、Saccharomyces cerevisiae(Saccharomyces cerevisiae)等酵母菌屬、Bacillus megaterium(Bacillus megaterium)等芽孢桿菌屬菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌來源者。
作為葡萄糖-6-磷酸-1-去氫酶(Zwf)之基因，可利用從上述微生物獲得之具有編碼為Zwf之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者可列舉具有Deinococcus radiophilus(Deinococcus radiophilus)等異常球菌屬菌、黑麴黴(Aspergillus niger)、Aspergillus aculeatus(Aspergillus aculeatus)等麴菌屬菌、Acetobacter hansenii(Acetobacter hansenii)等醋酸菌屬菌、Thermotoga maritima(Thermotoga maritima)等熱袍菌屬菌、Cryptococcus neoformans(Cryptococcus neoformans)等隱球菌屬菌、Dictyostelium discoideum(Dictyostelium discoideum等)之網柄菌屬菌、Pseudomonas fluorescens(Pseudomonas fluorescens)、Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa等假單胞菌屬、Saccharomyces cerevisiae(Saccharomyces cerevisiae)等酵母菌屬、Bacillus megaterium(Bacillus megaterium)等芽孢桿菌屬菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。更理想者可列舉具有異常球菌屬菌、麴菌屬菌、醋酸菌屬菌、熱袍菌屬菌、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬菌、埃希氏菌屬細菌等原核生物來源之基因之鹼基序列之DNA，尤佳為具有大腸桿菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
磷酸葡萄糖酸去氫酶(Gnd)，分類為酵素編號1.1.1.44，係指催化由6-磷酸-D-葡萄糖酸生成D-核酮糖-5-磷酸與CO2之反應的酵素的總稱。
上述酵素活性之賦予或強化，可藉由對於寄主導入基因、強化寄主在基因體上擁有之酵素基因之啟動子活性、將前述啟動子取代為其他啟動子、及該等之組合以進行。
生產異丙醇之大腸菌之啟動子，係指有sigma因子之RNA聚合酶結合並開始轉錄的部位。啟動子只要可控制基因之表現者即可，可為持續在微生物內作用的強力啟動子且即使於葡萄糖存在下時表現仍不易受抑制之啟動子。具體而言，可列舉GAPDH啟動子或絲胺酸羥基甲基轉移酶之啟動子。
生產異丙醇之大腸菌中，乳酸去氫酶(LdhA)之基因(ldhA)也可已破壞。藉此，即使在氧供給受限的培養條件下，乳酸之生產仍會受抑制，能以良好效率生產異丙醇。氧供給受限之培養條件，於將培養液攪拌使其通氣之氣體僅使用空氣之情形，一般指0.02vvm~2.0vvm(vvm；通氣容量[mL]/液容量[mL]/小時[分])、轉速200~600rpm。乳酸去氫酶(LdhA)，係指從丙酮酸與NADH生成D-乳酸與NAD之酵素。
-麩胺酸生產相關之微生物-
本發明之乙醯輔酶A生產微生物，可具有將乙醯輔酶A作為中間產物而生產麩胺酸之各種路徑，或也可強化與該路徑相關之酵素活性。
係本發明之乙醯輔酶A生產微生物且具有麩胺酸生產路徑之微生物，例如可藉由將具有麩胺酸生產路徑之微生物作為寄主，建構本發明之乙醯輔酶A生產微生物而獲得，或在將本發明之乙醯輔酶A生產微生物中賦予或強化關於麩胺酸生產路徑之酵素之基因以獲得。以下有時將具有麩胺酸生產路徑之微生物稱為「麩胺酸生產微生物」。
作為麩胺酸生產微生物，可列舉具有L-胺基酸生產能力的微生物。作為麩胺酸生產微生物之理想具體例，可列舉已賦予或強化麩胺酸生產路徑之埃希氏菌屬細菌、泛菌屬細菌等腸內細菌科屬菌、Corynebacterium glutamicum等棒桿型菌。
對於微生物賦予或強化麩胺酸生產能力之方法，例如包括以使編碼為L-麩胺酸生合成酵素之基因之表現增大及/或過度表現的方式進行的改變。作為L-麩胺酸生合成酵素之例，例如：麩胺酸去氫酶、麩醯胺酸合成酶、麩胺酸合酶、異檸檬酸去氫酶、烏頭酸(Aconitic acid)水合酶、檸檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸去氫酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、烯醇酶、磷酸甘油變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸去氫酶、三碳糖磷酸異構酶、果糖-2-磷酸醛醇縮酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖磷酸異構酶等。該等酵素之中，檸檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、及麩胺酸去氫酶中之1種或多種之活性增大較佳，該等3種酵素活性全部增強更佳。如此之麩胺酸生產微生物，例如日本特開2005-278643號公報記載之麩胺酸生產微生物。
L-麩胺酸生產菌，可使用於酸性條件下培養時，具有在液體培養基中累積超過L-麩胺酸之飽和濃度之量之L-麩胺酸之能力(以下有時稱為於酸性條件下之L-麩胺酸累積能力)的微生物。例如：可依歐洲公開公報1078989號記載之方法，藉由於低pH環境下取得對於L-麩胺酸之耐性提高之菌株，而對於本發明之微生物賦予累積超過飽和濃度之量之L-麩胺酸之能力。
原本於酸性條件下具有L-麩胺酸累積能力之微生物，具體而言可列舉Pantoea ananatisAJ13356株(FERM BP-6615)及AJ13601株(FERM BP-7207)(以上參照歐洲專利申請案公開0952221號說明書)等。Pantoea ananatisAJ13356係於1998年2月19日在通產省工業技術院生命工學工業技術研究所(現名稱為獨立行政法人 製品評價技術基盤機構 特許生物寄存中心(NITE-IPOD))以寄存號FERM P-16645寄存，於1999年1月11日依 布達佩斯條約移送保管於國際寄存並賦予寄存號FERM BP-6615。又，同株在分離時鑑別為Enterobacter agglomerans(Enterobacter agglomerans)，以Enterobacter agglomeransAJ13355之名寄存，但近年由於16S rRNA之鹼基序列解析等，再分類為Pantoea ananatis(Pantoea ananatis)(參照實施例)。又，從後述AJ13355誘導出的菌株AJ13356、及AJ13601，也同樣作為Enterobacter agglomerans於前述寄存機關寄存，但本說明書記載為Pantoea ananatis。AJ13601係於1999年8月18日於經濟產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(現名稱為獨立行政法人 製品評價技術基盤機構 特許生物寄存中心(NITE-IPOD))以寄存號FERM P-17156寄存，於2000年7月6日基於布達佩斯條約移送保管於國際寄存，並賦予寄存號FERMBP-7207。
賦予或增強L-麩胺酸生產能力的其他方法，還可列舉：賦予對於有機酸類似物或呼吸抑制劑等之耐性之方法、或賦予對於細胞壁合成抑制劑之感受性之方法。例如可列舉：賦予單氟乙酸耐性之方法(日本特開昭50-113209號公報)、賦予腺嘌呤耐性或胸腺嘧啶耐性之方法(日本特開昭57-065198號公報)、弱化尿素酶之方法(日本特開昭52-038088號公報)、賦予丙二酸耐性之方法(日本特開昭52-038088號公報)、賦予對於苯并哌哢(benzopyrone)或萘醌類之耐性之方法(日本特開昭56-1889號公報)、賦予HOQNO耐性之方法(日本特開昭56-140895號公報)、賦予α-酮丙二酸耐性之方法(日本特開昭57-2689號公報)、賦予胍(guanidine)耐性之方法(日本特開昭56-35981號公報)、賦予對於盤尼西林之感受性之方法(日本特開平4-88994號公報)等。
如此的耐性菌之具體例可列舉如下列之菌株。
．Brevibacterium flavumAJ3949(FERMBP-2632；參照日本特開昭50-113209號公報)
．Corynebacterium glutamicumAJ11628(FERM P-5736；參照日本特開昭57-065198號公報)
．Brevibacterium flavumAJ11355(FERM P-5007；參照日本特開昭56-1889號公報)
．Corynebacterium glutamicumAJ11368(FERM P-5020；參照日本特開昭 56-1889號公報)
．Brevibacterium flavumAJ11217(FERM P-4318；參照日本特開昭57-2689號公報)
．Corynebacterium glutamicumAJ11218(FERM P-4319；參照日本特開昭57-2689號公報)
．Brevibacterium flavumAJ11564(FERM P-5472；參照日本特開昭56-140895公報)
．Brevibacterium flavumAJ11439(FERM P-5136；參照日本特開昭56-35981號公報)
．Corynebacterium glutamicumH7684(FERM BP-3004；參照日本特開平04-88994號公報)
．Brevibacterium lactofermentumAJ11426(FERM P-5123；參照日本特開平56-048890號公報)
．Corynebacterium glutamicumAJ11440(FERM P-5137；參照日本特開平56-048890號公報)
．Brevibacterium lactofermentumAJ11796(FERM P-6402；參照日本特開平58-158192號公報)
具有L-麩醯胺酸生產能力之微生物之較佳例，為麩胺酸去氫酶活性經強化之菌、麩醯胺酸合成酶(glnA)活性經強化之菌、麩醯胺酸酶基因經破壞之菌(歐洲專利申請案公開1229121號、1424398號說明書)。麩醯胺酸合成酶之活性增強，也可藉由麩醯胺酸腺嘌呤基轉移酶(glnE)之破壞、PII控制蛋白質(glnB)之破壞達成。又，屬於埃希氏菌屬且麩醯胺酸合成酶之397位之酪胺酸殘基經取代為其他胺基酸殘基而得之具變異型麩醯胺酸合成酶之菌株亦為理想之L-麩醯胺酸生產菌之例(美國專利申請案公開第2003-0148474號說明書)。
賦予或增強L-麩醯胺酸生產能力之其他方法，可列舉賦予6-重氮-5-側氧基-正白胺酸耐性之方法(日本特開平3-232497號公報)、賦予嘌呤類似物耐性及甲硫胺酸亞碸耐性之方法(日本特開昭61-202694號公報)、賦予α- 酮馬來酸耐性之方法(日本特開昭56-151495號公報)等。具有L-麩醯胺酸生產能力之棒桿型菌之具體例，可列舉以下微生物。
．Brevibacterium flavumAJ11573(FERM P-5492；日本特開昭56-161495號公報)
．Brevibacterium flavumAJ11576(FERM BP-10381；日本特開昭56-161495號公報)
．Brevibacterium flavum AJ12212(FERM P-8123；日本特開昭61-202694號公報)
生產脯胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、精胺酸、瓜胺酸、鳥胺酸、及/或聚麩胺酸之微生物之較佳例，記載於日本特開2010-41920號公報。又，生產乙酸、(聚)3-羥基丁酸、伊康酸、檸檬酸、丁酸之微生物，記載於發酵手冊(共立出版)。製造4-胺基丁酸之微生物，例如可列舉對於生產麩胺酸之微生物導入有麩胺酸脫碳酸酵素之微生物(日本特開2011-167097號公報)。製造4-羥基丁酸之微生物，例如可列舉對於生產麩胺酸之微生物導入有麩胺酸脫碳酸酵素、胺基轉移酵素、醛脫氫酵素之微生物(日本特開2009-171960號公報)。
製造3-羥基異丁酸之微生物，可列舉導入有例如國際公開第2009/135074號小冊或國際公開第2008/145737號小冊記載之路徑之微生物。製造2-羥基異丁酸之微生物，可列舉導入有例如國際公開第2009/135074號小冊或國際公開第2009/156214號小冊記載之路徑之微生物。製造3-胺基異丁酸、及/或甲基丙烯酸之微生物，可列舉導入有例如國際公開第2009/135074號小冊記載之路徑之微生物。
<<乙醯輔酶A生產方法、將乙醯輔酶A作為中間產物之代謝產物之生產方法>>
第1發明之乙醯輔酶A生產方法、及將乙醯輔酶A作為中間產物之代謝產物之生產方法，包括：培養步驟，使第1發明之生產乙醯輔酶A之微 生物與碳源材料接觸並培養；及回收步驟，回收由接觸獲得之目的生產物(乙醯輔酶A、將乙醯輔酶A作為中間產物之代謝產物)。將乙醯輔酶A作為中間產物之代謝產物，例如：丙酮、異丙醇、麩胺酸。本發明中，有時總稱乙醯輔酶A、及將乙醯輔酶A作為中間產物之代謝產物為「目的生產物」。
第2發明之乙醯輔酶A生產方法、及將乙醯輔酶A作為中間產物之代謝產物之生產方法，包括：培養步驟，使第2發明之生產乙醯輔酶A之微生物與碳源材料接觸並培養；及回收步驟，回收由接觸獲得之目的生產物(乙醯輔酶A、或將乙醯輔酶A作為中間產物之代謝產物)。將乙醯輔酶A作為中間產物之代謝產物，例如：檸檬酸、伊康酸、(聚)3-羥基丁酸。本發明有時總稱乙醯輔酶A、及將乙醯輔酶A作為中間產物之代謝產物為「目的生產物」。
依照前述各生產方法，由於係使各微生物與碳源材料接觸而培養，前述生產乙醯輔酶A之微生物能利用碳源材料並邊固定二氧化碳，邊以良好效率生產目的生產物。
碳源材料只要是微生物可利用之含碳源之材料即可，不特別限制，宜為植物來源原料較佳。植物來源原料，係指包括根、莖、幹、枝、葉、花、種子等器官、含此等器官之植物體、此等植物器官之分解產物，再者，植物體、植物器官、或由此等之分解產物獲得之碳源當中可利用於在微生物培養時作為碳源者，都包括在植物來源原料。
如此的植物來源原料所包含之碳源中，一般者可列舉澱粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖等糖類、及含有多量此等成分之草木質分解產物、纖維素水解物等、及該等之組合，再者，植物油來源的甘油或脂肪酸在本發明中也可包括於碳源。
前述植物來源原料可宜為穀物等農作物，具體而且宜為例如玉米、米、小麥、大豆、甘蔗、甜菜、棉花等、及該等之組合為理想，其材料之使用 形態為未加工品、榨汁、粉碎物等，不特別限定。又，也可為僅為上述碳源之形態。
培養步驟中，生產乙醯輔酶A之微生物與植物來源原料之接觸，一般係以含有植物來源原料之培養基培養生產乙醯輔酶A之微生物而進行。
植物來源原料與生產乙醯輔酶A之微生物之接觸密度取決於生產乙醯輔酶A之微生物之活性而異，一般可為：就培養基中之植物來源原料之濃度而言，設定為以葡萄糖換算時，起始糖濃度相對於混合物(包括乙醯輔酶A生產微生物與碳源材料之混合物)之全部質量為20質量%以下，從生產乙醯輔酶A之微生物之耐糖性之觀點，較佳為起始糖濃度設定為15質量%以下。其他各成分，只要是對於微生物之培養基通常添加之量添加即可，不特別限制。
本發明之乙醯輔酶A生產方法，也可更包括以下步驟：對用於培養之培養基供給碳酸離子、碳酸氫離子、二氧化碳氣體(碳酸氣體)及/或還原劑之步驟(以下稱為供給步驟)。在用於培養之培養基中供給碳酸離子、碳酸氫離子及/或二氧化碳氣體，藉此增強磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶等酵素活性，增大二氧化碳之固定量，能有效率地生產目的生產物。供給步驟之溫度、pH等各條件，若無特別記載，可適用與培養步驟之各條件為同樣的條件。
碳酸離子或碳酸氫離子，只要是來自藉由對於培養基供給而能生成碳酸離子及/或碳酸氫離子之成分者即可。能生成碳酸離子及/或碳酸氫離子之成分，例如：碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸銨、碳酸氫銨、碳酸鎂、碳酸鈣等。
就對於培養基供給之碳酸離子及/或碳酸氫離子之量，只要能有效率地生產目的生產物即可，不特別限制。作為培養基每1L之總供給量，宜為150mmol以上較佳。藉由供給150mmol/L以上之碳酸離子及/或碳酸氫離子，能充分提升目的生產物之產率。培養基每1L之碳酸離子及/或碳酸氫離 子之總供給量更佳為200mmol以上。
又，培養基每1L之碳酸離子及/或碳酸氫離子之總供給量為5mol以下較佳。培養基每1L之總供給量若為5mol以下，不會有產生多量於培養步驟未被菌體使用之碳酸離子、碳酸氫離子之虞。培養基每1L之碳酸離子及/或碳酸氫離子之總供給量更佳為3mol以下，又更佳為2mol以下。
碳酸離子及/或碳酸氫離子對於培養基之供給方法可依公知方法。供給之時點可於培養開始時、也可為培養中，無特殊限定。碳酸離子及/或碳酸氫離子可以一次供給，也可分次供給。
二氧化碳氣體只要是含二氧化碳之氣體即可，例如可為空氣。二氧化碳氣體之二氧化碳濃度較佳為空氣中之二氧化碳濃度以上，更佳為0.1v/v%以上，又更佳為1v/v%以上。
又，二氧化碳濃度較佳為75v/v%以下，更佳為50v/v%以下，又更佳為25v/v%以下。
二氧化碳氣體可藉由打氣泡(bubbling)等而使其溶存於培養基中。對於培養基中供給之二氧化碳氣體之平均氣泡徑，能有效率地生產目的生產物者即可，無特殊限制。例如：平均氣泡徑100μm以上之二氧化碳氣體較佳。若為平均氣泡徑100μm以上之二氧化碳氣體，造成培養基中之起泡性極度增加，且發酵培養難以繼續的可能性低。更佳為平均氣泡徑200μm以上之二氧化碳氣體，又更佳為平均氣泡徑500μm以上之二氧化碳氣體。又，平均氣泡徑100cm以下之二氧化碳氣體較佳。平均氣泡徑若為100cm以下，能使足量的二氧化碳溶存於培養基中，為較理想。更佳為平均氣泡徑50cm以下之二氧化碳氣體，又更佳為平均氣泡徑20cm以下之二氧化碳氣體。
二氧化碳氣體可使用通常使用的氣泡產生器對於培養基供給。氣泡產生器，例如空氣噴布器(air sparger)等。
平均氣泡徑之測定方法，可列舉例如：使用粒度分布測定裝置(例如： Beckmancoulter公司製LS 13 320)依雷射繞射散射法測定的方法、使用精密粒度分布測定裝置(例如：Beckmancoulter公司製Multisizer3)依細孔電阻法測定之方法、使用高速攝影機將陰影圖像予以2值化並處理之方法等。
作為還原劑，只要是能在培養中將培養基或菌體中之成分還原，還原劑本身被氧化之成分即可，無特殊限制。例如：硫化物、碳化合物、氫等。硫化物，例如：亞硫酸鹽(亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鉀、亞硫酸銨等)、硫代硫酸鹽(硫代硫酸鈉、硫代硫酸鉀等)、硫化物離子之鹽(硫化鈉、硫化氫鈉、硫化鉀、硫化銨等)、半胱胺酸、二氧化硫、硫化氫等。碳化合物，例如：醇類、脂肪酸、石蠟、一氧化碳等。作為還原劑宜為硫化物，其中亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫化鈉、半胱胺酸較理想，亞硫酸鈉最理想。
對於培養基供給之還原劑之濃度，只要能有效率地生產目的生產物即可，不特別限制，可因應供給之成分適當設定。例如：作為亞硫酸鈉之濃度，宜定為培養基每1L之濃度為0.01g/L以上，更佳為0.1g/L以上，又更佳為1g/L以上。又，供給之還原劑之濃度宜定為較佳為50g/L以下，更佳為20g/L以下，又更佳為10g/L以下。
本發明之乙醯輔酶A生產方法，可更包含氣體供給步驟，係將由於培養而產生之含二氧化碳之氣體並對於培養用之培養基供給該氣體。亦即，可將培養基中消耗而作為排氣釋放的二氧化碳氣體再度對於培養基供給，而使其循環再利用。
作為將氣體對於培養基供給之方法，只要是通常可使用之方法即可，不特別限制。例如由具有細孔之環狀或板狀之構件將氣體在液體中加壓並噴出之方法(氣體為空氣的情形，使用稱為灌氣器(Aerator)或灌氣之方法)、從稱為通風管之在側周面全面有空隙之中空管供給之方法，使用在塑膠製或不銹鋼製的管的前端部裝有為了使空氣等的細小氣泡產生而開了無數孔的多孔性物質的空氣噴布器(氣體分散器)的方法等。
培養基中之乙醯輔酶A生產微生物之含量，取決於微生物之種類及活性而異，一般而言，設定培養開始時投入之前培養之菌液(OD660nm=4~8)之量相對於培養液為0.1質量%至30質量%，從培養條件控制之觀點，較佳為1質量%~10質量%。
生產乙醯輔酶A之微生物之培養使用之培養基，只要是含有碳源、氮源、無機離子、及微生物為了生產目的生產物所要求之無機微量元素、核酸、維生素類等之通常使用之培養基即可，不特別限制。
第1發明中，於培養步驟之培養條件無特別的限制，例如於好氣條件下，於pH4~9(較佳為pH6~8)、溫度為20℃~50℃(較佳為25℃~42℃)之範圍內於控制pH與溫度的狀態進行培養。
第2發明中，於培養步驟之培養條件無特別的限制。若為麴菌屬菌，例如於好氣條件下，於pH1~10(較佳為pH3~7)且溫度20℃~50℃(較佳為25℃~42℃)之範圍內於控制pH與溫度之狀態進行培養。若為貪銅菌屬菌，例如於好氣條件下於pH4~9(較佳為pH6~8)且溫度20℃~50℃(較佳為25℃~42℃)之範圍內於控制pH與溫度之狀態進行培養。
氣體於包含乙醯輔酶A生產微生物與碳源材料之混合物中之通氣量，不特別限制，當氣體僅使用空氣之情形，一般為0.02vvm~2.0vvm(vvm；通氣容量[mL]/液容量[mL]/小時[分])、50~600rpm，從抑制對於微生物之物理性損害的觀點，以0.1vvm~2.0vvm進行較佳，更佳為0.1vvm~1.0vvm。
培養步驟可以從培養開始繼續進行到混合物中之碳源材料消耗為止，或生產乙醯輔酶A之微生物之活性消失為止。培養步驟之期間，取決於混合物中之生產乙醯輔酶A之微生物之數及活性及碳源材料之量而異，一般進行1小時以上，較佳為4小時以上即可。培養步驟可藉由將碳源材料或生產乙醯輔酶A之微生物再投入，而無限制地連續培養期間，但是從處理效率之觀點，一般為5日以下，較佳為72小時以下。其他條件，可直接應 用通常培養使用之條件。
將培養液中累積的目的生產物回收之方法，無特別的限制，例如培養步驟獲得之培養液係混合目的生產物及其他成分之混合液，故例如可從培養液將菌體以離心分離等除去後，以因應目的生產物之種類之條件利用蒸餾或膜分離等通常之分離方法將目的生產物予以分離之方法。
又，本發明之乙醯輔酶A生產方法，也可在培養步驟之前包含用以使使用之生產乙醯輔酶A之微生物成為適當菌數或/及適度活性狀態之前培養步驟。前培養步驟，可因應生產乙醯輔酶A之微生物之種類之通常使用之培養條件進行培養。
-異丙醇生產方法、丙酮生產方法-
本發明之異丙醇生產方法及丙酮生產方法，包括使用乙醯輔酶A生產微生物，從碳源材料生產各目的生產物異丙醇或丙酮。亦即，本發明之異丙醇生產方法及丙酮生產方法包括以下步驟：使乙醯輔酶A生產微生物與碳源材料接觸而培養之培養步驟；及將利用前述接觸而得之目的生產物(異丙醇或丙酮)回收之回收步驟。
作為異丙醇生產方法使用之乙醯輔酶A生產微生物，從異丙醇之生產效率之觀點，作為乙醯輔酶A生產微生物之一理想態樣之前述具有硫解酶活性、輔酶A轉移酶活性、乙醯乙酸去羧酶活性及異丙醇去氫酶活性者較理想。
作為丙酮生產方法使用之乙醯輔酶A生產微生物，從丙酮之生產效率之觀點，作為乙醯輔酶A生產微生物之一理想態樣之前述具有硫解酶活性、輔酶A轉移酶活性及乙醯乙酸去羧酶活性者較理想。
異丙醇生產方法及丙酮生產方法較佳為包含以下步驟：培養步驟(有時也稱為「通氣培養步驟」)，邊對於包含乙醯輔酶A生產微生物及碳源材料之混合物中供給氣體，邊培養乙醯輔酶A生產微生物；及目的生產物回收步 驟，從混合物將由前述培養步驟生成之目的生產物(異丙醇或丙酮)分離並回收。藉由於通氣培養步驟中之通氣培養，目的生產物會釋放到混合物中，且同時混合物蒸散，其結果能輕易地將目的生產物從混合物分離。又，目的生產物係從混合物被連續地分離，所以能夠抑制混合物中之目的生產物之濃度上昇。所以，無須特別考慮乙醯輔酶A生產微生物對於目的生產物的耐性。針對培養條件，可直接適用前述事項。
作為前述目的生產物回收步驟中之目的生產物之回收方法，只要能將培養而從混合物蒸散之氣體狀或飛沫狀之目的生產物予以收集即可。例如：容納到一般使用之密閉容器等收集構件，從能以高純度僅回收目的生產物之觀點，宜為包含使用以捕捉目的生產物之捕捉液與從混合物分離之目的生產物接觸之步驟的方法為較佳。
異丙醇生產方法或丙酮生產方法中，目的生產物可以溶於捕捉液或混合物之態樣回收。如此的回收方法，可列舉例如國際公開2009/008377號小冊記載之方法等。回收的目的生產物為水溶液的狀態時，本發明也可更包含脫水步驟。目的生產物之脫水可依常法實施。回收的目的生產物可使用HPLC等通常之檢測手段確認。回收的目的生產物視需要可進一步精製。精製方法可列舉蒸餾等。
能以溶於捕捉液或混合物之態樣回收的目的生產物之生產方法中可應用的裝置，例如：國際公開2009/008377號小冊之圖1所示之生產裝置。該生產裝置中，於容納含有使用之微生物及植物來源原料之培養基之培養槽，連結著用於從裝置外部注入氣體的注入管，可對於培養基通氣。培養槽經由連結管連結於容納有做為捕捉液(捕集液)的捕集槽。於培養槽由於通氣培養生成之目的生產物由於通氣而蒸散，可輕易地從培養基分離，且同時此時往捕集槽移動之氣體或液體與捕集液接觸而產生氣泡，被捕集液捕捉。依此生產裝置，能以更為精製的形態連續且簡便地生產目的生產物。
-麩胺酸生產方法-
本發明之麩胺酸生產方法，包含使用乙醯輔酶A生產微生物由碳源材料生產目的生產物即麩胺酸的步驟。亦即本發明之麩胺酸生產方法包含以下步驟：培養步驟，使乙醯輔酶A生產微生物與碳源材料接觸並培養；及回收步驟，回收利用前述接觸而獲得之目的生產物(麩胺酸)。
依本發明之麩胺酸生產方法，係使乙醯輔酶A生產微生物與碳源材料接觸並培養，故乙醯輔酶A生產微生物會利用碳源材料，邊固定二氧化碳邊以良好效率生產麩胺酸。
培養使用之培養基，可使用含有碳源；氮源；無機鹽類；胺基酸、維生素等有機微量營養素之通常之培養基。合成培養基或天然培養基均可使用。培養基使用之碳源及氮源只要是培養的菌株可利用者各種種類均可使用。
碳源材料，可以使用葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、澱粉水解物、糖蜜等糖類，此外乙酸、檸檬酸等有機酸、乙醇等醇類也可單獨使用或與其他碳源併用。氮源可使用氨、硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨、乙酸銨等銨鹽；硝酸鹽等。無機鹽類可使用磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、錳鹽等。有機微量營養素，可使用胺基酸、維生素、脂肪酸、核酸、以及含有該等之蛋白腖、酪蛋白胺基酸(casamino acid)、酵母萃取物、黃豆蛋白分解物等，當使用對於生長要求有胺基酸等之營養要求性變異株時，宜補添要求之營養素較佳。
培養較佳為控制在溫度20~45℃、pH控制為3~9，並進行通氣培養。又，pH調整可使用無機或有機之酸性、鹼性物質、氨氣等。藉由在如此的條件下較佳為培養約10小時~120小時，於培養液中或菌體內會累積L-胺基酸。
又，目的之L-胺基酸為L-麩胺酸之情形，也可使用調整為L-麩胺酸析出之條件之液體培養基，邊於培養基中使L-麩胺酸析出邊進行培養使生 成、累積。L-麩胺酸析出之條件，例如：pH4.0~5.0，較佳為pH4.0~4.5，更佳為pH4.0~4.3，尤佳為pH4.0之酸性條件。又，為了兼顧於酸性條件下之生長提高及有效率的析出L-麩胺酸，pH較佳為4.0~5.0，更佳為4.0~4.5，更佳為4.0~4.3。又，於上述pH之培養，可在培養的全部期間也可為一部分的期間。
培養結束後從培養液採取L-胺基酸之方法，利用公知回收方法實施即可。例如：從培養液去除菌體之後進行濃縮晶析之方法或利用離子交換層析等採取。當於使培養基中析出L-麩胺酸之條件下培養之情形，析出培養液中之L-麩胺酸可利用離心分離或過濾等採取。於此情形，也可使溶於培養基中之L-麩胺酸晶析後再一併單離。
-檸檬酸生產方法、伊康酸生產方法、(聚)3-羥基丁酸生產方法-
本發明之檸檬酸生產方法、伊康酸生產方法、(聚)3-羥基丁酸生產方法，包含使用乙醯輔酶A生產微生物從碳源材料分別生產目的生產物(檸檬酸、伊康酸、或(聚)3-羥基丁酸)之步驟。亦即本發明之檸檬酸生產方法、伊康酸生產方法、(聚)3-羥基丁酸生產方法，包含以下步驟：培養步驟，使乙醯輔酶A生產微生物與碳源材料接觸並培養；回收步驟，回收利用前述接觸獲得之目的生產物(檸檬酸、伊康酸、或(聚)3-羥基丁酸)。
依上述各生產方法，係使乙醯輔酶A生產微生物與碳源材料接觸並培養，故乙醯輔酶A生產微生物會利用碳源材料，邊固定二氧化碳邊以良好效率生產目的生產物(檸檬酸、伊康酸、或(聚)3-羥基丁酸)。
培養使用之培養基，可使用含有碳源；氮源；無機鹽類；胺基酸、維生素等有機微量營養素之通常之培養基。合成培養基或天然培養基均可使用。培養基使用之碳源及氮源只要是培養的菌株可利用者各種種類均可使用。
碳源材料，可以使用葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、 半乳糖、澱粉水解物、糖蜜等糖類，此外乙酸、檸檬酸等有機酸、乙醇等醇類也可單獨使用或與其他碳源併用。氮源可使用氨、硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨、乙酸銨等銨鹽；硝酸鹽等。無機鹽類可使用磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、錳鹽等。有機微量營養素，可使用胺基酸、維生素、脂肪酸、核酸、以及含有該等之蛋白腖、酪蛋白胺基酸(casamino acid)、酵母萃取物、黃豆蛋白分解物等，當使用對於生長要求有胺基酸等之營養要求性變異株時，宜補添要求之營養素較佳。
本發明之檸檬酸生產方法、伊康酸生產方法、及(聚)3-羥基丁酸生產方法中，目的生產物(檸檬酸、伊康酸、或(聚)3-羥基丁酸)可以以溶於培養液之態樣、使其從培養液以固體形式析出之態樣、或累積於菌體內之態樣回收。回收之目的生產物為水溶液之狀態時，本發明可更包含脫水步驟。目的生產物之脫水可依常法進行。回收之目的生產物可依HPLC等通常的檢測方法確認。回收的目的生產物視需要可進一步精製。精製方法例如晶析、利用離子交換樹脂等所為之管柱精製等。
應用本發明之微生物生產脯胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、精胺酸、瓜胺酸、鳥胺酸、乙酸、(聚)3-羥基丁酸、伊康酸、檸檬酸、丁酸、聚麩胺酸之方法，可列舉例如發酵手冊(共立出版)p363~p364、p61~p63、p61~p63、p61~p63、p40~p42、p40~p42、p40~p42、p189~p192、p377~p378、p64~p65、p124~p125、p19~p23、p373記載之方法。
應用本發明之微生物生產4-胺基丁酸之方法，例如：利用對於麩胺酸生產微生物導入了麩胺酸脫碳酸酵素的微生物(日本特開2011-167097號公報)的生產方法。
應用本發明之微生物生產4-羥基丁酸之方法，例如利用於麩胺酸生產微生物導入了麩胺酸脫碳酸酵素、胺基轉移酵素、及醛脫氫酵素之微生物(日本特開2009-171960號公報)的生產方法。
應用本發明之微生物生產3-羥基異丁酸之方法，例如利用導入了國際公開第2009/135074號或國際公開第2008/145737號記載之路徑的微生物的生產方法。
應用本發明之微生物生產2-羥基異丁酸之方法，例如利用導入了國際公開第2009/135074號或國際公開第2009/156214號記載之路徑之微生物的生產方法。
應用本發明之微生物生產3-胺基異丁酸及/或甲基丙烯酸之方法，例如利用導入了國際公開第2009/135074號記載之路徑之微生物的生產方法。
【實施例】
以下依實施例詳細說明本發明。但是本發明不限於實施例。
為了使從細胞外導入之基因表現所必要的啟動子，可以使用大腸桿菌來源之甘油醛3-磷酸去氫酶(GAPDH)之啟動子。大腸桿菌來源之GAPDH啟動子之鹼基序列，在GenBank accession number X02662之鹼基序列資訊記載於397~440。以下實施例中之GAPDH啟動子，係指上述GAPDH啟動子。
大腸桿菌MG1655可由ATCC(美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection))取得。
大腸桿菌B(ATCC11303)可由ATCC取得。
Methylococcus capsulatusATCC33009之基因體DNA(ATCC33009D-5)可由ATCC取得。
棒桿菌DSM1412可由DSMZ(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)取得。
Rhodococcus jostiiNBRC16295可由NBRC(獨立行政法人製品評價技術基盤機構生物技術本部生物遺傳資源部門)取得。
黑麴黴ATCC1015可由ATCC取得。
土麴黴NBRC6365可由NBRC取得。
鉤蟲貪銅菌JMP134(DSM4058)可由DSMZ取得。
[實施例1]
<質體pMWGKC之製作>
為了取得GAPDH啟動子，以大腸桿菌MG1655之基因體DNA作為模板，使用CGAGCTACATATGCAATGATTGACACGATTCCG(序列編號42)及CGCGCGCATGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(序列編號43)作為引子以PCR法放大，將獲得之DNA片段以限制酶NdeI及SphI消化，藉此獲得約110bp相當於GAPDH啟動子之DNA片段。將此DNA片段、與將質體pBR322(GenBank accession number J01749)以限制酶NdeI及SphI消化獲得之片段混合，使用接合酶接合後對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡(股)公司 DNA-903)進行轉形，獲得在含50μg/mL安比西林之LB瓊脂板生長的轉形體。將獲得之菌落於含50μg/mL安比西林之LB液體培養基於37℃培養一晚並從獲得之菌體回收質體，獲得質體pBRgapP。
將質體pBRgapP作為模板，使用CCGCTCGAGCATATGCTGTCGCAATGATTGACACG(序列編號44)及GCTATTCCATATGCAGGGTTATTGTCTCATGAGC(序列編號45)作為引子，以PCR法放大，將獲得之DNA片段以T4 Polynucleotide Kinase(Takara)進行磷酸化，獲得含GAPDH啟動子之DNA片段。
將質體pMW119(GenBank accession number AB005476)以限制酶AatII及NdeI處理，並將獲得之DNA片段以KOD plus DNA polymerase(Takara)將末端予以平滑化，獲得含pMW119之複製起點的DNA片段。
將含GAPDH啟動子之DNA片段與含pMW119之複製起點的DNA片段混合，使用接合酶接合後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞進行轉形，獲得於含50μg/mL安比西林之LB瓊脂板生長之轉形體。將獲得之菌落於 含50μg/mL安比西林之LB液體培養基於37℃培養一晚並從獲得之菌體回收質體，獲得質體pMWG。
為了取得氯黴素耐性基因，將pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)作為模板，使用TCGGCACGTAAGAGGTTCC(序列編號46)及CGGGTCGAATTTGCTTTCG(序列編號47)作為引子以PCR法放大，將獲得之DNA片段以T4 Polynucleotide Kinase(Takara)進行磷酸化，獲得含氯黴素耐性基因之DNA片段。之後將pMWG作為模板，使用CTAGATCTGACAGTAAGACGGGTAAGCC(序列編號48)及CTAGATCTCAGGGTTATTGTCTCATGAGC(序列編號49)作為引子，以PCR法放大，與含氯黴素耐性基因之DNA片段混合，使用接合酶接合後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞進行轉形，獲得在含25μg/mL氯黴素之LB瓊脂板生長之轉形體。將獲得之菌落於含25μg/mL氯黴素之LB液體培養基於37℃培養一晚並將獲得之質體命名為pMWGC。
以質體pMWGC作為模板，使用CCTTTGGTTAAAGGCTTTAAGATCTTCCAGTGGACAAACTATGCC(序列編號50)及GGCATAGTTTGTCCACTGGAAGATCTTAAAGCCTTTAACCAAAGG(序列編號51)作為引子以PCR法放大，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞進行轉形，獲得於含25μg/mL氯黴素之LB瓊脂板生長之轉形體。將獲得之菌落於含25μg/mL氯黴素之LB液體培養基於37℃培養一晚並從獲得之菌體回收質體，獲得質體pMWGKC。
[實施例2]
<Methylococcus capsulatusATCC33009來源mtk及mcl表現質體pMWGKC＿mcl(Mc)＿mtk(Mc)之建構>
將Methylococcus capsulatus之基因體DNA作為模板，使用GGAATTCCATATGGCTGTTAAAAATCGTCTAC(序列編號52)及GCTCTAGATCAGAATCTGATTCCGTGTTC(序列編號53)作為引子實施PCR，獲得甲基球菌之mcl-mtk片段。把將mcl-mtk片段以NdeI與XbaI切斷並獲得之片段，與 將實施例1製作之質體pMWGKC以NdeI與XbaI切斷而得之片段予以連結後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞進行轉形，獲得在含25μg/mL氯黴素之LB瓊脂板生長之轉形體。將獲得之菌落於含25μg/mL氯黴素之LB液體培養基30℃培養一晚，將獲得之質體命名為pMWGKC＿mcl(Mc)＿mtk(Mc)。
pMWGKC＿mcl(Mc)＿mtk(Mc)，包含：Methylococcus capsulatus來源之蘋果醯輔酶A裂解酶基因(mcl)之鹼基序列(序列編號41)、蘋果酸硫激酶之次單元α基因(mtkA)之鹼基序列(序列編號28)、及蘋果酸硫激酶之次單元β基因(mtkB)之鹼基序列(序列編號29)。Methylococcus capsulatus來源之蘋果醯輔酶A裂解酶(Mcl)之胺基酸序列、蘋果酸硫激酶之次單元α(MtkA)之胺基酸序列、及蘋果酸硫激酶之次單元β(MtkB)之胺基酸序列，分別示於序列編號36、序列編號13、及序列編號14。
[實施例3]
<質體pCASET之製作>
將pHSG298(Takara)作為模板，使用CGCCTCGAGTGACTCATACCAGGCCTG(序列編號54)及CGCCTCGAGGCAACACCTTCTTCACGAG(序列編號55)作為引子，以PCR法放大，並將獲得之DNA片段以限制酶XhoI消化，使用接合酶予以接合後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡(股)公司 DNA-903)進行轉形，獲得在含25μg/mL康黴素之LB瓊脂板生長之轉形體。從獲得之菌體回收質體，將於pHSG298已插入XhoI之認識序列的質體命名為pHSG298-XhoI。
為了取得tac啟動子，將pKK223-3(Pharmacia)作為模板，使用ATCATCCAGCTGTCAGGCAGCCATCGGAAG(序列編號56)及ATCCCCGGGAATTCTGTT(序列編號57)作為引子，以PCR法放大，將獲得之DNA片段以限制酶PvuII及SmaI消化，獲得約0.2kbp之編碼為tac啟動子之DNA片段。
將編碼為tac啟動子之DNA片段、與將質體pHSG298-XhoI以限制酶 PvuII消化並進一步經鹼性磷解酶處理之約2.4kbp之DNA片段予以混合，使用接合酶接合後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡(股)公司DNA-903)進行轉形，獲得在含25μg/mL康黴素之LB瓊脂板生長之轉形體。從獲得之菌體回收質體，獲得pHSG298-XhoI之lac啟動子取代為tac啟動子、tac啟動子之方向與原本lac啟動子成為相同走向的質體pHSGT1。
為了於獲得之pHSGT1之tac啟動子之下游連結pHSG298之多重轉殖位，將pHSG298以限制酶EcoRI及ClaI消化，獲得含pHSG298之多重轉殖位之約1.0kbp之DNA片段。將獲得之DNA片段、及將質體pHSGT1以限制酶EcoRI及ClaI消化並進一步經鹼性磷解酶處理之約1.7kbp之DNA片段混合，使用接合酶接合後對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡(股)公司 DNA-903)進行轉形，獲得在含25μg/mL康黴素之LB瓊脂板生長之轉形體。從獲得之菌體回收質體，獲得在tac啟動子之下游連結了pHSG298的多重轉殖位的質體pHSGT2。
利用DNA合成製作含有由乳酪棒桿菌(Corynebacterium casei)JCM12072單離之pCASE1(Applied Microbiology and Biotechnology,2009；81：1107-1115)之複製起點、repA及repB之DNA片段(序列編號58)。序列如以下所示。
序列編號58：
把將製作之DNA片段以限制酶XhoI消化而獲得之DNA片段、與將質體pHSGT2以限制酶XhoI消化後進一步以鹼性磷解酶處理而得之DNA片段混合，使用接合酶接合後對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡(股)公司 DNA-903)進行轉形，獲得於含25μg/mL康黴素之LB瓊脂板生長之轉形體。從獲得之菌體回收質體，將於pHSGT2之XhoI認識部位插入了pCASE1之複製起點、插入了含repA及repB之DNA片段而得之質體命名為pCASET。回收的pCASET中，CASE1來源repA之方向與tac啟動子成為反向。
[實施例4]
<Methylococcus capsulatus來源mtk及mcl表現質體pCASET＿mcl(Mc)＿mtk(Mc)之建構>
將pMWGKC＿mcl(Mc)＿mtk(Mc)(包括Methylococcus capsulatus來源mcl及mtk之基因)作為模板，以GAATTCACAAAAAGGATAAAACAATGGCTGTCAAGAACCGTCTAC(序列編號59)及CGAATTCTCAGAATCTGATTCCGTGTTCCTG(序列編號60)之引子對實施PCR，獲得含甲基球菌之mcl-mtk的DNA片段。序列編號59及序列編號60之引子在5’末端側具有EcoRI認識部位。
將含甲基球菌之mcl-mtk的DNA片段、與將實施例3製作之質體pCASET以EcoRI切斷並脫磷酸化者，以接合酶予以結合後，對於大腸桿菌JM109株勝任細胞(東洋紡(股)公司 DNA-900)進行轉形，獲得在含25μg/mL康黴素之LB瓊脂板生長之轉形體。從獲得之菌體回收質體，將mcl-mtk片段已插入在適於利用質體之啟動子表現的方向的質體命名為pCASET＿mcl(Mc)＿mtk(Mc)。
pCASET＿mcl(Mc)＿mtk(Mc)，包含Methylococcus capsulatus來源之mcl之鹼基序列(序列編號41)、mtkA之鹼基序列(序列編號28)、及mtkB之鹼基序列(序列編號29)。
[實施例5]
<棒桿菌用mtk、mcl、gcl及glxR表現質體之建構>
將Rhodococcus jostiiNBRC16295以NBRC之培養基編號802培養，使用DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen(股)公司)獲得基因體DNA。將此基因體DNA作為模板，將CGAGCTCAAGCTTACAAAAAGGATAAAACAATGAGCACCATTGCATTCATCGG(序列編號61)CGGGATCCCTAGTCCAGCAGCATGAGAG(序列編號62)作為引子實施PCR，獲得紅球菌之glxR-gcl片段(序列編號63)。
把將紅球菌之glxR-gcl片段以SacI與BamHI切斷而得之片段、與將實 施例4構建之pCASET＿mcl(Mc)＿mtk(Mc)以SacI與BamHI切斷而得之片段予以連結後，對於大腸桿菌JM109株勝任細胞(東洋紡(股)公司DNA-900)進行轉形，獲得於含25μg/mL康黴素之LB瓊脂板生長之轉形體。從獲得之菌體回收質體，將於pCASET＿mcl(Mc)＿mtk(Mc)已插入glxR-gcl片段之質體命名為pCASET＿mcl(Mc)＿mtk(Mc)＿glxR(Rj)＿gcl(Rj)。
質體pCASET＿mcl(Mc)＿mtk(Mc)＿glxR(Rj)＿gcl(Rj)，除了含有Methylococcus capsulatus來源之mcl之鹼基序列(序列編號41)、mtkA之鹼基序列(序列編號28)、及mtkB之鹼基序列(序列編號29)，尚含有Rhodococcus jostii來源之2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶(glxR)之鹼基序列(序列編號64)及乙醛酸醛連接酶(gcl)之鹼基序列(序列編號65)。Rhodococcus jostii來源之2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶(GlxR)之胺基酸序列及乙醛酸醛連接酶(Gcl)之胺基酸序列分別示於序列編號66及序列編號67。
[實施例6]
<質體pMWCBL之製作>
將實施例1製作之pMWGKC作為模板，使用ATCGATCTCGAGTTACCCGTCTTACTGTCAGATCTAG(序列編號68)及ATCGATCTCGAGGCCTGTTGATGATACCGCTGCCTTA(序列編號69)為引子以PCR法放大，將獲得之DNA片段以限制酶XhoI消化並使用接合酶接合後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡(股)公司 DNA-903)轉形，獲得於含10μg/mL氯黴素之LB瓊脂板生長之轉形體。從獲得之菌體回收質體，將於pMWGKC已插入XhoI之認識序列的質體命名為pMWGKC-XhoI。
從Corynebacterium glutamicumATCC13869製備質體pBL1(Journal of General Microbiology,1984；130：2237-2246)，將獲得之質體作為模板，以CCGCTCGAGTCAACAACAAGACCCATCA(序列編號70)與CCGCTCGAGCATGCACATGCAGTCATGT(序列編號71)之引子對進行PCR，放大含複製起點及repA之約1.8kb之DNA片段(序列編號72)。序列如以下所示。
序列編號72：
把將已放大的DNA片段以限制酶XhoI消化而獲得之DNA片段、及將質體pMWGKC-XhoI以限制酶XhoI消化並進一步以鹼性磷解酶處理而得之DNA片段混合，使用接合酶接合後，對於大腸桿菌JM109株勝任細胞(東洋紡(股)公司 DNA-900)進行轉形，獲得在含10μg/mL氯黴素之LB瓊脂板生長之轉形體。從獲得之菌體回收質體，將於pMWGKC-XhoI之XhoI認識部位插入有含pBL1之複製起點及repA的DNA片段而得的質體命名為pMWCBL。
[實施例7]
<Corynebacterium glutamicumATCC13032來源pyc表現質體pMWCBL＿pyc之建構>
參考已公開之Corynebacterium glutamicumATCC13032來源的丙酮酸羧化酶基因之鹼基序列(GenBank accession number BA000036 GI：21323455)，合成2種AAGCGAGCTCACAAAAAGGATAAAACAATGTCGACTCACACATCTTCA(序列編號73)及ATACATGCATGCTTAGGAAACGACGACGATCAA(序列編號74)之引子。序列編號73之引子在5’末端側具有SacI認識部位，序列編號74之引子在5’末端側具有SphI認識部位。
製備Corynebacterium glutamicumATCC13032之基因體DNA，將獲得之基因體DNA作為模板，以序列編號73與序列編號74之引子對進行 PCR，將約3.5kb之DNA片段放大。將此DNA片段以SacI及SphI消化，以瓊脂糖凝膠電泳分離、回收。將回收的DNA片段、與以SacI及SphI消化並進一步以鹼性磷解酶處理而得之pMWCBL混合，使用接合酶接合後，對於大腸桿菌JM109株勝任細胞(東洋紡公司製)進行轉形，獲得在含10μg/mL氯黴素之LB瓊脂板於30℃生長之轉形體。從獲得之轉形體回收丙酮酸羧化酶基因已插入pMWCBL之質體pMWCBL＿pyc。
pMWCBL＿pyc，包含Corynebacterium glutamicum來源之丙酮酸羧化酶基因(pyc)之鹼基序列(序列編號75)。Corynebacterium glutamicum來源之丙酮酸羧化酶(Pyc)之胺基酸序列示於序列編號76。
[實施例8]
<評價用之Corynebacterium glutamicum株之建構>
將Corynebacterium glutamicumDSM1412(有時稱為「CG株」)作為寄主，使用於實施例3、5、及7建構的質體，以電穿孔法實施轉形。各株塗佈於含15μg/mL康黴素及/或10μg/mL氯黴素之LB瓊脂培養基，將會生長的菌株作為評價用菌株。此等菌株整理於表2。
[參考例1]
<已賦予mtk、mcl、gcl及glxR基因之棒桿菌株之評價>
將於實施例8建構的CG/vec1及CG/mtk＿mcl/gcl＿glxR分別以含15μg/mL康黴素之2mL之LB液體培養基，於30℃且280rpm之條件，培養至觀察到充分生長。之後於100mL之附槳葉的三角燒瓶中，配製含20g/L 葡萄糖及15μg/mL康黴素之10ml之棒桿菌用最小培養基{30g/L(NH4)2SO4、3g/L Na2HPO4、6g/L KH2PO4、2g/L NaCl、84mg/L CaCl2、3.9mg/L FeCl3、0.9mg/L ZnSO4．7H2O、0.3mg/L CuCl2．H2O、5.56mg/L MnSO4．5H2O、0.1mg/L(NH4)6MO7O24．4H2O、0.3mg/L Na2B4O7．10H2O、0.4g/L MgSO4．7H2O、40mg/L FeSO4．7H2O、500μg/L Vitamine B1．HCl、0.1g/L EDTA、10μg/L Biotin}，加入1mL由前述LB液體培養基而來的培養液，培養1日~4日直到觀察到有充分增殖，作為前培養液。以離心分離(5000rpm、5分鐘)從前培養液回收菌體。
準備含有100mM之碳酸氫鈉(經13C標定)、20g/L之葡萄糖、1.5%(w/v)之Tween60(Sigma Aldrich公司製)、及15μg/mL康黴素之2mL之棒桿菌用最小培養基(惟生物素(Biotin)最終濃度變更為2μg/L)，調整前培養菌體之OD為1~5之範圍內並添加。旋緊後，於30℃、150rpm培養1日~2日。培養液定期取樣，以離心分離(MILLIPORE公司 12,000rpm、3分鐘)將菌體除去，將上清以親水性PTFE濾膜(MILLIPORE公司、MSGVN2B50)過濾，作為培養樣本。
培養樣本中之麩胺酸之定量，使用安裝了NN-814管柱(昭和電工公司)的HPLC(Waters公司 2695)與UV/Vis檢測器(Waters公司 2489)。培養樣本中之葡萄糖之定量，使用安裝了ULTRON PS-80H管柱(信和化工公司)的HPLC(Waters公司 2695)與RI檢測器(Waters公司 2414)。
其結果，已賦予mtk、mcl、gcl及glxR基因之菌株(CG/mtk＿mcl/gcl＿glxR)，比起對照株(CG/vec1)顯示較高的對糖產率。亦即，藉由對於棒桿菌賦予mtk、mcl、gcl及glxR基因，新賦予CO2固定路徑，由此路徑被固定的CO2經由乙醯輔酶A被導入麩胺酸，對糖產率提高。對糖產率依以下方式計算。
(對糖產率)=(生成麩胺酸量(g))÷(消耗葡萄糖量(g))
[實施例9]
<mtk、mcl、gcl及glxR基因賦予及pyc基因增強棒桿菌株之評價>
使用實施例8構建的CG/mtk＿mcl/gcl＿glxR/vec2及CG/mtk＿mcl/gcl＿glxR/pyc作為評價用株，於培養基添加之抗生物質使用15μg/mL康黴素及10μg/mL氯黴素，除此以外以與參考例1為同樣方法進行培養及分析。分析之結果，pyc增強株(CG/mtk＿mcl/gcl＿glxR/pyc)比起對照株(CG/mtk＿mcl/gcl＿glxR/vec2)顯示較高的對糖產率。亦即，可認為：已賦予CO2固定路徑之棒桿菌株中，pyc基因之增強對於對糖產率之提升有效果。
[實施例10]
<於已添加亞硫酸鈉之條件進行麩胺酸生產評價>
使用實施例8構建的CG/mtk＿mcl/gcl＿glxR作為評價用株，接種於含25μg/mL康黴素之LB培養基，於30℃培養2日。之後將100μL之培養液塗佈於含25μg/mL康黴素之直徑9cm之LB板，於30℃培養2日。刮取板的1/8的面積的菌，接種在含20μg/L Biotine之5mL之棒桿菌株用之最小培養基{60g/L葡萄糖、30g/L(NH4)2SO4、1g/L KH2PO4、0.4g/L MgSO4．7H2O、0.01g/L FeSO4．7H2O、0.01g/L MnSO4．5H2O、200μg/L Thiamine．HCl、5.1g/L Soytone(Bacto)、25μg/mL康黴素、pH8.0}，和0.25g的碳酸鈣一起於125mL之附擋板的三角燒瓶中，於31.5℃、270rpm培養1日，作為前培養液。
將前培養液0.25mL接種於5mL之棒桿菌株用之最小培養基再供給亞硫酸鈉(還原劑)直到終濃度成為5g/L，和0.25g的碳酸鈣一起於125mL之附擋板的三角燒瓶中，於31.5℃、270rpm培養2日，作為本培養液。
將上述已供給亞硫酸鈉之試驗區作為「亞硫酸鈉供給試驗區」。又，作為對照試驗，也準備不添加亞硫酸鈉之外與上述以相同程序獲得的「亞硫酸鈉無添加試驗區」。
分析結果，在亞硫酸鈉無添加試驗區的對糖產率為44%，相對於此，在亞硫酸鈉供給試驗區的對糖產率為50%，可確認由於亞硫酸鈉之添加使產率提高。
又，測定培養液之OD620nm，結果意外地，於亞硫酸鈉無添加試驗區 為50的OD，在亞硫酸鈉供給試驗區為29，可確認有抑制菌體量增加之效果。若能抑制菌體量增加，能簡省廢菌體處理的成本。
[實施例11]
<大腸桿菌B株atoD基因體強化株之製作>
大腸桿菌MG1655之基因體DNA之全部鹼基序列係公知(GenBank存取號碼U00096)，編碼為大腸桿菌MG1655之輔酶A轉移酶α次單元的基因(以下有時稱為「atoD」)之鹼基序列也有人報告。亦即atoD記載於GenBank存取號碼U00096記載之大腸桿菌MG1655基因體序列的2321469~2322131。
為了取得GAPDH啟動子，將大腸桿菌MG1655之基因體DNA作為模板，使用CGCTCAATTGCAATGATTGACACGATTCCG(序列編號77)及ACAGAATTCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(序列編號78)作為引子，以PCR法放大，將獲得之DNA片段以限制酶MfeI及EcoRI消化，獲得約100bp之編碼GAPDH啟動子之DNA片段。
將獲得之DNA片段、以及將質體pUC19(GenBank存取號碼X02514)以限制酶EcoRI消化後再以鹼性磷解酶處理而得者混合，使用接合酶接合後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡(股)公司 DNA-903)進行轉形，獲得在含50μg/mL安比西林之LB瓊脂板生長之轉形體。將10個獲得之菌落分別於含50μg/mL安比西林之LB液體培養基於37℃培養一晚並回收質體，挑選以限制酶EcoRI及KpnI消化時未切出GAPDH啟動子者，再者，確認DNA序列，將已正確插入GAPDH啟動子者命名為pUCgapP。將獲得之pUCgapP以限制酶EcoRI及KpnI消化。
為了取得atoD，將大腸桿菌MG1655之基因體DNA作為模板，使用CGAATTCGCTGGTGGAACATATGAAAACAAAATTGATGACATTACAAGAC(序列編號79)及GCGGTACCTTATTTGCTCTCCTGTGAAACG(序列編號80)為引子，以PCR法放大，將獲得之DNA片段以限制酶EcoRI及KpnI 消化，獲得約690bp之atoD片段。將此DNA片段、與經限制酶EcoRI及KpnI消化之pUCgapP混合，使用接合酶接合後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡(股)公司 DNA-903)進行轉形，獲得於含50μg/mL安比西林之LB瓊脂板生長之轉形體。從獲得之菌體回收質體，確認已正確插入atoD，將此質體命名為pGAPatoD。
使用依大腸桿菌MG1655之atoD之5’附近區域之基因資訊製作之GCTCTAGATGCTGAAATCCACTAGTCTTGTC(序列編號81)及TACTGCAGCGTTCCAGCACCTTATCAACC(序列編號82)之引子，將大腸桿菌MG1655之基因體DNA作為模板實施PCR，將約1.1kbp之DNA片段予以放大。
使用依大腸桿菌MG1655之GAPDH啟動子之序列資訊製作之GGTCTAGAGCAATGATTGACACGATTCCG(序列編號83)、及依大腸桿菌MG1655之atoD之序列資訊製作之GCGGTACCTTATTTGCTCTCCTGTGAAACG(序列編號84)作為引子，將質體pGAPatoD作為模板實施PCR，獲得由GAPDH啟動子與atoD構成之約790bp之DNA片段。
將前述約1.1kbp之DNA片段以限制酶PstI與XbaI消化，並將前述約790bp之DNA片段以限制酶XbaI與KpnI消化，將兩片段與將溫度感受性質體pTH18cs1(GenBank存取號碼AB019610)(Gene,2000；241：185-191)以PstI與KpnI消化而得之片段混合，使用接合酶接合後，對於DH5α株轉形，獲得於含10μg/mL氯黴素之LB瓊脂板於30℃生長之轉形體。將獲得之菌落於含10μg/mL氯黴素之LB液體培養基於30℃培養一晚，從獲得之菌體回收質體。將該質體對於大腸桿菌B(ATCC11303)進行轉形，於含10μg/mL氯黴素之LB瓊脂板於30℃培養一晚，獲得轉形體。將獲得之轉形體接種於含10μg/mL氯黴素之LB液體培養基，於30℃培養一晚。將獲得之培養菌體塗佈於含10μg/mL氯黴素之LB瓊脂板，於42℃培養並獲得菌落。將獲得之菌落以不含抗生物質之LB液體培養基於30℃培養2小時，塗佈於不含抗生物質之LB瓊脂板，獲得於42℃生長的菌落。
從出現的菌落之中隨機挑取100個菌落，分別使其生長於不含抗生物質之LB瓊脂板及含10μg/mL氯黴素之LB瓊脂板，選擇氯黴素感受性的選殖體。再者，從該等選殖體之染色體DNA以PCR放大包含GAPDH啟動子與atoD之約790bp片段，挑選atoD啟動子區取代為GAPDH啟動子的菌株，將滿足以上條件的選殖體命名為大腸桿菌B株atoD基因體強化株(以下有時稱為「B：：atoDAB株」)。
[實施例12]
<大腸桿菌B株atoD基因體強化/pgi基因缺失株之製作>
大腸桿菌MG1655之基因體DNA之全部鹼基序列為公知(GenBank存取號碼U00096)，編碼為大腸桿菌之磷酸葡萄糖異構酶的基因(pgi)之鹼基序列也已有人報告(GenBank存取號碼X15196)。
為了選殖編碼為pgi之基因(1,650bp)的附近區域，合成CAGGAATTCGCTATATCTGGCTCTGCACG(序列編號85)、CAGTCTAGAGCAATACTCTTCTGATTTTGAG(序列編號86)、CAGTCTAGATCATCGTCGATATGTAGGCC(序列編號87)及GACCTGCAGATCATCCGTCAGCTGTACGC(序列編號88)4種引子。序列編號85之引子於5’末端側具有EcoRI認識部位，序列編號86及序列編號87之引子於5’末端側具有XbaI認識部位，序列編號88之引子於5’末端側具有PstI認識部位。
製備大腸桿菌MG1655(ATCC700926)之基因體DNA，將獲得之基因體DNA作為模板，以序列編號85與序列編號86之引子對進行PCR，放大約1.0kb之DNA片段(以下也稱為「pgi-L片段」)。又，以序列編號87與序列編號88之引子對進行PCR，放大約1.0kb之DNA片段(以下也稱為「pgi-R片段」)。將該等DNA片段以瓊脂糖凝膠電泳分離、回收，並將pgi-L片段以EcoRI及XbaI消化，將pgi-R片段以XbaI及PstI消化。將此2種消化片段2種、與溫度感受性質體pTH18cs1(GenBank存取號碼AB019610)之EcoRI及PstI的消化物混合，以T4DNA接合酶反應後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡公司製)進行轉形，獲得在含10μg/mL氯黴素之LB瓊脂 板於30℃生長之轉形體。從獲得之轉形體回收質體，確認編碼為pgi之基因之5’上游附近片段與3’下游附近片段之2個片段已正確插入pTH18cs1。將獲得之質體以XbaI消化後，利用T4DNA聚合酶進行平滑末端化處理。將此DNA片段、與藉由將pUC4K質體(GenBank存取號碼X06404)(Pharmacia)以EcoRI消化而得之康黴素耐性基因進一步利用T4DNA聚合酶以實施平滑末端化處理而得之DNA片段，利用T4DNA接合酶連結。之後對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞進行轉形，獲得於含10μg/mL氯黴素與50μg/mL康黴素之LB瓊脂板於30℃生長之轉形體。從獲得之轉形體回收質體，確認在編碼為pgi之基因之5’上游附近片段與3’下游附近片段之間已正確插入康黴素耐性基因，命名為pTH18cs1-pgi。
將製作的pTH18cs1-pgi對於實施例11製作之B：：atoDAB株轉形，於含10μg/mL氯黴素與50μg/mL康黴素之LB瓊脂板於30℃培養一晚，獲得轉形體。將獲得之轉形體接種於含50μg/mL康黴素之LB液體培養基，於30℃培養一晚。然後將此培養液之一部分塗佈於含50μg/mL康黴素之LB瓊脂板，獲得於42℃生長的菌落。將獲得之菌落以含50μg/mL康黴素之LB液體培養基於30℃培養24小時，再塗佈於含50μg/mL康黴素之LB瓊脂板，獲得於42℃生長之菌落。
從出現之菌落之中隨機挑取100個菌落，分別使其於含50μg/mL康黴素之LB瓊脂板、與含10μg/mL氯黴素的LB瓊脂板生長，選擇僅於含康黴素之LB瓊脂板生長的氯黴素感受性的選殖體。再者，將選殖體之染色體DNA作為模板，實施PCR，將pgi基因取代為康黴素耐性基因，藉此挑選能放大約3.3kbp片段的菌株，將獲得之菌株命名為大腸桿菌B株atoD基因體強化/pgi基因缺失株(以下也稱為「B：：atoDAB△pgi株」)。
[實施例13]
<大腸桿菌B株atoD基因體強化/pgi基因缺失/gntR基因缺失株之製作>
大腸桿菌B株之基因體DNA之全部鹼基序列為公知(GenBank存取號 碼CP000819)，編碼為轉錄抑制因子GntR之基因之鹼基序列記載在GenBank存取號碼CP000819所記載之大腸桿菌B株基因體序列之3509184~3510179。
為了選殖編碼為GntR之基因(gntR)的附近區域，合成GGAATTCGGGTCAATTTTCACCCTCTATC(序列編號89)、GTGGGCCGTCCTGAAGGTACAAAAGAGATAGATTCTC(序列編號90)、CTCTTTTGTACCTTCAGGACGGCCCACAAATTTGAAG(序列編號91)、及GGAATTCCCAGCCCCGCAAGGCCGATGGC(序列編號92)4種引子。序列編號89及序列編號92之引子於5’末端側分別具有EcoRI認識部位。
製備大腸桿菌B株之基因體DNA(GenBank存取號碼CP000819)，將獲得之基因體DNA作為模板，以序列編號89與序列編號90之引子對進行PCR，放大約1.0kb之DNA片段(以下也稱為「gntR-L片段」)。又，藉由以序列編號91與序列編號92之引子對進行PCR，放大約1.0kb之DNA片段(以下也稱為「gntR-R片段」)。將該等DNA片段以瓊脂糖凝膠電泳分離、回收，將gntR-L片段與gntR-R片段作為模板，以序列編號89與序列編號92之引子對進行PCR，放大約2.0kb之DNA片段(以下也稱為「gntR-LR片段」)。將此gntR-LR片段以瓊脂糖凝膠電泳分離、回收，以EcoRI消化，與將溫度感受性質體pTH18cs1(GenBank存取號碼AB019610)之EcoRI消化物脫磷酸化者混合，以T4DNA接合酶反應後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡公司製)進行轉形，獲得於含10μg/mL氯黴素之LB瓊脂板於30℃生長之轉形體。從獲得之轉形體回收質體，確認gntLR片段已正確插入pTH18cs1，將此質體命名為pTH18cs1-gntR。
將獲得之質體pTH18cs1-gntR對於實施例12製作之B：：atoDAB△pgi株轉形，於含10μg/mL氯黴素之LB瓊脂板於30℃培養一晚，獲得轉形體。將獲得之轉形體接種於含10μg/mL氯黴素之LB液體培養基，於30℃培養一晚。然後，將此培養液之一部分塗佈於含10μg/mL氯黴素之LB瓊脂板，獲得於42℃生長之菌落。將獲得之菌落於LB液體培養基於30℃培養24 小時，再塗佈於LB瓊脂板，獲得於42℃生長之菌落。
從出現之菌落之中隨機挑取100個菌落，分別使其於LB瓊脂板、及含10μg/mL氯黴素之LB瓊脂板生長，選擇氯黴素感受性之選殖體。再者，將選殖體之染色體DNA作為模板，實施PCR，挑選藉由gntR基因缺失而可放大約2.0kbp片段之菌株，將獲得之菌株命名為大腸桿菌B株atoD基因體強化/pgi基因缺失/gntR基因缺失株(以下「B：：atoDAB△pgi△gntR株」。
[實施例14]
<大腸桿菌B株atoD基因體強化/pgi基因缺失/gntR基因缺失/gnd基因缺失株之製作>
為了選殖編碼為磷酸葡萄糖酸去氫酶之基因(gnd)的附近區域，合成CGCCATATGAATGGCGCGGCGGGGCCGGTGG(序列編號93)、TGGAGCTCTGTTTACTCCTGTCAGGGGG(序列編號94)、TGGAGCTCTCTGATTTAATCAACAATAAAATTG(序列編號95)、及CGGGATCCACCACCATAACCAAACGACGG(序列編號96)4種引子。序列編號93之引子在5’末端側具有NdeI認識部位，序列編號94及序列編號95之引子在5’末端側具有SacI認識部位，序列編號96之引子在5’末端側具有BamHI認識部位。
製備大腸桿菌B株之基因體DNA(GenBank存取號碼CP000819)，以序列編號93與序列編號94之引子對實施PCR，放大約1.0kb之DNA片段(以下有時稱為「gnd-L片段」)。又，以序列編號95與序列編號96之引子對進行PCR，放大約1.0kb之DNA片段(以下有時稱為「gnd-R片段」)。將該等DNA片段以瓊脂糖凝膠電泳分離、回收，並將gnd-L片段以NdeI及SacI消化、gnd-R片段以SacI及BamHI消化。將此2種消化片段、與溫度感受性質體pTH18cs1(GenBank存取號碼AB019610)之NdeI及BamHI之消化物混合，以T4DNA接合酶反應後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡公司製)進行轉形，獲得於含10μg/mL氯黴素之LB瓊脂板於30℃生長之轉形體。從獲得之轉形體回收質體，確認編碼為gnd之基因之5’上游附近片段與3’下游附近片段之2個片段已正確插入到pTH18cs1，將此質 體命名為pTH18cs1-gnd。
將獲得之質體pTH18cs1-gnd對於實施例13製作之B：：atoDAB△pgi△gntR株轉形，於含10μg/mL氯黴素之LB瓊脂板於30℃培養一晚，獲得轉形體。將獲得之轉形體接種於含10μg/mL氯黴素之LB液體培養基，於30℃培養一晚。然後將此培養液之一部分塗佈於含10μg/mL氯黴素之LB瓊脂板，獲得於42℃生長之菌落。將獲得之菌落於LB液體培養基於30℃培養24小時，再塗佈於LB瓊脂板，獲得於42℃生長之菌落。
從出現之菌落之中隨機挑取100個菌落，分別使其生長於LB瓊脂板、及含10μg/mL氯黴素之LB瓊脂板，選擇氯黴素感受性之選殖體。再者，將選殖體之染色體DNA作為模板實施PCR，挑選藉由gnd基因缺失而能放大約2.0kbp片段的菌株，將獲得之菌株命名為大腸桿菌B株atoD基因體強化/pgi基因缺失/gntR基因缺失/gnd基因缺失株(以下有時稱為「B：：atoDAB△pgi△gntR△gnd株」)。
[實施例15]
<質體pIaz之製作>
梭狀芽胞桿菌(Clostridium)屬細菌之乙醯乙酸去羧酶記載於GenBank存取號碼M55392，異丙醇去氫酶記載於GenBank存取號碼AF157307。
以與實施例1之質體pBRgapP之製作為相同方法製作質體pBRgapP。
為了取得異丙醇去氫酶基因，將Clostridium beijerinckiiNRRL B-593之基因體DNA作為模板，使用AATATGCATGCTGGTGGAACATATGAAAGGTTTTGCAATGCTAGG(序列編號97)及ACGCGTCGACTTATAATATAACTACTGCTTTAATTAAGTC(序列編號98)為引子以PCR法放大，將獲得之DNA片段以限制酶SphI及SalI消化，以獲得約1.1kbp之異丙醇去氫酶片段。將獲得之DNA片段、與將質體pUC119以限制酶SphI及SalI消化而得之片段混合，使用接合酶接合後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞進行 轉形，獲得於含50μg/mL安比西林之LB瓊脂板生長之轉形體。將獲得之菌落於含50μg/mL安比西林之LB液體培養基於37℃培養一晚並從獲得之菌體回收質體，確認IPAdh已正確插入，將此質體命名為pUC-I。
把將質體pUC-I以限制酶SphI及EcoRI消化而得之含IPAdh之片段、與將質體pBRgapP以限制酶SphI及EcoRI消化而得之片段混合，使用接合酶接合後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞進行轉形，獲得於含50μg/mL安比西林之LB瓊脂板生長之轉形體。將獲得之菌落於含50μg/mL安比西林之LB液體培養基於37℃培養一晚，並從獲得之菌體回收質體，確認IPAdh已正確插入，將此質體命名為pGAP-I。
為了取得乙醯乙酸去羧酶基因，將Clostridium acetobutylicumATCC824之基因體DNA作為模板，使用ACGCGTCGACGCTGGTGGAACATATGTTAAAGGATGAAGTAATTAAACAAATTAGC(序列編號99)及GCTCTAGAGGTACCTTACTTAAGATAATCATATATAACTTCAGC(序列編號100)為引子，以PCR法放大，將獲得之DNA片段以限制酶SalI及XbaI消化，獲得約700bp之乙醯乙酸去羧酶片段。將獲得之DNA片段、與將質體pGAP-I以限制酶SalI及XbaI消化而得之片段混合，使用接合酶接合後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞進行轉形，獲得於含50μg/mL安比西林之LB瓊脂板生長之轉形體。將獲得之菌落於含50μg/mL安比西林之LB液體培養基於37℃培養一晚並從獲得之菌體回收質體，確認adc已正確插入，將此質體命名為pIa。
為了取得葡萄糖6磷酸-1-去氫酶之基因(zwf)，將大腸桿菌B株之基因體DNA(GenBank存取號碼CP000819)作為模板，使用GCTCTAGACGGAGAAAGTCTTATGGCGGTAACGCAAACAGCCCAGG(序列編號101)及CGGGATCCCGGAGAAAGTCTTATGAAGCAAACAGTTTATATCGCC(序列編號102)為引子以PCR法放大，將獲得之DNA片段以限制酶XbaI及BamHI消化，獲得約1500bp之葡萄糖6磷酸1-去氫酶片段。將獲得之DNA片段、與將質體pIa以限制酶XbaI及BamHI消化而得之片段混合，使用接合酶接 合後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞進行轉形，獲得於含50μg/mL安比西林之LB瓊脂板生長之轉形體。將獲得之菌落於含50μg/mL安比西林之LB液體培養基於37℃培養一晚，並將獲得之質體命名為pIaz。
[實施例16]
<質體pMWGC2及pMWGKC2之製作>
為了取得GAPDH啟動子，將大腸桿菌MG1655之基因體DNA作為模板，並使用CTACTAGTCTGTCGCAATGATTGACACGATTCCG(序列編號103)及GCTCGAATTCCCATATGTTCCACCAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(序列編號104)為引子，以PCR法放大，將獲得之DNA片段以限制酶EcoRI消化，以T4 Polynucleotide Kinase將末端進行磷酸化，以獲得含GAPDH啟動子之DNA片段。
將質體pMW119(GenBank存取號碼AB005476)以限制酶NdeI消化，並將末端平滑化後以EcoRI消化，將其末端予以脫磷酸化。將此pMW119之DNA片段、與含上述GAPDH啟動子之DNA片段混合，使用接合酶接合後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞轉形，獲得於含50μg/mL安比西林之LB瓊脂板生長之轉形體。將獲得之菌落於含50μg/mL安比西林之LB液體培養基於37℃培養一晚，並從獲得之菌體回收質體，獲得質體pMWG2。
為了取得氯黴素耐性基因，將pTH18cs1(GenBank存取號碼AB019610)作為模板，使用TCGGCACGTAAGAGGTTCC(序列編號46)及CGGGTCGAATTTGCTTTCG(序列編號47)為引子以PCR法放大，將獲得之DNA片段以T4 Polynucleotide Kinase(Takara)進行磷酸化，獲得含氯黴素耐性基因之DNA片段。之後將pMWG2作為模板，使用CTAGATCTGACAGTAAGACGGGTAAGCC(序列編號48)及CTAGATCTCAGGGTTATTGTCTCATGAGC(序列編號49)為引子，以PCR法放大，與含氯黴素耐性基因之DNA片段，使用接合酶接合後對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞進行轉形，獲得於含25μg/mL氯黴素之LB瓊脂板生長之轉形體。將獲得之菌落於含25μg/mL氯黴素之LB液體培養基於37℃ 培養一晚並將獲得之質體命名為pMWGC2。
將質體pMWGC2作為模板，使用CCTTTGGTTAAAGGCTTTAAGATCTTCCAGTGGACAAACTATGCC(序列編號50)及GGCATAGTTTGTCCACTGGAAGATCTTAAAGCCTTTAACCAAAGG(序列編號51)為引子，以PCR法放大，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞進行轉形，獲得在含25μg/mL氯黴素之LB瓊脂板生長的轉形體。將獲得之菌落於含25μg/mL氯黴素之LB液體培養基於37℃培養一晚並從獲得之菌體回收質體，獲得質體pMWGKC2。
[實施例17]
<Methylococcus capsulatusATCC33009來源mtk及mcl表現質體pMWGC2＿mtk(Mc)＿mcl及pMWGKC2＿mtk(Mc)＿mcl之建構>
將Methylococcus capsulatus之基因體DNA(ATCC33009D-5)作為模板，使用GGAATTCCATATGGCTGTTAAAAATCGTCTAC(序列編號52)及GCTCTAGATCAGAATCTGATTCCGTGTTC(序列編號53)作為引子，實施PCR，獲得甲基球菌之mcl-mtk片段。把將mcl-mtk片段以NdeI與XbaI切斷而得之片段、與將實施例16製作之質體pMWGC2或pMWGKC2以NdeI與XbaI切斷而得之片段連結後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞進行轉形，獲得於含25μg/mL氯黴素之LB瓊脂板生長之轉形體。將獲得之菌落於含25μg/mL氯黴素之LB液體培養基於30℃培養一晚，將獲得之質體分別命名為pMWGC2＿mtk(Mc)＿mcl、pMWGKC2＿mtk(Mc)＿mcl。
pMWGC2＿mtk(Mc)＿mcl及pMWGKC2＿mtk(Mc)＿mcl，包含Methylococcus capsulatus來源之mcl之鹼基序列(序列編號41)、mtkA之鹼基序列(序列編號28)、及mtkB之鹼基序列(序列編號29)。Methylococcus capsulatus來源之Mcl之胺基酸序列、MtkA之胺基酸序列、及MtkB之胺基酸序列，分別如序列編號36、序列編號13、及序列編號14所示。
[實施例18]
<glxR及glxK表現質體之建構>
為了獲得大腸桿菌來源之2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶基因(glxR)，將大腸桿菌B株之基因體DNA(GenBank存取號碼CP000819)作為模板，使用GCTCTAGACGGAGAAAGTCTTATGAAACTGGGATTTATTGGC(序列編號105)及AACTGCAGTCAGGCCAGTTTATGGTTAG(序列編號106)為引子以PCR法放大，將獲得之DNA片段以限制酶XbaI及PstI消化，獲得約900bp之glxR片段。為了獲得大腸桿菌來源之甘油酸3-激酶基因(glxK)，將大腸桿菌B株之基因體DNA(GenBank存取號碼CP000819)作為模板，使用AACTGCAGCGGAGAAAGTCTTATGAAGATTGTCATTGCGCCA(序列編號107)及GGAATTCAAGCTTTCAGTTTTTAATTCCCTGACC(序列編號108)為引子，以PCR法放大，將獲得之DNA片段以限制酶PstI及HindIII消化，獲得約1100bp之glxK片段。將獲得之glxR之片段及glxK之片段、與將實施例17建構之質體pMWGC2＿mtk(Mc)＿mcl以XbaI與HindIII切斷者混合，將glxR及glxK連接在質體pMWGC2＿mtk(Mc)＿mcl之蘋果酸硫激酶(mtk)序列之下游。將獲得之質體命名為pMWGC2＿mtk(Mc)＿mcl＿glxR＿glxK。
[實施例19]
<mtk及mcl導入異丙醇生產atoD基因體強化/pgi基因缺失/gntR基因缺失/gnd基因缺失株之製作>
對於實施例14製作之菌株(B：：atoDAB△pgi△gntR△gnd株)之勝任細胞，將實施例15製作之質體pIaz、與實施例16~18製作之質體中之任一者轉形，塗佈於含25mg/L之氯黴素、100mg/L之安比西林之LB瓊脂培養基獲得生長之菌株。此等菌株彙整於表3。
【表3】
[實施例20]
<異丙醇之生產>
作為前培養，在裝有含25mg/L之氯黴素、100mg/L之安比西林的LB培養液，Miller培養液(Difco244620)2mL的試管中，接種實施例19建構的各評價用菌株，於培養溫度30℃、120rpm的條件培養1晚。測定前培養之OD，回收相當OD3.0之細胞，懸浮於0.9% NaCl溶液300μl，取20μl接種在裝有含5%葡萄糖、25mg/L之氯黴素、100mg/L之安比西林的LB Broth，Miller培養液20mL的容量100mL的附擋板燒瓶中，於培養溫度30℃、120rpm培養48小時。取樣菌體培養液，以離心操作去除菌體後，以HPLC依定法測定獲得之培養上清中之異丙醇(IPA)、丙酮及主要副產物(琥珀酸等有機酸)之累積量。結果如表4及表5。
關於48小時之異丙醇生產量，對照株(vec/atoDAB△pgi△gntR△gnd)為 4.8g，mtk+mcl導入株(MtkAB/atoDAB△pgi△gntR△gnd)為7.2g，glxR+glxK+mtk+mcl導入株(MtkAB，glxR，glxK/atoDAB△pgi△gntR△gnd)為7.9g。
關於48小時之丙酮之生產量，對照株(vec/atoDAB△pgi△gntR△gnd)為0.1g，mtk+mcl導入株(MtkAB/atoDAB△pgi△gntR△gnd)為0.2g，glxR+glxK+mtk+mcl導入株(MtkAB，glxR，glxK/atoDAB△pgi△gntR△gnd)為0.3g。
由此可知，導入mtk及mcl而且導入glxR及glxK者，異丙醇及丙酮之生產量有所提升。
關於48小時之異丙醇與丙酮之對糖產率，對照株(vec/atoDAB△pgi△gntR△gnd)為14.8%、mtk+mcl導入株(MtkAB/atoDAB△pgi△gntR△gnd)為17.3%、glxR+glxK+mtk+mcl導入株(MtkAB，glxR，glxK/atoDAB△pgi△gntR△gnd)為18.8%。由此可知，藉由導入mtk及mcl而且導入glxR及glxK，糖變換為異丙醇及丙酮之變換效率提高。
於48小時，若將對照株(vec/atoDAB△pgi△gntR△gnd)與mtk+mcl導入株(MtkAB/atoDAB△pgi△gntR△gnd)加以比較，乳酸之量減少，可知導入mtk及mcl並導入glxR及glxK之菌株(MtkAB，glxR，glxK/atoDAB△pgi△gntR△gnd)，意外地乳酸之量進一步減少。
[實施例21]
<評價用黑麴黴株之製作>
從黑麴黴ATCC1015之基因體依文獻(Plasmid,2005；53：191-204)記載之方法，以PCR取得葡萄糖澱粉酶之啟動子區(GlaPr)與轉錄終結區(GlaTt)之基因。
將Methylococcus capsulatusATCC33009來源之蘋果醯輔酶A裂解酶基因(序列編號41)、蘋果酸硫激酶之次單元α基因(序列編號28)、及蘋果酸硫激酶之次單元β基因(序列編號29)，和適當的SD序列(Shine dalgarno sequence)一起以PCR法予以放大。將獲得之放大片段設計成各蛋白質之編碼區係以啟動子區(GlaPr)與轉錄終結區(GlaTt)夾住，並插入到質體pPTRII(Takara)之HindIII部位。將獲得之質體命名為pPTRII＿mcl(Mc)＿mtk(Mc)。
從Rhodococcus jostiiNBRC16295之基因體，將2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶之基因(glxR)(序列編號64)及乙醛酸醛連接酶之基因(gcl)(序列編號65)和適當的SD序列一起以PCR法予以放大。獲得之放大片段設計成各蛋白質之編碼區夾在啟動子區(GlaPr)與轉錄終結區(GlaTt)之間，並插入到pPTRII＿mcl(Mc)＿mtk(Mc)。將獲得之質體命名為pPTRII＿mcl(Mc)＿mtk(Mc)＿glxR(Rj)＿gcl(Rj)。
使用pPTRII、pPTRII＿mcl(Mc)＿mtk(Mc)及pPTRII＿mcl(Mc)＿mtk(Mc)＿glxR(Rj)＿gcl(Rj)，將黑麴黴ATCC1015轉形，製成黑麴黴之對照株(有時稱為「AN/vec」)、mtk+mcl導入株(有時稱為「AN/mtk＿mcl」)、mtk+mcl+glxR+gcl導入株(有時稱為「AN/mtk＿mcl＿gcl＿glxR」)。
[實施例22]
<利用黑麴黴所為之檸檬酸生產試驗>
將實施例21製作之黑麴黴株(AN/vec、AN/mtk＿mcl、及AN/mtk＿mcl＿gcl＿glxR)以含碳源及Pyrithiamine hydrobromide之培養基於30℃培養，結果比起對照株之AN/vec，AN/mtk＿mcl及AN/mtk＿mcl＿gcl＿glxR以較 高產率生產檸檬酸。使用經13C標定的碳酸氫鈉培養，檢查係中間產物之乙醯輔酶A及係最終產物之檸檬酸中的13C含量，確認被固定的碳酸已導入乙醯輔酶A及檸檬酸。
[實施例23]
<評價用之土麴黴株之製作>
以與實施例21為同樣方法，使用pPTRII、pPTRII＿mcl(Mc)＿mtk(Mc)及pPTRII＿mcl(Mc)＿mtk(Mc)＿glxR(Rj)＿gcl(Rj)，依pPTRII(Takara)之操作說明書，將土麴黴NBRC6365轉形，製作土麴黴之對照株(有時稱為「AT/vec」)、mtk+mcl導入株(有時稱為「AT/mtk＿mcl」)、mtk+mcl+glxR+gcl導入株(有時稱為「AT/mtk＿mcl＿gcl＿glxR」)。
[實施例24]
<利用土麴黴所為之伊康酸生產試驗>
將實施例23製作之土麴黴株(AT/vec、AT/mtk＿mcl、及AT/mtk＿mcl＿gcl＿glxR)以含碳源及Pyrithiamine hydrobromide之培養基於30℃培養，結果比起對照株之AT/vec，AT/mtk＿mcl及AT/mtk＿mcl＿gcl＿glxR以較高產率生產伊康酸。使用經13C標定的碳酸氫鈉培養，檢查係中間產物之乙醯輔酶A及係最終產物之伊康酸中的13C含量，確認被固定的碳酸已導入乙醯輔酶A及伊康酸。
將AT/mtk＿mcl＿gcl＿glxR作為評價用株，於培養基中供給碳酸鹽、二氧化碳氣體或還原劑作為添加劑，以同樣方法進行培養及分析。分析結果，供給碳酸鹽、二氧化碳氣體或還原劑作為添加劑之試驗區，比起未供給碳酸鹽、二氧化碳氣體或還原劑之試驗區，分別顯示較高的對糖產率。亦即，可認為：已賦予CO2固定路徑之菌株中，碳酸鹽、二氧化碳氣體或還原劑之供給對於對糖產率之提高為有效。
[實施例25]
<評價用鉤蟲貪銅菌株之製作>
將Methylococcus capsulatusATCC33009來源之蘋果酸硫激酶之次單元α基因(序列編號28)、及蘋果酸硫激酶之次單元β基因(序列編號29)，和適當的SD序列一起以PCR法予以放大。將獲得之放大片段連結於廣寄主範圍的載體pBBR1-MCS2(GenBank存取號碼U23751)，使其成為lac啟動子的支配下。將獲得之質體命名為pBBR-MCS2＿mtk(Mc)。
使用pBBR1-MCS2及pBBR-MCS2＿mtk(Mc)，將鉤蟲貪銅菌JMP134(DSM4058)轉形，製作鉤蟲貪銅菌之對照株(有時稱為「CP/vec」)及mtk導入株(有時稱為「CP/mtk」)。
[實施例26]
<利用鉤蟲貪銅菌進行之聚3-羥基丁酸生產試驗>
將實施例25製作之評價用株(CP/vec及CP/mtk)使用含碳源及康黴素之培養基於30℃培養，結果相較於對照株之CP/vec，mtk導入株之CP/mtk以較高產率生產聚3-羥基丁酸。使用經13C標定的碳酸氫鈉進行培養，檢查為中間產物之乙醯輔酶A及為最終產物之聚3-羥基丁酸之13C含量，確認被固定之碳酸已導入到乙醯輔酶A及聚3-羥基丁酸。
2013年1月24日提申之日本申請編號第2013-011536號、及2013年1月24日提申之日本申請編號第2013-011538號之揭示，其全體納入於本說明書作為參考。
本說明書記載的所有文獻、申請專利案、及技術規格，當各文獻、專利申請案、及技術規格利用參考而納入時係與具體的且個別記載時以同程度地利用參考而納入本說明書中。
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<120> 導入了二氧化碳固定循環之微生物
<130> P001301429
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<213> Hyphomicrobium methylovorum
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<213> Hyphomicrobium denitrificans
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<212> DNA
<213> Nitrosomonas europaea
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引子
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<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引子
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<212> DNA
<213> 人造序列
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<223> 引子
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<212> DNA
<213> 人造序列
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<223> 引子
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<212> DNA
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<223> 引子
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<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引子
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<212> DNA
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<223> 引子
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<212> DNA
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<223> 引子
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<212> DNA
<213> 人造序列
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<223> 引子
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<211> 45
<212> DNA
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<223> 引子
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<223> 引子
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<223> 引子
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<220>
<223> 引子
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<223> 引子
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
<223> 引子
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<223> 引子
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<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引子
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<213> Rhodococcus jostii
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<212> DNA
<213> Rhodococcus jostii
<400> 64
<210> 65
<211> 1806
<212> DNA
<213> Rhodococcus jostii
<400> 65
<210> 66
<211> 294
<212> PRT
<213> Rhodococcus jostii
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<212> PRT
<213> Rhodococcus jostii
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<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引子
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<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引子
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<212> DNA
<213> 人造序列
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<223> 引子
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引子
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<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> pBL1片段
<400> 72
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<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引子
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<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引子
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<211> 3423
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
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<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引子
<400> 77
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引子
<400> 78
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<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引子
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引子
<400> 80
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引子
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<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引子
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人造序列
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<223> 引子
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Claims (32)

  1. 一種乙醯輔酶A生產微生物，係對於下列(a)、(b)、(c)、(d)及(e)中任一者皆無之微生物，下列(a)、(b)、(c)及(d)任一者均不賦予、或即使賦予下列(a)、(b)、(c)及(d)中之1者以上也不使其發揮作用，而是藉由賦予蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中之至少1者之酵素活性而獲得之具有乙醯輔酶A生產循環之微生物；其選自於由丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、蘋果酸去氫酶、蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶、羥基丙酮酸異構酶、羥基丙酮酸還原酶、甘油酸2-激酶、甘油酸3-激酶、磷酸甘油酸變位酶及烯醇酶構成之群組中之至少1者之酵素活性被強化，及/或選自於由蘋果酸酵素及富馬酸還原酶構成之群組中之至少1者之酵素活性失活或減活；(a)具有丙二醯輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應的碳酸固定循環；(b)具有由乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應的碳酸固定循環；(c)具有由巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯輔酶A或戊烯二醯輔酶A之酵素反應的碳酸固定循環；(d)具有由CO2至甲酸之酵素反應的碳酸固定循環；(e)選自於由蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶構成之群組中之至少1者。
  2. 如申請專利範圍第1項之乙醯輔酶A生產微生物，其具有乙醯輔酶A生產循環，係將磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸變換為草醯乙酸；將草醯乙酸利用蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶及乙醛酸醛連接酶變換為2-羥基-3-側氧基丙酸；將2-羥基-3-側氧基丙酸變換為2-磷酸甘油酸；將2-磷酸甘油酸變換為磷酸烯醇丙酮酸。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之乙醯輔酶A生產微生物，具有包含下列(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)及(m)之乙醯輔酶A生產循環：(f)選自於由丙酮酸激酶及丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、及 磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶構成之群組中之至少1者；(g)蘋果酸去氫酶；(h)蘋果酸硫激酶；(i)蘋果醯輔酶A裂解酶；(j)乙醛酸醛連接酶；(k)選自於由.2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶、羥基丙酮酸異構酶及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中之至少1者；(l)選自於由甘油酸2-激酶、甘油酸3-激酶及磷酸甘油酸變位酶構成之群組中之至少1者；(m)烯醇酶。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之乙醯輔酶A生產微生物，其中，該(a)、(b)、(c)、(d)及(e)中任一者皆無之微生物係屬於腸內細菌科之微生物或屬於棒桿型菌之微生物。
  5. 如申請專利範圍第1或2項之乙醯輔酶A生產微生物，其中，該(a)、(b)、(c)、(d)及(e)中任一者皆無之微生物係屬於為埃希氏菌屬細菌或泛菌屬細菌之腸內細菌科之微生物、或屬於棒桿菌屬細菌之棒桿型菌之微生物。
  6. 一種乙醯輔酶A生產方法，包含以下步驟：培養步驟，使如申請專利範圍第1至5項中任一項之乙醯輔酶A生產微生物、與碳源材料接觸而進行培養；回收步驟，回收利用該接觸而獲得之目的生產物。
  7. 如申請專利範圍第6項之乙醯輔酶A生產方法，更包含供給步驟，該供給步驟係將選自於由碳酸離子、碳酸氫離子、二氧化碳氣體及還原劑構成之群組中之至少1者供給予用於培養之培養基。
  8. 如申請專利範圍第6或7項之乙醯輔酶A生產方法，更包含氣體供給步驟，該氣體供給步驟係回收由於培養而產生之含二氧化碳的氣體，並將該氣體對於用於培養之培養基供給。
  9. 一種乙醯輔酶A生產方法，包含以下步驟：培養步驟，培養具有乙醯輔酶A生產循環之乙醯輔酶A生產微生物，該乙醯輔酶A生產微生物係對於下列(a)、(b)、(c)、(d)及(e)中任一者皆無之微生物，下列(a)、(b)、(c)及(d)皆不賦予、或即使賦予下列(a)、(b)、(c)及(d) 中之1者以上也不使其發揮機能而藉由賦予選自於由蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中之至少1者之酵素活性而獲得；供給步驟，將選自於由總供給量為150mmol/L以上之碳酸離子或碳酸氫離子、平均氣泡徑為100μm以上之二氧化碳氣體、及總供給量為0.01g/L以上50g/L以下之亞硫酸鈉構成之群組中之至少1者供給予用於培養之培養基；(a)具有由丙二醯輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應的碳酸固定循環；(b)具有由乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應的碳酸固定循環；(c)具有由巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯輔酶A或戊烯二醯輔酶A之酵素反應的碳酸固定循環；(d)具有由CO2至甲酸之酵素反應的碳酸固定循環；(e)選自於由蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶構成之群組中之至少1者。
  10. 如申請專利範圍第9項之乙醯輔酶A生產方法，更包含氣體供給步驟，該氣體供給步驟係回收由於培養而產生之含二氧化碳的氣體，並將該氣體對於用於培養之培養基供給。
  11. 如申請專利範圍第9或10項之乙醯輔酶A生產方法，其中，該乙醯輔酶A生產微生物具有乙醯輔酶A生產循環，該乙醯輔酶A生產循環係將磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸變換為草醯乙酸，將草醯乙酸利用蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶及乙醛酸醛連接酶變換為2-羥基-3-側氧基丙酸，將2-羥基-3-側氧基丙酸變換為2-磷酸甘油酸，將2-磷酸甘油酸變換為磷酸烯醇丙酮酸。
  12. 如申請專利範圍第9或10項之乙醯輔酶A生產方法，其中，該乙醯輔酶A生產微生物係具有包含下列(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)及(m)之乙醯輔酶A生產循環的乙醯輔酶A生產微生物：(f)選自於由丙酮酸激酶及丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、及磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶構成之群組中之至少1者；(g)蘋果酸去氫酶； (h)蘋果酸硫激酶；(i)蘋果醯輔酶A裂解酶；(j)乙醛酸醛連接酶；(k)選自於由2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶、羥基丙酮酸異構酶及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中之至少1者；(l)選自於由甘油酸2-激酶、甘油酸3-激酶及磷酸甘油酸變位酶構成之群組中之至少1者；(m)烯醇酶。
  13. 如申請專利範圍第9或10項之乙醯輔酶A生產方法，其中，該(a)、(b)、(c)、(d)及(e)中任一者皆無之微生物係屬於腸內細菌科之微生物或屬於棒桿型菌之微生物。
  14. 如申請專利範圍第9或10項之乙醯輔酶A生產方法，其中，該(a)、(b)、(c)、(d)及(e)中任一者皆無之微生物係屬於埃希氏菌屬細菌或泛菌屬細菌之腸內細菌科之微生物、或屬於棒桿菌屬細菌之棒桿型菌之微生物。
  15. 一種異丙醇生產方法，係乙醯輔酶A生產微生物將利用如申請專利範圍第9至14項中任一項之乙醯輔酶A生產方法生產之乙醯輔酶A作為中間產物而生產異丙醇。
  16. 一種丙酮生產方法，係乙醯輔酶A生產微生物將利用如申請專利範圍第9至14項中任一項之乙醯輔酶A生產方法生產之乙醯輔酶A作為中間產物而生產丙酮。
  17. 一種麩胺酸生產方法，係乙醯輔酶A生產微生物將利用如申請專利範圍第9至14項中任一項之乙醯輔酶A生產方法生產之乙醯輔酶A作為中間產物而生產麩胺酸。
  18. 一種麩胺酸生產方法，包含以下步驟：培養步驟，使如申請專利範圍第1至5項中任一項之乙醯輔酶A生產微生物與碳源材料接觸而進行培養；回收步驟，將利用該接觸而獲得之麩胺酸回收。
  19. 一種麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物，係對於下列(a2)、(b2)、(c2)、(d2)及(e2)中任一者皆無之微生物，下列(a2)、(b2)、(c2)及(d2)均不賦予、或即使賦予下列(a2)、(b2)、(c2)及(d2)中之1者以上也不使其發揮作用，而是 藉由賦予選自於由蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶構成之群組中之至少1者之酵素活性而獲得：(a2)具有由丙二醯輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應的碳酸固定循環；(b2)具有由乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應的碳酸固定循環；(c2)具有由巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯輔酶A或戊烯二醯輔酶A之酵素反應的碳酸固定循環；(d2)具有由CO2至甲酸之酵素反應的碳酸固定循環；(e2)選自於由蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶構成之群組中之至少1者。
  20. 如申請專利範圍第19項之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物，具有乙醯輔酶A之生產能力。
  21. 如申請專利範圍第19或20項之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物，係藉由更賦予選自於由乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中之至少1者之酵素活性而獲得。
  22. 如申請專利範圍第19或20項之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物，具有乙醯輔酶A生產循環，該乙醯輔酶A生產循環係將磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸變換為草醯乙酸，將草醯乙酸利用蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶及乙醛酸醛連接酶變換為2-羥基-3-側氧基丙酸，將2-羥基-3-側氧基丙酸變換為2-磷酸甘油酸，將2-磷酸甘油酸變換為磷酸烯醇丙酮酸。
  23. 如申請專利範圍第19或20項之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物，具有含下列(f2)、(g2)、(h2)、(i2)、(j2)、(k2)、(l2)及(m2)之乙醯輔酶A生產循環：(f2)選自於由丙酮酸激酶及丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、及磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶構成之群組中之至少1者；(g2)蘋果酸去氫酶；(h2)蘋果酸硫激酶；(i2)蘋果醯輔酶A裂解酶；(j2)乙醛酸醛連接酶；(k2)選自於由2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶、羥基丙酮酸異構酶及羥基 丙酮酸還原酶構成之群組中之至少1者；(l2)選自於由甘油酸2-激酶、甘油酸3-激酶及磷酸甘油酸變位酶構成之群組中之至少1者；(m2)烯醇酶。
  24. 如申請專利範圍第19或20項之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物，具有包含以下酵素反應的路徑：選自於由下列(a3)及(b3)構成之群組中之至少1者之酵素反應；下列(c3)、(d3)、(e3)、(f3)及(g3)的酵素反應；選自於由下列(h3)的酵素反應、下列(i3)、(j3)、(k3)及(n3)的酵素反應、及下列(i3)、(j3)、(l3)、(m3)及(n3)的酵素反應構成之群組中之至少1者：(a3)由磷酸烯醇丙酮酸至草醯乙酸之酵素反應；(b3)由丙酮酸至草醯乙酸之酵素反應；(c3)由草醯乙酸至蘋果酸之酵素反應；(d3)由蘋果酸至蘋果醯輔酶A之酵素反應；(e3)由蘋果醯輔酶A至乙醛酸及乙醯輔酶A之酵素反應；(f3)由乙醛酸至甘胺酸之酵素反應；(g3)由甘胺酸至絲胺酸之酵素反應；(h3)由絲胺酸至丙酮酸之酵素反應；(i3)由絲胺酸至3-羥基丙酮酸之酵素反應；(j3)由3-羥基丙酮酸至甘油酸之酵素反應；(k3)由甘油酸至2-磷酸甘油酸之酵素反應；(l3)由甘油酸至3-磷酸甘油酸之酵素反應；(m3)由3-磷酸甘油酸至2-磷酸甘油酸之酵素反應；(n3)由2-磷酸甘油酸至磷酸烯醇丙酮酸之酵素反應。
  25. 如申請專利範圍第19或20項之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物，具有：選自於由下列(a4)及(b4)構成之群組中之至少1者的酵素；下列(c4)、(d4)、(e4)、(f4)及(g4)的酵素；選自於由下列(h4)的酵素、下列(i4)、(j4)、(k4)及(n4)的酵素、及下列(i4)、(j4)、(l4)、(m4)及(n4)的酵素構成之群組中之至少1者： (a4)選自於由丙酮酸激酶及丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、及磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶構成之群組中之至少1者；(b4)丙酮酸羧化酶；(c4)蘋果酸去氫酶；(d4)蘋果酸硫激酶；(e4)蘋果醯輔酶A裂解酶；(f4)甘胺酸轉胺酶；(g4)甘胺酸開裂系及絲胺酸羥基甲基轉移酶；(h4)絲胺酸脫水酶；(i4)絲胺酸轉胺酶；(j4)羥基丙酮酸還原酶；(k4)甘油酸2-激酶；(l4)甘油酸3-激酶；(m4)磷酸甘油酸變位酶；(n4)烯醇酶。
  26. 如申請專利範圍第19或20項之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物，其中，該(a2)、(b2)、(c2)、(d2)及(e2)中任一者皆無之微生物係黑麴黴、土麴黴或鉤蟲貪銅菌。
  27. 一種乙醯輔酶A生產方法，包含以下步驟：培養步驟，使如申請專利範圍第19至26項中任一項之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物由碳源材料生產檸檬酸。
  28. 如申請專利範圍第27項之乙醯輔酶A生產方法，更包含供給步驟，該供給步驟係將選自於由碳酸離子、碳酸氫離子、二氧化碳氣體及還原劑構成之群組中之至少1者對於培養使用之培養基供給。
  29. 如申請專利範圍第27或28項之乙醯輔酶A生產方法，更包含氣體供給步驟，該氣體供給步驟係回收由於培養產生之含二氧化碳之氣體，並將該氣體對於用於培養之培養基供給。
  30. 一種檸檬酸生產方法，包含使用如申請專利範圍第19至26項中任一項之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物由碳源材料生產檸檬酸。
  31. 一種伊康酸生產方法，包含使用如申請專利範圍第19至26項中任 一項之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物由碳源材料生產伊康酸。
  32. 一種(聚)3-羥基丁酸生產方法，包含使用如申請專利範圍第19至26項中任一項之麴菌屬菌或貪銅菌屬菌微生物由碳源材料生產(聚)3-羥基丁酸。
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