JPH0650982B2

JPH0650982B2 - 生体触媒の固定化方法

Info

Publication number: JPH0650982B2
Application number: JP28571587A
Authority: JP
Inventors: 正夫近藤; 渉下川; 克明福森; 卓也見城
Original assignee: Aichi Prefecture
Current assignee: Aichi Prefecture
Priority date: 1987-11-12
Filing date: 1987-11-12
Publication date: 1994-07-06
Anticipated expiration: 2009-07-06
Also published as: JPH01168349A

Description

【発明の詳細な説明】［発明の目的］酵素や微生物菌体などの生体触媒は、温和な反応条件下
で選択性の高い触媒活性を示す反面、不安定で回収して
再利用することが非常に困難なため高価である。本発明
の目的は生体触媒の長所を生かしつつ安定性を改善し、
再利用を可能にするため、生体触媒を固定化する簡便な
方法を提供することである。

［従来技術と欠点］生体触媒の固定化法には、担体結合法、架橋法、
包括法がある。

担体結合法は生体触媒を不溶性の担体に結合させて固定
化するもので、その結合の様式により、共有結合法、イ
オン結合法、物理的吸着法に分かれる。共有結合法は調
製が困難であり、酵素が部分的に修飾を受けるため活性
の低下がおきやすく、微生物菌体などの固定化に適さな
いことが欠点である。またイオン結合法と物理的吸着法
は、調製が容易であるものの生体触媒が脱離しやすい欠
点がある。

架橋法はグルタルアルデヒドのような２個以上の官能基
を持った試薬で生体触媒間に架橋を形成し不溶性にする
方法であるが、調製時に生体触媒の失活の可能性が大き
いことが欠点である。

包括法には、生体触媒を合成高分子や天然高分子のゲル
中に包み込む格子型と、半透膜の高分子皮膜に閉じ込め
るマイクロカプセル型がある。両者とも各種の生体触媒
に適用可能であるが、マイクロカプセル型は調製が難し
いことから医薬用などの特殊な用途に限られる。これに
対し格子型は調製も比較的容易である。本発明も格子型
包括法に属する。

格子型のうち合成高分子を用いるものとしては、ポリア
クリルアミドゲル法が利用されたが、重合反応の過程で
生体触媒が失活する可能性があるため、できるだけ影響
を及ぼさない温和な固定化法が検討された。その結果低
温下でモノマーやプレポリマーを放射線重合させる方
法、高感度感光性樹脂を可視光線で重合させる方法、光
架橋性樹脂プレポリマーやウレタンプレポリマーを利用
する方法などが開発された。しかし光照射の装置を必要
としたり、任意の形状のゲルビーズを得ることが困難で
あるなどの欠点がある。

以上の合成高分子を利用する方法に対し、近年海藻から
得られる多糖類の一種であるアルギン酸カルシウムやκ
−カラギーナンのような天然多糖類からなるゲル化物質
による固定化法が開発されている。素材が安価であり、
非常に温和な条件で簡単に固定化できることから工業的
にも広く利用されている。しかし前者にあってはカルシ
ウムイオンが、後者にあってはカリウムイオンが置換さ
れるような条件下で使用するとゲルが劣化する。またpH
3以下の酸性条件下で使用する場合も同様な欠点がみら
れる。しかも両者ともゲルの強度が弱く、長期の使用に
耐えず、その上低分子量酵素の固定化能力が劣るという
欠点がある。従って本発明の解決すべき課題は、天然多
糖類のみを用いる固定化方法に比べて固定化による生体
触媒の活性低下を同等又は同等以下とし、使用条件によ
る劣化をなくし、低分子量酵素までも固定化することで
ある。

［問題解決のための手段］本発明者らは、かかる問題点について鋭意研究を重ねた
結果、アセトアセチル化ポリビニルアルコールを架橋し
た水性ゲルを用いることにより、前記の問題点がすべて
解決されることを見出し、本発明を完成した。すなわち
本発明はアセトアセチル化ポリビニルアルコールの水溶
液に固定化すべき生体触媒を混合し、ついでアセトアセ
チル化ポリビニルアルコールの架橋剤を配合して架橋ゲ
ル化することを特徴とする生体触媒の固定化方法、およ
び少なくとも１種の多価金属イオンとの接触によりゲル
化する能力を有する水溶性高分子多糖類と、アセトアセ
チル化ポリビニルアルコールとの混合液に、固定化すべ
き生体触媒を混合し、ついでアセトアセチル化ポリビニ
ルアルコールの架橋剤の存在下で、多価金属塩の水溶液
中に粒子状に滴下して架橋ゲル化することを特徴とする
生体触媒の粒状固定化方法である。

本発明の素材であるアセトアセチル化ポリビニルアルコ
ールからなる水性ゲルは、その物性がκ−カラギーナン
ゲルと類似しており、生体触媒の固定化担体として代用
しうるものである。しかも実施例で示すように生体触媒
の固定化ゲルの調製はきわめて容易であり、触媒活性へ
の影響もなく、また調製された固定化ゲルはアルギン酸
カルシウムやκ−カラギーナンゲルが劣化するような条
件下で使用しても全く変化しない。従って本発明により
前記した多くの欠点を解決することができる。

本発明で用いるポリビニルアルコールのアセトアセチル
化物とは、ポリビニルアルコールとジケテンとを公知の
方法で反応させてえられる。たとえばポリビニルアルコ
ールを酢酸溶媒中に分散させておき、これにジケテンを
添加する方法や、ポリビニルアルコールをジメチルホル
ムアルデヒドまたはジオキサンなどの溶媒にあらかじめ
溶解しておき、これにジケテンを添加するなどがある。
また、ポリビニルアルコールにジケテンガスまたは液状
ジケテンを直接接触させてもえられる。使用するポリビ
ニルアルコールはポリ酢酸ビニルをケン化してえられた
重合度200〜3,000、ケン化度30〜100モル％のポリビニ
ルアルコールやその誘導体、又は酢酸ビニルと共重合性
を有する単量体と酢酸ビニルとの共重合体のケン化物で
あって、水溶性のものが好ましい。前記のようにしてえ
られたアセトアセチル化ポリビニルアルコールのうち、
本発明で用いられるものは、アセトアセチル化度が0.5
〜20モル％の２〜50％水溶液が好ましい。アセトアセチ
ル化度が0.5モル％未満ではゲル化しにくく、20モル％
を超えるものは水溶性が失われ、実用的でない。

本発明で使用する架橋剤としては、アミノ基を有する化
合物、アルデヒド基を有する化合物、ヒドラジド基を有
する化合物、メチロール基を有する化合物が挙げられ
る。これらは単独または組み合わせて使用される。

本発明で使用する架橋剤のアミノ基を有する化合物して
は、一般式：（但し、R₁、R₂、R₃はＨまたはCH₂CH₂NH₂、ｘおよびｙは
整数）で表され、分子量が100〜100,000のポリエチレン
イミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミ
ンなどの鎖状脂肪族ポリアミン、メンセンジアミン、イ
ソフォロンジアミンなどの環状脂肪族ポリアミンおよび
これらの誘導体または変性物、メタフェニレンジアミ
ン、ジアミノジフェニルスルホンなどの芳香族ポリアミ
ンおよびこれらの変性物、脂肪族ポリアミドアミンおよ
びN-β（アミノエチル）γ−アミノプロピルトリメトキ
シシラン、γ−アミノプロピルトリメトキシシランなど
のアミノシラン化合物が好適である。

本発明で使用するアルデヒド基を有する化合物として
は、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオン
アルデヒド、クロトンアルデヒド、ベンズアルデヒド、
ホルムアミドなどのモノアルデヒド類、グリオキザー
ル、マロンジアルデヒド、グルタルアルデヒド、テレフ
タルアルデヒドなどのジアルデヒド類、ジアルデヒド澱
粉、アクロレイン共重合アクリル樹脂などが適当であ
る。これらの中、ことにグリオキザール、グルタルアル
デヒド、ジアルデヒド澱粉が好適である。

本発明で使用するヒドラジド基を有する化合物しては、
ジヒドラジド化合物ないしポリヒドラジド化合物が適し
ており、例えばジヒドラジド化合物、ジヒドラジド化合
物のギ酸、シュウ酸などの有機酸塩類、ジヒドラジド化
合物のメチル、エチル、プロピル、ブチル、アリルなど
の一置換体、1,1-ジメチル、1,1-ジエチル、4-n-ブチル
−メチルなどの非対称二置換体並びに1,2-ジメチル、
1,2-ジエチル、1,2-ジイソプロピルなどの対称二置換体
などが挙げられる。ことに好適なヒドラジド基含有化合
物はカルボジヒドラジド、シュウ酸ジヒドラジド、マロ
ン酸ジヒドラジド、コハク酸ジヒドラジド、アジピン酸
ジヒドラジド、セバチン酸ジヒドラジド、ドデカン二酸
ジヒドラジド、イソフタル酸ジヒドラジド、テレフタル
酸ジヒドラジド、グリコール酸ジヒドラジド、ポリアク
リル酸ヒドラジドなどである。

本発明で使用するメチロール基を有する化合物として
は、尿素樹脂初期重合物、メラミン樹脂初期重合物が好
適である。

分子内にアセトアセチル基を有するポリビニルアルコー
ルとアミノ基含有化合物とは、推測ではあるが下式のご
とき反応機構により架橋構造を形成し、水を包含してゲ
ル化し、水性ゲルを生成する。

分子内にアセトアセチル基を有するポリビニルアルコー
ルとアルデヒド基含有化合物とは、推測ではあるが下式
のごとき反応機構により架橋構造を形成し、水を包含し
てゲル化し、水性ゲルを生成する。

分子内にアセトアセチル基を有するポリビニルアルコー
ルとヒドラジド基含有化合物とは、推測ではあるが下式
のごとき反応機構により架橋構造を形成し、前記と同様
にして水性ゲルを生成する。

分子内にアセトアセチル基を有するポリビニルアルコー
ルとメチロール基含有化合物とは、推測ではあるが下式
のごとき反応機構により架橋構造を形成し、前記と同様
にして水性ゲルを生成する。

以上の反応はいずれも加熱する必要は全くなく、室温で
速やかに進行して透明な水性ゲルを生成する。従って、
この時アセトアセチル化ポリビニルアルコールの水溶液
中に固定化すべき生体触媒を混合しておくと、ゲル格子
内に生体触媒が包括固定化される。これが本第１発明で
ある。

本発明で固定化される生体触媒としては、主として酵素
と微生物であるが、一般に固定化して用いられているも
のであれば如何なるものでもよい。

例えば酵素としては、アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキ
シダーゼ、乳酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素(AD
H)などの酸化還元酵素、グルタミン酸アミノトランスフ
ェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼな
どの転移酵素、グルコースイソメラーゼ、乳酸ラセマー
ゼなどの異性化酵素、リパーゼ、アミラーゼ、ウレアー
ゼ、グルコシダーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、アミ
ノペプチダーゼ、インベルターゼ、カルボキシペプチダ
ーゼなどの加水分解酵素などがある。

微生物としては、エタノール発酵酵母、酢酸発酵細菌、
有機酸発酵細菌、アミノ酸発酵細菌、硝化細菌、脱窒素
細菌などがあり、また微生物群としては活性汚泥、嫌気
メタン発酵微生物群、上下水・工業廃水処理微生物群な
どがある。そのほか、酵素や微生物以外に細胞内オルガ
ネラや動植物細胞などがある。

この固定化反応は室温で、早い場合は２〜３秒で進行し
水性ゲルが生成する。勿論、アセトアセチル化ポリビニ
ルアルコールの種類やアセトアセチル化度、架橋剤の種
類や使用割合、両者の溶液濃度、pHなどを調節すること
により、ゲル化時間を自由に調節することができる。第
１図は架橋剤としてジヒドラジド化合物のカルボジヒド
ラジドとアジピン酸ジヒドラジドを、第２図はジアルデ
ヒド化合物のグリオキザールを使用した場合のpHとゲル
化時間との関係を示している。

ゲル化に要する時間は、このように使用するゲル化剤と
pHによって任意に変化させることができる。また、えら
れる水性ゲルの硬さも架橋剤の種類や使用割合、両者の
溶液濃度、pHなどを調節することにより、流動性のある
ソフトなものから、強靱で弾性のあるハードなものまで
広範囲にコントロールすることができる。更に合成高分
子の特徴を生かし適当な官能基を導入することにより、
親水性と疎水性のバランスなどゲルの化学的性質を制御
することも可能である。ゲルの形状も板状、膜状、繊維
状と任意のものが選択できるので、本発明による固定化
生体触媒は各種の型式のバイオリアクターの素子として
利用することができる。

ところで、バイオリアクター用素子として、粒径0.5〜
５mmの粒状ゲルがしばしば有用である。アセトアセチル
化ポリビニルアルコールを用いた実質的に均一な大きさ
の粒状ゲルに、生体触媒をきわめて簡単に固定化する方
法が本第２発明である。

本第２発明で使用する少なくとも１種の多価金属イオン
との接触によりゲル化する能力を有する水溶性高分子多
糖類（以下、ゲル化性多糖類と称す）としては、海草か
ら製造されるアルギン酸のアルカリ金属塩やκ−カラギ
ーナンおよびキサントモナス属の微生物の発酵によって
製造されるキサンタンガムなどが用いられる。それらは
一般的には0.5〜2.0％の濃度で使用される。

また多価金属イオンとしては、前記ゲル化性多糖類と接
触した際にゲル化する能力を有するものであればよく、
多価金属イオンを発生する多価金属塩としては、アルミ
ニウム、バリウム、カルシウム、鉄、鉛、亜鉛などの水
溶性塩があり、ことに塩化アルミニウム、硫酸アルミニ
ウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、塩化亜鉛など
が好ましい。これらの金属イオンは普通0.1モル／以
上の濃度で使用される。

ゲル化性多糖類として、アルギン酸ナトリウムを例にと
って本第２発明の方法で粒状固定化ゲルの作り方を説明
する。

まずアセトアセチル化ポリビニルアルコールとアルギン
酸ナトリウムと生体触媒の混合水溶液を作る。アセトア
セチル化ポリビニルアルコールは、主として重合度に依
存するが、水に対して30％程度まで溶解する。また、ア
ルギン酸ナトリウムも水に対して５％程度まで溶解す
る。従ってこれらを適宜の濃度に均一に水中に溶解すれ
ばよい。この時加熱すると溶解が容易になる。ついで生
体触媒を混合する。アセトアセチル化ポリビニルアルコ
ールとアルギン酸ナトリウムの配合割合は、20:80〜9
8：２（重合比）の範囲で適宜用いることができるが、
アルギン酸ナトリウムの配合割合が多くなるに従って透
明性が低下するとともに架橋度が低くなり、硬度が低下
し、食塩水やリン酸に対する耐溶解性も低下するので、
アルギン酸ナトリウムの配合割合は少ない方が好まし
い。

次にこの混合水溶液を多価金属塩の水溶液中に粒子状に
滴下する。多価金属塩はアルギン酸ナトリウムのゲル化
剤であり、アルギン酸ナトリウムは多価金属塩に接触す
ると瞬時（１秒以内）にゲル化する。従って滴下した混
合水溶液の液滴は粒状を保ったままゲル化し、固定化ゲ
ル粒子が形成される。このように混合水溶液の滴下によ
って固定化ゲルを作るため、多価金属塩はアルギン酸ナ
トリウムの当量より過剰に使用する必要がある。多価金
属塩水溶液の濃度はとくに規定しないが、反応性の点か
ら0.2〜５％が適当である。

この固定化ゲル粒子が形成される時、アセトアセチル化
ポリビニルアルコールの架橋剤を存在させておくことが
必要である。架橋剤はアセトアセチル化ポリビニルアル
コールのアセトアセチル基と反応して架橋するので、多
価金属塩水溶液中に生成した固定化ゲル粒子の粒子内を
架橋して硬化するとともに、食塩水やリン酸に対する耐
溶解性が向上する。架橋剤の使用量は、存在するアセト
アセチル基に対して、0.1〜５当量が適当である。この
架橋反応は、数秒以上適宜な時間に調節できる。また架
橋剤は、あらかじめアセトアセチル化ポリビニルアルコ
ールとアルギン酸ナトリウム（ゲル化性多糖類）と生体
触媒の混合水溶液に配合しておくこともできるし、多価
金属塩の水溶液に配合しておくこともできる。

このようにして粒径約0.5〜５mmの硬度が高く、食塩水
やリン酸に不溶性の固定化ゲル粒子が常温できわめて簡
単にえられる。しかも、アルギン酸ナトリウムの配合量
は、例えば生成ゲル中0.35％という少量でも十分効果を
奏するため、無色透明の固定化ゲル粒子をえることがで
きる。このようにゲル化性多糖類は成形助剤として使用
される。

以上の方法により調製される粒状固定化生体触媒ゲル
は、アセトアセチル化ポリビニルアルコールの架橋ゲル
とアルギン酸カルシウムゲルの複合ゲルのため、２％の
食塩水に浸漬してもまったく変化が見られなかった。こ
れに対し、アルギン酸ナトリウムと塩化カルシウムのみ
を組み合わせて調製したアルギン酸カルシウムは、２％
食塩水に浸漬してカルシウムイオンをナトリウムイオン
と置換すると溶解した。その状況は表１の通りであっ
た。また成形助剤として、キサンタンガムやκ−カラギ
ーナンを使用した場合も、えられた複合ゲルは２％の食
塩水に浸漬してもまったく変化がなく、キサンタムガム
やκ−カラギーナンと金属イオンのみで調製したゲルは
２％食塩水に溶解した。

本発明の固定化方法によれば、寒天やκ−カラギーナン
ゲルのごとく、加熱溶解したのち冷却してゲル化させる
という工程は必要とせず、常温で単に撹拌混合するだけ
で、無臭で、強靱かつ弾性のある透明な固定化ゲルがえ
られ、凍結融解しても、高温に保持しても、あるいは高
温、凍結を繰り返しても劣化しないというすぐれた固定
化生体触媒ゲルがえられる。なお、本発明の方法による
とアルブミン、ヘモグロビンなどのタンパク質も包括固
定化することができる。

［実施例］次に実施例と比較例をあげて本発明を説明する。

実施例１（微生物の固定化）アセトアセチル化度６モル％、重合度1,100、ケン化度9
9モル％のアセトアセチル化ポリビニルアルコールを20
重量％になるように水に均一に分散し、120℃、15分間
オートクレーブにかけて溶解したのち放冷してゲル主剤
溶液を調製した。別に表２で示す培地中で、30℃、200r
pmで振盪培養した酢酸菌（アセトバクター・アセチ(Ace
tobacter aceti)IFO 3284）の菌体を遠心分離によって
集めたのち、上清と同量の培地に再び懸濁して、固定化
用の酢酸菌菌体懸濁液を調製した。

ゲル主剤溶液と酢酸菌菌体懸濁液とを５：４の重量比で
混合したのち、１規定の水酸化カリウム水溶液でpHを７
に調製し、成形助剤としてアルギン酸ナトリウムを0.5
重量％になるように添加混合した。この混合溶液190ｇ
に、１規定の水酸化カリウム水溶液でpHを７に調製した
グリオキザール10重量％水溶液の10mlを加えて（ゲル主
剤−酢酸菌菌体−成形助剤−架橋剤）混合液を調製し
た。この混合液を口径1.5mmのノズルを通して塩化カル
シウムの２％水溶液中に滴下すると、不溶性の球形のビ
ーズが形成され、アセトアセチル化ポリビニルアルコー
ルのゲル化が完了するまでその形状が維持され、粒径３
mm程度で、きわめて均一で弾力性のある球形のビーズ状
の固定化酢酸菌ゲルが調製された。

次に粒状固定化酢酸菌ゲル100gと表３の酢酸発酵用培地
200mlを300mlの上下円錐型リアクターに入れ、30℃で保
温しながら下方から300ml/minで空気を通気し、２〜３
日回分式で培養するとゲル中で酢酸菌が増殖した固定化
増殖酢酸菌ゲルを調製した。酢酸菌はゲル表面のマトリ
ックスで著しく増殖していた。この後通気量を600ml/mi
nとし、酢酸発酵用培地を各滞留時間で供給しつつ酢酸
発酵を行なった。流出液中の酢酸濃度は、滞留時間の増
加にともない次第に増加し、約９時間で40g/以上に達
した。酢酸生成速度は滞留時間10時間以内では、約３〜
４ｇ／・hrの範囲に分布しており、その後滞留時間の
増加にともない減少した。滞留時間と酢酸濃度および酢
酸生成速度の関係は表４および表５の通りであった。
又、酢酸発酵に使用した固定化増殖酢酸菌ゲルは６ケ月
以上にわたり安定であった。

比較例１（κ−カラギーナンゲル包括法による微生物の
固定化）酢酸菌菌体懸濁液とκ−カラギーナンの４％溶液とを
１：３の割合で混合した混合液を、２％の塩化カリウム
溶液中に滴下することにより、κ−カラギーナン固定化
酢酸菌ゲルを調製した。ついで実施例１と同様にしてゲ
ル内で酢酸菌を増殖させたのち、上下円錐型リアクター
を用いて酢酸発酵を行った。滞留時間と酢酸濃度との関
係は表６の通りであり、本発明の結果（表４）の方が良
好であった。またκ−カラギーナン固定化増殖酢酸菌ゲ
ルは使用にともない、次第に崩壊するなど不安定であっ
た。

実施例２（酵素の固定化）アセトアセチル化度６モル％、重合度1,100、ケン化度9
9モル％のアセトアセチル化ポリビニルアルコールを20
重量％になるように水に均一に分散し、120℃、15分間
オートクレーブにかけて溶解したのち放冷してゲル主剤
溶液を調製した。別に培養した酢酸菌の湿菌体をその10
倍量の0.01モルリン酸緩衝液（pH６）に懸濁した菌体懸
濁液を、1,500kg/cm²でフレンチプレスに２回通して菌
体を破砕し、遠心分離によって得られる上清を固定化用
の粗酵素液として調製した。

このゲル主剤溶液と粗酵素液とを５：４の重量比で混合
したのち、１規定の水酸化カリウム水溶液でpHを７に調
製し、成形助剤としてアルギン酸ナトリウムを0.5重量
％になるように添加混合した。この混合溶液190ｇに、
１規定の水酸化カリウム水溶液でpHを７に調製したグリ
オキザール10重量％水溶液の10mlを加えて（ゲル主剤−
粗酵素−成形助剤−架橋剤）混合液を調製した。この混
合液を口径1.5mmのノズルを通して塩化カルシウムの２
％水溶液中に滴下すると、不溶性の球形のビーズが形成
され、アセトアセチル化ポリビニルアルコールのゲル化
が完了するまでその形状が維持され、粒径３mm程度でき
わめて均一で弾力性のある球形ビーズ状の固定化酵素ゲ
ルが調製された。

粗酵素液には各種の酵素が含まれているが、そのうち酢
酸発酵の最初の反応を触媒するアルコール脱水素酵素(A
DH)をテストの対象とすることとし、次のような方法で
アルコール脱水素酵素反応を行った。すなわち100mlの
三角フラスコに固定化ADHゲル６ｇ、McIlvaine緩衝液
（pH４）18mlおよび１モルのエタノール水溶液と0.1モ
ルのフェリシアン化カリウム水溶液を各３mlずつ入れ、
毎分100回の往復振盪をしながら37℃で反応を行わせ
た。反応開始後、各時間ごとにデュパノール(Dupanol)
試薬を加えて反応を停止させた後、エタノールの脱水素
反応と共役して生成するフェロシアン化イオンを、デュ
パノール(Dupanol)試薬中のFe³⁺とから形成されるベル
リン青の660nmの吸光度によって測定し、その値から酸
化されたエタノール量を換算して求めた。固定化ADHに
よるアルコール脱水素反応の時間的経過は表７に示すご
とく、きわめて順調に進行した。ADHの至適pH、至適基
質濃度、至適温度は、本発明の方法による固定化によっ
てほとんど影響されなかった。しかも至適条件からはな
れた苛酷な条件下における活性の残存率は、固定化しな
い場合に比べて固定化によって著しく向上し、固定化の
効果が確認できた。なお固定化酵素ゲルからのADHの漏
出は全くみられなかった。

このアルコール脱水素反応の結果は、アルギン酸カルシ
ウムゲルやκ−カラギーナンゲルのみで酵素を包括固定
した場合よりすぐれていた。

実施例３（酵素タンパク質の固定化能力）アセトアセチル化度６モル％、重合度1,100、ケン化度9
9モル％のアセトアセチル化ポリビニルアルコールを20
重量％になるように水に均一に分散し、20℃、15分間オ
ートクレーブにかけて溶解したのち放冷してゲル主剤溶
液を調製した。このゲル主剤溶液に、低分子量酵素モデ
ル物質として分子量約68,000のヘモグロビンを200ppmに
なるように混合したのち、１規定水酸化ナトリウム水溶
液でpH6.3に調製し、成形助剤としてアルギン酸ナトリ
ウムを0.5重量％になるように添加混合した。この混合
溶液95ｇにジアルデヒド澱粉の10％水溶液５ｇを加えて
（ゲル主剤−ヘモグロビン−成形助剤−架橋剤）混合液
を調製した。

この混合液を口径1.5mmのノズルを通して塩化カルシウ
ムの２％水溶液中に滴下すると、不溶性の球形のビーズ
が形成され、アセトアセチル化ポリビニルアルコールの
ゲル化が完了するまでその形状が維持され、粒径３mm程
度で、きわめて均一で弾力性のある球形ビーズ状の固定
化ヘモグロビンゲルが調製された。

比較のために、アルギン酸ナトリウムの1.5％水溶液に
ヘモグロビンを200ppmになるように混合した（アルギン
酸ナトリウム−ヘモグロビン）混合液を調製し、前記と
同様にして塩化カルシウムの２％水溶液中に滴下して粒
径３mm程度の球状ビーズ状アルギン酸カルシウム固定化
ヘモグロビンゲルを調製した。

両者のタンパク質固定化能力を調べるために、当該ビー
ズゲルを水中に浸漬して、水中へのヘモグロビン溶出量
を測定した結果、表８の通りであった。

このように本発明の固定化方法は、ヘモグロビン溶出
量、ゲル強度とともにアルギン酸カルシウムゲルを用い
た固定化方法より優れていた。

実施例４（酵素の固定化）実施例２で調製したものと全く同様のゲル主剤溶液と粗
酵素液の混合液に、成形助剤としてキサンタンガム（米
国、ケルコ社製、商品名 KELTROL）を1.2重量％になる
ように添加混合した。この混合液190ｇにグルタルアル
デヒドの10重量％水溶液の８mlを加えて、（ゲル主剤−
粗酵素−成形助剤−架橋剤）混合液を調製した。この混
合液を実施例２の２％塩化カルシウム水溶液の代りに３
％硝酸アルミニウム水溶液を用いた以外は実施例２と同
様に処理して、球形ビーズ状固定化粗酵素ゲルを調製し
た。

このゲルを用いて、実施例２と同様にしてアルコール脱
水素酵素反応を行なったところ、実施例２と同様にきわ
めて順調に進行し、反応速度も殆ど同じであった。ま
た、ADHの至適pH、至適基質濃度、至適温度も実施例２
と同様に固定化によって殆ど影響されなかった。また、
至適条件外の活性の残存率も実施例２と同様すぐれてい
た。なお、固定化酵素ゲルからのADHの漏出も全くみら
れなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図はアセトアセチル化度６モル％、重合度1,100、
ケン化度99モル％のアセトアセチル化ポリビニルアルコ
ールの10％水溶液を、架橋剤としてジヒドラジド類を用
いてゲル化させた場合のpHとゲル化時間の関係を示す。
同様に第２図は架橋剤としてジアルデヒド類を用いた場
合を示す。Ａ：アジピン酸ジヒドラジドＫ：カルボジヒドラジドＧ：グリオキザール

フロントページの続き (72)発明者福森克明東京都港区赤坂４丁目10番33号ヘキスト合成株式会社内 (72)発明者見城卓也東京都港区赤坂４丁目10番33号ヘキスト合成株式会社内審査官植野浩志

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アセトアセチル化ポリビニルアルコールの
水溶液に、固定化すべき生体触媒を混合し、ついでアセ
トアセチル化ポリビニルアルコールの架橋剤を配合して
架橋ゲル化することを特徴とする生体触媒の固定化方
法。
【請求項２】架橋剤がアミノ基を有する化合物、アルデ
ヒド基を有する化合物、ヒドラジド基を有する化合物、
メチロール基を有する化合物から選んだ１又は２以上で
ある特許請求の範囲第１項記載の生体触媒の固定化方
法。
【請求項３】固定化する生体触媒が酵素である特許請求
の範囲第１項記載の生体触媒の固定化方法。
【請求項４】固定化する生成触媒が微生物である特許請
求の範囲第１項記載の生体触媒の固定化方法。
【請求項５】少なくとも１種の多価金属イオンとの接触
によりゲル化する能力を有する水溶性高分子多糖類と、
アセトアセチル化ポリビニルアルコールとの混合液に、
固定化すべき生体触媒を混合し、ついでアセトアセチル
化ポリビニルアルコールの架橋剤の存在下で、多価金属
塩の水溶液中に粒子状に滴下して架橋ゲル化することを
特徴とする生体触媒の粒状固定化方法。
【請求項６】架橋剤がアミノ基を有する化合物、アルデ
ヒド基を有する化合物、ヒドラジド基を有する化合物、
メチロール基を有する化合物から選んだ１又は２以上で
ある特許請求の範囲第５項記載の生体触媒の粒状固定化
方法。
【請求項７】固定化する生体触媒が酵素である特許請求
の範囲第５項記載の生体触媒の粒状固定化方法。
【請求項８】固定化する生体触媒が微生物である特許請
求の範囲第５項記載の生体触媒の粒状固定化方法。
【請求項９】架橋剤が少なくとも１種の多価金属イオン
との接触によりゲル化する能力を有する水溶性高分子多
糖類と、アセトアセチル化ポリビニルアルコールとの混
合水溶液中に存在することを特徴とする特許請求の範囲
第５項又は第６項記載の生体触媒の粒状固定化方法。
【請求項１０】架橋剤が多価金属塩の水溶液中に存在す
ることを特徴とする特許請求の範囲第５項又は第６項記
載の生体触媒の粒状固定化方法。