FR2530657A1

FR2530657A1 - Procede d'immobilisation de substances biologiques par absorption dans un support de vermiculite

Info

Publication number: FR2530657A1
Application number: FR8310856A
Authority: FR
Inventors: Wayne Elliott Swann
Original assignee: Genex Corp
Current assignee: Genex Corp
Priority date: 1982-07-20
Filing date: 1983-06-30
Publication date: 1984-01-27
Also published as: CA1195630A; IT8322155A0; NL8302587A; IT1163824B; GB2125407B; GR79324B; BR8303615A; US4504582A; FI832633A0; FI832633A; GB8319625D0; DE3323078A1; SE8304027L; DK323583D0; LU84920A1; CH661744A5; PL243093A1; SE8304027D0; IL68941A0; DK323583A

Abstract

PROCEDE D'IMMOBILISATION DE SUBSTANCES BIOLOGIQUES PAR PREPARATION D'UN COMPOSITE DE SUBSTANCE BIOLOGIQUE INSOLUBILISE. ON AJOUTE DES PARTICULES DE VERMICULITE A UN MILIEU AQUEUX DE SUBSTANCE BIOLOGIQUE, ON LAISSE LA VERMICULITE ABSORBER CE MILIEU AQUEUX, ET ON REVET LA VERMICULITE D'UN POLYMERE. ON PEUT EVENTUELLEMENT UTILISER DES AGENTS DE RETICULATION, DE CONDENSATION ET DE GELIFICATION TRES DIVERS POUR RENFORCER ET RETICULER LE POLYMERE. LE COMPOSITE OBTENU PEUT SERVIR DE CATALYSEUR POUR LA SYNTHESE DE L'ACIDE ASPARTIQUE, DU TRYPTOPHANE ET DE LA L-PHENYLALANINE.

Description

Procédé d'immobilisation de substances biologiques par absorption dans un

support de vermiculite La présente invention concerne un procédé d'immobilisation de substances biologiques Plus particulièrement, l'invention concerne l'immobilisation de substances biologiques consistant à faire absorber les substances par des particules de vermiculite que l'on revêt

ensuite d'un polymère.

Des substances biologiques telles que les enzymes ou les micro-organismes ou les cellules produisant des enzymes sont souvent utilisées comme catalyseurs pour des réactions de synthèse et pour des techniques d'analyse De tels catalyseurs sont souhaitables car ils opèrent avec une grande spécificité et un très bon rendement dans des

conditions de réaction généralement douces.

Comme les enzymes et autres bio-catalyseurs sont généralement solubles dans l'eau elles conviennent pour l'utilisation dans des systèmes réactionnels de type discontinu La réutilisation de telles enzymes et de tels autres bio-catalyseurs est limitée du fait de difficultés de récupération, sous une forme active ou utilisable, de ces substances à partir du milieu réactionnel usé Par ailleurs, ces substances ont tendance à rester dans le produit préparé sous forme d'impuretés Afin d'éviter ces problèmes, des procédés ont été mis au point pour immobiliser les substances biologiques qui font preuve d'une activité catalytique sur les supports solides insolubles L'immobilisation est censée avoir pour résultat une substance biologique stabilisée

capable de résister aux rigueurs d'un usage répété ou continu.

L'existence de plusieurs systèmes d'immobilisation pour les substances biologiques a été rapportée Des enzymes ont été immobilisées par absorption sur des substances insolubles telles que le charbon, le verre, la cellulose, un gel de phosphate de calcium, la montmorillonite et les résines organiques d'échange d'ions, entre autres L'immobilisation a également été réalisée par emprisonnement dans des gels d'amidon et d'acrylamide, par liaison covalente entre des enzymes et des polymères organiques insolubles, ainsi que

par liaison covalente entre les molécules d'enzyme elles-

mêmes. Les procédés de la technique antérieure aboutissent souvent à des produits d'activité biologique réduite, par rapport à celle de la substance biologique non liée correspondante On sait que ces substances biologiques sont sensibles à la dénaturation ou à l'inactivation thermique et chimique La perte d'activité biologique se produit souvent lorsque les opérations d'immobilisation sont menées dans des conditions très sévères, ce qui risque d'être particulièrement problématique lorsque des réactions de condensation de polymères entrent en jeu Par ailleurs, les produits résultant des procédés selon la technique antérieure sont souvent désavantageux du point de vue de leur caractère hydrophile, de leur résistance mécanique, de leur durabilité et de leur porosité. C'est par conséquent un objectif de la présente invention de mettre au point un procédé d'immobilisation de substances biologiques qui n'ait pas pour effet de réduire

l'activité biologique des produits obtenus.

C'est un autre objectif de la présente invention de mettre au point un procédé d'immobilisation de substances biologiques grâce auquel les produits résultants fassent preuve d'excellentes propriétés de résistance mécanique, de durabilité, de porosité et de stabilité biologique Encore un autre objectif de l'invention est de procurer un procédé d'immobilisation d'une grande quantité de substance biologique par unité de volume de support final (haute densité). Il a maintenant été découvert que des substances biologiques pouvaient être immobilisées d'une manière simple et très économique tout en conservant un haut degré de leur activité catalytique Le procédé selon la présente invention permet d'obtenir un composite de substance biologique insolubilisé qui contient la substance biologique emprisonnée 3-

dans des particules de vermiculite revêtues d'un polymère.

Suivant le polymère choisi et suivant la nature de la substance biologique emprisonnée dans la vermiculite, on peut avoir avantage à réticuler ou à condenser le polymère Il se produit une très faible perte d'activité quand on prépare le composite, et les composites en question font preuve d'excellentes propriétés de résistance mécanique et de durabilité Par ailleurs, lorsque le polymère est réticulé ou condensé, il est possible d'ajuster le caractère hydrophile de ces substances en faisant varier le degré de réticulation ou de condensation Le procédé selon la présente invention permet d'obtenir un composite qui peut être séparé des mélanges réactionnels par simple filtration, ou bien qui peut être utilisé dans des procédés de réaction continus tels que ceux dans lesquels un substrat réagissant circule dans un

réacteur en forme de colonne à garnissage.

Conformément au procédé selon la présente invention, on met les particules de vermiculite en contact avec la substance biologique, par exemple avec des cellules humides entières récoltées d'un bouillon de fermentation La substance

biologique est absorbée dans les particules de vermiculite.

On ajoute à la vermiculite une matière de revêtement polymère de manière à en revêtir les particules On peut ensuite ajouter divers agents de réticulation, de condensation et de gélification pour réticuler et renforcer le polymère et/ou la substance biologique et former un revêtement perméable dur On peut facultativement combiner le polymère avec un polyacide carboxylique pour former un pré-polymère soluble dans l'eau, avant de le mélanger avec la vermiculite Ce mode opératoire conduit à la formation d'un composite de substance biologique dans lequel la substance biologique est immobilisée à l'intérieur de la vermiculite revêtue de polymère. L'immobilisation de la substance biologique au sein de la vermiculite peut se faire par emprisonnement physique, par liaison covalente du polymère par l'intermédiaire de l'agent de réticulation ou de condensation et des groupements réactifs de la substance biologique, ou encore par réticulation au sein des particules de vermiculite par l'intermédiaire d'un agent de réticulation approprié Par exemple, lorsque le polymère est une polyalkylène-imine, la substance biologique peut être immobilisée par liaison covalente, étant donné que les groupements amine et carboxyle de la substance biologique peuvent se substituer soit à un _ groupement amine de la polyalkylène-imine soit à un groupement carboxyle d'un polyacide carboxylique qui peut être ajouté à la vermiculite revêtue Une liaison covalente avec le polymère se fait finalement par l'intermédiaire d'un agent de condensation. Le procédé selon la présente invention permet la préparation d'une large variété de composites de substances biologiques La substance biologique peut se composer d'enzymes, de cellules microbiennes, d'antigènes, d'anticorps, d'antibiotiques, de co-enzymes, de cellules végétales, de cellules animales, de bactéries, de levures, de champignons, de cultures tissulaires, ou de mélanges des précédents Il est préférable d'ajouter les substances biologiques à la

vermiculite sous une forme aqueuse.

-Il a été découvert que la vermiculite forme un excellent support pour l'immobilisation des substances biologiques Les particules de vermiculite sont capables d'absorber de très grandes quantités de substances biologiques, ce qui se traduit par une charge de forte densité De plus, la vermiculite est très bon marché et disponible en grande quantité, ce qui rend son utilisation extrêmement bénéfique comme support dans la production à grande échelle Enfin, le support d'immobilisation résultant de ce procédé d'immobilisation des substances biologiques

est rigide et extrêmement actif.

Il a été déterminé que la grosseur des particules de la vermiculite utilisée dans le procédé d'immobilisation selon la présente invention pouvait varier dans une large mesure Par exemple, la grosseur des particules de la vermiculite peut varier d'une fine poudre à 1 cm environ, de préférence d'environ 0,5 à 1 mm La quantité de substance biologique ajoutée à la vermiculite peut varier en fonction de l'utilisation finale spécifique du composite de substance biologique D'une manière générale, elle va d'environ 0,001 à 2 g (poids sec) par gramme de vermiculite utilisée, de préférence d'environ 0,01 à environ 1 g par gramme de vermiculite. Les composites de substance biologique qui sont préparés par le procédé selon la présente invention peuvent être très différents du point de vue de leur caractère hydrophile, de leur résistance mécanique, de leur durabilité et de leur porosité En diminuant le degré de réticulation ou de condensation du polymère utilisé pour revêtir la vermiculite, il est possible d'obtenir un composite ayant un caractère hydrophile plus marqué L'addition d'agents de réticulation multifonctionnels permet d'augmenter la

résistance mécanique et la durabilité du composite polymère-

vermiculite-substance biologique, les groupements fonctionnels supplémentaires ayant pour effet d'augmenter la condensation du polymère et de donner naissance à un

composite plus hydrophobe.

Il est possible d'augmenter la porosité globale de la matrice en ajoutant une substance en particules soluble

dans l'eau au polymère avant qu'il se condense complètement.

On élimine ensuite la matière sèche en ajoutant de l'eau après condensation, ce qui dissout le solide Les parties du composite qui avaient été déplacées par les solides restent inoccupées, augmentant ainsi la porosité de la matrice Pour augmenter la porosité du mélange, on peut utiliser n'importe quelle substance en particules soluble dans l'eau qui n'a

pas d'effet néfaste significatif sur le polymère, la vermi-

culite ou la substance biologique Les polyacides carboxyliques solubles dans l'eau, tels que ceux qui ont réagi avec les polymères non condensés, conviennent particulièrement bien pour augmenter la porosité de la matrice, étant donné que les excès utilisés pour augmenter la porosité n'ont pratiquement pas d'influence sur les réactions

de condensation.

Les polymères utilisés dans le procédé et dans les composites selon la présente invention ont d'une manière générale un poids moléculaire variable, en fonction des conditions de réaction, et ont de préférence une structure à chaîne ramifiée Des matières polymères très diverses peuvent être utilisées dans le procédé selon la présente

invention, y compris des polyalkylène-imines, des poly-

saccharides, des polyacrylamides, des polyuréthanes, des alginates et la carraghénine Les polymères préférés sont

les polyalkylène-imines.

Les polyalkylène-imines peuvent être synthétisés par polymérisation par addition, catalysée par des acides, des monomères d'alkylène-imine Une polyalkylène-imine préférée est la polyéthylène-imine (PEI) car elle est actuellement très disponible à un prix relativement bas, et elle se comporte bien dans les réactions de condensation utilisées dans le procédé selon la présente invention La polyéthylène-imine est produite par polymérisation avec ouverture de cycle de l'éthylène-imine, en présence de catalyseurs tels que les acides minéraux Le polymère est fortement ramifié et contient des groupements amine primaires, secondaires et tertiaires La PEI est soluble dans l'eau, et lors de la réticulation ou de la condensation des chaînes

de polymère, il se forme un produit insoluble dans l'eau.

La polyéthylène-imine peut être réticulée à l'aide d'un agent de réticulation des fonctions amine pour lui conférer un supplément de stabilité et de résistance mécanique Ce traitement a pour résultat une substance biologique emprisonnée, avec une certaine réticulation entre la poiyalkylène-imine et les groupements amine libres de la substance biologique Les agents de réticulation comprennent

le dialdéhyde glutarique, les diisocyanates, les polyiso-

cyanates, la 2,4,6-trichloro-S-triazine, le bisoxirane, le

bisimidate, la divinylsulfone, le 1,5-difluoro-2,4-dinitro-

benzène, et les agents de réticulation similaires On préfère

le dialdéhyde glutarique à cette fin.

7. D'une manière générale, on ajoute le polymère choisi au composite en quantité suffisante pour qu'il revête pratiquement en totalité les particules de vermiculite, et cette quantité varie d'une manière importante en fonction de la grosseur des particules de la vermiculite, de la nature des substances biologiques et des propriétés physiques que l'on veut obtenir D'unemanière générale, le polymère peut représenter d'environ 0,5 à environ 25 % du poids du composite, et représente de préférence d'environ 2 % à environ % du poids du composite La quantité d'agent de réticulation et/ou de condensation utilisée est fonction de

la quantité de polymère, ainsi qu'on l'exposera ci-après.

Lorsque le polymère est la polyéthylène-imine, un procédé de condensation extrêmement efficace fait appel à un polyacide carboxylique (PCA) pour "ponter" les groupements amine sur des chaînes de PEI adjacentes Les agents de condensation, qui sont de préférence des carbodiimides, provoquent facilement la condensation Les réactions mises en jeu dans la préparation de la polyéthylène-imine condensée selon la présente invention sont illustrées ci-dessous: ( 1) 112 C CI 12 >ICH 2 CH 2 IlnlCH 2 CI 12 tl Eiln CI 12 C Fi 2 "" 2 N ICH 2 CH 2 t'illn"-CI 12 CI 12 Nli 2 (PEI) 1 +

0 N 113

1 1 c-o- R

1 +

C-0 13

1 1

( È fî -

( 2) (PEI)

0 N 112 -

1 1 I/ NII-R'

C_ 0-C

\\ N-R

R

1 _:: N_-RI'

C-0-C

1 1 \

NH 2 J.- (PEI) -(-P E Il

0 N'13 +

il c-o-

( 3) 1 R + 2

il + C-0 t;'_ 3 1 1 (PEI) R' N 1 1 c

1 1 >

N R (CDI) (PEI) __ 1 Nil 2 COOH R cooff

Nil 2 -

(PEI)

(PET) (PEI)

O NH 2 NH

C-O-C O=C R

( 4) R > R + 2 O 1

2 O NEC

NH

N-R" I

IC-O-C 1 =

II = "NH-R' I

O Nfl NH 2

(PEI) (PEI)

La réaction ( 1) illustre la polymérisation de l'éthylène-imine pour former la PEI ayant une structure chaîne ramifiée, N et n' étant des nombres entiers plus grands que O et n" pouvant être égal à O (ce qui indique que

le groupement lCH 2 CH 2 NHl est absent) ou être plus grand que 0.

La réaction ( 2) montre la formation d'un sel des groupements amine de la PEI avec un polyacide carboxylique, R pouvant

être un groupement hydrocarboné substitué ou non substitué.

Les réactions ( 3) et ( 4) montrent la condensation de la PEI et du polyacide carboxylique, en utilisant un carbodiimide comme agent de condensation R et R' sont des groupements hydrocarbonés qui, de même que les autres produits réagissants et que les conditions des réactions illustrées, vont être

décrits plus complètement ci-dessous.

En général, les polyacides carboxyliques qui conviennent à l'utilisation dans la présente invention peuvent être des acides carboxyliques substitués ou non substitués ayant au moins deux groupements carboxyle De préférence, ces polyacides carboxyliques sont solubles dans l'eau, si bien qu'on peut les utiliser éventuellement pour augmenter la porosité du composite, ainsi que pour condenser la polyalkylène-imine Des exemples depolyacides carboxyliques que l'bn peut utiliser dans les procédés et dans les composites selon la présente invention comprennent les acides adipique, azélaique, 1,11-undécanedioique, 1,12-dodécane- diolque, traumatique, pentadécanedioique, hexadécanedioique, sébacique, subérique, glutarique, malonique, pimellique, succinique, malique, maléique, glutamique, aspartique, oxalique, fumarique, polyaspartique, etc Selon la présente invention, on préfère utiliser les diacides carboxyliques, qui comprennent l'acide maléique, l'acide succinique, l'acide glutarique et l'acide adipique Les polyacides carboxyliques supérieurs peuvent être n'importe quelle substance qui contient au moins deux groupements acide carboxylique, et comprennent des substances polymères de haut poids moléculaire, telles que l'acide polyaspartique, dont le poids moléculaire peut aller de 5 000 à 50 000 Les réactions de condensation sont généralement exothermiques, aussi a-t-on avantage à refroidir les mélanges réactionnels à une température qui n'ait pas d'effet néfaste sur la substance biologique à immobiliser, par exemple à une température de

37 environ ou moins.

Le rapport molaire du polyacide carboxylique à la polyalkylène-imine (PCA:PAI) peut varier dans une large mesure, du fait de la variation de poids moléculaire des produits réagissants D'une manière générale, ce rapport s'échelonne de 1:20 à l:0,0005 Dans le cas o l'on ajoute un polyacide carboxylique pour augmenter la porosité du composite selon la présente invention, on utilise souvent un excès

molaire considérable du polyacide carboxylique.

Le polyacide zarboxylique peut être ajouté à la polyalkylène-imine dans une quantité propre à provoquer la condensation, dans des conditions de prépolymérisation, de

façon à former un prépolymère soluble dans l'eau Ce pré-

polymère est généralement un liquide visqueux, auquel on peut commodément ajouter la vermiculite contenant la substance biologique immobilisée, laquelle peut être maintenue en suspension au cours de la réaction de condensation On ajoute ensuite l'agent de condensation pour provoquer la condensation

et la solidification du composite prépolymère-vermiculite.

On maintient le p H du mélange réactionnel à un niveau tel que la substance biologique ne subisse pas d'inactivation ou d'effet néfaste Ce p H peut s'échelonner de 2 environ à 12 environ et est de préférence compris entre 5 environ et 10 environ. Comme indiqué ci-dessus, pour provoquer la condensation des chaînes de polyalkylène-imine par l'intermédiaire de polyacides carboxyliques, on a avantage à employer un agent de condensation D'une manière générale, on peut utiliser n'importe quel agent de condensation qui catalyse ou facilite la réaction des amines et des acides carboxyliques Des exemples de tels agents de condensation

comprennent le N-éthyl-5-phénylisoazolium-3-sulfonate, la N-

éthoxycarbonyl-2-éthoxy-1,2-dihydroquinoléine, et divers carbodiimides Les carbodiimides que l'on peut utiliser comme agents de condensation dans la composition selon la présente invention ont pour formule R'-N=C= N-R", dans laquelle R' et R" sont des groupements hydrocarbonés contenant de 3 à environ 20 atomes de carbone, de préférence d'environ 5 à environ 12 atomes de carbone Ces agents de

condensation comprennent le 1-éthyl-3,3-diméthylamino-

propyl carbodiimide, le dicyclohexyl carbodiimide, le métho-

para-toluène sulfonate de 1-cyclohexyl-3-( 2-morpholino-

éthyl)carbodiimide, et les sels des précédents On ajoute les carbodiimides au mélange réactionnel dans une quantité propre à provoquer la condensation, laquelle est généralement égale à la quantité stoechiométrique, par exemple d'environ 0,2 à 3 fois, de préférence d'environ 0,5 à 1,5 fois, la quantité exactement stoechiométrique Chaque molécule de carbodiimide

réagit avec un seul groupement acide du polyacide carboxylique.

Par exemple, on utilise généralement, dans le procédé selon la présente invention, des rapports molaires carbodiimide-diacide carboxylique de 2:1 environ Lors de l'addition de l'agent de condensation à la température ambiante, il se produit une polymérisation notable dans un délai de 30 secondes, et cette polymérisation est généralement complète dans un délai de

deux heures environ.

Une fois que la polyéthylène-imine a été insolubilisée par addition d'un ageht de condensation, un post-traitement facultatif consiste à réticuler la vermiculite condensée et revêtue, à l'aide d'un agent de réticulation des fonctions amine, tel que le dialdéhyde glutarique, comme décrit cidessus, pour conférer-un supplément de résistance mécanique et de stabilité au

composite final.

Suivant le type de polymère choisi, des agents de condensation et de réticulation très divers peuvent être choisis parmi ceux qui sont connus dans la technique pour renforcer le composite En utilisant les procédés décrits dans la présente invention, il est possible d'immobiliser une large variété de substances biologiques pour produire de nouveaux composites biocatalytiques Dans les exemples suivants, les modes opératoires d'immobilisation sont décrits plus en détail Ces exemples décrivent la manière et le procédé de réalisation et d'utilisation de l'invention et exposent diverses formes de réalisation de l'invention,

mais ne doivent pas être considérés comme la limitant.

EXEMPLE I

On a préparé, à partir de E coli contenant de l'aspartase fraîche, 80 g d'une pâte de cellules de E coli contenant de l'aspartase, cette pâte contenant environ 75 % en poids d'eau Pour confectionner cette pâte, on a préparé le milieu de fermentation en dissolvant, dans un litre d'eau, 24 g d'extrait de levure, 30 g d'acide fumarique, 2 g de carbonate de sodium, 2 mmoles de sulfate de magnésium et 0,1 mmole de chlorure de calcium, et on a ajusté le p H à 7,2 environ à l'aide d'ammoniaque A ce milieu on a inoculé 1 ml d'une culture de E coli (ATCC N O 31976) que l'on avait fait incuber pendant 12 à 16 heures à 370 C dans un milieu de peptone contenant 0,5 % de glutamate monosodique On a fait incuber ce milieu inoculé pendant 12 à 14 heures à 370 C On a récolté les cellules par centrifugation à 5000 tours par

minute pendant 30 minutes -

On a ajouté les 80 g de E coli contenant de l'aspartase à 20 g de particules de vermiculite Après avoir laissé la vermiculite absorber la pâte de cellules, on a ajouté au mélange 10 g de polyéthylène-imine et on a agité jusqu'à obtenir une répartition uniforme On a ensuite ajouté du dialdéhyde glutarique ( 20 g d'une solution à 25 % dans l'eau) et on a mélangé jusqu'à ce qu'il se forme des particules dures Par le même mode opératoire, on a préparé un second lot de substance On a laissé sécher pendant une

nuit les deux lots de substance.

On a garni une colonne de la substance ci-dessus, avec un volume final de lit de 353 cm 3 On a ensuite utilisé la colo Rne pour transformer du fumarate d'ammonium en acide L-aspartique On a fait passer dans la colonne, à un débit de 360 cm 3/h ( 1,0 S Vh) une solution 1,5 M de fumarate d'ammonium avec 1 mmole de sulfate de magnésium, p H 8,5 On a surveillé l'activité aspartase de l'effluent en mesurant la disparition de l'acide fumarique sur un spectrophotomètre à 240 nm La colonne a fonctionné sans interruption pendant 151 jours Pendant ce temps, on a analysé des échantillons de l'effluent de la colonne pour déterminer le pourcentage de transformation du substrat Les résultats sont donnés dans le

tableau 1 ci-dessous.

TABLEAU 1

Jour % de transformation du fumarate d'ammonium 1,5 M ( 1 passe à 1 SV/h)

1 98,2

6 99,2

16 99,4

26 99,2

37 99,0

55 98,7

98,2

91,0

151 91,3

EXEMPLE II

On a suivi le mode opératoire général de l'Exemple

I en utilisant 120 g de pâte de cellules et 15 g de poly-

éthylène-imine Avec un lot de substance immobilisée on a garni un réacteur en forme de colonne d'un volume de lit de 173 cm 3 On a réussi, avec cette colonne, à transformer 99 % d'une solution-de fumarate d'ammonium 1,8 M à un débit de 360 cm 3/h ( 2,08 S Vh-1) On a calculé le rendement de cette colonne comme étant égal à 493 g d'acide L-aspartique produit par litre de volume de lit de cellules immobilisées par heure

à 37 C ( 3,7 moles/l/h).

EXEMPLE III

On a préparé dix lots de cellules immobilisées de E coli ( 100 g de vermiculite par lot) par le mode opératoire

général de l'Exemple II.

On a ensuite garni, avec ce biocatalyseur, une colonne d'un volume de lit de 12,5 litres On a fait passer dans cette colonne, à divers débits, du fumarate d'ammonium ( 1,8 M) à 37 C, et on a analysé l'effluent pour déterminer le pourcentage de transformation du fumarate d'ammonium, comme dans l'Exemple I Le Tableau 2 ci-dessous donne les

résultats des essais.

TABLEAU 2

Débit % de transformat Kg/h Moles/l/h

(l/h) (acide fumarique) (acide L (acide L-

aspartique) aspartique)

12,50 99,1 2,97 1,79

18,75 97,5 4,38 2,63

,00 95,0 5,69 3,42

62,50 56,00 8,38 5,04

EXEMPLE IV

On a répété le mode opératoire général de l'Exemple III avec un lot frais de cellules de E coli, à cela près que les cellules fraîches avaient une activité supérieure de 29 % à celle du lot précédent Lorsqu'on a fait passer le substrat dans la colonne à un débit de 62,5 I/h (c nlum dnéiï

l'Exemple III), on a constaté que la quantitd L' l.

aspartique produite était de 10,56 kg/h ( 6, 35 il;, L/li).

Cela représente une augmentation de rendeicm nt: d 27 _ par

rapport à l'Exemple III.

EXEMPLE V

Une enzyme, là synthétase de tryptophane, peut êtr utilisée dans le procédé selon l'invention pour catalyser la transformation de l'indole et de la sérine en tryptophane On a mélangé des particules de vermiculite ( 2 g) avec 4 ml d'une solution d'un extrait de synthétase de tryptophane brute obtenue à partir de cellules de E coli On a laissé 1 vermiculite absorber cet extrait On a ensuite ajouté au mélange 1 g de polyéthylèneimine pour en revêtir les particules de vermiculite On a ensuite ajouté du dialdéhyde glutarique ( 2 ml d'une solution à 25 % dans l'eau) et on a mélangé jusqu'à ce qu'il se forme des particules revêtues dures On a ensuite placé la totalité de la substance dans une colonne que l'on a fait traverser par une solution de substrat composée de sérine 0,05 M, d'indole 0,05 M, de glutathione 0,005 M, de phosphate de potassium dibasique 0,005 M et de 200 mg de pyridoxal-5-phosphate/litre, le p H étant ajusté à 7,8 On a ensuite utilisé la colonne à plusiet reprises dans un dispositif de recirculation discontinu poux

produire 80 mg de L-tryptophane en 24 heures -

EXEMPLE VI

On a mélangé 9 g de cellules de levure entières

R rubra contenant une enzyme, l'ammonia-lyase de phényl-

alanine, avec 3 g de particules de vermiculite, on a laissé les particules de vermiculite absorber et se recouvrir des cellules, puis on a refroidi à 10 C Ona préparé une solution de revêtement à base de polysaccharide en ajoutant 0,8 g de poudre de polysaccharide Kelco (K 9 A 50) dans 100 ml d'eau désionisée à 80 C et en agitant pendant 10 minutes La poudre s'est dissoute et on a ajouté à la solution 1 g de chlorure de potassium On a laissé la solution se refroidir à 50 C (tout en restant une solution) On a ensuite versé la solutio chaude sur la vermiculite froide, tout en mélangeant Le polysaccharide a formé très rapidement un gel, revêtant les particules de vermiculite qui contenaient R rubra On a placi les particules dans 100 ml d'un tampon de phosphate de potassium 0, 1 M, p H 7,0, et on a lavé soigneusement en

agitant On a séparé les particules de la solution tampon.

La solution n'a fait apparaître aucun signe de nébulosité ou de trouble et était pratiquement dépourvue de cellules de levure, ce qui indiquait que l'immobilisation avait réussi. On a placé les particules dans 50 ml de cinnamate d'ammonium 0,1 M à p H 9,3, et on a analysé l'activité PAL de lasolution en surveillant la production de L-phénylalanine La substance

à base de cellules immobilisées a réussi à produire de la L-

phénylalanine; on a observé dans la solution réactionnelle

des quantités de L-phénylalanine croissant avec le temps.

Claims

REVENDICATIONS

1 Procédé d'immobilisation de substances biologiques par préparation d'un composite de substance biologique insolubilisé, caractérisé en ce qu'il consiste: (a) à ajouter des particules de vermiculite à un milieu aqueux de substance biologique; (b) à laisser ladite vermiculite absorber ledit milieu aqueux de substance biologique; et (c) à revêtir ladite vermiculite d'un polymère. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on réticule la vermiculite revêtue de l'étape (c) à l'aide d'un agent de réticulation, ou bien on la condense à

l'aide d'un agent de condensation.

3 Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le polymère est une polyalkylène-imine, un polysaccharide, un polyacrylamide, un polyuréthane, un

alginate, ou une carraghénine.

4 Procédé d'immobilisation de substances biologiques par préparation d'un composite de substance biologique insolubilisé, caractérisé en ce qu'il consiste: (a) à ajouter des particules de vermiculite à un milieu aqueux de substance biologique; (b) à laisser ladite vermiculite absorber ledit milieu aqueux de substance biologique; (c) à revêtir ladite vermiculite d'un polymère de polyalkylène-imine; et (d) à réticuler ladite vermiculite revêtue à l'aide d'un agent de réticulation des fonctions amine, ou à condenser ladite vermiculite à l'aide d'un agent de condensation. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on mélange ladite vermiculite revêtue de polymère avec une quantité appropriée d'un agent de réticulation des fonctions amine de façon à immobiliser la substance

biologique au sein de ladite vermiculite revêtue.

6 Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on mélange ledit polymère de polyalkylène-imine avec

une quantité, propre à provoquer la condensation, d'un poly-

acide carboxylique, de façon à former un polymère soluble dans l'eau précondensé et partiellement polymérisé, avant

de le mélanger avec ladite vermiculite.

7 Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on condense ladite vermiculite revêtue en lui ajoutant une quantité appropriée d'un agent de condensation qui est un carbodiimide, dans des conditions propres à

provoquer la condensation.

8 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on condense ladite vermiculite revêtue en lui ajoutant une quantité appropriée d'un agent de condensation qui est un carbodiimide, dans des conditions propres à

provoquer la condensation.

9 Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce qu'il consiste en outre à modifier le composite de substance biologique insolubilisé en lui faisant subir un post-traitement par un agent de réticulation des fonctions amine de façon à lui conférer un supplément de

résistance mécanique et de stabilité.

Procédé selon l'une quelconque des

revendications 4 à 8, caractérisé en ce que le polymère de

polyalkylène-imine est une polyéthylène-imine, une poly-

propylène-imine, une polybutylène-imine ou une polypentylène-

imine. 11 Procédé selon l'une quelconque des

revendications 4 à 8, caractérisé en ce que le polymère de

polyalkylène-imine est une polyéthylène-imine.

12 Procédé selon la revendication 6 ou 8, caractérisé en ce que le polyacide carboxylique est l'acide

maléique, l'acide succinique ou l'acide adipique.

13 Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que le carbodiimide utilisé comme agent de

condensation est le chlorhydrate de 1-éthyl-3,3-diméthyl-

aminopropyl carbodiimide, le dicyclohexyl carbodiimide, le

métho-para-toluène sulfonate de 1-cyclohexyl-3-( 2-morpholino-

éthyl)carbodiimide, ou un sel des précédents.

14 Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que ledit agent de réticulation des fonctions amine est le dialdéhyde glutarique, un diiso- cyanate, un polyisocyanate, la 2,4,6-trichloro-S-triazine, le

bisoxirane, le bisimidate, la divinyl-sulfone, ou le 1,5-

difluoro-2,4-dinitrobenzène. Procédé selon la revendication 1 ou 4, caractérisé en ce que la quantité de ladite substance biologique que l'on ajoute à ladite vermiculite est d'environ

0,001 à environ 2 g, en poids sec, par gramme de vermiculite.

16 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le rapport molaire de la polyalkylène-imine au

polyacide carboxylique est d'environ 1:20 à 1:0,0005.

17 Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'on utilise le carbodiimide dans une quantité d'environ 0,2 à 3 fois la quantité stoechiométrique par

rapport au polyacide carboxylique.

18 Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'on utilise le carbodiimide dans une quantité d'environ 0,5 à 1,5 fois la quantité stoechiométrique par

rapport au polyacide carboxylique.

19 Procédé selon la revendication 1 ou 4, caractérisé en ce que la substance biologique immobilisée est une enzyme, des cellules microbiennes, un antigène, un anticorps, un antibiotique, une co-enzyme, une bactérie, une levure, un champignon, des cellules végétales, des cellules

animales, ou une culture tissulaire.

20 Procédé selon la revendication 1 ou 4, caractérisé en ce que la substance biologique est de

l'aspartase d'origine microbienne.

21 Procédé selon la revendication 1 ou 4, caractérisé en ce que l'enzyme est la synthétase de

tryptophane.

22 Composite de substance biologique insolubilisé, caractérisé en ce qu'il comprend une substance biologiquement active adsorbée dans des particules de vermiculite qui sont

immobilisées au sein d'un polymère.

23 Composite de substance biologique insolubilisé, caractérisé en ce qu'il comprend une substance biologiquement active adsorbée dans des particules de vermiculite qui sont immobilisées au sein d'un polymère, ledit polymère étant

réticulé par un agent de réticulation.

24 Composite de substance biologique insolubilisé selon la revendication 23, caractérisé en ce que le polymère est une polyalkylène-imine et l'agent de réticulation est un

agent de réticulation des fonctions amine.

Composite selon la revendication 24, caractérisé en ce que l'agent de réticulation des fonctions amine est le dialdéhyde glutarique, un diisocyanate, un polyisocyanate, la 2,4,6-trichloro-S-triazine, le bisoxirane,

le bisimidate, la divinylsulfone ou le 1,5-difluoro-2,4-

dinitrobenzène. 26 Composite selon la revendication 24, caractérisé en ce que l'agent de réticulation des fonctions

amine est le dialdéhyde glutarique.

27 Composite de substance biologique insolubilisé, caractérisé en ce qu'il comprend une substance biologiquement active adsorbée dans des particules de vermiculite qui sont immobilisées au sein d'un polymère, ledit polymère étant

condensé par un agent de condensation.

28 Composite de substance biologique insolubilisé selon la revendication 27, caractérisé en ce que le polymère est une polyalkylène-imine et l'agent de condensation est un carbodiimide. 29 Composite selon la revendication 28, caractérisé

en ce que l'agent de condensation est le chlorhydrate de 1-

éthyl-3,3-diméthylaminopropyl carbodiimide, le dicyclohexyl

carbodiimide ou le métho-para-toluène sulfonate de 1-cyclo-

hexyl-3 ( 2-morpholino-éthyl)carbodiimide, ou un sel des

précédents.

Composite selon la revendication 24 ou 26, caractérisé en ce que le polymère de polyalkylène-imine est

une polyéthylène-imine, une polypropylène-imine, une poly-

butylène-imine ou une polypentylène-imine.

31 Composite selon la revendication 22, 23, 24, 27 ou 28, caractérisé en ce que la substance biologiquement active est une enzyme, des cellules microbiennes, un antigène, un anticorps, un antibiotique, une co-enzyme, des cellules végétales, des cellules animales, une bactérie, une levure, un champignon ou une culture tissulaire 32 Composite selon la revendication 22, 23, 24, 27 ou 28, caractérisé en ce que la substance biologiquement

active est l'aspartase.

33 Composite selon la revendication 22, 23, 24, 27 ou 28, caractérisé en ce que la substance biologiquement

active est la synthétase de tryptophane.

34 Procédé de fabrication de l'acide aspartique, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact, dans des conditions propres à produire de l'acide aspartique, un substrat contenant du fumarate d'ammonium, avec un composite de substance biologique insolubilisé, constitué d'aspartase ou de cellules microbiennes contenant de l'aspartase

absorbée(s) dans des particules de vermiculite et immobili-

sée(s) au sein d'un polymère, la vermiculite immobilisée étant réticulée par un agent de réticulation ou condensée par

un agent de condensation.

35 Procédé de fabrication du tryptophane, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact, dans des conditions propres à produire du tryptophane, un substrat contenant de l'indole et de la sérine, avec un composite de substance biologique insolubilisé, constitué de synthétase de tryptophane ou de cellules microbiennes contenant de la synthétase de tryptophane, absorbée(s) dans des particules de vermiculite et immobilisée(s) au sein d'un polymère, la vermiculite immobilisée étant réticulée par un agent de

réticulation ou condensée par un agent de condensation.

36 Procédé de fabrication de la L-phénylalanine, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact, dans des conditions propres à produire de la L-phénylalanine, un substrat contenant du cinnamate d'ammonium, avec un composite

de substance biologique insolubilisé, constitué d'ammonia-

lyase de phénylalanine ou de cellules microbiennes contenant de l'ammonialyase de phénylalanine, absorbée(s) dans des particules de vermiculite et immobilisée(s) au sein d'un polymère.