FR2533941A1

FR2533941A1 - Procede de fabrication de la l-phenylalanine comportant la reutilisation de l'ammonia-lyase de phenylalanine

Info

Publication number: FR2533941A1
Application number: FR8315229A
Authority: FR
Inventors: Wayne Elliott Swann
Original assignee: Genex Corp
Current assignee: Genex Corp
Priority date: 1982-10-01
Filing date: 1983-09-26
Publication date: 1984-04-06
Also published as: IL69672A0; IT8368017A0; JPS5991890A; GB8325797D0; NL8303369A; SE8305151L; CA1206435A; ZA836626B; ES526165A1; DE3333246A1; GR79053B; CH658670A5; BE897889A; DK452783A; BR8305366A; DK452783D0; DD217822A5; GB2127821A; FI833552A0; FR2533941B1

Abstract

PROCEDE DE FABRICATION DE LA L-PHENYLALANINE, CONSISTANT A FAIRE REAGIR DE L'ACIDE TRANS-CINNAMIQUE AVEC UNE SOURCE D'IONS AMMONIUM POUR FORMER UNE SOLUTION DE SUBSTRAT, A AJUSTER LE PH DE CETTE DERNIERE, PUIS A LA METTRE EN CONTACT AVEC DE L'AMMONIA-LYASE DE PHENYLALANINE DANS DES CONDITIONS PROPRES A PRODUIRE DE LA L-PHENYLALANINE. ON UTILISE COMME SOURCE D'IONS AMMONIUM UN SEL D'AMMONIUM PRATIQUEMENT DEPOURVU D'HALOGENES, ET ON AJUSTE LE PH DE LA SOLUTION DE SUBSTRAT EN LUI AJOUTANT UN ACIDE PRATIQUEMENT DEPOURVU D'HALOGENE. LA FIGURE 2 CI-JOINTE REPRESENTE LE POURCENTAGE DE RETENTION DE L'ACTIVITE DE L'AMMONIA-LYASE DE PHENYLALANINE DANS LA FERMENTATION DE CELLULES DE R. RUBRA, AVEC ET SANS ALIMENTATION EN D, L-PHENYLALANINE, EN FONCTION DU TEMPS.

Description

A/ 2533941

PROCEDE DE FABRICATION DE LA L-PHENYLALANINE

COMPORTANT LA REUTILISATION DE L'AMMONIA-LYASE

DE PHENYLALANINE

La présente invention concerne un procédé de fabrica- tion de la phénylalanine à partir de la réaction, catalysée par

l'ammonia-lyase de phénylalanine (PAL), de l'acide trans-cinna-

mique et de l'ammoniac Plus précisément, la présente invention

concerne un procédé de fabrication de la phénylalanine dans le-

quel on conserve un haut degré de l'activité du catalyseur PAL,

et on peut réutiliser le catalyseur.

La phénylalanine est un acide aminé essentiel qui

est important pour la nutrition et dans d'autres secteurs ali-

mentaires et médicaux Elle a été isolée industriellement d' une grande variété de protéines, y compris l'ovalbumine et la lactalbumine Un procédé de laboratoire permettant de préparer la L-phénylalanine, bien connu dans la technique, fait appel à une enzyme, l'ammonia-lyase de phénylalanine (ci-après "PAL"), pour catalyser la réaction réversible:

L-phénylalanine + acide trans-cinnamique + am-

moniac.

(Voir le brevet britannique n 1 489,468 ( 19 octobre 1977).

L'équilibre de cette réaction est normalement de :20 en faveur de l'acide trans-cinnamique, et divers moyens

ont été expérimentés pour parvenir à un haut degré de transfor-

mation en L-phénylalanine Selon le brevet britannique n 1 489.

468, il est possible de parvenir à un rendement approchant les % théoriques de L-phénylalanine en utilisant une grande masse de cellules contenant le catalyseur PAL et un excès d' ions ammonium Conformément au procédé de ce brevet, la source des ions ammonium est de préférence le chlorure d'ammonium, et on mène de préférence la réaction à un p H compris entre 8,5 et 9,7.

Yamada, S, et al, Appl Environ Microbiol.

42:773-78 ( 1981), ont rapporté que l'on pouvait porter le ren-

dement de la transformation à plus de 70 % en ajustant le p H

de la solution du substrat à 10,0 avec de l'acide chlorhydrique.

Mais ces conditions sont si sévères que l'activité PAL des cel-

lules récupérées est grandement réduite, à un point tel que la réutilisation de l'enzyme est impraticable En outre, Yamada et al affirment que l'immobilisation de l'enzyme cellulaire

ne procure aucun avantage par rapport à l'1 utilisation de cellu-

les intactes Ainsi, bien qu'il soit possible d' obtenir initialement par ce procédé une forte concentration de

L-phénylalanine, l'impossibilité de réutiliser l'enzyme cataly-

tique rend ce procédé coûteux pour une application à grande é-

chelle. On a donc encore besoin d'un procédé de préparation de la Lphénvlalanine à partir de l'acide trans-cinnaminue et de l'ammoniac dans lequel on parvienne à un rendement élevé de L-phénylalanine et la PAL conserve une activité catalytique

suffisante pour pouvoir être réutilisée.

C'est par conséquent un objectif de la présente in-

vention de procurer un procédé de préparation de la L-phényalaa-

nine à partir de l'acide trans-cinnamique, permettant d'obtenir le produit à une concentration élevée et d'utiliser à plusieurs

reprises l'enzyme PAL.

C'est également un objectif de la présente invention

de procurer un moyen de préparation de la L-phénylalanine per-

mettant de mener la réaction, soit dans un système discontinu à cellules libres, soit dans un système à enzyme ou à cellules immobilisées.

C'est encore un autre objectif de la présente inven-

tion de procurer un moyen économique d'utilisation de la PAL

pour la fabrication de la L-phénylalanine.

Le procédé de préparation de la L-phénylalanine qui consiste à faire réagir l'acide trans-cinnamique et l'ammoniac en présence d'ammonia-lyase de phénylalanine a été amélioré

de façon que l'on obtienne'de hauts rendements de L-phénylala-

nine et que l'on conserve un haut degré de l'activité cataly-

tique de la PAL Dans des conditions réactionnelles maltrisées, la stabilité de la PAL est augmentée à un point tel que l'on

peut l'utiliser à plusieurs reprises pour produire de la L-

phénylalanine à une forte concentration.

Pour parvenir à ce résultat voulu, on prépare une solution de substrat en faisant réagir l'acide avec une source d'ions ammonium La source d'ions ammonium peut être n'importe

quel sel d'ammonium non halogéné On ajuste le p H de la solu-

tion de substrat de telle sorte au'il se trouve dans l'inter-

valle de 8,0 à 10,0 environ, en utilisant un acide non halogé-

né, puis on ajoute cette solution à une source de PAL telle

au'un système à cellules intactes libres ou un système à en-

zyme ou à cellules immobilisées qui contient de la PAL.

Conformément -au procédé de la présente invention,

on prépare une solution de substrat avec de l'acide trans-cin-

namique et une source d'ions ammonium On peut introduire la source d'ions ammonium soit en ajoutant directement un sel d' ammonium d'un acide organique ou d'un acide minéral à l'acide

trans-cinnamique, soit en la préparant dans la solution de subs-

trat, par exemple en mélangeant de l'ammoniague et un acide non

halogéné.

Le brevet britannique N O 1 489 468 révèle qu'une -

source préférée d'ions ammonium est un mélange de chlorure d' ammonium et d'ammoniaque (p 3, lignes 25 et 26) Le procédé

de Yarvada et al fait lui aussi appel au chlorure d'ammonium.

Par opposition à ces enseignements de la technique antérieure, il a été découvert qu'il était avantageux que le sel d'ammonium ne contienne pas d'ions halogènes Il a été constaté que la présence d'halogènes dans les solutions de substrat-inhibait l'-activité catalytique de la PAL Par conséquent, les sels d' ammonium préférés comprennent le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le citrate d'ammonium, l'acétate d'ammonium et le phosphate d'ammonium Un sel d'ammonium que l'on préfère tout

particulièrement est le sulfate d'ammonium.

Il est également souhaitable que le sel d'ammonium

soit ajouté à la solution de substrat à une forte concentration.

La concentration des ions ammonium est généralement de 0,1 à 7,5

M environ, de préférence de 1 à 5 M environ La forte concentra-

tion du sel d'ammonium augmente la concentration de l'ammoniac dans le système et joue également un rôle de tampon pour que

-l'on puisse maîtriser plus facilement l'ajustement du p H -du mé-

lange réactionnel.

Lorsque la concentration des ions ammonium se trouve à l'intérieur des intervalles sus-indiqués, la concentration de l'acide trans-cinnamique dans la solution est généralement de 30

à 200 m M environ, et de préférence de 60 à 150 m M environ.

Yamada et al révèlent que la solution de substrat doit être ajustée à un p H de 10,0 Mais, dans le procédé selon la présente invention, le p H peut être ajusté à l'intérieur de

l'intervalle de 8 à 10 environ et se situe de préférence à l'in-

térieur de l'intervalle de 8,5 à 9,5 environ La référence Yamada-

révèle également l'ajustement du p H de la solution de substrat

avec de l'acide chlorhydrique Cela peut avoir pour effet d'ajou-

ter une quantité importante de chlorure au substrat Mais dans le présent procédé, comme indiqué ci-dessus, il est avantageux d'ajuster le p H de la solution de substrat avec un acide non halogéné Les acides préférés pour ajuster le p H sont l'acide sulfurique, l'acide phosphorique et l'acide acétique, encore que l'on puisse utiliser d'autres acides non halogénés Un

acide que l'on préfère tout particulièrement est l'acide sulfu-

rique, car, ajouté à une solution de substrat contenant de l'ammoniaque, il réagit en formant du sulfate d'ammonium, qui

est un agent bien connu de stabilisation des enzymes.

On ajoute la solution de substrat à un bouillon de culture contenant de la PAL, aux cellules qui en sont séparées, ou à l'enzyme isolée La PAL est obtenue conformément à des procédés classiques enseignés par la technique antérieure La

réaction catalysée par la PAL se fait dans des conditions pro-

pres à produire de la L-phénylalanine, lesquelles comprennent

de préférence une température de réaction de 10 'C à 450 C envi-

ron Dans les conditions du procédé selon la présente invention, la stabilité de la PAL se trouve accrue au point que l'on peut

* l'utiliser à plusieurs reprises pour produire de la L-phénylala-

nine avec une forte concentration.

Le présent procédé de fabrication de la L-phénylala-

nine peut être utilisé soit dans un système discontinu à cel-

lules libres, soit dans un système à enzyme ou à cellules immo-

bilisées Le système discontinu peut être soit un simple système

discontinu, soit un système discontinu à alimentation continue.

Si la PAL est immobilisée dans une colonne, on peut faire tra-

vailler la colonne en une seule passe, avec recyclage ou avec

recyclage d'alimentation continue Un procédé préféré d'immobi-

lisation de l'enzyme PAL ou des cellules contenant cette enzyme

est décrit dans la demande de brevet français déposé par la de-

manderesse le 30 juin 1983 sous le N O 83 10856 Lorsque l'enzyme PAL ou les cellules contenant cette enzyme sont immobilisées dans une colonne, on peut maintenir la colonne à une tempéra-

ture de 100 à 40 'C environ, et de préférence de 18 à 30 'C en-

viron, tandis que la solution de substrat est pompée à travers

la colonne.

On analyse la teneur en phénylalanine du mélange ré-

actionnel par des méthodes classiques Lorsqu'on utilise de l'acide sulfurique à la place de l'acide chlorhydrique dans la solution de substrat, la quantité de L-phénylalanine produite représente environ 8 à 10 fois la quantité'produite lorsque

c'est de l'acide chlorhydrique que l'on utilise Lorsque l'en-

zyme PAL a été immobilisée, elle fait preuve d'une rétention d'activité de 50 % environ après 41 jours de réaction Cela est à comparer avec la rétention de 20 % au bout de 24 heures, rapportée par Yamada et al.

La L-phénylalanine peut êtreisolée du mélange réac-

tionnel par des procédés classiques.

Les exemples suivants sont destinés à illustrer et à mieux définir le procédé selon la présente invention, mais ne

doivent pas être considérés comme la limitant.

Exemple 1

On a préparé un milieu de culture par le mode opéra-

toire général suivant: A 1 litre d'eau désionisée, ajouter 10 g de peptone, g d'extrait de levure, 0,5 g de D, L-phénylalanine, 5 g de chlorure de sodium et 5 g de L-isoleucine Ajuster le p H à 6,0 à l'aide d'acide sulfurique et passer à l'autoclave à 120 'C pendant 10 minutes sous 1,05 atm On obtient ainsi un milieu inducteur normalisé pour les tubes de culture et les ballons

à secouer.

Exemple 2

On a suivi le mode opératoire général de l'exemple

1, excepté que l'on a ajouté au milieu 100 m M d'iodure de po-

tassium (KI) On a ainsi obtenu un milieu de sélection forte-

ment inducteur.

Exemple 3

On a suivi le mode opératoire général de l'exemple 1,

excepté que l'on a ajouté au milieu 200 m M de KI On a ainsi ob-

tenu un milieu de sélection qui est lui aussi fortement induc-

teur.

Exemple 4

On a suivi le mode opératoire général de l'exemple 1, excepté que l'on a utilisé 15 g d'extrait de levure et qu'on a supprimé la peptone On a également ajouté 200 m M de KI On a ainsi obtenu un milieu de production pour ballons à secouer qui

est fortement inducteur.

Exemple 5

On a préparé un milieu de fermentation par le mode opératoire général de l'exemple 4, excepté que l'on n'a ajouté ni chlorure de sodium, ni Lisoleucine On a ainsi obtenu un

milieu de production par fermentation qui est fortement induc-

teur.

Exemple 6

On a préparé trois milieux de culture comme dans les exemples 1, 2 et 3 On a utilisé une souche de Rhodotorula

rubra (ATCC n' 4056) productrice de PAL, que l'on avait main-

tenue sur des cultures inclinées de gélose nutritive pour ino-

culer 4,5 cm 3 de chaque culture en tube à essai On a ensuite

placé les tubes sur une secoueuse à 300 C et à 250 tours par mi-

nute On a procédé à sept transferts ( 0,2 cm 3) de chaque tube, au bout de 24 ou 48 heures, dans 4,5 ml d'un milieu de culture frais On a utilisé des tubes de culture pour inoculer 200 cm 3 de milieu dans des ballons à secouer de 1 000 ml On a récolté un ballon de chaque milieu au bout de 30 heures et au bout de

54 heures Le rendement cellulaire au bout de 30 heures s'éta-

blissait en moyenne à 14 g de pâte par litre et au bout de 54 heures à 29 g de pâte par litre L'activité PAL de 100 m M de KI était supérieure de 31 % à celle du témoin L'activité PAL de

m M de KI était supérieure de 39 % à celle du témoin.

Exemple 7 On a suivi le mode opératoire général de l'exemple 6 pour cultiver des cellules de R rubra dans un milieu fortement inducteur contenant 200 m M de KI, avec cette exception que l'on a procédé à 25 transferts de sélection-de la culture à 200 m M de

KI D'autre part, 24 heures après avoir inoculé le ballon à se-

couer, on a utilisé 2,5 % du milieu pour inoculer 15 ballons à secouer frais (ballon final) et après 24 heures de culture, on a récolté ces ballons On a mesuréiles rendements cellulaires

et l'activité PAL sur quelques ballons et sur la pâte cellu-

laire regroupée obtenue comme produit final La plus forte activité PAL, pour un milieu contenant 28,7 g de pâte par litre,

était de 18,4 unités par g de pâte ( 528 unités PAL par litre).

( 1 unité = 1 mole de L-phénylalanine transformgeen acide trans-

cinnamiaue et en ammoniac par minute à 30 C) On a déterminé l'activité par modification de la méthode enseignée par Kalghatgi et Subba Rao, Biochem J 149: 65-72, 1975 Le produit final constitué par les cellules regroupées contenait 15,0 unités de PAL par gramme de pâte pour un rendement cellulaire moyen de 27

g de pâte par litre ( 405 unités de PAL par litre).

Exemple 8

On a préparé une solution de substrat de cinnamate d'ammonium par le mode opératoire général suivant On a ajouté

de l'acide cinnamique à de l'ammoniaque ( 28 %) jusqu'à dissolu-

tion On a ensuite ajouté de l'eau et de l'acide pour ajuster respectivement le volume du substrat et le p H La concentration de l'acide cinnamique, la concentration de l'ammoniac et le p H (quantité d'acide ajoutée) varieront dans les exemples suivants;

par conséquent, les quantités de sels d'ammonium produites va-

rieront elles aussi.

Exemple 9

On a exploré l'effet des fortes concentrations d'ha-

logène sur la PAL en utilisant différents acides pour abaisser le p H des solutions de substrat On a préparé deux substrats par

le mode opératoire général de l'exemple 8 ( 60 m M d'acide cinna-

mique; NH 3 7,5 M; p H 10,0) o On a ajusté le p H de la solution A à l'aide d'acide chlorhydrique et le p H de la solution B à l'aide d'acide sulfurique On a placé les cellules de R rubra, cultivées comme dans l'exemple 4, dans des bêchers baignant dans l'eau et agités, à 30 C On a prélevé des échantillons à des intervalles de temps bien déterminés et on a déterminé leurs teneurs en L-phénylalanine par chromatographie en couche mince,

d'une part, et par essai enzymatique à l'oxydase de L-amino-

acide,' d'autre part On a constaté que la solution de substrat A (contenant du chlorure d'ammonium) inhibait l'enzyme PAL Les cellules de la

solution de substrat B produisaient 10 fois plus de L-phénylala-

nine (après 24 heures de réaction) que les cellules de la solu-

tion de substrat A.

Exemple 10

On a suivi le mode opératoire général de l'exemple 9 pour comparer l'acide phosphorique à l'acide sulfurique Les

cellules de R rubra, dans le substrat dont le p H avait été ajus-

té avec de l'acide phosphorique, produisaient 90 % de la L-phé-

nylalanine que produisait le substrat dont le p H avait été ajus-

té avec de l'acide sulfurique.

Exemple 11

On a suivi le mode opératoire général de l'exemple 9

pour comparer l'acide acétique à l'acide sulfurique La quanti-

té de L-phénylalanine produite dans les réacteurs était la même.

-Exemnle 12

On a préparé des cellules par le mode opératoire gé-

néral de l'exemple 6 On a utilisé ces cellules pour étudier

la possibilité de réutilisation (stabilité) des cellules en-

tières On a préparé trois substrats, contenant chacun 60 m M d'acide trans-cinnamique, et de l'ammoniac 7,5 M, dont le p H était abaissé à 10, 0, 9,0 et 8,0, respectivement, avec de l'acide sulfurique On a placé les cellules ( 4,5 g de pâte cellulaire) dans chaque substrat ( 45 cm 3) pendant 16 heures à 30 'C On a déterminé la concentration de la phénylalanine par l'essai à l'oxydase de L-amino-acide et par chromatographie en couche mince On a centrifugé les cellules, on les a lavées et on

les a placées dans un substrat frais pendant 16 heures Les ré-

sultats sont énoncés dans le tableau ci-dessous.

Passe I Passe II % de rétention p H mg/ml de L-PHE mg/ml de L-PHE d'activité

8 0,22 0,12 55

9 0,95 0,78 82

10 2,02 0,43 21

Ces résultats montrent que, alors même qu'avec un p H de 10,0 l'activité initiale était deux fois plus grande qu'à

p H 9,0, après une passe les cellules à p H 9,0 avaient une activi-

té supérieure de 163 % à celle des cellules à p H 10,0.

Exemple 13

On a procédé à une étude de stabilité sur deux semaines comme dans l'exemple 12 Cependant, les p H du réacteur étaient respectivement de 8, 75, 9,00 et 9,25, et la concentration de l'am- moniac était 5,5 M On a procédé à cet essai de 14 jours avec 6

essais discontinus consécutifs de cellules de R rubra libres.

Les résultats sont donnés dans le tableau ci-dessous.

mg de L-phénylalanine produits par heure/g de poids sec de cellules (% d'activité initiale conservé) Ces résultats montrent que des conditions appropriées peuvent autoriser la réutilisation de la PAL pour produire de la L-phénylalanine, et'que les degrés de rétention de l'activité

sont importants pour les cellules libres.

Exemple 14

On a immobilisé la pate cellulaire de l'exemple 7 par le mode opératoire général enseigné dans la demande de brevet

français n 83 10856 précitée On a pompé le substrat ( 80 m M d'acide cinna-

mique; NH 3 4,8 M; p H 9,23) à travers une colonne garnie de cellules de

R rubra immobilisées, avec écoulement ascendant Les débits va-

riaient de 0,10, 0,25 et 0,50 S Vh-1 à 22 C, à'0,25 et 0,50 S Vh-1

à 28 C On a analysé la teneur en L-phénylalanine de l'effluent.

Les résultats sont énoncés dans le tableau ci-dessous.

p H de la réaction Nombre de jours au p H indiqué 8,75 9,00 9,25

1 5,9 5,7 5,7

7 3,6 3,8 4,2

( 61) ( 67) ( 74)

14 3,5 3,5 4,0

( 59) ( 61) ( 70)

A 0,1 S Vh-l, on a observé un taux de transformation de 40 % du substrat, donnant 5,4 g de L-phénylalanine par litre

à 22 C.

Exemple 15

On a suivi les conditions de culture et d'immobili-

sation de l'exemple 14 On a utilisé une colonne de cellules de R rubra immobilisées contenant de la PAL pour déterminer la

demi-vie de rendement de la colonne dans certaines conditions.

Le substrat se composait de 75 m M d'acide cinnamique et de NH 3 4,5 M et avait un p H de 9,25, et on l'a fait passer en continu h-i

à 23 C avec un débit de 0,25 SV On a constaté que la demi-

vie de rendement était de'41 jours (voir la figure 1) Cet es-

sai démontre que l'on peut utiliser en continu la PAL immobili-

see sur une période de temps prolongée pour produire de la L-

phénylalanine.

Exemple 16 A

On a préparé un milieu de fermentation comme dans l'exemple 5 et on l'a utilisé pour cultiver des cellules de R rubra dans un fermenteur de 10 litres On a ensemencé le

fermenteur comme dans l'exemple 3 On a périodiquement récol-

té des échantillons de cellules du fermenteur On a analysé l'activité PAL des cellules pour déterminer le temps optimal de la récolte On a constaté que 6 heures après l'apparition du

pic d'activité, moins de 50 % de l'activité de pic subsistaient.

Il a également été noté que toute la D, L-phénylalanine avait

été épuisée du milieu avant que le pic d'activité soit atteint.

Exemple 16 B

On a repris l'exemple 16 A Cependant, immédiatement Temp Débit L-PHE Rendement ( C) (S Vh-1) produite (g/l/h)

0,10 5,4 0,54

22 0,25 2,7 0,68

0,50 2,1 1,05

28 0,25 3,8 0,95

0,50 2,8 1,40

après l'apparition du pic d'activité, on a introduit de la D, L-

phénylalanine ( 5 g pour 10 litres)dans le fermenteur La pre-

mière heure, il s'est produit une chute de l'activité PAL comme

à l'exemple 16 A Cependant, l'activité PAL s'est stabilisée pen-

dant les trois heures suivantes, avant que l'on procède à la ré-

colte (voir ia figure 2).

Exemple 17

* On a préparé et immobilisé des cellules selon le mode opératoire de l'exemple 14 Cependant, le substrat utilisé se composait de 75 m M d'acide cinnamique et de NH 3 4,5 M et avait h-i un p H de 9,43 à 23 C et un débit de S Vh 1 = 0,50 On a constaté que la colonne produisait 1,9 g de L-phénylalanine par litre de

support de volume de lit par heure La concentration de la phé-

nylalanine dans l'effluent était de 3,8 g/litre.

Exemple 18 On a préparé et immobilisé des cellules par le mode opératoire général de l'exemple 14 On a garni une colonne des cellules immobilisées et on a recyclé 352 cm 2 de substrat ( 75 m M d'acide cinnamique; NH 3 4, 5 M; p H 9,4) à travers la colonne à h-1 un débit de 1,0 S Vh 1 On a prélevé des échantillons du substrat

regroupé, à intervalles de temps bien déterminés, et on a déter-

miné la concentration de la L-phénylalanine par essai enzymatique à l'oxydase de L-amino acide et par chromatographie en couche

mince Les résultats sont rapportés dans le tableau ci-dessous.

Temps de recyclage (pn heures) L-phénylalanine (en q/l) % de transformation

7 2,8 23

21,5 4,6 37

24 5,0 40

44,5 6,8 55

Cet exemple démontre que, dans les conditions de la réaction, il est possible de produire de la L-phénylalanine

avec une forte concentration et avec un fort pourcentage de trans-

formation en utilisant des cellules immobilisées qui contiennent

de la PAL.

Claims

REVENDICATIONS

1 Procédé de fabrication de la L-phénylalanine, dans lequel, (a) on fait réagir de l'acide trans-cinnamique avec une source d'ions ammonium pour former une solution de substrat, (b) on ajuste le p H de ladite solution de substrat, et (c) on met ladite solution de substrat en contact avec de l'ammonia-lyase de phénylalanine dans des conditions propres à produire de la L-phénylalanine, pour former de la L-phénylalanine; 0 caractérisé en ce aue -(i) on utilise comme source d'ions ammonium un sel d' ammonium pratiquement dépourvu d' halogène, et (ii) on ajuste le p H de la solution de substrat en lui ajoutant un acide pratiquement dépourvu d'halogène 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on ajuste le p H de la solution de substrat de manière qu'il se

situe dans l'intervalle de 8 à 10 environ.

3 Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on ajuste le p H de la solution de substrat de manière

qu'il se situe dans l'intervalle de 8,5 à 9,5 environ.

4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la source d'ions ammonium est le sulfate d'xmmonium, le phos phate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le citrate-d'ammonium,

ou l'acétate d'ammonium.

5 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce

que la source d'ions ammonium est le sulfate d'ammonium.

6 Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caracté-

risé en ce qu'on ajuste le p H de la solution de substrat à l'aide d'un acide qui est l'acide sulfurique, l'acide phosphorique ou

l'acide acétique.

7 Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caracté-

risé en ce que l'on ajuste le p H dé la solution de substrat avec

de l'acide sulfurique.

8- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration des ions ammonium se situe entre 0,1 M et

7,5 M environ.

9 Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la concentration des ions ammonium se situe entre 1 M et 5 M environ. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration de l'acide trans-cinnamique dans la

solution se situe entre 30 m M et 200 m M environ.

11 Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la concentration de l'acide trans-cinnamique dans la

solution se situe entre 60 m M et 150 m M environ.

12 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en

ce que l'ammonia-lyase de phénylalanine peut être réutilisée.

13 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en

ce qu'on produit la L-phénylalanine en ajoutant des cellules in-

tactes contenant de l'ammonia-lyase de phénylalanine à la solu-

tion de substrat dans un réacteur discontinu.

14 Procédé selon la revendication 13, caractérisé en

ce que le système discontinu est un simple système discontinu.

Procédé selon la revendication 13, caractérisé en

ce rue le système discontinu est un système à alimentation con-

tinue. 16 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'ammonia-lyase de phénylalanine est immobisée sur ou dans

un support réutilisable.

17 Procédé selon la revendication 1 ou 16, caracté-

risé en ce que l'ammonia-lyase de phénylalanine est immobilisée

dans une colonne.

18 Procédé selon la revendication 17, caractérisé en

ce qu'on maintient la colonne à une température de 10 à 40 C-

environ, tandis que l'on pompe la solution de substrat à travers

la colonne.

19 Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'on maintient la colonne à une température de 18 à 30 C environ tandis que l'on pompe la solution de substrat à travers

la colonne.